大腸-26癌腫瘍を有するがん悪液質の研究のためのモデルとしてマウスを

Cancer Research

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Bonetto, A., Rupert, J. E., Barreto, R., Zimmers, T. A. The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia. J. Vis. Exp. (117), e54893, doi:10.3791/54893 (2016).

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Abstract

Introduction

筋萎縮は、癌、敗血症、肝臓、肝硬変、心臓や腎不全、慢性閉塞性肺疾患、およびAIDSなどの様々な臨床症状の重篤な合併症です。特に、筋消耗、癌1患者の少なくとも50%において明らかです。原因および/またはからの骨格筋タンパク質分解システムの過剰活性化に増加したタンパク質分解からの癌の結果で骨格筋の損失は、タンパク質合成6を減少ました 。脂肪分解は、脂肪組織の枯渇をもたらすも明らかです。臨床的には、悪液質を低減し、品質及び寿命の長さと関連し、20における死亡の原因であると推定されている-癌患者7の30%。できるだけヒトの疾患に似ている実験モデルの使用は有益であろう。最適な動物モデルは、異なる治療法との予測不可能な要因から高い再現性により、同様に制限された干渉によって特徴づけられます通常、臨床状態8に関連付けられている食事、性別、遺伝的背景。新しい方法は、癌の発生に影響を受けやすい遺伝的に改変されたマウスを使用することであるが、これまで、癌性悪液質は、癌細胞または発癌物質の注入の移植によって特徴付けられる動物モデルにおいて主に研究されてきました。

C26癌を有するマウスは、癌性悪液質2,5のよく特徴付けられたと広範囲に使用されるモデルを表す(結腸-26および腺癌と呼ばれます)。主に強化脂肪及びタンパク質異化9を介して身体および筋肉重量損失C26腫瘍結果の成長。一般に、全体重に対して10%の腫瘍重量は、骨格筋重量の20%〜25%の減少および脂肪3,10の高い枯渇と関連しています。肝腫および脾腫も、急性期反応の活性化及びプロinflaの上昇に伴って、腫瘍の成長で観察されていますmmatoryサイトカインレベル3,11。これらの中でも、同様にこのサイトカインはおそらく、悪液質12の唯一の誘導因子ではないにもかかわらず、IL-6は、C26モデルにおいて筋肉消耗を媒介する重要な役割を果たしていることが知られています。上昇したIL-6は、JAK / STAT3経路の活性化を介して筋萎縮を引き起こし、この転写因子を阻害すること3,4筋肉消耗を防ぐことができます。

C26誘発性筋萎縮時には、筋萎縮の多くの条件のように、筋肉量がない細胞死または繊維13の損失を介して、主に筋線維全体の筋肉のタンパク質含有量の減少によって失われます。 C26の悪液質では、より小さな断面積へのシフトは、解糖および酸化繊維2の両方で観察されました。これはまた、減少筋力5と一致しています。多くのグループが、世界中のがんCACのための筋萎縮の新しいメディエーターまたは臨床的に関連する薬物を発見するために、C26モデルの利点をとっていますhexia。しかし、このモデルの使用のために多くの異なる手順は、得られたデータの整合性についての懸念を高め、異なる実験条件で再現性の障壁を装った、報告されています。ここでは、標準化と再現性のあるデータが得られ、癌性悪液質の研究のためのこのモデルの典型的な使用を報告しています。

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Protocol

倫理文:説明すべての研究は、医学のトーマス・ジェファーソン大学とインディアナ大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されました。

1. C26細胞成長と準備

  1. 、1%、10%ウシ胎児血清(FBS)、1mMピルビン酸ナトリウムを含有する( すなわち、高グルコースのダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)C26大腸癌細胞(オハイオ州立大学医療センター(OSUMC))を取得し、完全増殖培地を作製グルタミン、および1%ストレプトマイシン/ペニシリン)。
    注:よりよい相互実験の再現性を可能にするためには、できるだけ低い通路でC26細胞を使用することが好ましいです。
  2. 完全増殖培地とフラスコに50,000細胞/ cm 2をめっきするために市販のセルカウンタを使用してください。サブコンフルエントになるまでCO 2を 37℃で加湿雰囲気中でそれらをインキュベートし、5%。 PREVする高密度でそれらを培養することを避けますENT分化および細胞の表現型の漂流。
  3. 最初の継代後、プレートに十分な細胞は、動物の予定数に移植されます。細胞移植の日に、トリプシンの1ml当たりの新鮮な培地の最低で3ミリリットルを添加することによりトリプシンを中和し、1cm 2当たり0.25%トリプシン-EDTA溶液0.02 mlをトリプシン処理によって細胞を解離、細胞/ mLで細胞濃度を決定します、および滅菌PBS中の実験(マウス当たり1×10 6細胞)のために必要な細胞の数を懸濁します。
    注:密度が/ cm 2で約500,000個の細胞である場合にC26細胞がコンフルエントに達します。

2.マウス

  1. 少なくとも群あたりn = 6でグループ(通常はコントロールおよび腫瘍ベアラ)に成人CD2F1マウス(年齢の少なくとも8週間)をランダム化します。
    注:C26腫瘍は、同様のBalb / cマウスに成長しています。しかし、私たちの経験に基づいて、CD2F1マウスは、この特定の腫瘍モデルのためのより汎用性と経済的なホストを表します。また、臨床現場へと14-16を無駄癌関連筋肉の他の実験モデルで報告調査結果と同様に、C26の悪液質に応じて、性差も(また、 表1を参照)17を観察することができます。
  2. 吸入(酸素中3%)でイソフルランを用いてマウスを麻酔。腫瘍接種を行うのに必要な時間のためだけに麻酔下で動物を維持します。マウスは、体熱の損失を防ぐために、加熱パッド上にあることを確認します。腫瘍注射の手順を開始する前に、そっと後部つま先をつまんで適切な麻酔を確認します。
    注:この手順(一般に数秒)の期間のため、獣医の眼軟膏の使用は必須ではありません。同じ理由で、偽手術を受けた対照動物は、体重を減らすことが期待されていません。
  3. 26ゲージの針を用いて滅菌1mlのインスリンシリンジを使って、すぐにTを含有する溶液の250μLを注入しますumor皮下およびintrascapularlyマウスの脂肪パッド内のセル。
    注:コントロール動物は、脂肪パッドにintrascapularly滅菌生理食塩液250μLを受け取ることになります。
  4. バックそのケージに動物を置きます。それは穏やかな操作に対応できるし、立ち直り反射を取り戻したまで直接少なくとも一回15分ごとにマウスを観察します。
    注:無人マウスを残し、および固体基板を含んで暖かい回復ケージに保管しないでください。それは完全に麻酔から回復するまでさらに、動物の部屋にマウスを返しません。一般的に、マウスは、研究者は、個々の食物摂取量を評価することを目的としない限り、個別に収容する必要はありません。これはケースと自動化された代謝ケージの使用は利用できない場合、食料消費の手動録画は、おそらく毎日毎日同じ時間に、行わなければなりません。
  5. 毎日マウスをチェックして、自分の体重を記録します。
    注:ボディコンディションスコアを記録し、ホームケージ行動は、治療研究の18のために有用である、悪液質および疾病行動の度合いを区別することができます。

3.安楽死と血コレクション

  1. コントロールに対する腫瘍の宿主における体重減少は、その初期体重と比較して(軽度、中程度、および重度の悪液質、それぞれ)5%、10%、または15%に達したとき、マウスを安楽死させます。
    注:一つのグループは、すべての群を安楽死させている時間に10%の重量損失に達するまでの典型的な実験が行われます。体重減少は、腫瘍の包括的体重を測定することによって評価されます。
  2. イソフルラン全身麻酔(酸素中3%)の下にマウスを置きます。 ( - 1.5ミリリットル約1)心臓穿刺によって血液を描画します。
  3. K 2 -EDTA(18 mg)を空のチューブに血液を採取し、氷の上に置きます。遠心分離血液(4℃で15分間、2000×gで)、血漿/血清を収集します。
  4. Cを用いて、マウスを安楽死させますervical脱臼。組織切除及び臓器コレクションに進んでください。

4.組織および臓器切除

注:生化学的または分子生物学的アッセイにおける組織の使用については、各臓器や組織の重量を量ると、すぐに予め標識クリオチューブに断片を配置する予定。 -80℃で液体窒素とストア内のスナップ凍結。

  1. ファーで組織試料の汚染を回避するために、全身にわたって70%エタノールをスプレー。
  2. 仰臥位で解剖ベッドの上にマウスを置き、高架ビュレットクランプに足を取り付けることにより、垂直方向に手足を伸ばします。
  3. デュモンの鉗子で下肢の皮膚をつかみ、ゆっくりと下肢の基礎となる筋肉の腹を露出させ、皮膚および筋膜を除去するために、湾曲した微細なハサミを使用しています。
  4. 横方向および内側後方大腿骨上顆とでその挿入時にその起源によって、事後下肢の腓腹筋を特定踵骨腱を介して踵骨。
    1. 腓腹筋の踵骨腱を切断するために進んでください。デュモンの鉗子で腓腹筋の遠位端をつかみ、その起源に向けて筋腹を引きます。はさみを使用して、大腿骨にできるだけ近い原点に筋を切りました。皿に筋肉を置きます。すぐにそれを計量し、液体窒素中にチューブでそれを凍結します。
      注:腓腹筋と一緒にヒラメ筋を切除しないように注意してください。それが発生した場合は、慎重に静かにピンセットでそれを引いて、ヒラメ筋を取り除きます。
  5. 識別し、脛骨とその遠位腱を介して、中間楔状骨でその挿入の前外側面には、その原点から前脛骨筋を切除するために進んでください。
    1. レバレッジを持っているために、人差し指と親指で数字をつかんで足をホールド。すぐ脛骨筋の浅遠位腱の下デュモン鉗子の先端を挿入し、そのようなBLその鉗子を移動UNT側が下にある結合組織から脛骨筋の腹を分離するために使用することができます。
    2. 細かい湾曲したハサミを使用して遠位腱をカットし、その後、脛骨にできるだけ近い、原点に筋を切りました。
  6. ちょうど横隔膜の上に切開を停止し、下腹部に開始矢状切開を行い、心窩部に上方に移動させることにより、腹腔を開きます。
    注:切開の深さは腹部の筋肉壁、基礎となる腹膜筋膜を突破するのに十分であるべきです。
  7. 慎重に鈍先端に付いたピンセットでそれを把握することにより、肝臓を除去し、空洞に肝臓を接着する任意の血管や結合組織を離れて分析する微細な湾曲したハサミを使用しています。背後にある任意のローブを残さないように注意してください。計量し、液体窒素中でチューブ内の肝臓を凍結スナップ。
  8. 鈍先端に付いた鉗子を使用して、腸を離れて移動し、公開し、微妙削除脾臓。鈍先端に付いたピンセットで軽く脾臓をつかみ、空洞に脾臓を付着した結合組織や血管を離れて分析する微細な湾曲したハサミの背面または鈍い側を使用しています。計量し、液体窒素中にチューブでそれを凍結スナップ。
  9. (雌)(男性の)精巣上体に隣接するか、子宮生殖腺脂肪パッドを、特定します。静か鈍先端に付いたピンセットで精巣上体脂肪パッドを把握し、空洞の外に組織を引っ張ります。細かい湾曲したハサミを使用して、脂肪パッドに取り付けることができる任意の生殖腺組織を切り取ります。脂肪パッドを計量し、液体窒素中にチューブでそれを凍結スナップ。
    注:一般的に、この脂肪組織は、マウスでの全体的な体脂肪量の代表とみなされ、悪液質と量が低下されます。他の脂肪パッドは、同様に、識別された解剖し、除去し、計量することができます。
  10. 動物の胸を開くように湾曲した微細なハサミを使用してください。 STの両側の境界に取り付けられたリブを切り取りますernum。胸骨を削除します。鉗子の二組を使用して、胸郭の両側を把持し、胸腔を開くために横方向に各側を引っ張ります。
  11. ほのかな鉗子で心を引き出します。慎重に左心房に大動脈を切断することによって、湾曲細かいハサミで心を切り出します。微妙にいくつかの吸収紙に対してそれをブロッティングすることによって任意の残留血液の臓器を空にしていることを確認します。計量し、液体窒素中にチューブでそれを凍結スナップ。

5.筋肉の凍結と取り付け

  1. 液体窒素中にイソペンタンを含む小さなプラスチック製ビーカー(50ml)中の下半分を浸します。それがわずかに粘性となり、ビーカー(:-160°Cの温度)の内側を裏打ちする白色固体積層体を形成する場合、イソペンタンは、使用する準備が整いました。
    注:常にnonsparking青銅またはアルミニウムハンドツールを使用しています。生成物蒸気の吸入を避けます。十分に換気して使用します。流出に対処し、換気が不可能またはimpracticある場合アルは、適切な呼吸用保護具を着用します。
  2. イソペンタンに簡単に(10秒)に浸漬することにより、チャック(コルク)上のいくつかの包埋媒体をフリーズします。
  3. 繊維の配向を維持し、断面を可能にするために、コルクに対して垂直に、腱てそれを保持することによって、筋肉(例えば 、脛骨または腓腹筋)を扱います。
  4. 慎重に凍結された包埋媒体の上に新鮮な筋肉の端部を配置。
    注:筋肉がついてしまいます。完全にメディアを埋め込むことで、筋肉を囲むしないことが重要です。断面積の後続の決意するための垂直配向を維持することも重要です。
  5. イソペンタン浴( - 試料のサイズおよび組成に応じて、15秒の通常の凝固時間は7である)に取り付けられた筋肉でチャックディップ。
    注:凍結溶液中の浸漬は完全に試料を凍結するために必要とされる以上に続くべきではありません。長すぎる意志FRACを凍結短すぎる時間が氷の結晶形成の原因となる一方で、組織ブロックをTURE。よく凍結標本は、チョークのような白になります。
  6. 試料を凍結した後、小さなビニール袋や試料管(50ミリリットル)にそれを配置し、直ちに-80℃で、または液体窒素中でディープフリーザーに保管してください。

生データの6.解析

  1. マウスの大きさの変動を制御するために、最終的な体重(FBW)を正規化します。腫瘍のない体重;カーカス、臓器、および(グラムで表される)組織重量最初の体重(IBW)によると、および「重量/ 100mgのIBW」としてそれらを表現します。
    注:あるいは、いくつかの研究者は、脛骨の長さに筋肉量を正規化します。
  2. データ分析のためのソフトウェアを使用してください。正規化された重みの平均とSDを探します。コントロールおよびC26を有するマウスの間で対応のないスチューデントのt検定で統計分析を実行します。
    注:結果は、IBW(本体に対して提示することができますおよび腫瘍のないFBW)、腫瘍、臓器、および組織重量。

7.筋肉セクショニング

  1. 周りに-23°Cにクライオスタット内側室の作動温度を設定します。
  2. (以前は-80℃で保存)標本は(時間のカップルが十分でなければならない)作業温度で順応することを可能にします。
  3. 試料の8-μmの厚さの切片(好ましくは前脛骨または腓腹筋)複数をカットし、ガラススライド上にそれらを収集。
    注:筋肉の半ば腹の領域にセクションをカット。 また、精度のために、取付軸に対して垂直にセクションをカット。
  4. クライオスタットチャンバ内のガラススライドを保管してください。目的は、IF / IHCの研究や酵素染色を行うことであるならば、それらは解凍させないでください。
  5. さらなる分析のために-80℃でスライドを保存してください。

ラミニン免疫蛍光によって筋線維サイズの8評価(代替1)

19を決定します。筋肉切片のH&E染色は、形態学の分析のための貴重かつ便利な方法を表しているが、IFのアプローチ14の使用が大幅に高速化し、H&Eベースの方法よりも控えめに、より正確です。 H&Eの方法を以下に記載します。

  1. クライオスタットまたは-80℃の保存のいずれかから組織切片を削除し、それらを室温に平衡化することを可能にする(約5から10分)。
    注:マウスで上昇し、一次抗体に関連する非特異的相互作用を回避するためには、いずれかの使用抗体は他の種に上昇したり、市販の「マウス・オン・マウス」免疫検出キットを利用することが望ましいです。
  2. 前クールのセクションを浸しEDのメタノール(-20℃)のための10分。
  3. 5分間、PBS 1×室温でセクションを洗ってください。
  4. PBSを削除し、スライド上のセクションを取り囲むように免疫組織化学的アプリケーションのためのペンを使用しています。任意の時点でのセクションでは、完全に乾燥させないでください。
  5. RTで1時間セクションに - (8%FBS PBSまたはPBS中の5%ヤギ血清5)適切なブロッキング緩衝液を適用します。
  6. ブロッキングバッファーを除去します。
  7. 加湿チャンバーでウサギ抗ラミニン(1時30分)またはRTで2時間のセクションにブロッキング緩衝液中のマウス抗ジストロフィン(1時30分)一次抗体(または4℃で一晩)のいずれかを適用します。
  8. 5分間、1×PBSでセクションを洗ってください。
  9. 洗浄バッファーを削除し、5分間、1×PBSで再びセクションを洗います。
  10. 洗浄バッファーを削除し、適切な蛍光二次抗体を適用します(1:ブロッキング緩衝液中1,000)、室温で1時間加湿チャンバー内のセクションへ。
  11. 二次抗体を除去し、5のために1×PBSでセクションを洗います分。
  12. 洗浄バッファーを削除し、5分間、1×PBSで洗浄を繰り返します。洗浄バッファーを削除し、水性媒体を用いたカバーガラスでセクションをカバーしています。
  13. 染色切片のデジタル画像を用いて、筋肉の形態学的特徴を理解します。そうするためには、デジタルカメラと画像キャプチャソフトウェアと一緒に、(10倍または20倍の倍率の対物レンズが適切である)セクションIF用倒立蛍光顕微鏡を使用しています。各デジタル画像中のスケールバーを置き - CSAの定量化を容易にするために、(20 30ランダムフィールドは、各筋肉のセクションに推奨されています)。画像は、ImageJのプログラムを使用して画像解析ソフトと互換​​性があるように。TIF形式で保存する必要があります。
  14. 筋内膜20中の蛍光二次抗体の存在を介して収縮性組織(筋線維サイズ)から結合組織を区別するためにImageJのマクロを使用します。
    注:マクロおよび命令が認証から入手可能ですORS、リチャード・リーバーとシャノン・ブレムナー。
  15. デスクトップのアイコンをダブルクリックしてImageJのプログラムを開きます。
  16. 「プラグイン」タブを一度クリックすることで、CSAマクロをロードします。一度それをクリックして「インストール」オプションを選択するには、カーソルを下に移動します。
  17. それはで保存されたフォルダから選択することにより断面マクロをロードしてから、「開く」をクリックします。
  18. マクロが開かれた後、ImageJのツールバーから「ファイル」とし、「開く」をクリックすることで、スケールバーを含む組織学的画像を開きます。
  19. 画像が開かれると、直線でアイコンをクリックしてImageJのプログラムに「直線ツール」を選択します。
  20. 「直線ツール」を選択すると、スケールバーの一番左の端に一回クリックして、スケールバーの一番右の端に一回クリックします。時が正常に完了したら、スケールバーの上に重ね黄色い線があるはずです。
  21. YELLOがしていることを確認しワットラインがまだスケールバーに重ねて、一度それをクリックすることで、ImageJのツールバーから「分析」タブを選択します。
  22. 「分析」タブで、下にカーソルを移動し、一度それをクリックして「設定スケール」を選択します。
  23. 「セットのスケール」ウィンドウで、「距離をピクセル単位で」ボックスに値を変更しないでください。 「既知の距離」ボックスにスケールバーの既知の距離を入力します。スケールバーユニット( すなわち、マイクロメートル=ミクロン)に対応する「単位長さの」ボックスで単位を変更します。最後に、一度「グローバル」の左にあるボックスをクリックして「グローバル」を選択します。
  24. 「設定スケール」ウィンドウを閉じます。
  25. キーボードの「O」ボタンを押すことによって測定された最初の画像を開きます。ユーザーは、それが中に保存されたフォルダから測定する画像を検索し、選択することができ、ウィンドウのポップアップを遵守してください。一度それをクリックし、次にクリックして画像を選択して「開く」を
  26. <李>開封後、ウィンドウはCSA測定用と真円度の許容範囲の選択のために表示されます。
    注:これらの設定は、通常、デフォルト値に残されています。 1は、これらの設定を変更したい場合は、実験で測定される各連続した画像に同じ値を保つようにしてください。
  27. CSAの範囲と真円度を設定した後、「しきい値」ウィンドウで赤色の画素に覆われた画像を観察。筋肉繊維が正確に赤色の画素で満たされるまで「しきい値」ウィンドウのバーを使用して、画像のしきい値を調整します。
    注:お互いに触れていない繊維の最大数を取得しようとしています。繊維が接触している場合、それらは、下流編集する必要があります一つの大きな繊維、として測定されます。
  28. しきい値を設定した後、筋線維を測定するために、キーボード上の「1」ボタンを押してください。
  29. 黄色の線を有する個々の筋線維をCIRCLE。画像を移動し、成果物またはプログラムによって選択された二重繊維を削除します。これを行うには、一度それらをクリックすることにより、繊維構造でない構造を選択し、キーボードの「D」ボタンを押してください。これは、測定値からそれらを削除します。
  30. 選択してからの測定値をコピーする「測定値ウィンドウ」、およびさらなる分析のためにスプレッドシートに貼り付けます。
    注:得られた値は、一般に、腫瘍の成長が小さく筋繊維への移行を促進するかどうかを決定するために有用なパラメータである繊維分布分析を評価するために使用することができます。
  31. ウィンドウの左上隅にある「X」をクリックしてImageJの中で開いているウィンドウをすべて閉じます。
  32. 8.29 - "O"を押すと手順8.24を繰り返すことによって測定する新しい画像を開きます。

評価のH&E染色切片からの筋線維サイズの9(代替2)

  1. ガラスを置きます8分間のフィルタリングハリスヘマトキシリンを含むコプリンジャーにスライドします。
    注:より弱い染色が所望される場合あるいは、マイヤーヘマトキシリンを使用することができます。
  2. 脱イオン水でスライドを洗浄します。
  3. 最大5分間スライドを水道水で浸します。
  4. すぐに脱イオン水にリンスし、次いで2未満分間ろ過1%エオシン溶液でそれらをインキュベートします。
    注: - エオシン溶液に酢酸(0.01%以下)の2滴のより強い染色が所望される場合、1を加えます。
  5. 脱水ステップを開始します。 1分未満、70%エタノールでスライドを洗浄します。
  6. 1分間、90%エタノールでスライドを浸します。
  7. 1分間、95%エタノールでスライドを浸します。
  8. 2分間100%エタノールでスライドを浸します。
  9. 2分間のキシレンにスライドを浸し。さらに2分間新鮮なキシレンを含む別のコプリージャーにスライドを移動します。
    注:それらがカバーガラスをされるまで(もはや1時間以上)キシレンにスライドしてください。
  10. coversliを配置パーマウントまたは選択のキシレン系封入剤を使用して、筋肉切片上のps。
  11. 20X倍率で顕微鏡下でのH&E染色されたガラススライドを観察し、全体の筋肉の断面積の画像を取得します。明るい光顕微鏡、デジタルカメラ、および画像取り込みソフトウェアを使用して画像を得ます。
    注:同一の倍率で撮影したマイクロメートルのスケールバーまたは画像の存在は、CSAを決定するために必要とされます。上記のように、記録は少なくとも20 - 各筋肉のセクションのための30のランダムなフィールド。
  12. ImageJソフトウェアを使用して、筋線維の大きさを評価します。すべてのデジタル画像を開きます。上記のようにスケールを設定します。タブレット入力デバイスとペンで、より高速な入力のために、マウスを使って繊維外周をトレースし、フリーハンド選択ツールを使用して、筋肉当たり少なくとも1,500〜2,000筋線維を測定しますか。

10.データの収集と分析

  1. 筋線維サイズを確立するために、平均繊維」領域を評価します。"実験設定は小さいまたは大きいのいずれか筋繊維への移行に関連しているかどうかを評価するために、さらに、エリア及びフェレ径の両方を含む、各筋肉について得られた測定のための手段及びSDの計算分析」繊維分布を。 "
  2. 二つのグループのための対応のないt検定を行うことにより、結果の有意性を評価します。 C26マウス群について、対照群について得られた値の間の比率を決定します。手段SDと繊維のサイズのシフトを実証することを目的とした頻度分布/ヒストグラムを報告するグラフ上の値をプロットします。

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Representative Results

( - 5 D 4)指数関数的な細胞増殖が続く注射後8 D、 - C26腫瘍増殖動態は、最初の7のための誘導期を示しました。腫瘍塊は、最終的に(; 1A-B約2g)〜体重の10%に達します。最初のフェーズでは、腫瘍は触診により配置することができ、皮膚の小さな突起として表示されます。第二段階では、腫瘍は、皮膚の下の塊として観察されます。まれに、腫瘍が開いた傷で、その結果、潰瘍になりません。この場合には、マウスを実験群から除外され、人道的に安楽死させます。

体重は、第1段階で不変であるが、それが10に達したときに有意に、第2段階で減少さ-最初の体重(腫瘍のない量の場合には30%; 図1A)の15%。担癌マウスは無駄との終わりに乱れた毛皮を示した表示されますボディコンディション(BC)での実験期間は、1〜18( 図1C)に等しい得点します。 BC1は、骨格構造が明らかであると椎骨が明確にセグメント化されている深刻な衰弱マウスを表します。体重減少は、主に骨格筋および脂肪組織萎縮( 図1B)の両方によって説明されます。腓腹筋における、特に骨格筋重量の30%、前脛骨筋および大腿四頭筋( 図2) -体重減少は、約20の減少と一致しています。心筋も有意に他の骨格筋( 図2)と比較してより少ない程度であるが、軽量化されています。興味深いことに、肝腫大(+ 16%、P <0.01)および脾腫骨格筋と同様の脂肪量は、著しく枯渇している間に(+ 110%、P <0.01)は、一般的に、腫瘍ホストで検出された(-70%、p <0.001 ; 図3)。

4A-B)後に観察されたように、また、と一致し、筋線維サイズの減少に比例しています。具体的には、度数分布の分析は、このように全体の筋肉がC26腫瘍( 図4C)の存在下での萎縮を受けることを示唆し、C26を有するマウスでより小さなサイズの繊維へのシフトを示しました。癌増殖に関連した筋肉のCSAの変化の大きさは、IF用少し(38%対コントロール、異なるP <0.01であるが、同様の結果が、繊維のサイズを定量化するため、従来のH&Eベースの方法を利用して観察することができますベースの方法;対照に対して-18%、P <H&Eベースの方法のための0.01; 図5)。

図1
図1:コントロールおよびC26-有するマウスにおけるボディのウェイト。 制御およびC26-で制御し、全実験期間にわたってC26ホスト(14日腫瘍注射後)。B)初期体重(IBW)、最終的な腫瘍のない体重(FBW)、および腫瘍重量のA)体重曲線有する動物。C)腫瘍接種後に屠殺(14日目の時点でコントロールとC26-ベアラの代表写真)。データは平均SDとして表されます。差異のはn = 6意義:。* P <0.05、** P <0.01、*** P <0.001対照群に対するスチューデントのt検定を使用して、 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2: コントロールおよびCにおける筋重量マウス26ベアリング。脛骨、腓腹筋、大腿四頭筋、および制御における心臓重みとC26腫瘍ベアラは、重量/ 100mgのIBWとして報告されています。データは平均SDとして表されます。差のN = 6の意義:** p <0.01及び*** p <0.001対照群に対するスチューデントのt検定を使用。

図3
図3:オルガンControlの重みとC26を有するマウスの肝臓、脾臓、および制御における精巣上体脂肪パッドの重みとC26腫瘍ベアラが重量/ 100 mgのIBWとして報告されていますデータは平均SDとして表されます。 n =差の6意義:**対照群と比較してp <0.01。

図4
図4: 免疫蛍光によって筋線維サイズのための形態計測。 A)の制御およびC26ホストからの抗ジストロフィン抗体(Vector Laboratories)を用いて、脛骨部分の蛍光免疫組織化学的反応。倍率:10X。サイズバー:100μmのB)制御およびC26を有するマウスの脛骨筋におけるCSAのImageJのマクロC)度数分布で測定脛骨筋におけるCSAの定量。データは、平均±SDとして表されています。各群についてn = 6。差の有意性:**スチューデントt検定を用いて対照群に対してP <0.01。

図5
5:H&E によって筋線維サイズのための形態計測。制御およびC26のホストからの脛骨部分のA)ヘマトキシリン&エオシン染色。倍率:20X。サイズバー:100μmのB)の定量化と周波数分布脛骨筋でCSA。データは平均SDとして表されます。差のN = 6意義:*** p <0.001対照群に対するスチューデントのt検定を使用。

著者 マウス株 マウスの性別 細胞の数 原点 固形腫瘍として移植? 注射部位 日々
ラザロ 、1999 CD2F1 M 5×10 5 NCI NO 背部 17
アル・マジドとマッカーシー、2001 CD2F1 F 2.5×10 6 OSUMC NO 背部17
サミュエルズら、2001 BALB / cの M 0.5g / mlの腫瘍懸濁液 NS はい背部最大11
Acharyya ら、2004 CD2F1 M 1×10 7 OSUMC NO 右脇腹最大24
Aulino 2010年 BALB / cの NS 0.5~3mm NCI はい背部 21
ベニー・クリメク 、2010 CD2F1 F 1×10 6 OSUMC NO 背部 14
Bonetto ら、2011; 2012 CD2F1 F 1×10 6 OSUMC NO 背部
CosperとLeinwand、2010 CD2F1 M + F 5×10 5 NS NO 右脇腹最大27
マーフィー 、2012 CD2F1 NS 5×10 5 NCI / OSUMC NO 背部 14
コーンウェルら、2014 CD2F1 M 5×10 5 NCI NO 右&左脇腹最大26
アッシ 、2016 BALB / cの NS 1×10 6 細胞株サービス NO 背部最大22

表1:C26移植のために使用される異なるプロトコルの比較Differen。C26注入のTプロトコルが、使用されるマウス系統を特に参照して、接種した腫瘍細胞の数とタイプ、細胞由来、注射部位、および実験期間の長さが提供されます。 OSUMC:オハイオ州立大学医療センター。 NCI:国立がん研究所。市販の細胞ラインサービスNS:指定されていません。

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Discussion

特にその最新の段階で、結腸直腸癌は、貧しい転帰と患者の生活の質の低下の原因である悪液質の開発と関連しています。多くの研究は、癌の二次的症状の治療に焦点を当てています。しかし、この方向に多くの努力にもかかわらず、癌性悪液質21には承認された治療法はまだありません。従って、動物モデルは、所見の変換を最大にするためにできるだけ近いヒト病理に似ていることが不可欠です。

C26腫瘍を有するマウスは、癌性悪液質22-24の一般的に使用される実験モデルです。このモデルは密接体、筋肉、および脂肪量だけでなく、筋線維の萎縮の減少および炎症性遺伝子と著しいタンパク質異化亢進2,5と一致してユビキチンリガーゼの発現増加を示す、ヒトの疾患に似ています。この、癌patieで得られたデータにはいくつかの格差にもかかわらず、国税庁は25,26報告されています。実際、非生理的な成長環境を含むモデルのいくつかの特徴、他のモデル(の例えば、遺伝的または同所注射に比べて、比較的短い実験期間を( 例えば、異所性腫瘍は、胃腸管に移植同所皮下の代わりに成長します)腫瘍)、IL-6の作用に依存し、厳しい制限を表すことができ、結果の解釈を制限する可能性CD2F1またはBalb / cマウスの必要使用。

現在のプロトコルは、同じ特性を維持し、異なる時間に、地理的に異なる場所に、異なる研究3,10により得られた結果との比較を可能にする、我々の研究室で行われ、多くの実験を横切る高い再現性であることが証明されました。しかし、データの再現性を促進するためには、明確かつ共通のガイドラインを確立することが重要です。

gathereとして文献からdは、いくつかの注意点が二つの異なる研究室で同じデータの再生を妨げる可能性があります。同じ理由で、異なるプロトコルを使用することは矛盾すると疑わしい結果と異なる表現型と成果だけでなく、リードを生成することができます。確かに、この動物モデルを実行するの違いは、主株(のBalb / CまたはCD2F1)から生じることが報告されている2,5,27-29またはマウスの性別、移植した腫瘍の型(細胞懸濁液3 17を使用、29よりむしろ移植片2,30)で固形腫瘍、腫瘍源(NCI、ATCC、またはOSUMC)、注入したC26細胞の数、および注射または移植の部位(フランク6,17、 31または背部3,10,32)。異なるソース(NCI対主OSUMC)から得られたC26細胞株の移植に関連した効果のない直接の比較は、これまでこのように、任意の決定的conclusiを描画するから私たちを防止し、実行されていませんアドオン。しかし、細胞の供給源の選択もかなり期待される成果に影響を及ぼし得る可能性があります。メス対オスの選択肢を検討する際に、研究者は、アウトカムに有意差を思い出すべきです。 CosperとLeinwand 17によって報告されているように確かに、男性の腫瘍を有するマウスは、エストロゲンの欠如に起因する、より大きな心臓質量損失および死亡率、腫瘍へのより強固な炎症誘発性応答を含む、女性より厳しい表現型を示すことができます、そしてより大きな心臓オートファジー。

特にこのモデルに精通していないと、最初に電力解析と私たちのこれまでの経験、実験条件当たり少なくとも6匹の動物(n = 6)が統計的に検出するために賢明であるの使用の両方に基づいて、問題に直面する可能性のある研究者のための有意差。ランダムに実験動物において、初期体重ので、慎重に行われることが重要です群間で有意差はありません。同様に、オペレータ間の変動を回避するために、同一の研究者は、すべての動物の組織と臓器の収集を行う、ことをお勧めします。また、組織(特に筋肉)が研究の目的は、遺伝子発現を評価するために、または酵素活性を評価することである場合は特に、RNA及び酵素の構造および活性を維持するためにできるだけ速く凍結することが必須です。また、筋肉のCSAを決定するための試みにおいて、我々は、繊維領域を報告することは一般に受け入れられ筋線維サイズを表すことを示しました。ここでは、筋肉のCSAを評価するために二つの異なる方法を提示します。 図4-5に示すように、両方の方法は、消耗の程度は異なる見えたが、コントロールと腫瘍ホスト間の筋線維サイズの有意な減少を検出することができました。

この相違は、両方の方法が、ロバに許容可能な方法があるが、という事実に起因し得ます筋線維サイズ、H&E染色スライドからの筋肉特性の定量化は、ほとんどの場合、依然として労働集約的、時間がかかり、かつ限られた精度の影響を受け、手動または半自動のプロセスです。私たちの経験に基づいて、我々は、IFベースの方法は、筋肉のCSAを報告するために、より正確な手法であると考えています。確かに、この技術を利用して自動的に測定することができる繊維の数は、このように、測定の精度を高める、著しく大きいです。注目すべきは、両方の技術のために、筋肉のサイズを報告する別の方法は、フェレ径を評価しています。興味深いことに、これは、このパラメータは切片の角度の大部分が独立しているという事実のために、非常に信頼性の高いツールであると考えられます。そのような「最小内径」と「最小外径」などの他のパラメータは、また切片の平面に対して非感受性であり、FIBの代替指標としてフェレ径の代わりに使用することができますえーサイズ。

悪液質のコミュニティは明らかに腫瘍関連筋萎縮の研究のために、より生理的なモデルを確立する必要があるが、結論として、我々は、分子変化を調査するためにC26結腸癌を有するマウスは、よく標準化された、使いやすいモデルを表していることを信じて、通常、腫瘍の発生後に検出された生理学的な異常。将来のアプリケーションは、大腸へのC26細胞の同所移植は、結腸直腸癌性悪液質の適切かつより生理学的なモデルを表すかどうかの調査を含むであろう。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture Flasks Falcon - Becton Dickinson 35-5001
DMEM Cellgro 10-017-CV
FBS Gibco 26140
Streptomycin-Penicillin  Cellgro 30-002-CI
CD2F1 mice Harlan 060
Anesthesia apparatus EZ-Anesthesia EZ-7000
2-Methyl Butane Sigma-Aldrich M32631
OCT Tissue-Tek 4583
Cryostat Leica CM1850
Cork disks Electron Microscopy Sciences 63305
Superfrost plus glass slides VWR 48311-703
Anti-Laminin Rabbit polyclonal antibody Sigma-Aldrich L9393
Anti-Dystrophin Mouse Monoclonal antibody Vector Laboratories VP-D508
Alexa Flour 594 anti-mouse IgG Life Technologies A11062
Alexa Flour 594 anti-rabbit IgG Life Technologies A21211
Hematoxylin Sigma-Aldrich GHS216
Eosin Sigma-Aldrich HT110332
Xylene Acros Organics 422680025
Cytoseal-XYL Thermo 8312-4
Microscope Zeiss Observer.Z1 
Bamboo Tablet Wacom CTH-661
Prism 7.0 for Mac OS X GraphPad Software, Inc.
Excel for Mac 2011 Microsoft Corp.
ImageJ US National Institutes of Health IJ1.46 http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
Microtainer BD 365873

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References

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