Plunge Nedfrysning: Et værktøj for Ultrastrukturelle og immunlokalisering Studier af Suspension Celler i Transmission Electron Microscopy

Published 5/05/2017
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Dette manuskript beskriver en nem at bruge og billig cryofixation fremgangsmåde til visualisering suspensionsceller ved transmissionselektronmikroskopi.

Cite this Article

Copy Citation

Blancard, C., Salin, B. Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (123), e54874, doi:10.3791/54874 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Transmission Electron Microscopy (TEM) er et ekstraordinært redskab til at studere celle ultrastruktur, for at lokalisere proteiner og visualisere makromolekylære komplekser med meget høj opløsning. Men for at komme så tæt som muligt på den naturlige tilstand, er perfekt prøve konservering påkrævet. Konventionel elektronmikroskopi (EM) fiksering med aldehyder, for eksempel, giver ikke god ultrastrukturel konservering. Den langsomme penetration fikseringer inducerer celle reorganisering og tab af forskellige cellekomponenter. Derfor er konventionelle EM fiksering ikke mulighed for en øjeblikkelig stabilisering og konservering af strukturer og antigenicitet. Det bedste valg for behandlingen intracellulære begivenheder er at bruge cryofixation efterfulgt af fryse-substitution fiksering metode, der holder cellerne i deres native tilstand. Højtryks-frysning / fryse-substitution, som bevarer integriteten af ​​cellulær ultrastruktur, er den mest almindeligt anvendte metode, men kræver expensive udstyr. Her er en nem at bruge og billig fryse fiksering metode efterfulgt af fryse-substitution for suspension cellekulturer fremlagt.

Introduction

Prøve forberedelse er afgørende for succes i enhver elektronmikroskopi undersøgelse. Konventionel EM fiksering var den primære metode til fastsættelse væv eller celler til transmissionselektronmikroskopi (TEM) 1. Først aldehyder og osmiumtetroxid anvendes til kemisk fastgøre materialet ved stuetemperatur. Derefter er materialet dehydreret med organiske opløsningsmidler, infiltreret og indlejret i epoxyharpiks. Denne metode er afhængig af dækningsgraden fikseringer i cellen. Følgelig er artefakter og ekstraktion af cellulære indhold observeres sædvanligvis 2.

Cryofixation er klart en bedre alternativ til konservering af cellulære strukturer 3, holde dem intakt. Kan opnås den højeste kvalitet af TEM billeder 4 i tynde harpiksafsnit hjælp af cryofixation / fryse substitution metode. Formålet med denne teknik er at opnå forglasset biological prøver uden iskrystaller dannelse eller indeholder iskrystaller små nok til ikke at beskadige ultrastruktur af cellerne. Højtryks-frysning (HPF) og ultrahurtig cryofixation, som også kaldes springet frysning (PF), er to metoder til cryofix prøver. HPF immobiliserer molekyler i cellen går og undgår skader forårsaget af konventionel EM fiksering. Flere typer af frysemaskiner og automatiske substitutionsreaktioner indretninger er blevet udviklet 5. Indefrysningsforanstaltningerne maskiner og hjælpematerialer (flydende nitrogen, specimen bærere, etc.) er dyre, men de giver mulighed for fremstilling af høj kvalitet elektronmikrografier 6, 7. PF er en teknik, som blev anvendt i begyndelsen af 1950'erne og er beskrevet i litteraturen som enkel og billig 8 .Under PF fremgangsmåde udføres den forbehandlede prøve frosset ved en hurtig hastighed til opnåelse af iskrystaller på mindre end 3 og 5 nm. Til dette formål er prøvenkastet ud i en flydende kryogen, såsom ethan, propan, eller en ethan-propan-blanding. Siden 1950'erne har forbedringer af PF blevet gjort for at gøre denne teknik til rådighed for et større antal brugere. Højtryks-frysning er i øjeblikket den eneste måde, hvorpå at fryse en lang række prøver tykkere end 50 um (op til en tykkelse på 200 um for skiveformede prøver) 5, mens PF vidt omfang anvendes til at afbilde små genstande (<100 nm ), såsom makromolekylære komplekser suspenderet i en tynd film af amorf is 9. Større prøver, fx eukaryote celler, kan cryofixed af PF, men kræver prøveholder, såsom kapillær kobberrør eller sandwichsystemer 8, 10, 11.

Her, en hurtig, nem at bruge og billig springet frysning / fryse-substitution teknologi kan anvendes til forskellige suspension cellekulturer præsenteres.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling af Formvar Grid Film

BEMÆRK: Udfør chloroform manipulation under en emhætte bruger personlige værnemidler (handsker, kittel, briller). Anvende 400 mesh elektronmikroskopi kobbergitre. Med andre grid typer (andre maskestørrelser, guld og nikkel gitre), kvaliteten af ​​frysning er værre.

  1. Fremstilling af en 100 ml opløsning af 0,3% formvar i chloroform. Lade den blive opløst natten over uden omrøring.
  2. Sætte 400 mesh (antal huller per kvadrattomme) elektron microscopycopper gitre (diameter 3,05 mm) i en glasbeholder (højde 3 cm og en diameter på 2 cm) indeholdende acetone. Omrør hætteglas med en cirkulær bevægelse af hånden. Fjerne acetone med en plastikoverførselspipette. Lader opløsningsmidlerne fordampe i 5 min. Overfør gitrene ved at hælde dem på et filterpapir og lad dem tørre i 5 minutter.
  3. Polere en 76 x 26 mm 2 objektglas ved at tørre den med en fnugfri klud, indtil skinnende / glatte.
  4. Læs krystallisator (diameter 15 cm, højde: 7 cm og kapacitet 1200 ml) og fyld den til randen med destilleret vand. Rengør vandoverfladen ved at passere en glas bar over overfladen to gange for at fjerne støv.
  5. Hold objektglasset mellem to fingre og dyppe den i den formvar løsning i et par sekunder. Hold den oprejst for at tørre under en omvendt bæger i 5 min.
  6. Når filmen er tør, score kanterne af objektglasset med en skarp barberblad til at definere grænserne for filmen, der skal fjernes fra slæden.
  7. Tag en dyb indånding og udånder kraftigt på dias for at få et lag af vanddamp på og under filmen at gøre filmen svagt uigennemsigtig og øge sin synlighed.
    1. flyde straks filmen på krystallisatoren vandoverfladen ved at røre bunden af ​​objektglasset med en vinkel på ca. 30 °. Lad filmen frigivelse fra slæden og flå det på krystallisatoren vandoverfladen. Træk forsigtigt filmen ud medpincet, hvis det er nødvendigt.
  8. Læg forsigtigt gitrene forsiden nedad på filmen flyder på vandoverfladen i de regioner, der er i den korrekte tykkelse (ca. 10 nm) og uden rynker.
  9. Afhente filmen ved at dække gitrene med Joseph papir som de flyder på krystallisatoren vandoverfladen.
    1. Holding Joseph papir med den ene hånd, skal du trykke den ene ende af Joseph papir til den ene ende af filmen. Vent til Joseph papiret er helt våd. Fjern Joseph papir med gitrene sidder fast på.
  10. Placere ristene i 24 timer i en overdækket petriskål til endelig tørring og opbevaring før anvendelse ved stuetemperatur.

2. Fremstilling af Freeze-substitution Medium

BEMÆRK: Osmiumtetroxid (OsO4) og uranylacetat er farlige kemikalier. Håndter dem i stinkskabet mens iført egnede personlige værnemidler (PPE), herunder en kittel og handsker. Follow sikkerhedsadvarslerne til håndtering (OSO4) og uranylacetat. Brug O-ring kryoglas for at undgå udsivning af OsO4.

  1. ultrastrukturelle undersøgelser
    1. Sætte glas OSO4 ampul i en glaskolbe.
    2. Bryde ampullen ved rystes.
    3. Tilsæt en passende mængde acetone 100% til opnåelse af en 4% slutkoncentration.
    4. Omrør og dispensere 1,5 ml alikvoter i 1,8 ml kryoglas.
  2. Protein immunolabeling
    1. Placere 0,05 g uranylacetat i en glaskolbe.
    2. Der tilsættes 50 ml 100% acetone.
    3. Opløsningen omrøres med en magnetomrører. Når opløsningen bliver klar, filtrere det under anvendelse af et 0,2 um filter.
    4. Dispensere 1,5 ml portioner på 1,8 ml kryoglas.
      BEMÆRK: Forbered kryoglas indeholdende fryse-substitution medium før springet nedfrysningsprocessen og holde dem i -84 ° C fryser. Vend glaskolbe at smideOsO4 ampul i det farlige affald.

3. Fremstilling af celler

BEMÆRK: Dette trin er afgørende for succes af metoden. For alle celletyper, dyrke celler for at opnå det angivne antal celler. Centrifuge i den angivne rør på det angivne tidspunkt og hastighed.

  1. At opnå den relevante konsistens af pellets fra forskellige celletyper, vokser celler som følger:
    1. For Saccharomyces cerevisiae og Schizosaccharomyces pombe, pode gær i 5 ml minimal eller fuldstændig flydende medium. Inkuber natten over ved 28 ° C, roterende (180 rpm). Måle den optiske densitet ved 600 nm (OD600) af overnatskulturen. Fortynd gærceller til en OD 600 på 0,2 i 50 ml friskt selektivt medium. Fortsæt med at inkubere celler ved 28 ° C, roterende, til opnåelse af 1 x 10 9 gærceller 7.
    2. For Leishmania flagel, inoculate parasitter i 5 ml AM-medium med 7,5% FCS (føtalt kalveserum). Inkuber natten over ved 24 ° C, roterende (180 rpm). Måle OD600 af overnatskulturen. Fortynd parasit celler til en OD 600 på 0,2 i 50 ml friskt selektivt medium. Fortsæt med at inkubere celler ved 24 ° C, roterende, til opnåelse af 5 x 10 8 parasit celler 12.
    3. For Trypanosoma brucei, pode parasitter i 5 ml SDM-79-medium med 10% FCS og 30 ug / ml hygromycin. Inkuber natten over ved 27 ° C, roterende (180 rpm). Måle OD600 af overnatskulturen. Fortynd parasit celler til en OD 600 på 0,2 i 50 ml friskt selektivt medium. Fortsæt med at inkubere celler ved 27 ° C, roterende, til opnåelse af 5 x 10 8 parasit celler 13.
    4. For Escherichia coli, pode bakterier i 5 ml DYT medium med 100 pg / ml ampicillin. Inkuber natten over ved 37 ° C, roterende (180rpm). Måle OD600 af overnatskulturen. Fortynd bakterieceller til en OD 600 på 0,2 i 50 ml friskt selektivt medium. Fortsæt med at inkubere celler ved 37 ° C, roterende, til opnåelse af 5 x 10 10 bakterieceller 14.
      BEMÆRK: Efter inkubation natten over, kan celler i kultur være i enten logaritmisk eller stationær vækstfase. Meget langsomtvoksende cellestammer kan kræve inkubationstider længere end en nat, eller podning af et større antal celler, som bestemt empirisk.
  2. For alle celletyper, overføre dyrkningsmediet indeholdende cellerne til 50 ml polypropylenrør og centrifugeres i 3 minutter ved 1.500 x g.
  3. Fjern supernatanten og resuspender pellet af alle celletyper i 1 ml af den pågældende celledyrkningsmediet.
  4. Centrifuge alle celletyper i et mikrocentrifugerør i 1 min ved 3.900 x g. Helt at fjerne supernatanten.
  5. Hold cellerne på is.

Bemærk: Håndtag flydende nitrogen med omhu. Brug personligt beskyttelsesudstyr, herunder cryogloves og motorbriller. Propan er potentielt eksplosivt, så udføre flydendegørelse i et godt ventileret rum eller under en emhætte. Ingen åben ild er tilladt.

  1. Sætte omkring 150 ml flydende nitrogen i en polystyrenbakke. Placer en messing bæger (højde 3,6 cm, diameter 2 cm og tykkelse 1,5 mm) i flydende nitrogen til at fryse det. Lad ikke den flydende nitrogen trænge ind i messing kop.
  2. Vent boblerne stilne at være sikker på, at messing kop er frosset.
  3. Sætte slangen forbundet med propan cylinder i kontakt med messing cup væg.
  4. åbne forsigtigt propan cylinderventilen.
    BEMÆRK: På dette trin propan fortætter i messing kop.
  5. Stoppe flydendegørelse ved at lukke propan cylinderventilen og hurtigt fjernes gasslangen.
  6. Hans position polystyrenbakke med flydende niTrogen op til 5 mm fra toppen af ​​messing kop. Lad ikke den flydende nitrogen trænge ind messing kop.

5. Plunge Nedfrysning af prøven

  1. Sætte ca. 200 ml flydende nitrogen i polystyrenbakke. Frys små messing kopper (højde 1,5 cm diameter 2,5 cm og tykkelse 1 mm) ved at sætte dem i flydende nitrogen. Put en kop til en suspension celleprøve. Pas på ikke at blande prøver. Med henblik herpå sætte prøve 1 i koppen 1, prøve 2 i bæger 2 osv.
  2. Frys pincetten ved at dyppe deres spids i flydende nitrogen.
  3. Kaste en dobbelt kant dissekere nål i pelleten opnået i 3,5.
  4. Med en pincet, læs 400 mesh kobber mikroskopi gitter belagt med formvar fremstillet i afsnit 1.
  5. Ved hjælp af dissekering nål en dråbe af pelleten opnået i 3.5 på gitteret. Prøv forskellige dråbe størrelser (fx 2, 5 og 10 pi).
  6. Meget hurtigt styrte gitteret holdes af pincet i flydende propan genvurderet i afsnit 4 og omrør nettet med cirkulær bevægelse i et par sekunder.
  7. Hurtigt overføre den frosne gitter med en pincet til den lille messing kop frosset i afsnit 5.1.
    BEMÆRK: For hver prøve skal mindst 3 net. fryse altid pincet, før du tager en kobber gitter.

6. Freeze-substitution

BEMÆRK: Osmiumtetroxid er potentielt flygtig, så bruge et åndedrætsværn med damp patroner. Frysning af fiksativ i flydende nitrogen før springet frysning er også en løsning.

  1. For ultrastruktur undersøgelser, åbne 1,8 ml kryohætteglas rør indeholdende fryse-substitution medium fremstillet i afsnit 2.1. Til immunlokalisering undersøgelser, åbne 1,8 ml kryohætteglas rør indeholdende fryse-substitution medium fremstillet i afsnit 2.2. Placer låget på kryoglas.
  2. Frys pincetten ved at dyppe deres spids i flydende nitrogen.
  3. Hurtigt fjerne hætten og overføre de frosne gitre jegnto de kryohætteglas ved hjælp af en pincet.
  4. Sæt penhætten på kryoglas.
  5. Gentage operationen for hver gitter af hver prøve.
  6. Luk alle hætterne og røre kryoglas med en cirkulær bevægelse af hånden for at sikre prøverne er i fryse-substitution medium.
  7. Placere kryoglas i en lufttæt boks i 3 dage i en -84 ° C fryser under fryse-substitution proces.

7. Prøve Warming

  1. ultrastruktur studier
    1. Bære de kryoglas i en polystyrenbakke (for at undgå en pludselig stigning i temperatur) til en -30 ° C fryser. Anbring dem i -30 ° C fryser i 1 time.
    2. Placer kryoglas i en -15 ° C fryser i 2 timer. Placere prøverne ved 4 ° C i 2 timer og derefter i 30 minutter ved stuetemperatur.
    3. Fjern fryse substitution medium med en plastikoverførselspipette. Der tilsættes ca. 500 pi af 100% acetone.
    4. Omrør 1,8 ml kryohætteglasmed en cirkulær bevægelse af hånden og hurtigt hæld acetone (1,5 ml) indeholdende nettene i en glasbeholder (højde 3 cm og en diameter på 2 cm).
    5. Skyl samme kryoglas med 1 ml 100% acetone for at være sikker på at have overført alle nettene. Omrør cryovialet med en cirkulær bevægelse af hånden og hæld indholdet af cryovialet i et hætteglas.
    6. Skyl hvert hætteglas glas med 3 ml 100% acetone 3 gange i 10 min.
    7. Følg indlejring og inklusionslegemerne procedurer som beskrevet i reference 15. Imprægnere prøven med stigende koncentrationer af epoxyharpiks i acetone (25%, 50% og 75%) og integrere prøven med 100% epoxyharpiks i gelatinekapsler.
  2. immunolabeling undersøgelser
    1. Bære de 1,8 ml kryoglas i en polystyrenbakke (for at undgå en pludselig stigning i temperatur) til -30 ° C fryser.
    2. Placer kryoglas i 2 timer i en -30 ° C fryser.
    3. I et -30 ° C fryser, omrør cryovialet med en cirkulær bevægelse af hånden og hurtigt hæld fryse substitution medium i en polypropylenhætteglas (højde 5 cm og diameter 1,5 cm).
    4. Erstatte fryse substitution medium med 2 ml frisk fryse-substitution medium.
    5. Placer hætteglasset polypropylen i 2 timer i en -30 ° C fryser.
    6. Skyl polypropylenhætteglas i 1 time med 2 ml 100% acetone og tre gange i 1 time med 2 ml 100% ethanol.
    7. Følg indlejring og inklusionslegemerne procedurer som beskrevet i reference 15. Imprægnere prøven med stigende koncentrationer af acrylharpiks (25%, 50%, og 75% i acetone) og integrere prøven med 100% acrylharpiks i gelatinekapsler.

8. Visualisering af prøver

  1. Efter indlejring, gør 80 nm ultra-tynde snit af prøverne med en ultramikrotom. Kontrast afsnittene med 2% bly citrat ved stuetemperatur i 1 minutass = "xref"> 15.
  2. Anvende en 80 kV eller 120 kV elektronmikroskop at kapitlerne 15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I denne artikel er en nem at bruge og billig springet frysning fremgangsmåde til ultrastrukturelle (figur 1 og figur 2) og immunmærkning (figur 3) undersøgelser fremlagt. Vi viser, at det ikke er nødvendigt at have særligt udstyr til fryse-substitution proceduren, og at opvarmningen procedure tager mindre end 6 timer i stedet for de 24 timer ved hjælp af et dedikeret system.

PF / fryse-substitutionsmetode resulterede i den forbedrede bevarelse af de intracellulære strukturer af Saccharomyces cerevisiae (figur 1A og 1D-H), Schizosaccharomyces pombe (figur 1B og C), Leishmania flagellum (figur 2 A og B), Trypanosoma brucei ( Figur 2 C og D ) og Escherichia coli ( Figur 2E ). Strukturerne er ikke krympede, og cytoplasmaet forekommer tæt. Desuden er membranerne glatte, hvilket er et bevis på god bevaring. Alle organellerne, såsom kerne ( figur 1A , BD og figur 2A- D ), mitochondrier ( figur 1A -C , E og H ) og vakuoler ( figur 1A , C , F og H ) kan identificeres perfekt . I kernen er en dobbeltmembrandannende nukleær kuvert, nukleær pore, spindelpollegeme og ribosomer, der er fastgjort på den ydre membran af den nukleare kappe, tydeligt synlige ( figur 1D og figur 2B, 2D). I mitokondrierne, de indre membran invaginationer, kaldet cristae (figur 1E), er klart synlige. De vakuoler er kritiske organeller fordi store iskrystaller kan udvikle nemt inde i dem. Som illustreret i figur 1, er vakuoler perfekt bevaret uden iskrystal beskadigelse (figur 1A, C, F og H). Endelig, som ultrastrukturen er velbevaret, forskellige biologiske hændelser kan observeres og analyseres, såsom autofagi (figur 1C, F og H), mitokondrie morfologi (figur 1E), sekretoriske vesikler (figur 1G), og kernedeling (figur 1A figur 2 B, ennd 2C).

In situ lokalisering af proteiner med specifikke antistoffer er en af ​​de mest kraftfulde og populære teknikker i cellebiologi. PF kan også anvendes som en metode til at udføre protein immunlokalisering. Denne procedure bevarer protein antigenicitet og, som nævnt ovenfor, organel identitet. Forskellige antistoffer rettet forskellige gærproteiner, såsom anti-ATP-syntase 7, 15 (figur 3A, 3C og 3D), anti-GFP (figur 3B), anti-porine 16 (figur 3 E), og anti-fox2 17 (figur 3F), er allerede blevet testet. Det er også muligt at udføre disse eksperimenter på forskellige organismer, såsom Leishmania 12.


Figur 1: TEM-billeder af ultrastrukturelle studier af gær Saccharomyces cerevisiae og Schizosaccharomyces pombe. (A) Oversigt over S. cerevisiae. (B) Oversigt over S. pombe. (C) En del af S. pombe cytoplasma. (D) Stor forstørrelse af en kerne. (E) Detalje af en mitokondrie med cristae tydeligt synlige. (F) Vakuolær morfologi under autofagi. (G) Gær knop med sekretionssignaler vesikler inde. (H) Eksempel på intime kontakt mellem vacuoler og mitokondrier under autofagi proces. N, nucleus; V, vacuole; m, mitokondrie; SV, sekretion vesicykler; r, ribosomer. Skalapanelerne = 200 nm. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 2
Figur 2: TEM-billeder af ultrastrukturelle studier af Leishmania amazonesis, Trypanosoma brucei og E. coli. (A) Overblik over Leishmania. (B) Detalje af Leishmania cytoplasma med kerneporen og endoplasmatiske reticulum. (C) Oversigt over T. brucei. (D) Stor forstørrelse af T. brucei kerne. (E) Oversigt over E. coli-celle. N: nucleus; V, vacuole; m, Mitochondrion; NP, kerneporen; F, flagellum; FP, flagellatlomme; K, kinetoplast; r, ribosomer. Skalapanelerne = 200 nm. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 3
Figur 3: Eksempler på proteinmærkning anvendelse af monoklonale og polyklonale antistof. (A) Oversigt over S. cerevisiae. (B) immunmærkning af amyloid-β med anti-GFP-antistoffer. (CD) Eksempel på mitokondrier mærkning med anti-ATP-syntase-antistoffer. (E) Porin lokalisering i ekstern membran af et mitokondrie. (F) Fox2 protein påvises i mitochondriet ved immunolabeling. (G) Lokalisering af Ld Flabarin iEt langsgående snit af et flagellum af Leishmania amazonesis . Alle antistofferne detekteres ved anvendelse af 10 nm guld polyklonale antistoffer. N, kerne; V, vacuole; M, mitochondrion. Skalestænger = 200 nm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

TEM er en kraftfuld metode til ultrastrukturelle observation af organeller, celler og væv. Cryofixation / fryse-substitution er i øjeblikket den bedste metode til konservering af både ultrastruktur og protein antigenicitet. Kemiske fikseringsmidler trænge ind og virke meget langsomt hvorved strukturelle omlejringer før fuldstændig stabilisering af ultrastrukturen 2. Omvendt cryofixation / fryse-substitution øjeblikkeligt stabiliserer cellulære strukturer 4. Dog cryofixation / freeze-substitutionsreaktioner teknikker indbefatter en række begrænsninger og vanskeligheder, hvilket begrænser antallet af anvendelsesområder. Dette vedrører prøve, frysning artefakter, realisering af teknikken, omkostninger og udstyr. Højtryks- frysning / fryse-substitution teknik har muliggjort en høj grad af konservering af cellulære detaljer 6, 7. I modsætning hertil er PF allerede anvendes til obsErving små genstande ophængt på tynde film af amorft is 9. Her, PF / fryse-substitution fremgangsmåde til ultrastrukturelle og immunmærkning undersøgelser tilvejebringer billeder af høj kvalitet af gær, parasitter og bakterielle ultrastruktur sammenlignes med højtryk frysning billeder.

Fiksering kvalitet afhænger af køling satser 18. Ved høje afkølingshastigheder er vand i glaslegemet tilstand og viser ikke synlig krystallinsk struktur på elektronmikroskopi niveau. Forglasningen finder kun sted i et meget tyndt overfladelag (200 um i almindelighed), og derfor vil god tykkelse frysning gradvist falde fra overfladen af prøven til de indre lag 4. I planteceller, kan voksagtig belægning eller rum fyldt med gas bremse afkølingshastigheder. Med PF overraskende blev observeret noget fald i kvaliteten af ​​frysning ydeevne. I alle eksperimenterne, den procentdel af godt frosne celler er g reater end 50%. Denne procentdel varierer mellem 50% til mere end 90% og er afhængig af forskellige parametre (dyrkningsmediet, fysiologiske status af cellerne, udendørs temperatur og fugtighed niveau). Som anført ovenfor, dannelsen af ​​iskrystaller ødelægger cellestruktur og iskrystaller er særligt synlige i vakuoler. I PF / fryse substitution proces, skal man være særlig opmærksom på frysepunktet. Fryse substitutionstrin må ikke udføres over -82 ° C, ellers glaslegemet vand vil blive omdannet til krystallinsk vand. For at undgå dannelsen af iskrystaller overlast, kryobeskyttelsesmiddel gængs, men som fører til ændringer i ultrastrukturen af cellerne 19. Gær, bakterier og parasit dyrkningsmedier kan indeholde en komponent, der er kryobeskyttende middel. I den forbindelse blev det besluttet ikke at bruge ekstra kryoprotektant for at være så tæt som muligt på den faktiske cellulære tilstand.

ve_content "> Succesen med PF / fryse substitution afhænger af mange kritiske trin i udviklingsfasen af ​​metoden. Først et kritisk punkt er at opnå den rette konsistens af pillerne. Den opnåede efter centrifugering pellet skal være kompakt nok til at blive rullet ud på en elektronmikroskopi gitter. Hvis pelleten er for kompakt, kan den fryse-erstatningsvæske ikke trænge dråben, og ultrastrukturen vil ikke blive velbevaret. Omvendt, hvis pelleten er ikke kompakt nok, kan sidesten dyrkningsmedium udvikle iskrystaller og forringe celle ultrastruktur. for at opnå den passende konsistens af pellets fra de forskellige celletyper, er det nødvendigt at overholde de dyrkningsbetingelser at opnå det angivne antal celler og centrifugering parametrene i protokollen (se ovenfor) for alle celletyper. Men mængden af ​​materialet sættes på kobber gitteret er ikke kritisk. Forskellige dråbestørrelser kan testes. for det andet, gitteret typen that bruges som støtte er vigtig. Flere guld, nikkel, og kobbergitre med forskellige maskestørrelser blev testet. De bedste resultater blev opnået med et 400 mesh kobber gitter med tynde stænger. Tredje, med hensyn til frysetrinnet, er en messing kop foretrukket at smelte propan. Flydende propan i kobber kop tendens til at fryse, og derfor komplicerer eksperimentet. Endelig må manipulatoren arbejde hurtigt og under kolde forhold for at undgå utilsigtet prøve opvarmning. Hvis det sker, skal prøven kasseres. For eksempel for at forhindre prøven opvarmning, pincetten skal forafkølet før brug og fryse substitution medium skal forberedes i god tid før proceduren. Kølet pincet skal også anvendes under springet fryseprocessen becauseif springet frysning realiseres uden frysning pincetten, en masse røgudvikling som pincetten er kastet i propan (som følge af varme / kulde udveksling). Dette uundgåeligt har en indvirkning på den afkøling satser. Forsøg med samples frosset med ufrosne pincet synes ikke at være korrekt frosset.

Desuden brugen af farlige kemikalier, såsom O S O 4 og uranylacetat i fryse-substitution medium kræver, under fremstillingen af opløsninger og fryse-substitution proces, at arbejde under stinkskabet med tilstrækkelig PV. At forhindre lækage af OSO4 og indånding af dampe, skal kryoglas har en hård O-ring for at sikre, at rørene forbliver forseglet under fryse-substitution proces. At undgå unødig udsættelse for osmium damp under fremstillingen af fryse-substitution mediet, kan OsO4 ampul brydes i en glaskolbe. Tilstedeværelsen af ​​glasskår i harpiksen blok efter optagelsen kan undgås ved anvendelse af fine-tip overførselspipetter under acetones skylninger og trinnene indlejring. Udførelse af trin inddragelsen under et binokulært løkke og realiseringen af ​​semi-tynde sektioner giver også mulighed for at kontrollere, at der ikke er nogen glasskår.Når der ikke kan udføres forsøgene under en emhætte (navnlig i første trin af fryse substitution processen), bruge en luftrensende respirator med damp patroner. Manipulatoren skal også være forsigtig ved arbejde i kolde omgivelser med flydende nitrogen eller under frysning trin. Brugen af ​​handsker og briller anbefales. Endvidere propan er potentielt eksplosivt, så likvefaktion skal udføres i et godt ventileret rum eller under en emhætte og ikke er åben ild er tilladt.

Flere artikler viste, at en lang række forskellige prøver, såsom hjernevæv, vedbend blad eller rodspidserne A. thaliana og N. benthamiana, er bevarelsen af ultrastrukturen forbedret med HPF teknik i forhold til kemisk fiksering 20, 21. Med PF, udførtes forsøgene på celler i suspension. Derfor er der ingen tegn på succesen af ​​denne teknik på larger prøver lignende væv. Yderligere eksperimenter nødvendigt at udføre undersøgelsen for at løse dette punkt. Imidlertid har fremgangsmåden med succes blevet testet med trådsvamp Podospora anserina der ikke isoleres celler, men er snarere af mycelium formular 22.

Fremgangsmåden præsenteres i denne artikel er en betydelig forbedring i forhold til nuværende fremgangsmåder til kemisk fiksering eller HPF. For eksempel betyder PF ikke kræver dyrt udstyr eller forbrugsvarer i modsætning til HPF 23. Det må desuden tages fordi HPF teknik bruger en stor mængde flydende nitrogen (ca. 80 I pr eksperiment). Med den foreslåede teknik, en stor fordel er, at ingen vigtige udstyr er nødvendig 23. Således er prisen for et eksperiment er meget lavere (ca. én hundrede gange billigere). En anden fordel er, at ingen særlig ekspertise er nødvendig, fordi teknikken er nem at bruge. Desuden prøve behandling of PF / fryse-substitution er meget kortere end HPF / fryse-substitution på grund af opvarmning proces, der tager mindre end 6 timer i stedet for 24 timer 24. Det er ikke mere tidskrævende end de konventionelle kemisk fiksering. Fordelen er, at den cellulære ultrastruktur perfekt bevares med minimale artefakter og er meget tættere på cellernes oprindelige tilstand. Anvendelsen af denne teknologi vil bestemt være til nytte at studere forskellige hurtige biologiske hændelser eller til at lokalisere proteiner ved høj opløsning til celler dyrket i suspension og for prøver af et par mikrometer tykkelse, såsom svampehyfer 22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter.

Acknowledgements

Vi udtrykker vores taknemmelighed til M. Bouchecareilh, E. Tétaud, S. Duvezin-Caubet, og A. Devin for deres hjælp og kommentarer til manuskriptet. Vi er taknemmelige for den elektroniske billedbehandling pol af Bordeaux Imaging Center, hvor billederne blev taget. Dette arbejde blev støttet af Centre National de Recherche Scientifique.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Grids Electron Microscopy Sciences T400-Cu
Formvar Electron Microscopy Sciences 15800
Propane N35
Liquid nitrogen
Double edge dissecting needle Electron Microscopy Sciences 72947
Cryovials Electron Microscopy Sciences 61802-02
Osmium tetroxide Electron Microscopy Sciences 19130
Glass vial 8.5 mL Electron Microscopy Sciences 64252
Uranyl acetate Electron Microscopy Sciences 48851
Acetone Sigma 32201
Ethanol 100% Sigma 32221
Glass slides VWR international 631-9439
Tweezers
Acrylic resin Electron Microscopy Sciences 104371
Epoxy resin M Sigma 10951
Epoxy resin M hardener Sigma 10953
Dibutyl phtalate  Sigma 80102
Epoxy resin M accelerateur Sigma 10952
Crystallizer Fischer scientific 08-762-9
Joseph paper VWR international 111-5009
Brass cups do it yourself shop or made by yourself
Saccharomyces cerevisiae
Shizosacharomyces cerevisiae
Trypanosoma brucei
Leishmania amazonensis
Escherichia coli 
Airtight box Fischer scientific 7135-0001 
Air purifying respirator Fischer scientific 3M 7502 
Cartridge for respirator Fischer scientific 3M 6001
Particulate filter Fischer scientific 3M 5N11 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Palade, G. E., Porter, K. R. Studies on the endoplasmic reticulum. I. Its identification in cells in situ. J Exp Med. 100, (6), 641-656 (1954).
  2. Kellenberger, E., Johansen, R., Maeder, M., Bohrmann, B., Stauffer, E., Villiger, W. Artefacts and morphological changes during chemical fixation. J Microsc. 168, (Pt 2), 181-201 (1992).
  3. Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochem Cell Biol. 130, (5), 877-889 (2008).
  4. McDonald, K. L. Out with the old and in with the new: rapid specimen preparation procedures for electron microscopy of sectioned biological material. Protoplasma. 251, 429-448 (2014).
  5. Studer, D., Graber, W., Al-Amoudi, A., Eggli, P. A new approach for cryofixation by high-pressure freezing. J Microsc. 203, (Pt 3), 285-294 (2001).
  6. Bernales, S., McDonald, K. L., Walter, P. Autophagy counterbalances endoplasmic reticulum expansion during the unfolded protein response. PLoS Biol. 4, (12), 2311-2324 (2006).
  7. Kissová, I., Salin, B., Schaeffer, J., Bhatia, S., Manon, S., Camougrand, N. Selective and non-selective autophagic degradation of mitochondria in yeast. Autophagy. 3, (4), 329-336 (2007).
  8. Gilkey, J. C., Staehling, A. Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure. Microsc Res Tech. 3, (2), 177-210 (1986).
  9. Nogales, E., Scheres, S. H. Cryo-EM: A Unique Tool for the Visualization of Macromolecular Complexity. Mol Cell. 58, (4), 677-689 (2015).
  10. Baba, M. Electron microscopy in yeast. Methods Enzymol. 451, 133-149 (2008).
  11. Leunissen, J. L. M., Yi, H. Self-pressurized rapid freezing (SPRF): a novel cryofixation method for specimen preparation in electron microscopy. J Microsc. 235, (1), 25-35 (2009).
  12. Lefebvre, M., et al. LdFlabarin a new BAR domain membrane protein of Leishmania flagellum. PLoS One. 8, (9), 1-12 (2013).
  13. Tetaud, E., et al. TbFlabarin, a flagellar protein of Trypanosoma brucei, highlights differences between Leishmania and Trypanosoma flagellar-targeting signals. Exp Parasitol. 166, 97-107 (2016).
  14. Wasmer, C., et al. Solid-state NMR spectroscopy reveals that E coli inclusion bodies of HET-s(218-289) are amyloids. Angew Chem Int Ed Engl. 48, (26), 4858-4860 (2009).
  15. Lefebvre-Legendre, L., et al. Failure to assemble the alpha 3 beta 3 subcomplex of the ATP synthase leads to accumulation of the alpha and beta subunits within inclusion bodies and the loss of mitochondrial cristae in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 280, (18), 18386-18389 (2005).
  16. Paumard, P., et al. The ATP synthase is involved in generating mitochondrial cristae morphology. EMBO J. 21, (3), 221-230 (2002).
  17. Gabriel, F., et al. A Fox2-dependent fatty acid ß-oxidation pathway coexists both in peroxisomes and mitochondria of the ascomycete yeast Candida lusitaniae. PLoS One. 9, (12), 1-27 (2014).
  18. Dubochet, J. The physics of rapid cooling and its implications for cryoimmobilization of cells. Methods Cell Biol. 79, 7-21 (2007).
  19. Meryman, H. T. Cryopreservation of living cells: principles and practice. Transfusion. 47, (5), 935-945 (2007).
  20. Vanhecke, D., Graber, W., Studer, D. Close-to-native ultrastructural preservation by high pressure freezing. Methods Cell Biol. 88, 151-164 (2008).
  21. Bobik, K., Dunlap, J. R., Burch-Smith, T. M. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution of plant tissues for transmission electron microscopy. J Vis Exp. (92), e51844 (2014).
  22. Pinan-Lucarré, B., Clavé, C. Monitoring autophagy in the filamentous fungus Podospora anserina. Methods Enzymol. 451, 251-270 (2008).
  23. Follet-Gueye, M. L., Pagny, S., Faye, L., Gomord, V., Driouich, A. An improved chemical fixation method suitable for immunogold localization of green fluorescent protein in the Golgi apparatus of tobacco Bright Yellow (BY-2) cells. J Histochem Cytochem. 51, (7), 931-940 (2003).
  24. Jesus, D. M., Moussatche, N., Condit, R. C. An improved high pressure freezing and freeze substitution method to preserve the labile vaccinia virus nucleocapsid. J Struct Biol. 195, (1), 41-48 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats