Plunge congélation: un outil pour les études ultrastructurales et immunolocalisation de cellules en suspension dans microscopie électronique à transmission

Published 5/05/2017
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Biology

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Summary

Ce manuscrit décrit une méthode facile à utiliser et cryofixation à faible coût pour la visualisation des cellules en suspension par microscopie électronique à transmission.

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Blancard, C., Salin, B. Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (123), e54874, doi:10.3791/54874 (2017).

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Abstract

Microscopie électronique à transmission (MET) est un outil extraordinaire pour étudier ultrastructure cellulaire, afin de localiser des protéines et de visualiser des complexes macromoléculaires à très haute résolution. Toutefois, pour obtenir le plus près possible de l'état natif, parfait état de conservation de l'échantillon est nécessaire. fixation conventionnelle microscopie électronique (EM) avec des aldéhydes, par exemple, ne fournit pas une bonne conservation ultrastructurale. La pénétration lente de fixateurs induit une réorganisation cellulaire et la perte de divers composants cellulaires. Par conséquent, la fixation conventionnelle EM ne permet pas une stabilisation instantanée et la conservation des structures et antigénicité. Le meilleur choix pour examiner les événements intracellulaires est d'utiliser cryofixation suivie de la méthode de fixation gel-substitution qui maintient les cellules dans leur état natif. gel / gel de substitution à haute pression, qui préserve l'intégrité de ultrastructure cellulaire, est la méthode la plus couramment utilisée, mais nécessite expensive équipement. Ici, une méthode facile à utiliser et à la fixation de gel à faible coût, suivi par le gel de substitution des cultures de cellules en suspension est présentée.

Introduction

La préparation des échantillons est essentielle pour le succès de toute étude de microscopie électronique. Fixation classique EM est la principale méthode pour la fixation de tissu ou de cellules pour la microscopie électronique à transmission (TEM) 1. Tout d'abord, des aldéhydes et du tétroxyde d'osmium sont utilisés pour fixer chimiquement le matériau à la température ambiante. Ensuite, le matériau est déshydraté avec des solvants organiques, infiltrés, et noyé dans une résine époxy. Cette méthode dépend de la vitesse de fixateurs de pénétration dans la cellule. Par conséquent, les artefacts et l' extraction des matières cellulaires sont habituellement observées 2.

Cryofixation est clairement une meilleure alternative pour la préservation des structures cellulaires 3, en les gardant intactes. La plus haute qualité d'images TEM 4 dans des coupes minces de résine peut être obtenue en utilisant la méthode de substitution cryofixation / gel. Le but de cette technique est d'obtenir vitrifié biéchantillons giques sans formation de cristaux de glace ou contenant des cristaux de glace suffisamment petites pour ne pas endommager l'ultrastructure des cellules. congélation à haute pression (HPF) et cryofixation ultra-rapide, qui est aussi appelé gel plongée (PF), sont deux méthodes pour cryofix échantillons. HPF immobilisant molécules dans la cellule instantanément et évite les dommages causés par la fixation classique EM. Plusieurs types de machines et d' appareils de substitution automatique de congélation ont été mis au point 5. Les machines de congélation et consommables (azote liquide, porte - échantillons, etc.) sont chers, mais ils permettent de produire des micrographies électroniques de haute qualité 6, 7. PF est une technique qui a été utilisée au début des années 1950 et est décrit dans la littérature aussi simple et pas cher 8 .Pendant la procédure PF, l'échantillon préparé est gelé à un rythme rapide pour obtenir des cristaux de glace taille inférieure à 3 à 5 nm. A cet effet, l'échantillon estplongé dans un cryogène liquide, tel que l'éthane, le propane, ou un mélange éthane-propane. Depuis les années 1950, l'amélioration de PF ont été fait pour rendre cette technique à un plus grand nombre d'utilisateurs. Congélation à haute pression est actuellement la seule solution viable pour geler une grande variété d'échantillons plus épais que 50 um (jusqu'à une épaisseur de 200 pm pour des échantillons en forme de disques) 5, alors que PF est largement utilisé pour l' image des petits objets (<100 nm ), tels que des complexes macromoléculaires en suspension dans un film mince de glace amorphe 9. Des échantillons plus importants, par exemple des cellules eucaryotes, peuvent être cryofixed par PF, mais nécessite des porte-échantillons, tels que des tubes en cuivre capillaire ou des systèmes sandwich 8, 10, 11.

Ici, un rapide, facile à utiliser et plonger la technologie de congélation / gel de substitution à faible coût utilisable pour diverses cultures de cellules de suspension est présentée.

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Protocol

1. Préparation de Formvar Grille Film

REMARQUE: Manipulez de chloroforme sous une hotte en utilisant un équipement de protection individuelle (gants, blouse de laboratoire, lunettes). Utiliser 400 grilles de cuivre de microscopie électronique maillage. Avec d'autres types de réseau (autres tailles de mailles, l'or et les grilles de nickel), la qualité du gel est pire.

  1. Préparer une solution de 100 ml de 0,3% dans le chloroforme formvar. Laisser se dissoudre pendant la nuit sans agitation.
  2. Mettre 400 mesh (nombre de trous par pouce carré) grilles de microscopycopper d'électrons (diamètre 3,05 mm) dans un flacon en verre (hauteur 3 cm et un diamètre de 2 cm) contenant de l'acétone. On agite le flacon de verre avec un mouvement circulaire de la main. Éliminer l'acétone avec une pipette de transfert en plastique. Laisser évaporer le solvant pendant 5 minutes. Transférer les grilles en les versant sur un papier filtre et les laisser sécher pendant 5 minutes.
  3. Polir une lame de verre 76 x 26 mm 2 en l' essuyant avec un chiffon non pelucheux jusqu'à brillant / glissant.
  4. Prendre un cristallisoir (diamètre 15 cm, hauteur: 7 cm et de capacité 1200 ml) et de le remplir à ras bord avec de l'eau distillée. Nettoyer la surface de l'eau en passant une barre de verre au-dessus de la surface deux fois pour enlever la poussière.
  5. Tenez la lame de verre entre deux doigts et le tremper dans la solution formvar pendant quelques secondes. Tenez-le debout sécher sous un bécher à l'envers pendant 5 min.
  6. Lorsque le film est sec, marquer les bords de la lame de verre avec une lame de rasoir pour définir les limites du film à être délogés de la diapositive.
  7. Prenez une grande respiration et expirez fortement sur la lame pour obtenir une couche de vapeur d'eau et sous le film pour rendre le film légèrement opaque et améliorer sa visibilité.
    1. flotter immédiatement le film sur la surface de l'eau de cristallisation en touchant le fond de la lame avec un angle d'environ 30 °. Laisser la sortie du film de la lame et de le retirer à la surface de l'eau de cristallisation. Tirez doucement sur le film de laPinces, si nécessaire.
  8. Collez doucement les grilles vers le bas sur le film flottant sur la surface de l'eau dans les régions qui sont de l'épaisseur appropriée (environ 10 nm) et sans rides.
  9. Retirez le film en recouvrant les grilles avec du papier Joseph alors qu'ils flottent sur la surface de l'eau cristalliseuse.
    1. En tenant le papier Joseph d'une main, touchez une extrémité du papier Joseph à une extrémité du film. Attendez que le papier Joseph soit complètement humide. Retirez le papier Joseph avec les grilles collées.
  10. Placez les grilles pendant 24 h dans une boîte de Petri couverte pour le séchage final et le stockage avant utilisation à température ambiante.

2. Préparation du milieu de substitution au gel

REMARQUE: Le tétroxyde d'osmium (OsO 4 ) et l'acétate d'uranyle sont des produits chimiques dangereux. Manipulez-les dans la hotte de fumée tout en portant un équipement de protection individuelle approprié (EPI) comprenant une blouse de laboratoire et des gants. Follow les consignes de sécurité pour la manipulation (OSO 4) et de l' acétate d'uranyle. Utilisez cryotubes O-ring pour éviter la fuite de OsO 4.

  1. Des études ultrastructurales
    1. Mettez le verre OsO 4 ampoule dans un flacon en verre.
    2. Briser l'ampoule en secouant le flacon.
    3. Ajouter un volume approprié de l'acétone à 100% pour obtenir une concentration finale de 4%.
    4. Remuer et distribuer aliquotes de 1,5 ml dans 1,8 ml cryoampoules.
  2. Immunomarquage des protéines
    1. Placer 0,05 g d'acétate d'uranyle dans un flacon en verre.
    2. Ajouter 50 ml d'acétone à 100%.
    3. On agite la solution avec un agitateur magnétique. Lorsque la solution devient limpide, un filtrage en utilisant un filtre de 0,2 um.
    4. 1,5 ml aliquotes Distribuer dans 1,8 ml cryoampoules.
      NOTE: Préparer les cryotubes contenant un milieu de gel de substitution avant le processus de congélation d'eau froide et les garder à -84 ° C congélateur. Inverser le flacon de verre pour jeter leOsO 4 ampoule dans les déchets dangereux.

3. Préparation des cellules

REMARQUE: Cette étape est essentielle pour le succès de la méthode. Pour tous les types de cellules, cultiver des cellules pour obtenir le nombre indiqué de cellules. Centrifugeuse dans le tube indiqué à l'heure indiquée et la vitesse.

  1. Pour obtenir la consistance appropriée des granulés de différents types de cellules, les cellules se développer comme suit:
    1. Pour Saccharomyces cerevisiae et Schizosaccharomyces pombe, inoculer levure dans 5 ml de milieu liquide minimal ou complet. Incuber pendant une nuit à 28 ° C, rotation (180 rpm). Mesurer la densité optique à 600 nm (DO 600) de la culture d'une nuit. Diluer les cellules de levure à une DO 600 de 0,2 dans 50 ml de milieu frais sélectif. Continuer à incuber les cellules à 28 ° C, en rotation, pour obtenir 1 x 10 9 cellules de levure 7.
    2. Pour flagelle Leishmania, inoparasites culer dans 5 ml de milieu AM avec 7,5% de FCS (sérum de veau foetal). Incuber pendant une nuit à 24 ° C, rotation (180 rpm). Mesurer la 600 OD de la culture du jour au lendemain. Diluer les cellules parasitaires à une DO 600 de 0,2 dans 50 ml de milieu frais sélectif. Continuer à incuber les cellules à 24 ° C, en rotation, pour obtenir 5 x 10 8 cellules de parasites 12.
    3. Pour Trypanosoma brucei, inoculer parasites dans 5 ml de milieu SDM-79 avec 10% de FCS et 30 ug / ml d' hygromycine. Incuber pendant une nuit à 27 ° C, rotation (180 rpm). Mesurer la 600 OD de la culture du jour au lendemain. Diluer les cellules parasitaires à une DO 600 de 0,2 dans 50 ml de milieu frais sélectif. Continuer à incuber les cellules à 27 ° C, en rotation, pour obtenir 5 x 10 8 cellules de parasites 13.
    4. Pour Escherichia coli, inoculer les bactéries dans 5 ml de milieu DYT avec 100 ug / ml d' ampicilline. Incuber pendant une nuit à 37 ° C, rotation (180rpm). Mesurer la 600 OD de la culture du jour au lendemain. Diluer les cellules bactériennes à une DO 600 de 0,2 dans 50 ml de milieu frais sélectif. Continuer à incuber les cellules à 37 ° C, en rotation, pour obtenir 5 x 10 10 cellules bactériennes 14.
      NOTE: Après une nuit d'incubation, des cellules en culture peuvent être en phase de croissance logarithmique ou stationnaire. souches cellulaires croissance très lente peuvent nécessiter des temps d'incubation plus d'une nuit, ou l'inoculation d'un plus grand nombre de cellules, comme déterminé de manière empirique.
  2. Pour tous les types de cellules, le transfert du milieu de culture contenant les cellules à 50 ml tube en polypropylene et centrifuger pendant 3 min à 1500 x g.
  3. Retirer le surnageant et remettre en suspension le culot de tous les types de cellules dans 1 ml du milieu de culture cellulaire pertinente.
  4. Centrifugeuse de tous les types de cellules dans un tube de microcentrifugation pendant 1 min à 3900 x g. supprimer complètement le surnageant.
  5. Gardez les cellules sur la glace.

Remarque: Manipulez l'azote liquide avec soin. Utiliser un équipement de protection individuelle, y compris cryogloves et googles. Le propane est potentiellement explosif, effectuer la liquéfaction dans une pièce bien ventilée ou sous une hotte. Pas de flammes nues sont autorisées.

  1. Mettre environ 150 ml d'azote liquide dans un plateau en polystyrène. Placer une tasse en laiton (hauteur 3,6 cm, diamètre 2 cm et d'épaisseur 1,5 mm) dans de l'azote liquide à congeler. Ne laissez pas l'azote liquide pénètre dans la coupe en laiton.
  2. Attendez jusqu'à ce que les bulles disparaissent pour être sûr que la coupe en laiton est gelé.
  3. Mettre le tuyau relié à la bouteille de propane en contact avec la paroi de la coupelle en laiton.
  4. ouvrir doucement le robinet de la bouteille de propane.
    NOTE: A ce stade, le propane liquéfie dans la coupe en laiton.
  5. Arrêter la liquéfaction par la fermeture du robinet de la bouteille de propane et de retirer rapidement le tuyau de gaz.
  6. Remplissez le bac en polystyrène avec ni liquideTrogène jusqu'à 5 mm du haut de la cuvette en laiton. Ne laissez pas l'azote liquide pénétrer dans une tasse en laiton.

5. Congélation par immersion de l'échantillon

  1. Mettez environ 200 ml d'azote liquide dans un bac en polystyrène. Congéler de petites cuvettes en laiton (hauteur 1,5 cm de diamètre 2,5 cm et épaisseur 1 mm) en les mettant dans de l'azote liquide. Mettez une tasse pour un échantillon de cellule de suspension. Veillez à ne pas mélanger les échantillons. À cette fin, mettre l'échantillon 1 dans la tasse 1, l'échantillon 2 en tasse 2, etc.
  2. Geler les pinces en plongeant leur pointe dans de l'azote liquide.
  3. Plongez une aiguille disséquante à double bord dans la pastille obtenue en 3.5.
  4. À l'aide de pincettes, prenez une grille de microscopie de cuivre de 400 mesh recouverte de formvar préparée dans la section 1.
  5. À l'aide de l'aiguille de dissection, placer une goutte de pastille obtenue en 3.5 sur la grille. Essayez différentes tailles de gouttes ( p. Ex. 2, 5 et 10 μL).
  6. Plongez très rapidement la grille retenue par la pincette dans le gène du propane liquideclassé à l'article 4 et mélanger la grille avec un mouvement circulaire pendant quelques secondes.
  7. transférer rapidement la grille gelée avec la pince à épiler à la petite tasse en laiton gelé dans la section 5.1.
    NOTE: Pour chaque échantillon, faire au moins 3 grilles. geler toujours la pince à épiler avant de prendre une grille de cuivre.

6. Gel de substitution

NOTE: Le tétroxyde d'osmium est potentiellement volatile, de sorte que l'utilisation d'un respirateur à adduction d'air avec des cartouches de vapeur. Gel de l'fixatif dans l'azote liquide avant la congélation d'eau froide est également une solution.

  1. Pour les études de ultrastructure, ouvrez les 1,8 mL tubes contenant du milieu cryovial gel de substitution préparé dans la section 2.1. Pour les études immunolocalisation, ouvrez les 1,8 mL tubes contenant du milieu cryovial gel de substitution préparé à la section 2.2. Placez le bouchon sur les cryoampoules.
  2. Congeler les pinces à épiler en plongeant leur pointe dans l'azote liquide.
  3. retirer rapidement le bouchon et transférer les grilles congelés iNTO les cryoampoules utilisant la pince à épiler.
  4. Mettre le bouchon sur les cryoampoules.
  5. Répéter l'opération pour chaque grille de chaque échantillon.
  6. Fermer tous les bouchons et remuer les cryotubes avec un mouvement circulaire de la main pour que les échantillons se trouvent dans le milieu de congélation-substitution.
  7. Placer les tubes cryogéniques dans une boîte étanche à l'air pendant 3 jours dans un congélateur -84 ° C au cours du processus de congélation-substitution.

7. Le réchauffement de l'échantillon

  1. Études de ultrastructure
    1. Transporter les cryotubes dans un plateau en polystyrène (pour éviter une augmentation soudaine de la température) dans un congélateur -30 ° C. Placez-les dans le congélateur -30 ° C pendant 1 h.
    2. Placer les cryotubes dans un congélateur -15 ° C pendant 2 h. Placer les échantillons à 4 ° C pendant 2 h et ensuite pendant 30 min à température ambiante.
    3. Retirer le moyen de substitution de congélation avec une pipette de transfert en plastique. Ajouter environ 500 pi de 100% d'acétone.
    4. Incorporer 1,8 ml cryovialavec un mouvement circulaire de la main et verser rapidement de l'acétone (1,5 ml) contenant les grilles dans un flacon en verre (hauteur de 3 cm et un diamètre de 2 cm).
    5. Rincer la même cryovial avec 1 ml de 100% d'acétone pour être sûr d'avoir transféré toutes les grilles. On agite le cryotube avec un mouvement circulaire de la main et verser le contenu du cryotube dans un flacon en verre.
    6. Rincer chaque flacon en verre avec 3 ml d'acétone à 100% 3 fois pendant 10 min.
    7. Suivez les procédures d'incorporation et d' inclusion comme décrit en référence 15. Imprégner l'échantillon avec des concentrations croissantes de résine époxyde dans de l'acétone (25%, 50% et 75%) et incorporer l'échantillon avec une résine époxy de 100% dans des capsules de gélatine.
  2. Des études immunomarquage
    1. Transporter les 1,8 ml cryotubes dans un plateau en polystyrène (pour éviter une augmentation soudaine de la température) à -30 ° C au congélateur.
    2. Placer les tubes cryogéniques pendant 2 h dans un congélateur -30 ° C.
    3. Dans un -30 ° C congélateur, agiter le cryotube avec un mouvement circulaire de la main et verser rapidement le moyen de substitution de gel dans un flacon en polypropylene (hauteur 5 cm et diamètre 1,5 cm).
    4. Remplacer le moyen de substitution de gel avec 2 ml de milieu de congélation-substitution frais.
    5. Placer le flacon de polypropylene pendant 2 h dans un congélateur -30 ° C.
    6. Rincer le flacon de polypropylene pendant 1 h avec 2 ml d'acétone à 100% et trois fois pendant 1 heure avec 2 ml d'éthanol à 100%.
    7. Suivez les procédures d'incorporation et d' inclusion comme décrit en référence 15. Imprégner l'échantillon avec des concentrations croissantes de résine acrylique (25%, 50% et 75% dans de l'acétone) et incorporer l'échantillon avec de la résine 100% acrylique dans des capsules de gélatine.

8. Visualisation des échantillons

  1. Après enrobage, faire 80 nm sections ultra-minces des échantillons avec un ultramicrotome. Contraste sections avec 2% de citrate de plomb à la température ambiante pendant 1 minass = "xref"> 15.
  2. Utilisation d' un microscope électronique à 80 kV ou 120 kV pour observer les articles 15.

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Representative Results

Dans cet article, un outil facile à utiliser et la méthode de congélation chute à faible coût pour ultrastructurales (figures 1 et figure 2) et immunomarquage (figure 3) les études sont présentées. Nous démontrons qu'il est pas nécessaire d'avoir un équipement spécial pour la procédure de gel de substitution et que la procédure de réchauffement prend moins de 6 h au lieu des 24 h en utilisant un système dédié.

PF / méthode de congélation-substitution conduit à l'amélioration de la préservation des structures intracellulaires de Saccharomyces cerevisiae (figure 1A et 1D-H), Schizosaccharomyces pombe (Figure 1B et C), flagelle Leishmania (Figure 2 A et B), Trypanosoma brucei (Figure 2 C et D), et Escherichia coli (Figure 2E). Les structures ne sont pas rétrécis et le cytoplasme apparaît dense. De plus, les membranes sont lisses, ce qui est une preuve de bonne conservation. Tous les organelles, comme noyau (figure 1A, B et D Figure 2A - D), les mitochondries (figure 1A à C, E et H), et vacuoles (figure 1A, C, F et H), peuvent être parfaitement identifiés . Dans le noyau, une double membrane formant enveloppe nucléaire, pore nucléaire, corps polaires des fuseaux, et des ribosomes attachés sur la membrane externe de l'enveloppe nucléaire sont nettement visibles (Figure 1D et la figure 2B, 2D). Dans les mitochondries, les invaginations de la membrane interne, appelée cristae (figure 1E), sont clairement visibles. Les vacuoles sont des organites critiques parce que les grands cristaux de glace peuvent se développer facilement à l'intérieur. Comme cela est illustré sur la figure 1, les vacuoles sont parfaitement conservés sans dommage des cristaux de glace (Figure 1A, C, F et H). Enfin, comme l'ultrastructure est bien conservé, les différents événements biologiques peuvent être observées et analysées, comme autophagie (Figure 1C, F et H), de la morphologie des mitochondries (figure 1E), des vésicules sécrétoires (Figure 1G), et la division nucléaire (Figure 1A , la figure 2 B, unnd 2C).

Localisation in situ des protéines avec des anticorps spécifiques est l'une des techniques les plus puissantes et les plus populaires en biologie cellulaire. PF peut également être utilisé comme méthode pour effectuer immunolocalisation des protéines. Cette procédure préserve l 'antigénicité de protéines et, comme mentionné ci-dessus, l'identité organite. Différents anticorps ciblant différentes protéines de levure, tels que les anti-ATP synthase 7, 15 (Figure 3A, 3C et 3D), anti-GFP (figure 3B), anti-porine 16 (figure 3 E), et anti-FOX2 17 (Figure 3F), ont déjà été testés. Il est également possible d'effectuer ces expériences sur les différents organismes, tels que Leishmania 12.


Figure 1: les images TEM d'études ultrastructurales des levures Saccharomyces cerevisiae et Schizosaccharomyces pombe. (A) Vue d'ensemble de S. cerevisiae. (B) Vue d' ensemble de S. pombe. (C) Une partie de S. pombe cytoplasme. (D) fort grossissement d'un noyau. (E) Détail d'une mitochondrie avec cristae clairement visible. (F) au cours de la morphologie Vacuolar autophagie. (G) des bourgeons de la levure avec des vésicules de sécrétion de l' intérieur. (H) Exemple de contacts intimes entre vacuoles et des mitochondries pendant le processus d'autophagie. N, le noyau; V, vacuole; m, mitochondrie; SV, la sécrétion vesi; cules r, ribosomes. Les barres d'échelle = 200 nm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2: les images TEM des études ultrastructurales de amazonesis Leishmania, Trypanosoma brucei et E. coli. (A) Vue d'ensemble de Leishmania. (B) Détail du cytoplasme Leishmania avec pore nucléaire et réticulum endoplasmique. (C) Vue d' ensemble de T. brucei. (D) grossissement élevé du noyau T. brucei. (E) Vue d'ensemble de cellule de E. coli. N: noyau; V, vacuole; m, mitochondrion; NP, pore nucléaire; F, flagelle; FP, poche flagellaire; K, kinetoplaste; r, ribosomes. Les barres d'échelle = 200 nm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

figure 3
Figure 3: exemples de marquage de la protéine en utilisant un anticorps monoclonal et polyclonal. (A) Vue d'ensemble de S. cerevisiae. (B) L' immunomarquage de l' amyloïde-β avec des anticorps anti-GFP. (CD) Exemple de marquage des mitochondries avec des anticorps anti-synthase ATP. (E) la localisation Porin dans la membrane externe d'une mitochondrie. (F) une protéine Fox2 est détectée dans la mitochondrie par immunomarquage. (G) La localisation de Ld dans Flabarinune coupe longitudinale d'un flagelle de amazonesis Leishmania. Tous les anticorps sont détectés en utilisant 10 nm anticorps polyclonaux or. N, le noyau; V, vacuole; m, mitochondrie. Les barres d'échelle = 200 nm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

TEM est une méthode puissante pour l'observation ultrastructurale des organelles, des cellules et des tissus. Cryofixation / gel de substitution est actuellement la meilleure méthode pour la préservation des deux ultrastructure et de protéines antigénicité. Fixateurs chimiques pénètrent et agissent très lentement , permettant ainsi réarrangements structuraux avant la stabilisation complète de l'ultrastructure 2. A l' inverse, cryofixation / gel substitution stabilisent instantanément des structures cellulaires 4. Cependant, les techniques cryofixation / gel de substitution comprennent un certain nombre de contraintes et difficultés limitant ainsi leur champ d'application. Cela concerne l'échantillon, les artefacts congélation, la réalisation de la technique, le coût et l'équipement. La technique de congélation / gel de substitution à haute pression a permis un degré élevé de conservation des détails cellulaires 6, 7. En revanche, PF est déjà utilisé pour obsERVING petits objets suspendus sur des films minces de glace amorphe 9. Ici, la méthode PF / gel de substitution pour les études ultrastructurales et immunomarquage fournit des images de haute qualité des levures, des parasites et des bactéries ultrastructure comparables à figer les images à haute pression.

La qualité de fixation dépend des taux de refroidissement 18. A taux de refroidissement, l'eau est à l'état vitreux et ne montre pas la structure cristalline visible au niveau de la microscopie électronique. La vitrification se produit uniquement dans une couche superficielle très mince (200 um en général) et, par conséquent, un bon point de congélation de l' épaisseur diminue progressivement à partir de la surface de l'échantillon vers les couches internes 4. Dans les cellules végétales, un revêtement cireux ou des espaces remplis de gaz peuvent ralentir les vitesses de refroidissement. Avec PF, de façon surprenante, aucune diminution de la qualité de la performance gel a été observée. Dans toutes les expériences, le pourcentage de cellules congelées bien est g rand de 50%. Ce pourcentage varie entre 50% à plus de 90% et dépend de divers paramètres (milieu de culture, l'état physiologique des cellules, de la température extérieure, et le niveau d'humidité). Comme indiqué plus haut, la formation de cristaux de glace détruit la structure cellulaire et les cristaux de glace sont particulièrement visibles dans les vacuoles. Dans le processus de substitution PF / gel, une attention particulière doit être portée à la température de congélation. L'étape de substitution de gel ne doit pas être effectuée au-dessus de -82 ° C, sinon, l'eau vitreuse sera transformée en eau cristalline. Pour éviter la formation de dommages de cristaux de glace, cryoprotecteur est actuellement utilisé, mais qui conduit à des altérations de l'ultrastructure des cellules 19. Levures, des bactéries et des milieux de culture de parasite peut contenir un composant qui est un agent cryoprotecteur. Dans ce contexte, il a été décidé de ne pas utiliser cryoprotecteur supplémentaire afin d'être aussi proche que possible de l'état cellulaire réel.

ve_content "> Le succès de substitution PF / gel dépend de plusieurs étapes critiques pendant la phase de développement de la méthode. Tout d'abord, un point critique est d'obtenir la consistance appropriée des granulés. Le culot obtenu après centrifugation doit être suffisamment compact pour être roulé sur une grille de microscopie électronique. Si la pastille est trop compacte, la solution gel de substitution ne peut pas pénétrer dans la goutte, et l'ultrastructure ne sera pas bien préservé. a l'inverse, si la pastille n'est pas assez compact, le milieu de culture restant peut se développer cristaux de glace et nuisent à l'ultrastructure de la cellule. pour obtenir la consistance appropriée des granulés à partir des différents types de cellules, il est nécessaire de respecter les conditions de culture pour obtenir le nombre indiqué de cellules et des paramètres de centrifugation indiqués dans le protocole (voir ci-dessus) pour l'ensemble types de cellules. Cependant, la quantité de matériel mis sur la grille de cuivre n'est pas critique. les différentes tailles de gouttelettes peuvent être testées. en second lieu, le type de grille that est utilisé comme un support est important. Plusieurs or, nickel, cuivre et grilles avec différentes tailles de mailles ont été testées. Les meilleurs résultats ont été obtenus avec une grille de cuivre de 400 mesh avec des barres minces. En troisième lieu, en ce qui concerne l'étape de congélation, une tasse en laiton est préféré pour liquéfier le propane. propane liquide dans la tasse de cuivre a tendance à geler et donc complique l'expérience. Enfin, le manipulateur doit travailler rapidement et dans des conditions de froid pour éviter l'échantillon accidentelle warm-up. Si cela se produit, l'échantillon doit être mis au rebut. Par exemple, pour empêcher le réchauffement de l'échantillon, la pince à épiler doivent être pré-refroidies avant de les utiliser et le moyen de substitution de gel doivent être bien préparés à l'avance avant la procédure. pincettes réfrigérées doivent également être utilisés au cours du processus de congélation d'eau froide becauseif le gel profond est réalisée sans geler la pince à épiler, beaucoup de formes de fumée comme la pince à épiler sont plongées dans le propane (en raison de la chaleur / froid échange). Cette situation a inévitablement un impact sur les taux de refroidissement. Tests avec samples congelés avec des pincettes dégelés ne semblent pas être correctement gelé.

De plus, l' utilisation de produits chimiques dangereux , tels que O S O 4 et de l' acétate d'uranyle dans le milieu de congélation-substitution nécessite, lors de la préparation de solutions et de gel-substitution processus, de travailler sous la hotte avec EPI adéquat. Pour éviter la fuite de OsO 4 et l' inhalation de vapeurs, les tubes cryogéniques doivent avoir un fort joint torique pour assurer que les tubes restent fermés pendant le processus de congélation-substitution. Afin d' éviter une exposition inutile à la vapeur d'osmium pendant la préparation du milieu de congélation-substitution, l'ampoule OsO 4 peut être décomposé dans un flacon en verre. La présence de fragments de verre dans le bloc de résine après inclusion peut être évité en utilisant des pipettes de transfert à pointe fine lors de rinçages des acétones et les étapes de l'incorporation. Exécution de l'étape d'inclusion dans une boucle binoculaire et la réalisation des sections semi-minces permet également de vérifier que il n'y a pas de tessons de verre.Lorsque les expériences ne peuvent pas être réalisées sous une hotte d'aspiration (en particulier dans la première étape du processus de substitution de gel), utiliser un respirateur à adduction d'air avec des cartouches de vapeur. Le manipulateur doit également être prudent lorsque vous travaillez dans des conditions de froid avec de l'azote liquide ou au cours des étapes de congélation. L'utilisation des gants et des lunettes sont recommandés. En outre, le propane est potentiellement explosif, la liquéfaction doit être effectué dans une pièce bien ventilée ou sous une hotte et pas de flammes nues sont autorisés.

Plusieurs articles ont montré que, sur une grande variété d'échantillons tels que les tissus du cerveau, la feuille de lierre, ou des conseils de racine de A. thaliana et N. benthamiana, la préservation de l'ultrastructure est améliorée avec la technique HPF par rapport à la fixation chimique 20, 21. Avec PF, les expériences ont été réalisées sur des cellules en suspension. Par conséquent, il n'y a pas d'indication du succès de cette technique sur larger spécimens comme les tissus. D'autres expériences doivent être menées pour répondre à ce point. Cependant, la méthode a été testée avec succès avec champignon filamenteux qui est anserina Podospora pas des cellules isolées , mais est plutôt la forme de 22 mycelium.

La méthode présentée dans cet article représente une amélioration significative par rapport aux méthodes actuelles de fixation chimique ou HPF. Par exemple, PF ne nécessite pas de matériel coûteux ou consommables contrairement à HPF 23. Il faut aussi prendre parce que la technique HPF utilise une grande quantité d'azote liquide (environ 80 litres par expérience). Avec la technique proposée, un avantage majeur est qu'aucun équipement important est nécessaire 23. Ainsi, le coût d'une expérience est beaucoup plus faible (environ cent fois moins cher). Un autre avantage est que aucune expertise particulière est nécessaire parce que la technique est facile à utiliser. De plus, le traitement des échantillons of PF / congélation-substitution est beaucoup plus courte que HPF / congélation-substitution en raison du processus de réchauffement qui prend moins de 6 heures au lieu de 24 h 24. Il n'est pas plus de temps que la fixation chimique classique. L'avantage est que le ultrastructure cellulaire est parfaitement conservée avec des objets minimum et est beaucoup plus proche de l'état d'origine des cellules. L'application de cette technologie sera certainement utile pour étudier les différents événements biologiques rapides ou de localiser des protéines à haute résolution pour les cellules cultivées en suspension et pour les échantillons d'une épaisseur de quelques micromètres, comme hyphes 22.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun conflit d'intérêts.

Acknowledgements

Nous exprimons notre gratitude à M. Bouchecareilh, E. Tétaud, S. Duvezin-Caubet, et A. Devin pour leur aide et leurs commentaires sur le manuscrit. Nous sommes reconnaissants au pôle d'imagerie électronique de Bordeaux Centre d'imagerie où les images ont été prises. Ce travail a été soutenu par le Centre National de la Recherche Scientifique.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Grids Electron Microscopy Sciences T400-Cu
Formvar Electron Microscopy Sciences 15800
Propane N35
Liquid nitrogen
Double edge dissecting needle Electron Microscopy Sciences 72947
Cryovials Electron Microscopy Sciences 61802-02
Osmium tetroxide Electron Microscopy Sciences 19130
Glass vial 8.5 mL Electron Microscopy Sciences 64252
Uranyl acetate Electron Microscopy Sciences 48851
Acetone Sigma 32201
Ethanol 100% Sigma 32221
Glass slides VWR international 631-9439
Tweezers
Acrylic resin Electron Microscopy Sciences 104371
Epoxy resin M Sigma 10951
Epoxy resin M hardener Sigma 10953
Dibutyl phtalate  Sigma 80102
Epoxy resin M accelerateur Sigma 10952
Crystallizer Fischer scientific 08-762-9
Joseph paper VWR international 111-5009
Brass cups do it yourself shop or made by yourself
Saccharomyces cerevisiae
Shizosacharomyces cerevisiae
Trypanosoma brucei
Leishmania amazonensis
Escherichia coli 
Airtight box Fischer scientific 7135-0001 
Air purifying respirator Fischer scientific 3M 7502 
Cartridge for respirator Fischer scientific 3M 6001
Particulate filter Fischer scientific 3M 5N11 

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References

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