微生物光遺伝学アプリケーションのための自動照明、培養、およびサンプリングシステムの設計と実装

1Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison
Bioengineering

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Summary

我々は、倒立顕微鏡を用いて流出液中の微生物、定期的に画像を細胞の培養物を照明する光遺伝学システムを使用するための連続的な培養装置を設計しました。照明の動的応答は、数日間にわたって測定することができるように培養、サンプリング、画像化、および画像解析は完全に自動化されています。

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Stewart, C. J., McClean, M. N. Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications. J. Vis. Exp. (120), e54894, doi:10.3791/54894 (2017).

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Abstract

光遺伝学システムは、細胞プロセスを変更するために特定の波長の光に反応して立体構造を変更遺伝的にコードされたタンパク質を利用します。光遺伝学システムのプログラムされた照明および刺激を組み込んだシステムを培養し、測定が必要です。我々が構築した光のプログラムされた用量で微生物細胞を照射し、自動的に取得し、流出液中の細胞の画像を分析するために、連続培養装置を使用するためのプロトコルを提示します。ケモスタット、この装置の動作は、増殖速度と細胞環境を厳密に制御することを可能にします。連続的な細胞培養の流出物は定期的にサンプリングし、細胞をマルチチャンネル顕微鏡によって画像化されます。蛍光強度および培養流出物から採取した細胞の細胞形態の動的応答が複数日にわたって測定されるように培養、サンプリング、画像化、および画像解析は完全に自動化されていますユーザーの入力なし。我々は、動的に転写を活性化する光遺伝学系で操作サッカロマイセス・セレビシエの株においてタンパク質産生を誘導することによって、この培養装置の有用性を実証します。

Introduction

光遺伝学システムは、遺伝子発現、1、2、3、4、5タンパク質の局在化、6タンパク質活性、6、7、8タンパク質結合、8、9、10、およびタンパク質分解を含む細胞プロセスの成長のリストを制御するために光を使用します。プログラムされた光刺激と制御された環境で細胞を培養するため、および生物学的に関連するタイムスケールの上にそれらの応答を測定するための11の方法は、細胞生物学、バイオテクノロジーの研究のためにこれらのツールの可能性を利用することが必要です。我々の方法は、AE、よく混合した一定の細胞増殖速度を維持するためにchemostasisを利用します評価、及びプログラムされた照明に曝される温度制御されたガラス製の培養容器12、13。倒立顕微鏡で培養排水中の我々の画像の個々の細胞は、プログラムされた照明への文化の応答を測定します。流出液の細胞培養の蛍光強度および細胞形態は、ユーザ入力なしに複数日にわたって測定することができるように培養、サンプリング、画像化、および画像解析は完全に自動化されています。

このプロトコルは、増殖する細胞培養及び顕微鏡精通ほとんどの研究室で実施することができ、使用される装置は、安価で容易に入手可能なコンポーネントで構成されています。透明な培養容器は、光の1μW/ cm 2の範囲では-10 mW / cm 2で発光可能な発光ダイオード(LED)のマトリックス上に配置されています。微生物を連続培養容器で増殖させます。 1蠕動ポンプがでメディアを追加するために使用されます希釈率は、他の顕微鏡に小さい速度で培養物を回収するために使用され、その差は、オーバーフロー出口を通って逃げます。加熱パッドは、温度を維持しています。空気が継続的に正の圧力を維持するだけでなく、ミックスと文化を通気するために培養容器内に圧送されます。空気ポンプを除き、これらのデバイスへの電力はまた、温度計と接続されたデスクトップコンピュータからの入力を受け取るマイクロコントローラによって調節されます。流出液の細胞培養物を倒立顕微鏡のステージ上のマイクロ流体デバイスに圧送されます。非蛍光及び蛍光画像を自動的に取得されます。画像中の細胞は、関心領域(ROI)のように各セルを検索し、各ROIの特性を測定するアルゴリズムを特徴とします。

このプロトコルの適用を実証するために、我々は、青色光responsiで操作サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)細胞の変化する光強度に対する応答を測定し蛍光タンパク質の転写を制御する光遺伝学システムまし。このシステムにおいて遺伝子発現を制御するための複数の光遺伝学系はすでに14、15、16存在するため、一般的パン酵母としても知られているS.セレビシエは 、選択されました。さらに、このモデル生物は、一般にシステム生物学17およびバイオテクノロジーアプリケーション18、19、20のための筐体としての研究のために使用されます。私たちの代表的な結果は、このプロトコルは、入力光強度を変化させると、蛍光レポーターの産生を測定することによって、複数日間の培養の転写を制御するために使用することができることを示しています。

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Protocol

図1

図1:連続培養装置。この略図は、それを培養するために使用されたときに装置を組み立てすべきかを示し照明、及び微生物の光学的特性を測定します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2:プロトコルの概要。斜線領域での手順は、プロトコルが使用されるたびに繰り返さなければなりません。閉ループ制御34可能であるが、このプロトコルで実装されていません。

1.サーキットボードに温度計を組み立て


図3:接続は、温度計の値を読み取ります。この図は、マイクロコントローラは、培養の温度を制御するためのフィードバックを得ることができるように、デジタル体温計を基板に接続する方法を示しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

  1. それぞれにグラウンド、データ、およびデジタル温度計の正電圧線を半田付けし、貫通孔 "GD + Vを。」と記されました
  2. 女性の3ピン・ヘッダから1ピンをオフにクリップし、それが「R2」と表示された2つの貫通孔に収まるとマイクロコントローラを妨げないように、ワイヤバリカンで残りの2ピンをトリミングします。代わりに、これを半田付けします。ピンヘッダで4.7kΩの抵抗を挿入することにより、2つの半田付け端子を接続しています。

2.電源コンを接続します回路基板へのトロールのコンポーネント

図4
図4:接続は、加熱パッドへの電力を制御します。この図は、PCB及び付属部品は、加熱パッドへの電力を制御するために組み立てする方法を示す図です。蠕動ポンプを制御するための部品は同様の方法で接続されています。温度計のためのコンポーネントは、明確にするために削除されていることに注意してください。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

  1. 5女性の3ピン・ヘッダのピンから1cmに切り落とします。プリント回路基板上の位置にこれらの(PCB)としてマークされた「#1」、「#2」、「#3」、「#4を、はんだ付けし」と「CB E. "
  2. 女性の6ピンと8ピン・ヘッダのピンから1cmに切り落とします。への側でこれらの側に半田付け貫通孔の列は、K14を通してK1標識。
  3. 回路基板に加熱パッドを接続します。
    1. PCB上のK1およびK2ラベルされたスルーホールに100kΩ抵抗の両端を挿入します。ソース端子が "#に最も近いように、MOSFETのラベルは、貫通孔K14を介しK1に面するとともに、PCB上の#1をマークした位置に、金属酸化膜半導体電界効果トランジスタ(MOSFET)を挿入#「ラベル」のラベル、およびドレイン端子から遠いです」。
    2. 5 Vの直流(DC)電源ケーブルの接地線をカットし、J2に接続します。 J1への加熱パッドの接地線を接続します。 1kΩの抵抗と3番ピンにK3を接続します。ピン3が+ 5V.zに設定されているとき、電流は今だけJ2にJ1から流れるべき
      注:マイクロコントローラのピン3が+ 5Vに設定されている場合J2にピンJ1からの電流が流れますスイッチとして抵抗/ MOSFETの集合関数
  4. 接続します遅い蠕動ポンプ。
    1. PCB上K4とK5ラベルされたスルーホールに100kΩ抵抗の両端を挿入します。位置にMOSFETを挿入し、ソース端子が "#"ラベルに最も近い、ドレイン端子はから遠いように、MOSFETのラベルが貫通穴K14を通してK1の方を向いていると、PCB上の#2をマークし「#」のラベル。
    2. 遅い蠕動ポンプの12 V DC電源ケーブルの接地線をカットします。 J3の端部とJ4に終止符が直面している壁のいぼが直面している蠕動ポンプを接続します。 1kΩの抵抗と4番ピンにK6を接続します。ピン4が+ 5Vに設定されているとき、電流は今だけJ4にJ3から流​​れるべき
  5. 高速蠕動ポンプを接続します
    1. PCB上K7とK9ラベルされたスルーホールに100kΩ抵抗の両端を挿入します。位置にMOSFETを挿入K14スルーホールSをK1の方を向いているMOSFETのラベルで、PCB上の#3をマークしソース端子が "#"ラベルに最も近い、ドレイン端子が "#"のラベルから遠いこと、O。
    2. 高速蠕動ポンプの12 V DC電源ケーブルの接地線をカットします。 J5に終了し、J6に終止符が直面している壁のいぼが直面している蠕動ポンプを接続します。 1kΩの抵抗で5番ピンにK9を接続します。ピン5が+ 5Vに設定されているとき、電流は今だけJ6にJ5から流れるべき

3.サーキットボードにLEDマトリクスを接続

図5
図5:接続のLEDマトリクスを制御します。この図は、LEDマトリクスを基板に接続する方法を示しています。また、PCBは、マイクロコントローラ上に積層することができることを示しています。温度計および他のデバイスにDC電力を制御するための構成要素は、明確にするために除去されていることに留意されたいです。エス/ ftp_upload / 54894 / 54894fig5large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

  1. それは、マイクロコントローラの上に積み重ねることができるようにPCBの側面に貫通穴に6ピン、10ピン、および2つの8ピンのメスのピンヘッダを半田付けします。
  2. 10μFのコンデンサ(短いリード)の負端子は負の符号が付いているスルーホールに接続する必要があることを指摘し、PCB上の彼らのマーク付けされた位置に100 nFのと10μFのコンデンサを半田付けします。
  3. 遠くからドライバ上のくぼみで、スルーホールの2 12による設定にLEDドライバをハンダ付けしてスルーホールLEDマトリクスのために予約。
  4. スルーホールLEDマトリックスのためにマークにオスのピン・ヘッダの2列をはんだ付けし、そして彼らは、マイクロコントローラを妨げないようなブレッドボードの下にこれらの両端をトリミングします。女性/女性のジャンパ線の2つの8線式ストリップにこれらを接続します。男性の第2のセットを接続しますジャンパ線のもう一方の端にピンヘッダ。
  5. ブレッドボードの中央値を超えるLEDマトリクスを挿入し、マトリックスの両側に列にピンヘッダーの第2のセットを挿入します。 LEDマトリクスを直接スルーホールのラベルされた列に対応する行列のラベル面にPCBに接続されたかのように電気的接続が同じであることを確認してください。
  6. 女性の3ピン・ヘッダから1ピンをオフにクリップし、それが「R1」と表示された2つの貫通孔に収まるとマイクロコントローラを妨げないように、ワイヤバリカンで残りの2ピンをトリミングします。これを半田付けします。ピンヘッダーで1kΩの抵抗を挿入することにより、2つの半田付け端子を接続しています。
    注:培養容器は、LEDマトリクス上に積層されます。ワイヤーリボンが血管を妨害した場合、マトリックスからそれらを相殺しました。そして、電気的接続がCHしないように、マトリックスピンおよびワイヤリボン・ピンとの間のギャップを埋めるために固体芯線を使用ANGE。

4.ソフトウェアをインストールし、ハードウェアへの接続

  1. マイクロコントローラ上のPCBスタック。
  2. マイクロコントローラ用の統合開発環境(IDE)およびカスタム・コードをダウンロードするには材料リスト内のリンクに従ってください。
  3. ABユニバーサルシリアルバス(USB)ケーブルを介して顕微鏡のコンピュータにマイクロコントローラを接続します。マイクロコントローラにカスタムコードをコンパイルし、アップロードします。
  4. マイクロマネージャー21、22とフィジー23をダウンロードしてください。マイクロマネージャーは「Fiji.app」ディレクトリにダウンロードしたディレクトリからすべて "の.dll」ファイル、「mmplugins」ディレクトリ、および「mmautofocus"ディレクトリをコピーすることによってFIJIプラグインとしてマイクロマネージャーを構成します。また、「Fiji.app/plugins "ディレクトリに"プラグイン/マイクロマネージャー」ディレクトリをコピーします。
  5. 「BioreactorController.jar「ファイルint型をダウンロード「Fiji.app/mmplugins "ディレクトリO。
  6. フィジー>プラグイン>マイクロマネージャー>マイクロマネージャーStudioからオープンマイクロマネージャー。顕微鏡を制御するためのソフトウェアを構成するハードウェアの構成ウィザードを使用してください。 AB USBケーブルが接続されているポートのラベルを持つウィザードの「FreeSerialPort "デバイスが含まれます。

5.作成し、培養容器のためにライトプルーフエンクロージャを特徴づけます

  1. 培養容器は、マトリックス上に彼らに休むことができるように、LEDマトリクスの各隅にブレッドボード上のビルディングブロックとして3つの8ピンICソケットをスタック。
  2. LEDマトリックスから培養容器に当たる光が拡散であるように、ソケットのトップ層の下に拡散紙の部分を固定します。
  3. 黒い泡の部分 "6によって「3 8を切り取ります。最初TWの内側から電子ブレッドボード(2.3 "×3.5")と同じサイズである部分を切り取ります第三の内側からICソケット(0.9 "×1.8")によって作られた矩形のサイズであるoおよび部分。 0.9 "×1.8"の開口部を含む最終層があっても、ICソケットの上部に位置し、LEDマトリクスを囲むようマトリクスLEDの上にこれらの層を積み重ねます。
  4. 6 "による24」四角形を作るために半分に黒い泡の追加のシートをカット。培養容器は、それが熱的および光学的に培養容器を絶縁するような、チューブや電線のための部屋とに収まることができる黒泡の中空カラムにこれをロールバックします。
  5. LEDマトリクス上に黒の泡の中空列を中央、およびその下の黒い泡の層の上に列の境界をマーク。それが将来的に中央に配置されるべきであるここの境界がマークします。
  6. 黒い泡の3 "×3"の部分を切り取ります。この後には、外光を遮断するために、列の一番上にテープで固定することができる蓋として使用します。
  7. 目にフォトダイオードパワーセンサを接続します電子テープ付き容器のキャップを培養し、キャップを取り付け、エンクロージャ内の培養容器を挿入します。
  8. マイクロマネージャーでは、プラグイン>バイオリアクターコントローラにアクセスしてください。 30秒間隔で可能な強度の範囲のサブセットで照明するために行列を設定します。
  9. パワー・センサに接続された電力メーターコンソールに表示されるように、光の強度を記録します。これらの測定は、それらのLEDに点灯しているLEDの数とパルス幅変調(PWM)電流が設定されるとき、光の実際の強度を知ることができるようになります。

6.培養容器を準備します

図6
図6:船の接続。この図は、装置の容器とチューブは前オートクレーブ処理されているに接続する方法を示しています。「ブランク>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

  1. マーク培養容器内の30 mLで10 mLの範囲内の液体のすべての2mLの増加に対応する高さ。滅菌脱イオン水10mlを入れ、水位をマークし、2 mLを加え、水位をマークし、30 mLのレベルがマークされるまで繰り返します。彼らは容易に除去されないように明確なテープでマーキングをカバーし、そして液体を処分。
  2. 培養容器に、シリコーンガスケットを介してアルミポートの長い方の端を置きます。キャップをし。
  3. 1/16 "IDのシリコンチューブで1ショートアルミポートコンセントをカバーする。雌型ルアーロックを挿入した後、雄型ルアーロックプラグを接続することにより、遠位端を差し込みます。このコンセントは補足的であり、使用されません(チューブ6 図6に)。
  4. オスとメス型ルアーロックと1/16 "IDのシリコンチューブの2短いセグメントを接続します。短いアルミポートコンセントに一端を接続し、DISTAプラグlは雄ルアーと雌ルアーロックプラグで終わります。容器は、このチューブ( 図6のチューブ7 / 7.1)を介して接種されます。
  5. ID蠕動チューブとコネクター」を1月16日の端にIDチューブ "2 1/16を接続します。ショートアルミポートに一端を接続します図6にチューブ4)他のプラグ。以降、このメディアフラスコに接続されます。

7.メディアフラスコを準備

  1. 1/16「最長アルミポートに内径(ID)シリコンチューブを。チューブがメディアフラスコに到達するのに十分な長さでなければならない。1/8接続」の接続1/16の短いセグメントにIDオスルアーロックを」 IDチューブ、前のチューブにこれを接続し,,し、その後メディアフラスコ( 図6のチューブ3)上のゴム栓にこの短いセグメントを挿入します。
  2. チューブをクランプします。この接続は、空気が培養容器にメディアフラスコから流れることを可能にします。メディアフラスコを後で空気ANでポンピングされたときDこのチューブがアンクランプされ、文化は、曝気混合し、入ってくる泡によって正圧に保たれます。
  3. 「十分な長さのメディアが転送されるを通してストッパー、にフラスコの底に到達するためのIDチューブ。他1/16接続」1/16を挿入するには、このいずれかにIDのチューブを、次に3/16 "IDチューブそれは。3月16日、「ID雌型ルアーロックと雄ルアーロックプラグ(チューブ図6の1 / 1.1)でこれを差し込みます。
  4. ストッパーで第3ホールは、これが接続されます。1/16 "IDチューブ、中径の管の二つの他のセグメントに接続されており、先端部( 図6のチューブ2 / 2.1)でのプラグインの短いセグメントで埋めなくてはなりません真空ポンプへと以降の水槽ポンプへ。
    注:チューブは簡単にゴム栓の穴に収まらない場合は、斜めにチューブの端をカット。そして、貫通孔押される傾斜端部が通って残りを引っ張るために使用することができます。

  1. 1/16のセグメントに雄ルアーロックの挿入」IDのシリコンチューブ、その後しっかりと0.022挿入」IDのポリテトラフルオロエチレン(PTFE)チューブを。これとは別に、ロックと( 図6のチューブ5)ショートアルミポートに他を接続するためにPTFEチューブに沿って1/16 "IDチューブ。そして、スレッド一端に雌型ルアーロックを取り付けます。
  2. ID蠕動チューブとコネクター」1/50にIDのシリコンチューブ」さらさ1/50を接続します。このために、それらを交互に、1/50 "IDチューブと0.022の2セグメント」のID PTFEチューブの3つのセグメントに接続します。 1/16 "IDチューブ( 図6のチューブ5)を介して廃液フラスコに、これを接続します。
  3. アルミポートの二番目に長いチューブと廃液フラスコにもう一方の端に1/16 "IDのシリコンチューブの一端を接続します。このアルミニウム管は、培養液量を設定し、余分な文化は廃液容器(チューブ8内にオーバーフロー
  4. 30分間121℃、15 psiの(一般的な殺菌)で培養アセンブリをオートクレーブ。
    注:遠位部が汚染されている場合、滅菌を明らかにするために取り外すことができるように、メディアフラスコを真空にそれを通してメディアフラスコに充填され、それを通して管、およびそれを通して培養容器に接種され、チューブの複数のセグメントを有していますセグメント。

9.マイクロ流体チャネルを準備

  1. 1の比率:9にポリジメチルシロキサン(PDMS)と硬化剤を混ぜます。ドガとは、シリコンマスターモールド上に注ぎます。
  2. 65℃で2時間、PDMSを硬化させ、その後、かみそりの刃でマスクからそれをカット。それは金型から解放されるまでPDMSの周りにカットします。押し下げて脆いウエハを切断しないようにします。
  3. チャネルの両端に穴をパンチするために1.2ミリメートルIDの生検穴パンチャーを使用してください。
  4. カバーガラス24にプラズマ結合PDMS。
  5. テープの長 PDMSチャネルは、アルミフレームを中心とするように支持するアルミニウムフレームにカバーガラスの端部、およびその後65℃で2時間再度PDMSを焼きます。

10.メディアフラスコを埋めます

図7
図7:メディアを追加します。この図は、メディアがメディアフラスコ中に濾過し、真空でなければならない方法を示しています。これは、メディアが無菌のままであることを保証します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

  1. 適切なメディアを作成します。連続培養システムは、ケモスタットとして運転される場合は、特定の栄養のために限られたメディアを使用します。
    :S.セレビシエでの研究のための標準的な培地組成の例としては、以前に25を公開されています= "外部参照"> 26、27、28、29。
  2. 100ミリリットルボトルに真空フィルターを取り付け、ニップルカバーを取り外し、その後、滅菌ピンセットで真空フィルターの乳首から白いプラグを取り外します。
  3. 乳首に3/16 "IDのシリコンチューブを接続し、真空ポンプへのメディアフラスコの他のフリーのチューブ(チューブ1と、それぞれ図7の2)、および培養容器へのメディアのフラスコを接続するチューブがクランプされていることを確認シャット( 図7のチューブ3)。
  4. 、メディアでフィルタを記入し、真空ポンプをオンにしてから、メディアの残りの部分をフィルタリングします。真空(図7のチューブ2)に接続された1/16 "IDのシリコンチューブをクランプし、真空ポンプをオフにします。
  5. チューブの汚染されていない端部がアクセスできるように真空ポンプに接続された1/16 "IDチューブの中間セグメントからleursを削除してください。番目の挿入このチューブに滅菌シリンジエアフィルターの電子青終わり。
  6. 3/16 "IDのシリコンチューブ( 図7のチューブ1)をクランプし、そこから雄ルアーを切断する。培養容器のメディア導入管の雌ルアーからプラグを抜いてください。なるようにメディアを有効にするには、次のオスとメスのルアーを接続します培養容器にポンプ。
  7. 真空フィルターを外し、真空フィルターに付着したメディアの100mLのボトルキャップ。
  8. 培養容器を接種する前の日には、前のステップで収集した培地4mlで試験管に光遺伝学、微生物の単一コロニーを接種し、それを30℃または培養の最適温度を成長温度で一晩成長させ攪拌しながら。

11.顕微鏡の周りに装置を組み立てます

  1. 培養容器とeffluよりも高いメディアフラスコに顕微鏡の近くに連続培養アセンブリを設定します。0.022 "IDのPTFEチューブ( 6のチューブ5)のセグメントで構成管は顕微鏡のステージに到達することができるように、培養容器よりも低い耳鼻咽喉科フラスコは、。しっかりメディアフラスコと廃液容器にゴム栓を下にテープで固定します。
  2. それらを接続IDのシリコンチューブ0.022」1/50からID PTFEチューブ」( 6のチューブ5)の両端を抜いて、マイクロ流体デバイスの入口と出口にこれらの端を差し込みます。
  3. 水槽のポンプにシリンジエアフィルターの白い端を接続します。空気圧は、培養容器にメディアをプッシュします。
  4. メディアは廃液ポートのレベルに達すると、高速の周り1/16 "IDのメディアの入口チューブとコネクタ( 6のチューブ4)遅い蠕動ポンプの周りと1/50" IDの試料出口チューブとコネクタを包みます蠕動ポンプ( 6のチューブ5)。
  5. 空気TUをアンクランプすることにより、メディアを曝気メディアフラスコと培養容器の間です。
  6. その温度を制御することができるように、培養容器の加熱パッド及び温度計をテープ。入力メディアは、容器と同じ温度になりますので、培養容器の周囲のメディアチューブをコイル。
    注:加熱パッドにPWM電流がその目標温度での培養容器を保持するために温度計からの入力を使用してマイクロコントローラによって調節されます。
  7. LEDマトリクスに黒の泡のエンクロージャに培養容器を挿入し、チューブが挟まれていないことを確認してください。
  8. マイクロマネージャーでは、プラグイン>バイオリアクターコントローラにアクセスしてください。流量が非常に低いが、蒸発速度よりも大きくなる0に0.1へのフィールド」に関するメディアポンプ比」およびフィールド」にサンプルポンプ比」に設定します。
  9. メディアフラスコと培養容器との間に入ってくる空気チューブをクランプします。 中の接種チューブ(管7からプラグを外します
  10. 光が入らないように囲いを覆い、そして文化が一晩増殖してみましょう。

12.キャリブレーションポンピング料金

  1. マイクロマネージャーでは、プラグイン>バイオリアクターコントローラにアクセスしてください。 0.5フィールド」でのメディアポンプ比」と0のフィールド」にサンプルポンプ比」に設定します。
  2. 廃液フラスコ( 6のチューブ8)からの流出物をフラスコ( 6のチューブ8)とサンプリングチューブからオーバーフローチューブを外し、別々の容器に廃液を収集します。ポンプを15分間にされた後に開始、1時間廃液を収集します。
  3. 容器などに回収ボリュームから培養容器に媒体の流量を計算します。
  4. この線形推定によってフィールド」でのメディアポンプ比」の値を調整します。
    Equaiton 2
    どこ
    Equaiton 3
  5. 所望の流量との差になるまで、この較正手順を反復し、測定された流量は、流量を1時間にわたって平均化される<0.2ミリリットル/ hです。
  6. フィールド」にサンプル比」の値を増やして、培養容器を残して、ボリュームの約4/5 番目はサンプリングポンプによって圧送されるまで、同様の方法でそれを校正し、ボリュームの約1/5を介して、残していますオーバーフロー口。
  7. 連続培養装置で培養密度が一晩これらの条件下で平衡化してみましょう。
    注:目標流量に到達できない場合は、変更蠕動ポンプチューブ。液体は、より大きな直径のチューブが使用され、より高い速度でポンプ輸送されます。ステップ14に従って、その後、8.4のステップに戻ります。

13.培養微生物の顕微鏡画像を収集

  1. マイクロ流体チャネル内に圧送細胞の画像が焦点面になりますれる非重複位置の組でマイクロマネージャーのステージポジションリストを記入してください。
  2. 「バイオリアクターコントローラ」プラグインを開きます。プロンプトから目的のLEDマトリクスの時間経過、画像化チャネル、および他の実験設定を選択します。画像を収集し、分析します。
  3. 実験の実行中、メディアフラスコ内のメディアは明確なままであることを確認してください。それは濁っている場合は、汚染されています。

14.ポストの実験

  1. メディア、過剰な細胞培養および廃液を処分。
  2. 脱イオン水と混合した20%エタノール200mlでメディアフラスコを補充します。それは以前に持っていたとしてケモスタットを実行します。細胞の破片やメディアを洗い流すために、実験中に実行されて。
  3. アルコール溶液は、メディアフラスコから排出した場合、完全にケモスタットを分解。
  4. 温水と中性洗剤でガラス製品やチューブを洗浄し、脱イオン水で十分に洗い流してください。乾燥するままにしておきます。
  5. 実験の過程で温度とLEDマトリクスのステータスを確認するための「microcontrollerRecords.csv」ファイルを開き、画像の各セットと「結果<n>は.csvファイル」からの要約データをレビューする「Summary.csv」ファイルnはデータセットn 番目である各時間帯から、各ROIをまとめたデータを確認するファイル。

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Representative Results

この装置は、CRY2 / CIB1タンパク質対30に基づいて、誘導光遺伝学転写系を介して青色光に応答して、黄色蛍光タンパク質(YFP)を発現するS.セレビシエの培養物を刺激するために使用しました。細胞は0.2±0.008の平均希釈率でリン酸限定培地でchemostatically成長させました。リン酸塩の制限は、一般に、成長速度を制御するためにS.セレビシエケモスタット実験で使用され、リン酸制限の効果は十分に特徴付けられています。 31、32 連続的に希釈された培養容器33の流出物は、倒立顕微鏡でマイクロ流体デバイスにサンプリングしました。 図8に示すように、画像が自動的に分析されました。個々の細胞は、バックグラウンドを差し引いた位相コントラスト画像とそのYFPのconcentraで同定されましたバックグラウンドを差し引いた蛍光画像から測定されるようションは、それらの蛍光から推定しました。

169677細胞の蛍光を、実験の70時間にわたり、マイクロ流体デバイス内の28の場所から取得した排出物の33600画像から解析しました。我々は、蛍光照明系とCMOSカメラを装備した倒立顕微鏡を使用しました。 YFP画像は500/20 nmの励起フィルター、30分の535 nmの発光フィルター、およびT515lpダイクロイックを用いて取得しました。画像は、ケーラー照明の下で、40X位相差対物レンズを用いて撮影しました。画像は平方マイクロメートルあたり87ピクセルと16ビットの色深度で記録しました。培養は、6時間間隔で完全な暗闇に続く、6時間間隔で青色光の強度を変化させることに暴露しました。文化は前にその蛍光強度が最初の暗期中に減少している理由である最初の測定に光にさらされていました。</ P>

図9は、培養容器を照明に応答して起因する光遺伝学システムの起動時にYFP生産に蛍光を示しています。これは、平均単セル測定は、蛍光強度の人口分布を明らかにする集団にわたって蛍光の単セル測定の有用性を実証します。 42時間26分で外れ値に注意してください。対応する画像を確認した後、バックグラウンドを差し引いた画像中の細胞に似ているアーチファクトをもたらす、背景の合成画像を生成するために使用される画像の大部分において、細胞の塊があったことが明らかでした。また、培養容器からの泡は、マイクロ流体チャンネルに圧送し、その縁の部分は、画像解析アルゴリズムにより細胞と誤解しました。気泡やバックグラウンドを差し引いアーチファクトも、実際のセルに対応しているので、それらの測定された蛍光強度細胞の自己蛍光よりも低いです。この図は、自動的に3日間にわたって取得することができるデータの品質を実証します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図8
図8: 画像解析アルゴリズムの視覚的描写。これらの画像はトリミングされ、閲覧を容易にするために拡張されました。 (A)6つの画像は、細胞培養のバックグラウンドを差し引いた位相コントラスト画像を生成するために取得されます。主画像が取得された後に、5つの追加の画像を簡単にセルがずれていることを確認するために、各取得の間オン廃液サンプリングポンプを用いて取得されます。背景の合成画像は、5つの成分画像から生成されます。各画素の値背景画像5成分画像の両端が同じ画素の中央値です。 (B)バックグラウンドを差し引いた画像は、バイナリに変換されます。バイナリは、その後拡張され、バイナリの連続セクション内の穴が充填されています。黄色のアウトラインは大きさや真円度の基準に基づいて選択された関心領域(ROI)に対応しています。 (C)これらのROIは、各細胞の蛍光がROI内の最も明るいピクセルの値として測定された蛍光画像上にマッピングされます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図9
図9: 経時的な蛍光強度の人口分布 。これらの副図中の測定されたフッ素の対数escenceは、フローサイトメトリーにおける標準的な慣行に従って、表示されます。 ABの線は、培養容器内の細胞培養物を透過した無菌培地および光を透過光との強度の差として測定される培養によって吸収または回折された光の強度を示しています。なお、第2縦軸に対してプロットされています。時間の経過とともに人口の測定された蛍光の対数の(A)]ボックスおよびウィスカープロット(5 パーセンタイル 、25 パーセンタイル値、中央値、75 パーセンタイル 、95 パーセンタイル )。 (B)色に対応するビンの範囲で測定された蛍光を有する細胞の正規化周波数に対応し、同じデータの2次元ヒストグラム。色は42時間26分で、外れ値なしデータの範囲に含まれるスケールました。最低蛍光ビン内の外れ値の正規化周波数0.7です。 (C)光への最初の記録露光前と光に対する最大の暴露後の人口の測定された蛍光の対数の1次元ヒストグラム。それは、この株でYFPの光誘起式は二峰性であることを示しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

私たちは心の中で柔軟にこの装置を設計しました。使用されるすべてのコードはフリーでオープンソースです。セグメント細胞へのデフォルトの画像解析処理が簡単で、すぐに実行されます。カスタム解析は、フィジーグラフィック・ユーザ・インタフェースを代表画像を解析BeanShellのスクリプトに入力を変換し、その後、スクリプトを呼び出すためのプラグインを設定する際に、ユーザ入力を記録することによって実現することができます。それが呼び出されると、このスクリプトは、バックグラウンドを差し引いた画像の最新のセットにファイルパスを含む「画像」と呼ばれる文字列配列を送信されます。実験が突然終了した場合、それらが失われないように、それらが収集される画像やデータが保存されます。青色LEDアレイは、我々の光遺伝学系を誘導するために選択されたが、それは、異なる色のLEDに置き換えることができます。それは簡単にPCB上の追加のMOSFETスイッチとリレースイッチ用のマイクロコントローラ上だけでなく、スルーホール利用可能な追加の入力ピンと出力ピンがあります。このシステムのために、より複雑な目的のために適合されます。例えば、LEDに電力を供給し、培養容器に縛り付け光センサーから値を読み、その後、濁度を測定するためのソフトウェアを変更し、それに応じて容器を希釈するために、マイクロコントローラ上で追加のピンを使用し、タービとして動作し、この装置を作るために。

ケアは、敏感な顕微鏡装置を保護するために、流体の流量が一貫していることを確認するために、文化が汚染されないように注意する必要があります。培養容器は、意図的に接種されたときに前の汚染は、容器に接種し、内部には成長がないことを確認する前に数日を待つことによって検出することができます。顕微鏡対物レンズで細胞培養をこぼす回避するために、マイクロ流体デバイスは、吸収性の布の上にそれを介して第1ポンピング細胞培養によって漏れないことを確認してください。培養容器に培地の流れが不整合である場合、それは通常、チューブの周りため蠕動ポンプのローラが緩すぎるとなっています。水槽ポンプからの空気の流れが矛盾している場合、液体はプールと一貫性のない空気の流れに抵抗することが排水管にはU字型の曲がりがないことを確認してください。メディアはそれの内側まで乾燥しているため、チューブは実験後に詰まった場合は、目詰まりを溶解するために湯浴中で詰まったチューブを浸します。

実験の計画や結果を分析する際に考慮すべきこのプロトコルに固有の制限があります。希釈率と使用するチューブの長さに応じて、細胞培養物を顕微鏡に培養容器からポンプ輸送される間の約10分の遅れがあります。したがって、十分に短い時間スケールにわたって発生研究のイベントに適していません。実験は、メディアの容量によってのみ制限され、約10日間連続して実行することができますしながら、また、細胞培養の進化は、実験が増加する期間として考慮されなければなりません。リミメディアのティン栄養素、代謝および遺伝子発現35、36、37、38、39に重大な影響を有し、したがって、研究対象の生理学の局面に基づいて決定されるべきです。結果を分析すると、画像、特に辺境のデータから画像のROIを画像解析ルーチンによって同定されたような方法でエラーを検討する点が、必要があります。気泡やアーチファクトが細胞について誤解することにより測定された蛍光をゆがめることが可能です。このような誤測定を排除するための簡単な方法の1つは、自家蛍光強度以下の蛍光強度を持つすべてのROIを破棄することです。

このプロトコルは、セット連続培養で増殖することができる生物で光に応答して蛍光強度および/または廃液細胞培養の細胞形態を測定するために有用であろう攪拌しない一貫性のある焦点面にTLE、及び自動画像分析アルゴリズムによって同定すること。ここで使用されるデフォルトのセル識別アルゴリズムは、出芽酵母似ているほぼ球形の微生物に最も直接的に適用されます。このプロトコルの一代替手段40は、バッチ培養のセットで微生物を成長し、各時点について一括をサンプリングし、フローサイトメトリーによってサンプルを特徴付けることです。しかしながら、ここで説明されたプロトコルの利点は、同じ培養物から採取されたサンプルは、多くのサンプルを採取することができ、プロセスが自動化されることです。このプロトコルはまた、光遺伝学酵母が継続的に培養し、蛍光によって関心領域の識別をバイアスすぐにではなく、複数の画像を取得することにより、顕微鏡34の下で撮像されたされた同様の方法を改善します。このプロトコルの大きな利点は、個々の細胞の多くの測定が定期的にwitho数日間にわたって取得することができることですUTのユーザー入力。露光に微生物培養物の応答を測定した後、次のステップは、応答のシリコ閉ループ制御実装することができます。

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Disclosures

著者らは、開示することは何もありません。

Acknowledgements

私たちは便利な議論や編集のためのプロトコル、キーラン・スウィーニーをテストする際に支援するためのモリーラザルとベロニカ・デルガドに感謝して、原稿の重要な読書のためのテイラー・スコット、私のアン・adirekkun、およびステファニーゲラーだろう。ミーガンニコールMcClean氏、博士バローズウェルカム基金からの科学的なインターフェイスでのキャリア賞を保持しています。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Extensive lab manual GitHub NA An extensive, regularly updated lab manual is available in the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). This also includes a description of the microfluidic mold used to generate the representative results.
Fritzing Design Viewer Fritzing NA The free, open-sourced software to view and edit the .fzz type circuit board designs is available at "http://fritzing.org/download/"
Arduino Uno R3 (Atmega328 - assembled) Adafruit 50 Microcontroller. 1 required.
Arduino Stackable Header Kit SparkFun Electronics 10007 Female pin headers for connecting PCB to microcontroller. 1 required.
Adjustable 30W 110V soldering iron - XY-258 110V Adafruit 180 For making electrical connections to the PCB. 1 required.
Soldering iron stand Adafruit 150 For making electrical connections to the PCB. 1 required.
Mini Solder spool - 60/40 lead rosin-core solder 0.031" diameter - 100g Adafruit 145 For making electrical connections to the PCB. 1 required.
0.1 μF capacitor SparkFun Electronics COM-08375 Stabilizes voltage in PCB. 1 required.
10 μF capacitor SparkFun Electronics COM-00523 Stabilizes voltage in PCB. 1 required.
MAX7219CNG LED Matrix/Digit Display Driver - MAX7219 Maxim MAX7219CNG LED driver. 1 required.
8 pin IC Socket Mouser Electronics 575-144308 16 required. These will be stacked on top of each other to support the culture vessel above the LED matrix.
24 Pin IC socket Mouser Electronics 535-24-3518-10 Optional. Use this to reversibly attach the MAXIM 7219CNG driver to the PCB.
Digital multimeter Adafruit 2034 For troubleshooting electronics. 1 required.
Break Away Headers - 40-pin Male (Long Centered, PTH, 0.1") SparkFun Electronics PRT-12693 Male pin headers for connected LED matrix to printed circuit board. Ends can be trimmed with wire cutters. 1 set required. 
Flush diagonal wire cutters Adafruit 152 For trimming long pin headers and cutting power cables. 1 required.
Premium Female/Female Jumper Wires - 40 x 12" (300mm) Adafruit 793 Wire ribbon for connecting breadboard to LED matrix. Can be connected end-to-end with male pin-headers to be longer. 1 required.
Half-size breadboard Adafruit 64 The LED matrix will connect to this and the culturing vessel will rest above it.
Miniature 8x8 Blue LED Matrix Adafruit 956 Light source. Dominant wavelength is 470nm (blue). 1 required. Alternative miniature LED matrices from the same vendor are available with dominant wavelengths: 624 nm (red), 588 nm (yellow), 525 nm (green), 572 nm (yellow-green), and white.
Stackable header-3 pin SparkFun Electronics 13875 8 required.
Resistor Kit - 1/4W (500 total) SparkFun Electronics 10969 For electronics. 1 required.
 IRL520N MOSFET International Rectifier IRL520N Voltage regulating switch for controlling DC current. 4 required.
Hook-Up Wire - Assortment (Solid Core, 22 AWG) SparkFun Electronics PRT 11367 Wire for electronics. 1 required.
5V 2A (2000mA) switching power supply - UL Listed Adafruit 276 Power supply for the heating pad and Arduino. 2 required.
12 VDC 1000mA regulated switching power adapter - UL listed Adafruit 798 For peristaltic pumps. 2 required.
Electric Heating Pad - 10cm x 5cm Adafruit 1481 For heating the bioreactor. 1 required.
Low flow variable flow peristaltic pump Fisher Scientific 13-876-1 For pumping media. 1 required
Medium flow variable flow peristaltic pump Fisher Scientific 13-876-2 For pumping culture. 1 required.
9 VDC 1000mA regulated switching power adapter - UL listed Adafruit 63 For microcontroller power supply. Order 1.
High Temp Waterproof DS18B20 Digital temperature sensor + extras Adafruit 642 Thermometer for the bioreactor. 1 required.
Micromanager Micromanager NA The free, open-sourced microscope control software is available at "https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release"
FIJI ImageJ NA The free, open-sourced image analysis software is available at "http://fiji.sc/"
Arduino Integrated Development Environment Arduino NA The free, open-sourced IDE is available at "https://www.arduino.cc/en/Main/Software"
Custom code GitHub NA The custom microcontroller code and "Bioreactor Controller" plugin are available in the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).
USB Cable A to B - 6 Foot SparkFun Electronics CAB-00512 Used to download data to microcontroller. 1 required.
bioreactorTimecourse_example.csv GitHub NA The advantage of loading LED matrix values from a CSV file is that a program can be called by the plugin to update those values based on image analysis results, and those values can be reloaded to the microcontroller, enabling feed-back control. It is available from the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).
Tota-frost gels (diffusion paper) B&H B&H # LOFSFTL
MFR # T1-72
For LED matrix. 1 required.
Kitting Sheet Crosslink 1/4x12x24in Grainger, inc 20JL37 Black foam for culturing vessel enclosure. 4 required.
Standard Photodiode Power Sensor, Si, 200 - 1100 nm, 50 mW  Thorlabs S120VC For measuring light intensity. 1 required.
Labelling Tape Fisher Scientific 159015N For labelling and securing loose components. 1 required.
Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD Thorlabs PM100D For measuring light intensity. 1 required.
100mL GL45 hybridization glass bottle Bellco Glass, Inc. (7910-40150) Bioreactor vessel. 1 required.
Six port assembly Bellco Glass, Inc. Custom  For the bioreactor vessel. Tubing Specs: .125" OD x .055"ID. Port A: 1.0" long above cap slug and to bottom of tube. Ports B,C,E,F: 1.0" long above cap slug, 33 mm long below. Port D: 1.0" long above cap slug, 65 mm  long below. 1 required. Includes 45 mm diameter polypropylene open top screw cap and a white silicone gasket to ensure a tight seal between the cap and the vessel. 
Scotch Magic Tape 3105, 3/4 x 300 Inches, Pack of 3 Amazon B0009F3P3U Clear scotch tape. This is available from many other vendors. It is used to cover markings on the culturing vessel and to secure the coverglass with the PDMS channel to the aluminum support frame.
1/16" ID x 3/16" OD x 1/16" Wall Tygon Sanitary Silicone Tubing United States Plastic Corp. 57288 Tubing. ~25' required.
Cole-Parmer Twistit white rubber stopper, size 10 Cole-Parmer EW-62992-32 Media flask stopper and effluent flask stopper. 2 required.
2L Laboratory Flask Pyrex 4980 Media flask and effluent flask. 2 required.
Day pinchcock Fisher Scientific 5867 For pinching tubes shut. 3 required.
Replacement tubing assembly 1/16" ID Traceable Products 3372 The peristaltic pumps come with a set of tubes, but they wear out after weeks of use.
Replacement tubing assembly 1/50" ID Traceable Products 3371 The peristaltic pumps come with a set of tubes, but they wear out after weeks of use.
Male luer with lock ring x 1/16" hose barb, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45505-00 Connectors. ~10 luers are required.
Male luer with lock ring x 1/8" hose barb, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45505-04 Connectors. 5 required, one for each rubber stopper hole to fill with tubing.
Female luer x 1/16" hose barb adapter, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45502-00 Connectors. ~10 luers required.
Female luer x 3/16" hose barb adapter Cole-Parmer EW-45502-08 Connectors. ~10 luers required.
Cole-Parmer Luer Accessory, Female Luer Cap, Nylon, 25/Pk Cole-Parmer SC-45502-28
Cole-Parmer Luer Accessory, Male Luer Lock Plug, Nylon, 25/Pk Cole-Parmer EW-45505-56
Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID x 0.042"OD, 100 ft/roll Cole-Parmer EW-06417-21 Tubing. 1 roll required.
Masterflex platinum-cured silicone tubing, L/S 13, 25 ft Cole-Parmer EW-96410-13 Tubing. ~25' required.
3/16" ID x 1/4" OD x 1/32" Wall Tygon Sanitary Silicone Tubing United States Plastic Corp. 57293 Tubing. ~1' required.
Vacuum filter Fisher Scientific 974107 Nalgene vacuum filter for sterile filtering media.
Aquel Oxy-Boost 200 Rena Aquatic Supply AP200 Dual diaphram adjustable flow air pump for aerating and mixing media. 1 required. 
0.2 μm pore syringe filter Corning International 431229 This ensures that air from the aquarium pump does not contaminate the apparatus. 1 required.
Slygard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning Slygard 184 For microfluidic device. 1 required.
American Safety Razor GEM Scientific Single-Edge Razor Blades Fisher Scientific 17989000 For cutting tubes and PDMS. 1 blade required.
Harris Uni-Core hole puncher 1.2mm ID Sigma-Aldrich WHAWB100028 ALDRICH For punching inlet/outlet in microfluidic device. 1 required.
Microscope cover glass 22x60-1.5 Fisher Scientific 12-544-G For microfluidic device. 1 required.
Rectangular aluminum frame with a square window Custom Custom To support the microfluidic channel. Outer dimensions: 3 inches x 1.25 inches.
Inner dimmensions (cut out portion): 7/8 inches x 7/8 inches
Thickness: ~1/32 inches

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References

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