プランジ凍結:透過型電子顕微鏡での懸濁細胞の超微細構造と免疫学的研究のためのツール

Published 5/05/2017
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Biology

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Summary

この原稿は、透過型電子顕微鏡により懸濁細胞を可視化するために使いやすく、低コストの低温固定の方法を記載しています。

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Blancard, C., Salin, B. Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (123), e54874, doi:10.3791/54874 (2017).

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Abstract

透過型電子顕微鏡(TEM)は、タンパク質を局在化し、非常に高い分解能で高分子複合体を可視化するために、細胞の超微細構造を研究するための特別なツールです。しかし、本来の状態にできるだけ近い取得するには、完璧なサンプル保存が必要です。従来の電子顕微鏡(EM)アルデヒド固定、例えば、良好な超微細構造保存を提供しません。固定剤の遅い浸透は、様々な細胞成分の細胞の再編成および損失を誘発します。したがって、従来のEM固定は、構造および抗原性の瞬間的安定化および保存を可能にしません。細胞内事象を調べるための最良の選択は、その天然の状態で細胞を維持し、凍結置換固定法に続いて低温固定を使用することです。高圧凍結細胞の超微細構造の整合性を維持する/凍結置換は、最も一般的に使用される方法ですが、expensiが必要です機器VEの。ここでは、懸濁細胞培養のための凍結置換に続いて、使いやすく、低コストの凍結固定方法が提示されます。

Introduction

サンプル調製は、電子顕微鏡検査の成功のために重要です。従来のEM固定は、透過型電子顕微鏡(TEM) 1の組織または細胞を固定するための主要な方法であった1 。まず、アルデヒドと四酸化オスミウムを用いて室温で材料を化学的に固定する。次いで、材料を有機溶媒で脱水し、浸透させ、エポキシ樹脂に包埋する。この方法は、細胞への固定剤の浸透率に依存する。結果として、アーチファクトおよび細胞内容物の抽出が通常観察される2

凍結融解は、明らかに、細胞構造3の保存のためのより良い選択肢であり、それらをそのまま維持する。薄い樹脂切片における最高品質のTEM画像4は、低温固定/凍結置換法を用いて得ることができる。この技術の目的は、ガラス化されたbiologicalサンプル氷晶形成せず、または細胞の超微細構造を損傷しない十分に小さな氷晶を含みます。 (HPF)を凍結高圧またプランジ凍結(PF)と呼ばれる超急速低温固定は、サンプルをcryofixするための2つの方法です。 HPFは瞬間セル内の分子を固定化し、従来のEM固定によって引き起こされる損傷を回避します。冷凍機や自動置換デバイスのいくつかのタイプが5を開発されています。冷凍機や消耗品(液体窒素等のキャリアを試料)は高価であり、それらは、高品質の電子顕微鏡写真6,7製造を可能にします。 PFは、1950年代初期に使用された技術であり、PF手順を.During簡単で安価な8として文献に記載され、調製された試料は、氷の結晶が5nm未満3サイズ得るために急速に凍結されます。この目的を達成するために、サンプルがありますエタン、プロパン、エタンまたはプロパンの混合物として、液体寒剤に突入。 1950年代以来、PFの改善は、より多くのユーザーにこの技術を利用できるようにするために行われてきました。 PFは広く画像小さな物体(<100 nmのに使用されるのに対し、高圧凍結は、現在、50ミクロン(ディスク状サンプルについて200μmの厚さまで)5よりも厚い試料の多種多様を凍結するための唯一の実行可能な方法であります)、アモルファス氷9の薄膜に懸濁高分子複合体など。より大きなサンプルは、例えば、真核細胞は、PFによってcryofixedすることができるが、そのようなキャピラリー銅管またはサンドイッチシステム8、10、11のように、試料ホルダーを必要とします。

ここでは、迅速で簡単に使用し、様々な懸濁細胞培養のために使用可能な低コストのプランジ凍結/凍結置換技術が提示されます。

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Protocol

ホルムバールグリッドフィルムの調製

注:個人用保護具(手袋、白衣、メガネ)を使用して、ヒュームフードの下でクロロホルム操作を実行します。 400のメッシュの電子顕微鏡銅グリッドを使用してください。他のグリッドタイプ(他のメッシュサイズ、金とニッケルグリッド)で、凍結の品質が悪化しています。

  1. クロロホルム中の0.3%ホルムバール100mLの溶液を調製します。それは、攪拌せずに一晩溶解させます。
  2. アセトンを含有するガラスバイアル(高さ3センチメートル及び径2a CM)中で400メッシュ(平方インチ当たりの穴の数)電子microscopycopperグリッド(直径3.05ミリメートル)を置きます。手の円運動でガラスバイアルをかき混ぜます。プラスチック製のトランスファーピペットを用いてアセトンを除去します。溶剤を5分間蒸発させます。濾紙上にそれらを注ぐことによって、グリッドを転送し、それらを5分間乾燥させます。
  3. 滑り/光沢まで、糸くずの出ない布で拭いて76×26 mm 2のスライドガラスを研磨します。
  4. 晶析装置(直径15センチメートル、高さ:7 cmであり、容量1200 ml)に取り、蒸留水で縁にそれを埋めます。ほこりを取り除くために二回表面にガラス棒を渡して、水面を清掃してください。
  5. 二本の指の間にガラススライドを持ち、数秒間ホルムバール溶液中に浸し。 5分間逆さまにビーカーの下で乾燥するために直立それを保持。
  6. 膜が乾燥しているときに、スライドから除去されるフィルムの限界を定義するために鋭利なカミソリの刃を用いてガラススライドのエッジのスコア。
  7. 深呼吸をして、わずかに不透明なフィルムをレンダリングし、その視認性を高めるために、フィルムの上や下に水蒸気の層を得るために、スライド上に大きく息を吐きます。
    1. 直ちに約30°の角度でスライドの底に触れることにより、晶析装置の水面上に膜をフロート。スライドからフィルム剥離をしようと晶析装置の水面上にそれをはがします。ゆっくりとフィルムをやってのけますピンセット、必要に応じて。
  8. 穏やかグリッドは適切な厚さ(約10nm)および皺なしである領域に水面に浮かぶ膜上伏せ置きます。
  9. 彼らは晶析装置の水面に浮くようジョセフ・ペーパーでグリッドを覆うことによりフィルムをピックアップ。
    1. 片手でジョセフ紙を持ち、フィルムの一端にジョセフ紙の一方の端をタッチします。ジョセフ紙が完全に湿潤するまでお待ちください。引っかかってグリッドとジョセフの用紙を取り除きます。
  10. 室温で使用する前に最終的な乾燥および保管のために覆われたペトリ皿で24時間グリッドを置き。

凍結置換培地の調製

注:四酸化オスミウム(のOsO 4)および酢酸ウラニルは、有害化学物質です。白衣や手袋など、適切な個人用保護具(PPE)を着用したままヒュームフードでそれらを扱います。 Foll(のOsO 4)を取り扱うための安全警告および酢酸ウラニルOW。 OsO 4の漏れを避けるために、Oリングの凍結バイアルを使用します。

  1. 超微細構造の研究
    1. ガラスフラスコにガラスのOsO 4アンプルを入れてください。
    2. フラスコを振ってアンプルを破ります。
    3. 4%の最終濃度を得るために、アセトン100%の適切なボリュームを追加します。
    4. 攪拌し、1.8 mLのクリオバイアルに1.5 mLのアリコートを分配します。
  2. タンパク質の免疫標識
    1. ガラスフラスコに酢酸ウラニルを0.05gを置き。
    2. 100%のアセトン50mlを加えます。
    3. マグネチックスターラーで溶液を攪拌します。溶液が透明になったとき、0.2μmのフィルターを使用してフィルタリングします。
    4. 1.8 mLのクリオバイアルに1.5 mLのアリコートを分注します。
      注:プランジ凍結プロセスの前に、凍結置換媒体を含むクライオバイアルを準備し、-84℃の冷凍庫に保管してください。捨ててガラスフラスコを反転有害廃棄物中のOsO 4アンプル。

細胞の調製

注:このステップは、方法の成功のために重要です。全ての細胞型のために、細胞の指示された数を得るために、細胞を増殖させます。指定された時間および速度で示される管内の遠心分離機。

  1. 次のように異なる細胞型からのペレットの適切な整合性を得るために、細胞を増殖させます。
    1. サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)及びシゾサッカロミセス・ポンベのために、最小または完全液体培地5mlに酵母を接種します。 28℃、回転(180 rpm)で一晩インキュベートします。一晩培養物の600nmで(OD 600)での光学密度を測定します。 0.2ミリリットル50新鮮な選択培地のOD 600に酵母細胞を希釈します。 1×10 9酵母細胞7を得るために、回転し、28℃で細胞をインキュベートし続けます。
    2. リーシュマニア鞭毛のためにイノ7.5%FCS(ウシ胎児血清)とAM培地5mlでculate寄生虫。 24℃、回転(180 rpm)で一晩インキュベートします。一晩培養物のOD 600を測定ます。 0.2ミリリットル50新鮮な選択培地のOD 600に寄生虫細胞を希釈します。 5×10 8寄生虫セル12を得るために、回転し、24℃で細胞をインキュベートし続けます。
    3. トリパノソーマのために、10%FCSおよび30μgの/ mLのハイグロマイシンを用いてSDM-79培地5mLに寄生虫を接種します。 27℃、回転(180 rpm)で一晩インキュベートします。一晩培養物のOD 600を測定ます。 50mLの新鮮な選択培地中で0.2のOD 600に寄生虫細胞を希釈します。 5×10 8寄生虫細胞13を得るために、回転、27℃で細胞をインキュベートし続けます。
    4. 大腸菌のために、100μg/ mLのアンピシリンを有するDYT培地5ml中の細菌を接種します。 (180回転、37℃で一晩インキュベートしますRPM)。一晩培養物のOD 600を測定ます。 0.2ミリリットル50新鮮な選択培地のOD 600に細菌細胞を希釈します。 5×10 10細菌細胞14を得るために、回転し、37℃で細胞をインキュベートし続けます。
      注:一晩のインキュベーション後、培養中の細胞は、いずれかの対数または定常増殖期にあってもよいです。経験的に決定されるように非常にゆっくりと成長している細胞株は、一晩、または細胞のより多くの接種より長いインキュベーション時間を必要とするかもしれません。
  2. 全ての細胞タイプについて、1500×gで3分間、50 mlのポリプロピレン製チューブと遠心分離機に細胞を含む培地を移します。
  3. 上清を除去し、関連する細胞培養培地1ml中の全ての細胞型のペレットを再懸濁します。
  4. 遠心3,900×gで1分間マイクロ遠心チューブ内の全ての細胞型。完全に上清を除去します。
  5. 氷の上で細胞を保管してください。

注意:注意して液体窒素を処理します。 cryoglovesやゴーグルなどの個人保護具を使用してください。プロパンは、潜在的に爆発性であるため、風通しのよい部屋またはヒュームフードの下で液化を行います。裸火禁止は許可されません。

  1. ポリスチレントレイに液体窒素の約150ミリリットルを入れました。それを凍結し、液体窒素中で真鍮カップ(高さ3.6センチメートル、径2a cmであり、厚さ1.5ミリメートル)を置きます。液体窒素は、真鍮のカップの中に浸透させないでください。
  2. 気泡が真鍮のカップが凍結されていることを確認するために治まるまで待ちます。
  3. 真鍮カップ壁に接触してプロパンボンベに接続されたホースを入れてください。
  4. ゆっくりプロパンボンベのバルブを開きます。
    注:このステップで、プロパンは真鍮カップで液化します。
  5. プロパンボンベのバルブを閉じて、急速にガスホースを除去することにより、液状化を停止します。
  6. 液体NIポリスチレントレーを充填真鍮カップの上部から5mmまでトローゲン。液体窒素は、真鍮のカップの中に浸透させないでください。

サンプルの5プランジ凍結

  1. ポリスチレントレイに液体窒素の約200ミリリットルを入れました。液体窒素でそれらを置くことによって少し真鍮カップ(高さ直径1.5cm 2.5センチメートルと厚さ1ミリメートル)を凍結。 1つの懸濁細胞のサンプルに対して一杯に入れました。サンプルを混在しないように注意してください。このため、 などカップ2、で、カップ1のサンプル2をサンプル1を置きます。
  2. 液体窒素中でその先端を沈めることにより、ピンセットをフリーズします。
  3. 3.5で得られたペレット中の針を解剖ダブルエッジプランジ。
  4. ピンセットを使用して、セクション1で調製したホルムバールでコーティングされた400メッシュ銅顕微鏡グリッドを取ります。
  5. 解剖針を使用して、グリッド上3.5で得られたペレットのドロップを置きます。異なる液滴サイズ( 例えば、2、5、10μL)を試してみてください。
  6. 非常に急速に液体プロパン遺伝子の中にピンセットで開催されたグリッドを急落4章で評価し、数秒間円運動でグリッドをかき混ぜます。
  7. 急速にセクション5.1で凍結した小さな真鍮カップにピンセットで凍結されたグリッドを転送します。
    注:各試料について、少なくとも3つのグリッドを作ります。必ず、銅グリッドを取る前にピンセットを凍結します。

6.凍結置換

注:四酸化オスミウムが潜在的に揮発性であるので、蒸気カートリッジと空気浄化呼吸器を使用します。プランジ凍結も解決される前に液体窒素中で固定液を凍結。

  1. 超微細構造研究のために、セクション2.1で調製した凍結置換培地を含有する1.8mLのクライオバイアル管を開きます。免疫局在研究のために、セクション2.2で調製した凍結置換培地を含有する1.8mLのクライオバイアル管を開きます。クライオバイアルのキャップを置きます。
  2. 液体窒素中でその先端を沈めることにより、ピンセットをフリーズします。
  3. 急速にキャップを外し、冷凍グリッドiを転送しますピンセットを使用してクリオバイアルNTO。
  4. バッククライオバイアルのキャップを置きます。
  5. 各サンプルの各グリッドのための操作を繰り返します。
  6. すべてのキャップを閉め、サンプルを凍結置換培地中であることを保証するために手の円運動とクリオバイアルをかき混ぜます。
  7. 凍結置換処理中に-84℃の冷凍庫に3日間気密ボックス内の凍結バイアルを置きます。

7.サンプル温暖化

  1. 微細研究
    1. -30℃の冷凍庫に(急激な温度上昇を回避するため)、ポリスチレントレーで凍結バイアルを運びます。 1時間-30℃の冷凍庫でそれらを置きます。
    2. 2時間にわたって-15℃のフリーザーで凍結バイアルを置きます。 2時間4℃でサンプルを置き、次いで室温で30分間インキュベートしました。
    3. プラスチック製のトランスファーピペットで凍結置換媒体を取り外します。 100%アセトンの約500μLを追加します。
    4. クライオバイアル1.8ミリリットルをかき混ぜます急速に円形の手の動きとを有するガラスバイアルにグリッド(高さ3センチメートル及び直径2cmに)を含むアセトン(1.5ml)に注ぎます。
    5. すべてのグリッドを転送してください100%アセトン1mLで同じクライオバイアルをすすぎます。手の円運動とクライオバイアルを攪拌し、ガラスバイアル中にクリオバイアルの内容を注ぎます。
    6. 10分間、100%アセトン3mLの3回各ガラスバイアルをすすぎます。
    7. 参照15で説明したように埋め込み、封入手順に従います。 (25%、50%、および75%)アセトン中のエポキシ樹脂の濃度を増加させてサンプルを含浸し、ゼラチンカプセル中の100%のエポキシ樹脂と試料を埋め込みます。
  2. 免疫標識の研究
    1. ポリスチレントレイに1.8 mLのクリオバイアルを運ぶ-30℃の冷凍庫に(急激な温度上昇を避けるため)。
    2. -30℃の冷凍庫に2時間クライオバイアルを置きます。
    3. -30°で Cフリーザーに入れ、手の円形の動きでクライオバイアルを攪拌し、ポリプロピレンバイアル(高さ5cmおよび直径1.5cm)に凍結置換媒体を急速に注ぐ。
    4. 凍結置換培地を2 mlの新しい凍結置換培地で置換する。
    5. ポリプロピレンバイアルを-30℃の冷凍庫に2時間入れます。
    6. ポリプロピレンバイアルを100mLの2mLのアセトンで1時間、100mLの2mLのエタノールで3時間3回洗浄します。
    7. 参考文献15に記載されているように、埋め込みおよび包含手順に従ってください。サンプルをアクリル樹脂(25%、50%、および75%アセトン)の濃度を増加させて含浸させ、サンプルを100%アクリル樹脂でゼラチンカプセルに包埋する。

8.サンプルの可視化

  1. 埋め込み後、サンプルの80nm超薄切片をウルトラミクロトームで作製する。セクションを2%クエン酸鉛と室温で1分間対照するお尻= "外部参照"> 15。
  2. 切片15を観察するために80キロボルト又は120 kVの電子顕微鏡を使用します。

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Representative Results

この記事では、超微細構造( 図1及び図2)及び免疫標識( 図3)研究のために使いやすく、低コストのプランジ凍結方法が提供されます。私たちは、凍結置換法のためと温暖化手続きではなく、専用のシステムを使用して、24時間の6時間未満を取ることを特別な機器を用意する必要はありませんことを示しています。

PF /凍結置換法は、 サッカロミセス・セレビシエ図1Aおよび1D-H)、 シゾサッカロミセス・ポンベ図1Bとの細胞内構造の改善された保存をもたらし C)、 リーシュマニア鞭毛図2 のA及びB)、 トリパノソーマ図2 C及びD)、及び大腸菌図2E)。構造が収縮していないと、細胞質が密表示されます。また、膜は、良好な保存の証拠である、滑らかです。このような核( 1A、B、Dおよび2A-D)、ミトコンドリア( 1A〜C、EおよびH)、および液胞( 1A、C、F及びH)のような細胞小器官の全て、完全に識別することができます。核において、核膜、核膜孔、紡錘体極体、および核エンベロープの外膜に付着リボソームを形成する二重膜は、( 図1にはっきり見えますDおよび2B、2D)。ミトコンドリアは、クリステ( 図1E)と呼ばれる内部膜陥入は、はっきりと見えます。液胞は大きな氷の結晶は、それらの内側に簡単に開発することができますので、重要な器官です。 図1に示すように、空胞は完全に氷晶損傷( 1A、C、F、およびH)なしで保存されます。最後に超微細がよく保存されているように、異なる生物学的事象を観察し、分析することができ、このようなオートファジー( 1C、F及びH)、ミトコンドリアの形態( 図1E)、分泌小胞( 図1G)、及び核分裂として( 図1A 図2 B、AND 2C)。

特定の抗体を用いたタンパク質のその場でのローカライズでは細胞生物学における最も強力で人気のある技術の一つです。 PFはまた、タンパク質の免疫局在を実行するための方法として使用することができます。上述したように、この手順は、細胞小器官のアイデンティティをタンパク質の抗原性を保持し。例えば、抗ATPシンターゼ7、15( 3A、3Cおよび3D)、抗GFP( 図3B)、抗porine 16( 図3 E)、および抗FOX2 17( などの異なる酵母タンパク質を標的とする異なる抗体3F)、既にテストされています。このようなリーシュマニア12のように異なる生物、上でこれらの実験を行うことも可能です。


1: 酵母 サッカロマイセス ・セレビシエ 分裂酵母 の超微細構造の研究のTEM像 S.セレビシエ(A)概要。 S.ポンベ(B)の概要。 S.ポンベ細胞質の(C)部品。 (D)核の高倍率。はっきりと見えるクリステを有するミトコンドリアの(E)の詳細。オートファジー中(F)液胞形態。内部の分泌小胞と(G)酵母芽。 (H)オートファジープロセス中胞とミトコンドリアの間の密接な接触の例。 N、核; V、液胞; M、ミトコンドリア。 SV、分泌VESIcles; r、リボソーム。スケールバー= 200nm。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図2
図2 Leishmania amazonesis Trypanosoma brucei および E.coliの 超微細構造研究のTEM画像 Aリーシュマニアの概要B核孔および小胞体を有するリーシュマニア細胞質の詳細。 ( CT.ブルセイの概要。 ( D )ブルセイ核の高倍率。 ( E大腸菌(E.coli)細胞の概要。 N:核; V、液胞; m、ミトchondrion; NP、核膜孔。 F、鞭毛; FP、鞭毛ポケット。 K、キネトプラスト; R、リボソーム。スケールバー= 200 nmの。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
3: モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を用いてタンパク質の標識の例。 S.セレビシエ(A)概要。 (B)抗GFP抗体を用いたアミロイドβの免疫標識。 (CD)抗ATP合成酵素抗体を用いたミトコンドリアのラベルの例。ミトコンドリアの外膜における(E)ポリン局在。 (F)FOX2タンパク質は、免疫標識によってミトコンドリアにおいて検出されます。 Ldを Flabarinの(G)局在化リーシュマニアamazonesisの鞭毛の縦断面図。全ての抗体は、10のnmの金ポリクローナル抗体を用いて検出されます。 N、核; V、液胞;メートル、ミトコンドリア。スケールバー= 200 nmの。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

TEMは、細胞小器官、細胞、および組織の微細構造観察するための強力な方法です。低温固定/凍結置換は現在、超微細構造とタンパク質の抗原性の両方の保全のための最善の方法です。化学固定剤は、超微細2の完全な安定化の前に構造的再編成を許可することにより、非常にゆっくりと浸透し、行動します。逆に、低温固定/凍結置換は瞬時に細胞構造4を安定させます。しかし、低温固定/凍結置換法は、それによってアプリケーションの彼らの範囲を限定する制約や困難の数が含まれます。これはサンプル、凍結成果物、技術、コスト、および機器の実現に関するものです。高圧凍結/凍結置換技術は、細胞の詳細の保存6,7の高度を可能にしました。これとは対照的に、PFはすでにOBSのために使用されていますアモルファス氷9の薄膜に懸架小さなオブジェクトをアービング。ここでは、超微細構造および免疫標識研究のためのPF /凍結置換法は、高圧凍結の画像に匹敵する酵母、寄生虫、及び細菌の超微細構造の高品質の画像を提供します。

固定品質は冷却速度18に依存します。高い冷却速度で、水がガラス状態にあり、電子顕微鏡レベルで可視の結晶構造を示しません。ガラス化は、非常に薄い表面層(一般的には200μm)でのみ発生し、従って、良好な厚さの凍結は徐々に内層4に試料の表面から減少します。植物細胞、ワックス状コーティング又はガスで満たされた空間に冷却速度を遅くすることができます。 PFで、驚くべきことに、凍結パフォーマンスの質の低下は見られませんでした。すべての実験では、うまく凍結された細胞の割合は、gであります 50%reater。この割合は90%以上50%の間で変化し、様々なパラメータ(培地、細胞の生理学的状態、外気温、及び水分レベル)に依存します。上述したように、氷の結晶の形成は、細胞構造を破壊し、氷の結晶が液胞に特に見ることができます。 PF /凍結置換処理では、特別な注意が凍結温度に支払わなければなりません。凍結置換ステップは、-82℃以上実行されてはならない、そうでなければ、硝子体水は、結晶水に変換されます。氷の結晶損傷の形成を回避するために、凍結保護剤は、現在使用されているが、それは、細胞19の超微細構造の変化につながります。酵母、細菌、および寄生虫培養培地は、凍結保護剤である成分が含まれているかもしれません。この文脈では、実際の携帯状態にできるだけ近くなるようにするために、追加の凍結防止剤を使用しないことに決めました。

ve_content "> PF /凍結置換の成功は、この方法の開発段階での多くの重要なステップに依存します。まず、ペレットの適切な一貫性を得ることが重要です。遠心分離後に得られるペレットは、逆に、ペレットが十分にコンパクトでない場合、残った培地が発達する可能性があり、また、ペレットが小さ過ぎると、凍結置換溶液が液滴に浸透することができず、超微細構造が十分に保存されない。異なる細胞型からのペレットの適切な一貫性を得るために、培養条件を尊重して、プロトコル(上記参照)に示された指示された細胞数および遠心分離パラメータを得る必要があるしかし、銅グリッド上に置かれる材料の量は重要ではない。異なる液滴サイズを試験することができ、第2に、グリッドタイプthaサポートが重要であるとしてtが使用されています。異なるメッシュサイズを有するいくつかの金、ニッケル、銅グリッドを試験しました。最良の結果が細いバーが400メッシュの銅グリッドを得ました。第三に、凍結工程に関して、真鍮カップはプロパンを液化することが好ましいです。銅カップ内の液体プロパンは、したがって、実験を複雑、凍結する傾向があり。最後に、マニピュレータは偶発サンプルウォームアップを避けるために、迅速かつ低温の条件で働かなければなりません。それが発生した場合、サンプルは廃棄しなければなりません。例えば、サンプル温暖化を防ぐために、ピンセットは、手順の前にも先に準備する必要があり、それらと凍結置換媒体を使用する前に、事前に冷却しなければなりません。チルドピンセットもプランジ凍結becauseifプランジ凍結工程中に使用されなければならないが、ピンセットを凍結することなく実現され、ピンセット(による熱/冷交換に)プロパンに突入される煙の形態の多く。これは必然的に冷却速度に影響を与えます。 samplを用いた試験凍結していないピンセットで凍結したESは、適切に凍結することがないように見えます。

また、そのような凍結置換培地中のO S O 4及び酢酸ウラニルなどの有害化学物質の使用は、適切なPPEとヒュームフードの下で動作するように、溶液の調製および凍結置換プロセスの間、必要です。 OsO 4および蒸気の吸入の漏洩を防止するために、クライオバイアル、チューブを凍結置換処理中に密封されたままであることを保証するために、ハードOリングを持っている必要があります。凍結置換媒体の製造中オスミウム蒸気への不要な曝露を防止するために、のOsO 4アンプルはガラス製フラスコに分けることができます。封入後の樹脂ブロック中のガラス破片の存在は、アセトンリンス及び埋め込み工程中に微細な先端転送ピペットを使用することによって回避することができます。双眼ループ下封入工程と、半薄切片の実現を行うこともあり、ガラスの破片がないことを検証することができます。実験は、(特に凍結置換プロセスの最初のステップで)ヒュームフードの下で行うことができない場合、蒸気カートリッジと空気浄化呼吸器を使用します。液体窒素で凍結またはステップの間冷たい状態で作業しているときのマニピュレータにも注意しなければなりません。手袋、眼鏡の使用が推奨されています。液化は、風通しのよい部屋またはヒュームフードの下で行わなければならず、いかなる裸火が許可されていないので、また、プロパンは、潜在的に爆発性です。

いくつかの記事は、脳組織、ツタの葉、又はシロイヌナズナ及びベンサミアナタバコの根端などの試料の広範囲に、超微細の保存は、化学固定20、21に比べHPF技術によって改善されることを示しました。 PFでは、実験は懸濁液中の細胞に対して実施しました。したがって、ラ上のこの技術の成功の兆候はありませんrgerは、組織標本のように。さらなる実験は、この点に対処するために実施する必要があります。しかし、この方法は成功し、単離された細胞ではなく、菌糸フォーム22である糸状菌Podosporaのanserinaでテストされています。

この記事で提示した方法は、化学固定又はHPFの現在の方法に比べて有意な改善を表しています。例えば、PFは、HPF 23とは対照的に高価な機器や消耗品を必要としません。 HPF技術は、液体窒素(実験あたり約80 L)を多量に使用するので注意も払わなければなりません。提案手法では、一つの大きな利点は、重要な機器が23必要ではないということです。このように、実験のコストははるかに低い(約百倍安い)です。もう一つの利点は、技術は使いやすいので、特に専門知識が必要とされないことです。また、試料処理のOF PF /凍結置換により、24時間、24の代わりに6時間未満を取る温暖化プロセスにHPF /凍結置換よりもはるかに短いです。これは、従来の化学的固定よりも時間がかかるではありません。利点は、細胞の超微細構造が完全に最小のアーティファクトで保存されていることで、細胞の元の状態に非常に近いです。この技術の応用は確かに異なる迅速な生物学的事象を研究するか、懸濁液中で増殖した細胞のためにと、このような真菌の菌糸22として、数マイクロメートルの厚さのサンプルを、高解像度でタンパク質をローカライズするために使用されるであろう。

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Disclosures

著者は、彼らが興味の競合がないことを宣言します。

Acknowledgements

私たちは、原稿上の彼らの助けとコメントのためにM. Bouchecareilh、E.Tétaud、S. Duvezin-Caubet、およびA.デヴィンへの感謝の意を表明します。私たちは、画像が撮影されたボルドーイメージングセンターの電子撮像ポールに感謝しています。この作品は、センター国立デラRECHERCHE科学研究によってサポートされていました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Grids Electron Microscopy Sciences T400-Cu
Formvar Electron Microscopy Sciences 15800
Propane N35
Liquid nitrogen
Double edge dissecting needle Electron Microscopy Sciences 72947
Cryovials Electron Microscopy Sciences 61802-02
Osmium tetroxide Electron Microscopy Sciences 19130
Glass vial 8.5 mL Electron Microscopy Sciences 64252
Uranyl acetate Electron Microscopy Sciences 48851
Acetone Sigma 32201
Ethanol 100% Sigma 32221
Glass slides VWR international 631-9439
Tweezers
Acrylic resin Electron Microscopy Sciences 104371
Epoxy resin M Sigma 10951
Epoxy resin M hardener Sigma 10953
Dibutyl phtalate  Sigma 80102
Epoxy resin M accelerateur Sigma 10952
Crystallizer Fischer scientific 08-762-9
Joseph paper VWR international 111-5009
Brass cups do it yourself shop or made by yourself
Saccharomyces cerevisiae
Shizosacharomyces cerevisiae
Trypanosoma brucei
Leishmania amazonensis
Escherichia coli 
Airtight box Fischer scientific 7135-0001 
Air purifying respirator Fischer scientific 3M 7502 
Cartridge for respirator Fischer scientific 3M 6001
Particulate filter Fischer scientific 3M 5N11 

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References

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