Congelamento Plunge: Uma ferramenta para os estudos ultra-estruturais e de imunolocalização de células em suspensão em Microscopia Eletrônica de Transmissão

Published 5/05/2017
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Este manuscrito descreve um método fácil de usar e criofixação de baixo custo para a visualização de células em suspensão por meio de microscopia electrónica de transmissão.

Cite this Article

Copy Citation

Blancard, C., Salin, B. Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (123), e54874, doi:10.3791/54874 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM) é uma ferramenta extraordinária para estudar a ultra-estrutura celular, a fim de localizar proteínas e visualizar complexos macromoleculares em resolução muito alta. No entanto, para chegar o mais perto possível do estado nativo, preservação amostra perfeita é necessária. fixação convencional microscopia electrónica (EM) com aldeídos, por exemplo, não proporcionar uma boa preservação ultraestrutural. A penetração lenta de fixadores induz reorganização de células e perda de vários componentes celulares. Portanto, a fixação EM convencional não permite para uma estabilização instantânea e preservação de estruturas e antigenicidade. A melhor escolha para examinar eventos intracelulares é usar criofixação seguido pelo método de fixação de congelamento e de substituição que mantém as células em seu estado nativo. congelamento de alta pressão / congelar-substituição, o qual preserva a integridade da ultra-estrutura celular, é o método mais vulgarmente utilizado, mas requer expensive equipamento. Aqui, um método fácil de usar e congelamento de fixação de baixo custo seguido de congelamento de substituição de culturas de células de suspensão é apresentado.

Introduction

A preparação da amostra é crítico para o sucesso de qualquer estudo de microscopia electrónica. EM convencional de fixação foi o principal método para a fixação de tecidos ou células por microscopia electrónica de transmissão (TEM) 1. Em primeiro lugar, aldeídos e tetróxido de ósmio são usados ​​para fixar o material quimicamente à temperatura ambiente. Em seguida, o material é desidratado com solventes orgânicos, infiltrados e embebidos em resina epoxi. Este método é dependente da taxa de penetração de fixadores para dentro da célula. Por conseguinte, os artefactos e extracção de conteúdos celulares são geralmente observados dois.

Criofixação é claramente a melhor alternativa para a preservação de estruturas celulares 3, mantendo-as intactas. A mais alta qualidade de imagens de TEM em 4 secções finas de resina pode ser obtida utilizando o método de substituição criofixação / congelamento. O objectivo desta técnica é a obtenção de bi vitrificadosamostras ological sem formação de cristais de gelo ou contendo cristais de gelo pequenos o suficiente para não danificar a ultra-estrutura das células. congelamento de alta pressão (HPF) e criofixação ultra-rápida, que também é chamado mergulho congelação (PF), são dois métodos para cryofix amostras. HPF imobiliza moléculas na célula instantaneamente e evita o dano causado por fixação EM convencional. Vários tipos de máquinas de congelamento e dispositivos de substituição automática foram desenvolvidos 5. As máquinas de congelamento e de consumo (azoto líquido, espécime transportadoras, etc.) são caros, mas eles permitem a produção de micrografias electrónicas de alta qualidade 6, 7. PF é uma técnica que foi usada no início dos anos 1950 e está descrito na literatura como simples e barato 8 .Durante o procedimento PF, a amostra preparada é congelado a uma taxa rápida para se obter cristais de gelo com tamanho inferior a 3 a 5 nm. Para este fim, a amostra émergulhado num líquido criogénico, tal como etano, propano, ou uma mistura de etano-propano. Desde 1950, as melhorias de PF ter sido feito para tornar esta técnica disponível para um número maior de usuários. Congelamento de alta pressão é actualmente o único meio viável para congelar uma grande variedade de amostras mais espessa do que 50? M (até uma espessura de 200 um para as amostras em forma de disco) 5, enquanto que PF é amplamente utilizado para a imagem objectos pequenos (<100 nm ), tal como complexos macromoleculares em suspensão em um filme fino de gelo amorfo 9. Amostras maiores, por exemplo células eucarióticas, pode ser criofixados por PF, mas requer suportes de amostra, tais como tubos de cobre capilar ou sistemas de sanduíche 8, 10, 11.

Aqui, um rápido, fácil de usar e de baixo custo mergulhar tecnologia / congelamento de substituição de congelamento utilizável para várias culturas de células em suspensão é apresentada.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Preparação de Formvar Grade Film

NOTA: Executar manipulação clorofórmio sob uma coifa utilizando equipamento de protecção individual (luvas, bata de laboratório, copos). Use 400 mesh grelhas de cobre de microscopia electrónica. Com outros tipos de grade (outros tamanhos de malha, ouro e grades níquel), a qualidade do congelamento é pior.

  1. Prepara-se uma solução de 100 mL de 0,3% formvar em clorofórmio. Permita que ele se dissolver durante a noite sem agitação.
  2. Coloque 400 malhas (série de furos por polegada quadrada) grelhas microscopycopper electrões (diâmetro 3,05 mm) em um frasco de vidro (altura de 3 cm e 2 cm de diâmetro) contendo acetona. Agita-se o frasco de vidro com um movimento circular da mão. Remover a acetona, com uma pipeta de transferência de plástico. Permitir que o solvente evapora-se durante 5 min. Transferir as grades ao derramá-las para um papel de filtro e permitir-lhes secar durante 5 min.
  3. Polir uma lâmina de vidro 76 x 26 mm2 esfregando-o com um pano que não solte fiapos até brilhante / escorregadio.
  4. Tomar um cristalizador (diâmetro 15 cm, altura: 7 cm e capacidade de 1200 mL) e preenchê-lo até a borda com água destilada. Limpar a superfície da água por passagem de uma barra de vidro sobre a superfície de duas vezes para remover o pó.
  5. Segure a lâmina de vidro entre dois dedos e mergulhá-lo na solução formvar por alguns segundos. Segurá-la na posição vertical para secar sob uma proveta de cabeça para baixo durante 5 min.
  6. Quando a película é seca, marcar as extremidades da lâmina de vidro com uma lâmina de barbear afiada para definir os limites da película a ser deslocado a partir do slide.
  7. Respire fundo e expire fortemente sobre a lâmina para obter uma camada de vapor de água sobre e sob o filme para tornar o filme um pouco opaco e aumentar a sua visibilidade.
    1. flutuar imediatamente a película sobre a superfície da água do cristalizador por tocar o fundo da lâmina com um ângulo de cerca de 30 °. Deixe o filme de libertação a partir do slide e retire-a sobre a superfície da água cristalizador. Com cuidado, puxe o filme fora com opinças, se necessário.
  8. Cuidadosamente, coloque as grelhas de face voltada para baixo sobre a película que flutua na superfície da água nas regiões que são de espessura adequada (cerca de 10 nm) e sem rugas.
  9. Escolher-se a película, cobrindo as grelhas com papel Joseph enquanto flutuam sobre a superfície da água cristalizador.
    1. Segurando o papel Joseph com uma mão, toque em uma das extremidades do papel Joseph a uma extremidade do filme. Espere até que o papel Joseph é completamente molhado. Retire o papel Joseph com as grades preso por diante.
  10. Coloque as grades durante 24 horas, em uma placa de Petri coberta para a secagem e armazenamento antes da sua utilização, à temperatura ambiente final.

2. Preparação de Meio Freeze-substituição

NOTA: tetróxido de ósmio (OsO4) e acetato de uranilo são produtos químicos perigosos. Segurá-los no exaustor enquanto vestindo equipamento adequado de protecção individual (EPI), incluindo um jaleco e luvas. Follow os avisos de segurança para a manipulação (OsO 4) e acetato de uranilo. Use criotubos de O-ring, para evitar a fuga de OsO4.

  1. estudos ultra-estruturais
    1. Coloque vidro OsO4 ampola, num frasco de vidro.
    2. Quebrar a ampola por agitação do balão.
    3. Adicionar um volume apropriado de acetona 100% para obter uma concentração final de 4%.
    4. Agita-se e dispensar 1,5 mL de alíquotas em criotubos de 1,8 ml.
  2. imunomarcação de proteínas
    1. Coloque 0,05 g de acetato de uranilo em um frasco de vidro.
    2. Adicionar 50 ml de 100% de acetona.
    3. Agita-se a solução com um agitador magnético. Quando a solução se torna claro, filtrá-lo utilizando um filtro de 0,2? M.
    4. Dispensar 1,5 mL de alíquotas em criotubos de 1,8 ml.
      NOTA: Prepare os criotubos contendo meio de congelamento e de substituição antes de o processo de congelação de imersão e mantê-los em -84 ° C congelador. Inverter o frasco de vidro para jogar fora oOsO4 ampola na resíduos perigosos.

3. Preparação de células

NOTA: Esta etapa é fundamental para o sucesso do método. Para todos os tipos de células, as células crescem para obter o número indicado de células. Centrífuga no tubo indicado no tempo e velocidade especificada.

  1. Para se obter a consistência adequada dos peletes a partir de diferentes tipos de células, crescimento de células como se segue:
    1. Para Saccharomyces cerevisiae e Schizosaccharomyces pombe, inocular levedura em 5 ml de meio líquido mínimo ou completa. Incubar durante a noite a 28 ° C, rotação (180 rpm). Medir a densidade óptica a 600 nm (OD600) da cultura durante a noite. Dilui-se células de levedura para um OD600 de 0,2 em 50 ml de meio selectivo fresco. Continuar-se a incubar as células a 28 ° C, rotação, para se obter 1 x 10 9 culas de levedura 7.
    2. Para Leishmania flagelo, inoculate parasitas em meio 5 mL de AM com 7,5% de FCS (soro fetal de vitelo). Incubar durante a noite a 24 ° C, rotação (180 rpm). Medir a OD 600 da cultura durante a noite. Dilui-se as células de parasitas para uma OD600 de 0,2 em 50 ml de meio selectivo fresco. Continuar-se a incubar as células a 24 ° C, rotação, para se obter 5 X 10 8 culas parasita 12.
    3. Para Trypanosoma brucei, inocular parasitas em 5 ml de meio SDM-79 com 10% de FCS e 30? G / ml de higromicina. Incubar durante a noite a 27 ° C, rotação (180 rpm). Medir a OD 600 da cultura durante a noite. Dilui-se as células de parasitas para uma OD600 de 0,2 em 50 mL de meio selectivo fresco. Continuar-se a incubar as células a 27 ° C, rotação, para se obter 5 X 10 8 culas parasita 13.
    4. Para a Escherichia coli, as bactérias em inocular 5 ml de meio DYT com 100 ug / mL de ampicilina. Incubar durante a noite a 37 ° C, rotação (180rpm). Medir a OD 600 da cultura durante a noite. Dilui-se células de bactérias a uma OD600 de 0,2 em 50 ml de meio selectivo fresco. Continuar-se a incubar as células a 37 ° C, rotação, para se obter 5 X 10 10 culas 14 bacterianas.
      NOTA: A seguir à incubação durante a noite, as culas em cultura podem ser em qualquer fase de crescimento logarítmica ou estacionária. De crescimento muito lento estirpes celulares podem exigir tempos de incubação mais longo do que uma noite, ou a inoculação de um maior número de células, como determinado empiricamente.
  2. Para todos os tipos de células, a transferência do meio de cultura contendo as células para 50 ml de tubo de polipropileno e centrifuga-se durante 3 min a 1500 x g.
  3. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento de todos os tipos de células em 1 ml de meio de cultura celular relevante.
  4. Centrifugar todos os tipos de células em um tubo de microcentrífuga durante 1 min a 3900 x g. Completamente remover o sobrenadante.
  5. Manter as células no gelo.

Nota: Pega de azoto líquido com cuidado. Use equipamento de protecção individual, incluindo cryogloves e googles. O propano é potencialmente explosivo, de modo realizar a liquefacção em um espaço bem ventilado ou sob um exaustor de fumos. Não há chamas são permitidos.

  1. Colocar aproximadamente 150 ml de azoto líquido num tabuleiro de poliestireno. Colocar um copo de bronze (altura 3,6 cm, diâmetro de 2 cm e uma espessura de 1,5 mm) em azoto líquido para congelar. Não deixe que o nitrogênio líquido penetrar no copo de bronze.
  2. Espere até que as bolhas desaparecem ter certeza de que a taça de bronze está congelado.
  3. Coloque a mangueira ligada ao cilindro de gás em contacto com a parede da taça de latão.
  4. Suavemente abrir a válvula de cilindro de gás propano.
    NOTA: Nesta etapa, o propano liquefaz no copo de bronze.
  5. Pare a liquefacção fechando a válvula de cilindro de gás propano e rapidamente removendo a mangueira de gás.
  6. Encher o tabuleiro de poliestireno com líquido nitrogen até 5 mm do topo da taça de latão. Não deixe que o nitrogênio líquido penetrar no copo de bronze.

5. Imersão de congelação da amostra

  1. Colocar aproximadamente 200 ml de azoto líquido no tabuleiro de poliestireno. Congelar pequenos copos de latão (altura de 1,5 cm de diâmetro de 2,5 cm e espessura de 1 mm), colocando-os em azoto líquido. Colocar um copo para uma amostra de células em suspensão. Tenha cuidado para não misturar as amostras. Para este fim, colocar uma amostra no copo 1, a amostra 2, em forma de taça 2, etc.
  2. Congelar as pinças, mergulhando a sua ponta em azoto líquido.
  3. Mergulhar uma agulha de dupla extremidade de dissecção no sedimento obtido em 3.5.
  4. Usando pinças, tomar uma malha de grade 400 microscopia de cobre revestida com Formvar preparada na secção 1.
  5. Usando a agulha de dissecação, colocar uma gota do sedimento obtido em 3.5 em grelha. Tente diferentes tamanhos de gotas (por exemplo, 2, 5 e 10? L).
  6. Muito rapidamente mergulhar a grade realizada pelas pinças em propano líquido geneavaliado na seção 4 e agitar a grade com movimento circular por alguns segundos.
  7. Rapidamente transferir a grade congelada com a pinça para o pequeno copo de bronze congelado na secção 5.1.
    NOTA: Para cada amostra, fazer pelo menos 3 grades. Sempre congelar as pinças antes de tomar uma grade de cobre.

6. Freeze-substituição

NOTA: tetróxido de ósmio é potencialmente volátil, portanto, use um respirador purificador de ar com cartuchos de vapor. Congelamento do fixador em azoto líquido antes de mergulhar de congelação é também uma solução.

  1. Para os estudos de ultra-estrutura, abrir os tubos de 1,8 ml criotubo contendo meio de congelamento-substituição preparada na secção 2.1. Para os estudos de imunolocalização, abrir os tubos de 1,8 ml criotubo contendo meio de congelamento-substituição preparada na secção 2.2. Coloque a tampa sobre os criotubos.
  2. Congelar as pinças, mergulhando a sua ponta em azoto líquido.
  3. Rapidamente remover a tampa e transferir as grades congeladas into as cryovials usando a pinça.
  4. Coloque a tampa de volta nas cryovials.
  5. Repita a operação para cada grade de cada amostra.
  6. Fechar todas as tampas e agitar os criotubos com um movimento circular da mão para assegurar que as amostras são no meio de congelamento-substituição.
  7. Colocar os frascos criogénicos numa caixa estanque ao ar, durante 3 dias em um congelador -84 ° C durante o processo de congelação-substituição.

Aquecimento 7. Amostra

  1. estudos ultra-estrutura
    1. Transportar os criotubos em uma bandeja de poliestireno (para evitar um aumento repentino da temperatura) para um congelador de -30 ° C. Colocá-los no congelador -30 ° C durante 1 h.
    2. Coloque as criotubos em um congelador a -15 ° C durante 2 h. Colocar as amostras a 4 ° C durante 2 h e, em seguida, durante 30 minutos à temperatura ambiente.
    3. Remover o meio de substituição de congelação com uma pipeta de transferência de plástico. Adicionar aproximadamente 500 mL de 100% de acetona.
    4. Agita-se a 1,8 ml criotubocom um movimento circular da mão e rapidamente despeje a acetona (1,5 ml) contendo as grades em um frasco de vidro (altura de 3 cm e um diâmetro de 2 cm).
    5. Lavar o mesmo criotubo com 1 ml de 100% de acetona para ter a certeza de ter transferido todas as grades. Agita-se a criotubo com um movimento circular da mão e derramar o conteúdo do criotubo para um frasco de vidro.
    6. Lavar cada frasco de vidro com 3 mL de 100% de acetona 3 vezes durante 10 min.
    7. Seguir os procedimentos de incorporação e de inclusão como descrito na referência 15. Impregnar a amostra com concentrações crescentes de resina epoxi em acetona (25%, 50%, e 75%) e incorporar a amostra com resina epóxi de 100% em cápsulas de gelatina.
  2. immunolabeling estudos
    1. Transportar os 1,8 criotubos ml num tabuleiro de poliestireno (para evitar um aumento repentino da temperatura) para a -30 ° C congelador.
    2. Colocar os frascos criogénicos de 2 h, num congelador de -30 ° C.
    3. Em -30 ° C congelador, agita-se o frasco de congelação com um movimento circular da mão e verter rapidamente o meio substituição congelamento num frasco de polipropileno (5 cm de altura e 1,5 cm de diâmetro).
    4. Substituir o meio de congelamento substituição com 2 ml de meio de congelação-substituição fresco.
    5. Colocar o frasco de polipropileno durante 2 horas num congelador de -30 ° C.
    6. Lavar o frasco de polipropileno durante 1 hora com 2 ml de 100% de acetona e três vezes durante 1 h com 2 mL de etanol a 100%.
    7. Seguir os procedimentos de incorporação e de inclusão como descrito na referência 15. Impregnar a amostra com concentrações crescentes de resina acrílica (25%, 50%, e 75% em acetona) e incorporar a amostra com uma resina acrílica de 100% em cápsulas de gelatina.

8. A visualização das Amostras

  1. Após a incorporação, fazer 80 nm secções ultra-finas das amostras com um ultramicrotomo. Contrastar as secções com citrato de chumbo a 2% à temperatura ambiente durante 1 minAss = "xref"> 15.
  2. Use um microscópio eletrônico de 80 kV ou 120 kV para observar as seções 15 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Neste artigo, um método de congelação fácil de usar e de imersão de baixo custo para ultra-estruturais (Figuras 1 e Figura 2) e estudos de imunomarcação (Figura 3) é apresentada. Nós demonstramos que não é necessário ter um equipamento especial para o processo de congelamento e de substituição e que o procedimento de aquecimento leva menos de 6 h, em vez das 24 h usando um sistema dedicado.

Método / congelamento-substituição PF resultou na melhoria da manutenção das estruturas intracelulares de Saccharomyces cerevisiae (Figura 1A e 1D-H), Schizosaccharomyces pombe (Figura 1B e C), Leishmania flagelo (Figura 2 A e B), Trypanosoma brucei (Figura 2 C e D), e Escherichia coli (Figura 2E). As estruturas não estão encolhidos e citoplasma aparece densa. Além disso, as membranas são lisas, o que é prova de uma boa preservação. Todos os organelos, tais como o núcleo (Figura 1A, B e D Figura 2A-D), mitocôndria (Figura 1A-C, E e H) e vacúolos (Figura 1A, C, F e H), pode ser perfeitamente identificada . No núcleo, uma dupla membrana formando envelope nuclear, poro nuclear, corpos polares de fusos, e ribossomas ligados na membrana externa do envelope nuclear são nitidamente visíveis (Figura 1D e Figura 2B , 2D ). Nas mitocôndrias, as invaginações da membrana interna, chamadas cristae ( Figura 1E ), são claramente visíveis. Os vacúolos são orgânulos críticos porque grandes cristais de gelo podem se desenvolver facilmente dentro deles. Conforme ilustrado na Figura 1 , as vacuolas estão perfeitamente preservadas sem danos causados ​​por cristais de gelo ( Figura 1A , C , F e H ). Finalmente, como a ultraestrutura está bem preservada, diferentes eventos biológicos podem ser observados e analisados, como a autofagia ( Figura 1C , F e H ), morfologia mitocondrial ( Figura 1E ), vesículas secretoras ( Figura 1G ) e divisão nuclear ( Figura 1A , Figura 2B , and 2C).

Localização in situ de proteínas com anticorpos específicos é uma das técnicas mais poderoso e popular em biologia celular. PF pode também ser utilizado como um método para realizar imunolocalização proteína. Este processo preserva a antigenicidade de proteínas e, como aqui mencionado acima, a identidade organelo. Anticorpos diferentes dirigidos a diferentes proteínas de levedura, tais como anti-ATP sintase 7, 15 (Figura 3A, 3C e 3D), anti-GFP (Figura 3B), anti-porine 16 (Figura 3E), e anti-FOX2 17 (Figura 3F), já foram testados. É também possível realizar estas experiências em diferentes organismos, tais como Leishmania 12.


Figura 1: Imagens TEM de estudos ultra-estruturais das leveduras Saccharomyces cerevisiae e Schizosaccharomyces pombe. (A) Resumo de S. cerevisiae. (B) Visão geral de S. pombe. (C) Parte de S. pombe citoplasma. (D) Ampliação elevada de um núcleo. (E) Detalhe de uma mitocôndria com cristas claramente visível. Morfologia (F) vacuolar durante autofagia. (L) broto levedura com vesículas de secreção no interior. (H) Exemplo de contactos íntimos entre vacúolos e mitocôndria durante o processo de autofagia. N, núcleo; V, vacúolo; m, mitocôndria; SV, vesi secreçãoCles; R, ribossomas. Barras de escala = 200 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2 : Imagens TEM de estudos ultraestruturais de Leishmania amazonesis , Trypanosoma brucei e E. coli . ( A ) Visão geral de Leishmania. ( B ) Detalhe do citoplasma de Leishmania com poro nuclear e retículo endoplasmático. ( C ) Visão geral de T. brucei . ( D ) Ampliação elevada do núcleo de T. brucei . ( E ) Descrição geral da célula de E. coli . N: núcleo; V, vacuola; Mitochondrion; NP, poro nuclear; F, flagelo; FP, bolso flagelar; K, cinetoplástico; r, ribossomas. Barras de escala = 200 nm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3: Exemplos de marcação de proteínas, utilizando o anticorpo monoclonal e policlonal. (A) Resumo de S. cerevisiae. (B) de imunomarcação de amilóide-β com anticorpos anti-GFP. (CD) Exemplo de rotulagem mitocôndrias com anticorpos anti-sintase ATP. Localização (E) Porin na membrana externa de uma mitocôndria. Proteína (F) FOX2 é detectado na mitocôndria por imunomarcação. (L) Localização de Ld em Flabarinum corte longitudinal de um flagelo de Leishmania amazonesis. Todos os anticorpos são detectados usando 10 anticorpos policlonais de ouro nm. N, núcleo; V, vacúolo; m, mitocôndria. Barras de escala = 200 nm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

TEM é um método poderoso para a observação ultraestrutural de organelos, células e tecidos. Criofixação / congelamento-substituição é actualmente o melhor método para a preservação de ambos ultraestrutura e proteína antigenicidade. Fixadores químicos penetrar e actuar, desse modo permitindo que muito lentamente rearranjos estruturais antes da estabilização completa da ultra-estrutura 2. Por outro lado, a criofixação / congelamento-substituição estabiliza instantaneamente estruturas celulares 4. No entanto, as técnicas criofixação / freeze-substituição incluem uma série de limitações e dificuldades limitando assim o seu campo de aplicação. Trata-se de amostra, artefatos de congelamento, a realização da técnica, custo e equipamentos. A técnica / congelamento-substituição de congelação de alta pressão permitiu um elevado grau de conservação de detalhes celulares 6, 7. Em contraste, a PF já é usado para observing pequenos objectos suspensos em películas finas de gelo amorfo 9. Aqui, método / congelamento-substituição PF para estudos ultra-estruturais e imunomarcação fornece imagens de leveduras, parasitas e ultra-estrutura bacteriana comparáveis ​​a imagens de congelamento de alta pressão de alta qualidade.

Qualidade fixação depende velocidades de arrefecimento 18. Em taxas altas de arrefecimento, a água está no estado vítreo e não mostra estrutura cristalina visível ao nível microscopia electrónica. A vitrificação ocorre apenas numa camada superficial muito fina (200? M, em geral) e, portanto, uma boa espessura de congelação irá diminuir gradualmente a partir da superfície da amostra e as camadas internas 4. Nas células vegetais, o revestimento de cera ou de espaços preenchidos com gás pode retardar as taxas de arrefecimento. Com PF, surpreendentemente, não foi observada nenhuma diminuição na qualidade do desempenho de congelamento. Em todas as experiências, a percentagem de células bem congelados é g reater do que 50%. Esta percentagem varia entre 50% a mais do que 90% e está dependente de vários parâmetros (meio de cultura, o estado fisiológico das células, a temperatura exterior, e de nível de humidade). Como afirmado acima, a formação de cristais de gelo destrói a estrutura de célula e os cristais de gelo são particularmente visíveis nos vacúolos. No processo de substituição / congelamento PF, atenção especial deve ser dada à temperatura de congelamento. O passo de congelamento substituição não deve ser realizada acima -82 ° C, caso contrário, a água vítrea será transformado em água cristalina. Para evitar a formação de cristais de gelo danos, crioprotector é actualmente utilizado, mas que conduz a alterações na ultraestrutura das células 19. Leveduras, bactérias, e cultura parasita meios pode conter um componente que é o agente crioprotector. Neste contexto, foi decidido não usar cryoprotectant adicional, a fim de ser o mais próximo possível do estado celular real.

ve_content "> O sucesso de PF substituição / congelamento depende de diversos passos críticos durante a fase de desenvolvimento do método. Em primeiro lugar, um ponto crítico é para obter a consistência adequada dos peletes. O pelete obtido depois de centrifugação deve ser compacto o suficiente para ser enrolada para fora sobre uma grelha de microscopia electrónica. Se o sedimento é muito compacta, a solução de congelação-substituição não pode penetrar a gota, e a ultra-estrutura não será bem preservada. por outro lado, se o sedimento não é suficientemente compacto, o meio de cultura residual pode desenvolver cristais de gelo e prejudicar a ultra-estrutura celular. para se obter a consistência adequada dos peletes a partir de diferentes tipos de células, é necessário respeitar as condições de cultura para obter o número indicado de células e parâmetros de centrifugação indicados no protocolo (ver acima) para todos tipos de células. no entanto, a quantidade de material colocado na grelha de cobre não é crítica. tamanhos de gotículas diferentes podem ser testadas. em segundo lugar, o tipo de grade that é usado como um apoio é importante. Vários ouro, níquel, cobre e redes com dimensões de malha diferentes foram testadas. Os melhores resultados foram obtidos com uma grelha de cobre de malha 400 com barras finas. Em terceiro lugar, no que diz respeito à etapa de congelação, uma taça de latão é preferido para liquefazer o propano. propano líquido no copo de cobre tende a gelar e, por conseguinte, dificulta a experiência. Finalmente, o manipulador deve trabalhar rapidamente e em condições de frio para evitar amostra acidental warm-up. Se isso acontecer, a amostra deve ser descartado. Por exemplo, para evitar o aquecimento da amostra, a pinça tem de ser pré-arrefecida antes de os utilizar e a forma de substituição de congelação deve ser preparados com bastante antecedência antes do procedimento. pinças refrigerados também deve ser utilizado durante o processo de congelação de imersão becauseif o congelamento de imersão é realizado sem congelar a pinça, um lote de formas de fumo como as pinças são mergulhados na propano (devido à troca de calor frio /). Isto tem inevitavelmente um impacto sobre as taxas de arrefecimento. Testes com samples congelados com uma pinça descongeladas parecem não estar adequadamente congelados.

Além disso, a utilização de produtos químicos perigosos, tais como O, S e O 4 de acetato de uranilo no meio de congelamento-substituição exige, durante a preparação de soluções e congelar-substituição processo, para trabalhar sob o exaustor de fumos com PPE adequada. Para impedir a fuga de OsO4 e inalação de vapores, criotubos deve ter um anel de vedação de disco para assegurar que os tubos de permanecer selada durante o processo de congelação-substituição. Para evitar a exposição desnecessária ao vapor de ósmio durante a preparação do meio de congelamento-substituição, a ampola de OsO 4 pode ser dividido em um frasco de vidro. A presença de fragmentos de vidro em bloco de resina após a inclusão pode ser evitado usando pipetas de transferência de ponta fina durante acetonas lavagens e os passos de incorporação. Realizando o passo a inclusão no âmbito de um circuito binocular e a realização de cortes semi-finos também permite a verificação de que não há cacos de vidro.Quando as experiências não pode ser conduzida sob uma coifa (particularmente no primeiro passo do processo de substituição de congelamento), utilizar um respirador de purificação de ar com cartuchos de vapor. O manipulador deve também ter cuidado quando se trabalha em condições frias, com azoto líquido ou durante os passos de congelação. O uso de luvas e óculos são recomendados. Além disso, o propano é potencialmente explosivo, de modo a liquefacção deve ser realizada em um espaço bem ventilado ou sob um exaustor de fumos e não há chamas são permitidos.

Vários artigos mostraram que, em uma grande variedade de amostras, tais como tecido do cérebro, folha de hera, ou pontas de raiz de A. thaliana e N. benthamiana, a preservação da ultra-estrutura é melhorada com a técnica HPF comparado a fixação química 20, 21. Com PF, as experiências foram realizadas em células em suspensão. Portanto, não há nenhuma indicação do sucesso desta técnica em larger espécimes como tecidos. Outros experimentos precisam ser realizados para abordar este ponto. No entanto, o método tem sido testado com sucesso com o fungo filamentoso anserina Podospora que não é isolado de células, mas é, em vez da forma micélio 22.

O método apresentado neste artigo representa uma melhoria significativa sobre os métodos correntes de fixação química ou HPF. Por exemplo, PF não requer equipamento ou consumíveis caro em contraste com HPF 23. Além disso, deverá ser feita porque a técnica HPF usa uma grande quantidade de azoto líquido (cerca de 80 L por experiência). Com a técnica proposta, uma grande vantagem é que nenhum equipamento importante é necessária 23. Assim, o custo de um experimento é muito mais baixas (cerca de cem vezes mais barato). Outra vantagem é que nenhum conhecimento especial é necessário porque a técnica é fácil de usar. Além disso, o processamento das amostras Of PF / congelamento-substituição é muito mais curto do que HPF / congelamento-substituição, devido ao processo de aquecimento que leva menos de 6 h, em vez de 24 h 24. Não é mais demorado do que a fixação química convencional. A vantagem é que a ultra-estrutura celular é perfeitamente preservada com artefatos mínimos e é muito mais perto de estado original das células. A aplicação desta tecnologia será, certamente, da utilização para estudar diferentes eventos biológicos rápidos ou para localizar proteas com elevada resolução para células cultivadas em suspensão e para as amostras de uma espessura alguns micrómetros, tais como hifas fúngicas 22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores declaram que não têm nenhum conflito de interesse.

Acknowledgements

Nós expressamos nossa gratidão a M. Bouchecareilh, E. Tétaud, S. Duvezin-Caubet, e A. Devin por sua ajuda e comentários sobre o manuscrito. Somos gratos ao pólo imagens eletrônicas de Bordeaux Imaging Center, onde as imagens foram tiradas. Este trabalho foi apoiado pelo Centro Nacional de la Recherche Scientifique.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Grids Electron Microscopy Sciences T400-Cu
Formvar Electron Microscopy Sciences 15800
Propane N35
Liquid nitrogen
Double edge dissecting needle Electron Microscopy Sciences 72947
Cryovials Electron Microscopy Sciences 61802-02
Osmium tetroxide Electron Microscopy Sciences 19130
Glass vial 8.5 mL Electron Microscopy Sciences 64252
Uranyl acetate Electron Microscopy Sciences 48851
Acetone Sigma 32201
Ethanol 100% Sigma 32221
Glass slides VWR international 631-9439
Tweezers
Acrylic resin Electron Microscopy Sciences 104371
Epoxy resin M Sigma 10951
Epoxy resin M hardener Sigma 10953
Dibutyl phtalate  Sigma 80102
Epoxy resin M accelerateur Sigma 10952
Crystallizer Fischer scientific 08-762-9
Joseph paper VWR international 111-5009
Brass cups do it yourself shop or made by yourself
Saccharomyces cerevisiae
Shizosacharomyces cerevisiae
Trypanosoma brucei
Leishmania amazonensis
Escherichia coli 
Airtight box Fischer scientific 7135-0001 
Air purifying respirator Fischer scientific 3M 7502 
Cartridge for respirator Fischer scientific 3M 6001
Particulate filter Fischer scientific 3M 5N11 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Palade, G. E., Porter, K. R. Studies on the endoplasmic reticulum. I. Its identification in cells in situ. J Exp Med. 100, (6), 641-656 (1954).
  2. Kellenberger, E., Johansen, R., Maeder, M., Bohrmann, B., Stauffer, E., Villiger, W. Artefacts and morphological changes during chemical fixation. J Microsc. 168, (Pt 2), 181-201 (1992).
  3. Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochem Cell Biol. 130, (5), 877-889 (2008).
  4. McDonald, K. L. Out with the old and in with the new: rapid specimen preparation procedures for electron microscopy of sectioned biological material. Protoplasma. 251, 429-448 (2014).
  5. Studer, D., Graber, W., Al-Amoudi, A., Eggli, P. A new approach for cryofixation by high-pressure freezing. J Microsc. 203, (Pt 3), 285-294 (2001).
  6. Bernales, S., McDonald, K. L., Walter, P. Autophagy counterbalances endoplasmic reticulum expansion during the unfolded protein response. PLoS Biol. 4, (12), 2311-2324 (2006).
  7. Kissová, I., Salin, B., Schaeffer, J., Bhatia, S., Manon, S., Camougrand, N. Selective and non-selective autophagic degradation of mitochondria in yeast. Autophagy. 3, (4), 329-336 (2007).
  8. Gilkey, J. C., Staehling, A. Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure. Microsc Res Tech. 3, (2), 177-210 (1986).
  9. Nogales, E., Scheres, S. H. Cryo-EM: A Unique Tool for the Visualization of Macromolecular Complexity. Mol Cell. 58, (4), 677-689 (2015).
  10. Baba, M. Electron microscopy in yeast. Methods Enzymol. 451, 133-149 (2008).
  11. Leunissen, J. L. M., Yi, H. Self-pressurized rapid freezing (SPRF): a novel cryofixation method for specimen preparation in electron microscopy. J Microsc. 235, (1), 25-35 (2009).
  12. Lefebvre, M., et al. LdFlabarin a new BAR domain membrane protein of Leishmania flagellum. PLoS One. 8, (9), 1-12 (2013).
  13. Tetaud, E., et al. TbFlabarin, a flagellar protein of Trypanosoma brucei, highlights differences between Leishmania and Trypanosoma flagellar-targeting signals. Exp Parasitol. 166, 97-107 (2016).
  14. Wasmer, C., et al. Solid-state NMR spectroscopy reveals that E coli inclusion bodies of HET-s(218-289) are amyloids. Angew Chem Int Ed Engl. 48, (26), 4858-4860 (2009).
  15. Lefebvre-Legendre, L., et al. Failure to assemble the alpha 3 beta 3 subcomplex of the ATP synthase leads to accumulation of the alpha and beta subunits within inclusion bodies and the loss of mitochondrial cristae in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 280, (18), 18386-18389 (2005).
  16. Paumard, P., et al. The ATP synthase is involved in generating mitochondrial cristae morphology. EMBO J. 21, (3), 221-230 (2002).
  17. Gabriel, F., et al. A Fox2-dependent fatty acid ß-oxidation pathway coexists both in peroxisomes and mitochondria of the ascomycete yeast Candida lusitaniae. PLoS One. 9, (12), 1-27 (2014).
  18. Dubochet, J. The physics of rapid cooling and its implications for cryoimmobilization of cells. Methods Cell Biol. 79, 7-21 (2007).
  19. Meryman, H. T. Cryopreservation of living cells: principles and practice. Transfusion. 47, (5), 935-945 (2007).
  20. Vanhecke, D., Graber, W., Studer, D. Close-to-native ultrastructural preservation by high pressure freezing. Methods Cell Biol. 88, 151-164 (2008).
  21. Bobik, K., Dunlap, J. R., Burch-Smith, T. M. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution of plant tissues for transmission electron microscopy. J Vis Exp. (92), e51844 (2014).
  22. Pinan-Lucarré, B., Clavé, C. Monitoring autophagy in the filamentous fungus Podospora anserina. Methods Enzymol. 451, 251-270 (2008).
  23. Follet-Gueye, M. L., Pagny, S., Faye, L., Gomord, V., Driouich, A. An improved chemical fixation method suitable for immunogold localization of green fluorescent protein in the Golgi apparatus of tobacco Bright Yellow (BY-2) cells. J Histochem Cytochem. 51, (7), 931-940 (2003).
  24. Jesus, D. M., Moussatche, N., Condit, R. C. An improved high pressure freezing and freeze substitution method to preserve the labile vaccinia virus nucleocapsid. J Struct Biol. 195, (1), 41-48 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats