Design og implementering af en automatiseret lysende, Dyrkning, og Sampling System for Mikrobiel optogenetic Applications

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi designede en kontinuerlig dyrkning apparat til brug med optogenetic systemer til at belyse kulturer af mikrober og regelmæssigt billedceller i effluenten med et inverteret mikroskop. Dyrkning, prøveudtagning, billedbehandling og billedanalyse er fuldt automatiseret, så dynamiske reaktioner på belysning kan måles over flere dage.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Stewart, C. J., McClean, M. N. Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications. J. Vis. Exp. (120), e54894, doi:10.3791/54894 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Optogenetic systemer anvender genetisk kodede proteiner, der ændrer konformation som reaktion på specifikke lysbølgelængder at ændre cellulære processer. Der er behov for dyrkning og målesystemer, der inkorporerer programmerede belysning og stimulering af optogenetic systemer. Vi præsenterer en protokol til opbygning og anvendelse af en kontinuerlig dyrkning apparat til at belyse mikrobielle celler med programmerede doser af lys, og automatisk erhverve og analysere billeder af celler i spildevandet. Driften af ​​apparatet som en chemostat tillader vækstraten og den cellulære miljø, der skal tæt kontrolleret. Effluenten af ​​den kontinuerlige cellekultur regelmæssigt stikprøven, og cellerne afbildes af flere kanaler mikroskopi. Dyrkning, prøveudtagning, billedbehandling og billedanalyse er fuldt automatiseret, så dynamiske reaktioner i fluorescensintensitet og cellulære morfologi af celler stikprøven fra kulturen spildevand måles over flere dageuden brugerinput. Vi demonstrerer anvendeligheden af denne dyrkning apparat ved dynamisk at inducere proteinproduktion i en stamme af Saccharomyces cerevisiae manipuleret med et optogenetic system, der aktiverer transskription.

Introduction

Optogenetic systemer bruger lys til at styre en voksende liste af cellulære processer, herunder genekspression, 1, 2, 3, 4, 5 proteinlokalisering, 6 proteinaktivitet, 6, 7, 8-protein binding, 8, 9, 10 og proteinnedbrydning. 11 En metode til dyrkning af celler i et kontrolleret miljø med programmeret optisk stimulation og til måling af deres respons over biologisk relevante tidsskalaer er nødvendig for at udnytte potentialet i disse værktøjer til forskning i cellebiologi og bioteknologi. Vores fremgangsmåde drager fordel af chemostasis at opretholde en konstant celle vækst i en velblandet, aevurderet, og temperaturstyret glas dyrkningsbeholder 12, 13, der er udsat for programmeret belysning. Vi billeddata individuelle celler i kulturen spildevand med et inverteret mikroskop til måling af, kulturen til programmeret belysning. Dyrkning, prøveudtagning, billedbehandling og billedanalyse er fuldt automatiseret, så fluorescensintensiteten og cellulær morfologi spildevandet cellekultur kan måles over flere dage uden brugerinput.

Denne protokol kan implementeres i de fleste laboratorier er fortrolige med voksende cellekultur og mikroskopi, og det anvendte apparat er billig og lavet af let tilgængelige komponenter. En gennemsigtig dyrkningsbeholder anbringes over en matrix af lysemitterende dioder (LED), der kan udsende 1 pW / cm2 -10 mW / cm2 af lys. Mikrober dyrkes i dyrkningsbeholderen kontinuerligt; en peristaltisk pumpe bruges til at tilføje medier påfortynding rate, en anden bruges til at trække kulturen på en mindre sats til mikroskopet, og forskellen undslipper gennem et overløb stikkontakt. En varmepude opretholder temperaturen. Luft kontinuerligt pumpet ind i dyrkningsbeholderen at opretholde et positivt tryk samt at blande og lufte kulturen. Bortset fra luftpumpen, er strøm til disse enheder reguleret af en microcontroller, der også modtager input fra et termometer og en tilsluttet computer. Effluenten cellekultur pumpes til en mikrofluidanordning på scenen af ​​et omvendt mikroskop. Ikke-fluorescerende og fluorescerende billeder automatisk erhverves. Cellerne i billederne er karakteriseret ved en algoritme, der lokaliserer hver celle som et område af interesse (ROI) og måler egenskaberne for hver ROI.

For at demonstrere en anvendelse af denne protokol, vi målte reaktion på varierende lysintensiteter af Saccharomyces cerevisiae-celler manipuleret med en blå lys responsive optogenetic system, som kontrollerer transkriptionen af ​​fluorescerende protein. S. cerevisiae, almindeligvis kendt som bagegær, blev valgt, fordi der allerede findes flere optogenetic systemer til kontrol af genekspression i dette system 14, 15, 16. Desuden er denne model organisme almindeligt anvendt til studier i systembiologi 17 og som et chassis til bioteknologiske applikationer 18, 19, 20. Vores repræsentative resultater viser, at denne protokol kan anvendes til at styre transkription af en kultur over flere dage ved at variere input lysintensiteter og måling af produktion af en fluorescerende reporter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

figur 1

Figur 1: Den kontinuerlige dyrkning apparat. Denne forenklede diagram viser, hvordan apparatet skal samles, når det anvendes til kultur, belyse og måle optiske egenskaber af mikrober. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: Oversigt over protokollen. Trinene i det skraverede område skal gentages hver gang der bruges protokollen. Lukket sløjfe kontrol er mulig 34, men er ikke implementeret i denne protokol.

1. Saml Termometer til Circuit Board


Figur 3: Tilslutning til at læse termometer værdier. Dette diagram viser, hvordan det digitale termometer skal forbindes til PCB således at microcontroller kan få feedback til at styre temperaturen af ​​kulturen. Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Lod Ground, Data og positiv spænding linjer af det digitale termometer til deres respektive gennemgående huller mærket "GD + V."
  2. Clip off en pin fra en kvindelig 3-pin header og trim de resterende 2 ben med wire neglesaks, sådan at det kan passe ind i de to gennemgående huller mærket "R2" og ikke hindre microcontroller. Lod dette på plads. Forbind de to loddede stifter ved at indsætte en 4,7 kohm modstand i pin header.

2. Tilslut Power Conkontrolsystemer Komponenter til Circuit Board

Figur 4
Figur 4: Forbindelser til at styre strømmen til varmepuden. Dette diagram viser, hvordan PCB og tilbehørsdele bør samles for at styre strømmen til varmepuden. Delene til styring af peristaltiske pumper er forbundet på en tilsvarende måde. Bemærk, at komponenterne til termometeret er blevet fjernet for klarhedens skyld. Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Skær 1 cm fra stifter af fem kvindelige 3-pin headers. Lod disse til de positioner på printkortet (PCB) markeret som "# 1", "# 2", "# 3", "# 4" og "CB E."
  2. Skær 1 cm fra stifter af en kvindelig 6-pin og 8-pin header. Lod disse ved siden af ​​hinanden tilsøjlen af ​​gennemgående huller mærket K1 gennem K14.
  3. Tilslut varmepuden til printpladen.
    1. Sæt enderne af en 100 kohm modstand i de gennemgående huller mærket K1 og K2 på printet. Indsætte en metal-oxid-halvleder felt-effekt transistor (MOSFET) til positionen markeret # 1 på printet, med etiketten af ​​MOSFET vender mod K1 gennem K14 gennemgående huller, således at kilden pin er tættest på "# "label, og drænet pin er længst fra" # "label.
    2. Skær jorden linje i 5 V jævnstrøm (DC) strømforsyning kabel og slutte den til J2. Forbind jorden linje i varmepude til J1. Slut K3 til pin 3 med en 1 kohm modstand. Aktuelle bør nu kun flyde fra J1 til J2, når ben 3 er sat til + 5V.z
      BEMÆRK: modstand / MOSFET sæt fungerer som en omskifter, der tillader strøm at flyde fra ben J1 til J2 når ben 3 af microcontroller sættes til +5 V.
  4. Forbindeden langsomme peristaltisk pumpe.
    1. Sæt enderne af en 100 kohm modstand i de gennemgående huller mærket K4 og K5 på printet. Indsæt en MOSFET til positionen markeret # 2 på printet, med etiketten af ​​MOSFET vender mod K1 gennem K14 gennemgående huller, således at kilden pin er tættest på "#" label, og drænet pin er længst fra "#" etiket.
    2. Skær jorden linje i 12 V DC strømforsyning kabel af den langsomme peristaltisk pumpe. Tilslut den peristaltiske pumpe vender ende på J3 og væggen vorte vender ende til J4. Slut K6 til ben 4 med en 1 kohm modstand. Aktuelle bør nu kun flyde fra J3 til J4 når ben 4 er sat til 5 V.
  5. Forbind den hurtige peristaltisk pumpe
    1. Sæt enderne af en 100 kohm modstand i de gennemgående huller mærket K7 og K9 på printet. Sæt en MOSFET ind i position markeret # 3 på printet, med etiketten af ​​MOSFET vender mod K1 gennem K14 gennem huller s o at kilden pin er tættest på "#" label, og drænet pin er længst fra "#" label.
    2. Skær jorden linje i 12 V DC strømforsyning kabel af den hurtige peristaltisk pumpe. Tilslut den peristaltiske pumpe vender ende til J5 og væggen vorte vender ende til J6. Slut K9 til ben 5 med en 1 kohm modstand. Aktuelle bør nu kun flyde fra J5 til J6 når ben 5 er sat til 5 V.

3. Tilslut LED Matrix til Circuit Board

Figur 5
Figur 5: Tilslutning til at styre LED-matrix. Dette diagram viser, hvordan LED matrix skal forbindes til printet. Den viser også, at PCB kan stables microcontroller. Bemærk, at komponenterne til termometeret og til styring jævnstrøm til andre enheder er blevet fjernet for klarhedens skyld.es / ftp_upload / 54894 / 54894fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Lodde 6-bens 10-pin, og de to 8-pin hun pin headers i de gennemgående huller på siderne af PCB, således at den kan stables oven på microcontroller.
  2. Lod 100 nF og de 10 uF kondensatorer til deres markerede positioner på printet, at bemærke, at den negative terminal på 10 uF kondensator (kortere bly) skal tilsluttes den gennemgående hul markeret med et negativt fortegn.
  3. Lod LED-driveren til 2 med 12 sæt af gennemgående huller, med fordybningen på førerens langt fra de gennemgående huller, der er forbeholdt LED matrix.
  4. Lod 2 kolonner af mandlige pin headers til de gennemgående huller markeret til LED-matrix, og trim enderne af disse under breadboard sådan at de ikke vil hindre microcontroller. Forbind disse til to 8-wire strimler af kvindelige / kvindelige jumperledninger. Tilslut et andet sæt af mandligepin headers til den anden ende af jumper ledninger.
  5. Sæt LED-matrix over medianen af ​​breadboard, og sæt derefter det andet sæt pin headers til søjlerne på hver side af matricen. Sikre, at de elektriske tilslutninger er den samme, som hvis LED matrix var blevet direkte forbundet til PCB med den mærkede side af matricen svarende til den mærkede kolonne i gennemgående huller.
  6. Clip off en pin fra en kvindelig 3-pin header og trim de resterende 2 ben med wire neglesaks, sådan at det kan passe ind i de to gennemgående huller mærket "R1" og ikke hindre microcontroller. Lod dette. Forbind de to loddede stifter ved at indsætte en 1 kohm modstand i pin header.
    Bemærk: dyrkningsbeholderen stakkes over lysdioden matrix. Hvis wiren bånd hindrer fartøjet, offset dem fra matrixen. Brug derefter fast kerne wire til at bygge bro mellem matrix stifter og ledninger farvebånd stifter, således at de elektriske forbindelser ikke Change.

4. Installer software og Opret forbindelse til Hardware

  1. Stable PCB på microcontroller.
  2. Følg linkene i listen materialer til at downloade Integrated Development Environment (IDE) og brugerdefinerede kode for microcontroller.
  3. Slut microcontroller til mikroskopet computer via en AB Universal Serial Bus (USB) kabel. Compile og uploade den brugerdefinerede kode til microcontroller.
  4. Hent Micro-manager 21, 22 og FIJI 23. Konfiguration Micro-Manager som en FIJI plugin ved at kopiere alle "Dll" filer, de "mmplugins" mappe, og "mmautofocus" mappe fra den mappe, hvor Micro-manager blev hentet ind i "Fiji.app" mappe. Også kopiere "plugins / Micro-Manager" mappe i "Fiji.app/plugins" mappe.
  5. Download "BioreactorController.jar" fil into "Fiji.app/mmplugins" mappe.
  6. Åbn Micro-Manager fra FIJI> Plugins> Micro-styring> Micro-manager Studio. Brug Hardware Configuration Wizard til at konfigurere softwaren til at styre mikroskop. Medtag "FreeSerialPort" enhed i guiden med etiketten af ​​den port, som AB USB-kablet er tilsluttet.

5. Lav og karakterisere Light-bevis kabinet til Dyrkning Vessel

  1. Stable tre 8 pin IC sokkel som byggesten på breadboard ved hvert hjørne af LED matrix, således at dyrkningsbeholderen kan hvile på dem over matrixen.
  2. Fastgøre en del af diffusion papir under det øverste lag af soklerne, således at lyset, der rammer dyrkningsbeholderen fra LED matrix er diffus.
  3. Skåret ud tre 8 "med 6" dele af sort skum. Skære en del, der er af samme størrelse som den elektroniske breadboard (2,3 "x 3,5") fra indersiden af ​​den første two og en del, som er størrelsen af ​​rektanglet, som de IC sokler (0,9 "x 1,8") fra indersiden af ​​den tredje. Stable disse lag over LED matrix, således at det sidste lag indeholdende 0,9 "x 1,8" blænde ligger selv med toppen af ​​IC sokler, og omgiver LED matrix.
  4. Skær et ekstra ark af sort skum i halve for at gøre en 6 "med 24" rektangel. Rulle det ind i et hult søjle af sort skum, dyrkningsbeholderen kan passe ind med plads til rør og ledninger, således at den termisk og optisk vil isolere dyrkningsbeholderen.
  5. Centrer hule kolonne i sort skum over LED-matrix, og markere grænsen af ​​kolonnen på laget af sort skum under det. Denne grænse vil markere, hvor det skal være centreret i fremtiden.
  6. Skære en 3 "x 3" delen af ​​sort skum. Brug dette senere som et låg, der kan tapes til toppen af ​​kolonnen for at blokere eksternt lys.
  7. Fastgør fotodiode power sensor til th e dyrkning fartøjets kasket med tape, fastgør dækslet, og sæt dyrkning fartøj i kabinettet.
  8. I Micro-manager, gå til Plugins> bioreaktor Controller. Indstil matrix tændes på en delmængde af den række af mulige intensiteter ved 30 s intervaller.
  9. Optag de lysstyrker, som vises på power meter konsol tilsluttet strøm sensor. Disse målinger vil give den faktiske intensitet af lys at være kendt, når antallet af lysdioder, der tændes og puls-bredde-moduleret (PWM) strøm til disse lysdioder er indstillet.

6. Forbered Dyrkning Vessel

Figur 6
Figur 6: Fartøjets forbindelser. Dette diagram viser, hvordan beholderen og slangen af ​​apparatet skal forbindes, før de autoklaveret.blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Marker højde svarende til hver 2 ml forøgelse af væske i området fra 10 ml til 30 ml i dyrkningsbeholderen. Sæt 10 ml sterilt deioniseret vand, markere vandstanden, tilsættes 2 ml, markerer vandstanden, og gentag indtil 30 ml niveau er markeret. Dæk markeringerne med klar tape, så de ikke let fjernes og bortskaffes i væsken.
  2. Anbring den lange ende af aluminium åbning gennem den silikone pakning, i dyrkningsbeholderen. Skru hætten.
  3. Dæk en kort aluminium port stikkontakt med 1/16 "ID silicium slange. Sæt den distale ende ved at indsætte en kvindelig luer lock og derefter forbinde en mandlig luer lock stik. Denne afsætningsmulighed er supplerende, og vil ikke blive brugt (rør 6 i figur 6 ).
  4. Forbind to korte segmenter af 1/16 "ID silikone slange med mandlige og kvindelige luer låse. Slut den ene ende til en kort aluminium port stikkontakt og sætte distal ende med en han-luer og Luer lock stik. Fartøjet vil blive podet gennem dette rør (rør 7 / 7.1 i figur 6).
  5. Forbind to 1/16 "ID rør til enderne af 1/16" ID peristaltisk slanger og konnektorer. Tilslut den ene ende til en kort aluminium-port og sæt den anden (rør 4 i figur 6). Senere vil denne blive forbundet til medierne kolbe.

7. Forbered Media Kolbe

  1. Tilslut en 1/16 "indre diameter (ID) silikone rør til den længste aluminium-port. Røret skal være lang nok til at nå medierne kolben. Tilslut en 1/8" ID mandlige luer lock til en kort segment af 1/16 " ID slanger, tilslutte denne til det foregående rør ,, og derefter indsætte denne korte segment i gummiproppen på medierne kolbe (rør 3 i figur 6).
  2. Spænd røret. Denne tilslutning tillader luft at strømme fra medierne kolben til dyrkningsbeholderen. Når mediet kolben senere pumpes med luft end dette rør er fastspændt, vil kulturen blandes, beluftet og holdt ved et positivt tryk af indkommende bobler.
  3. Indsæt en 1/16 "ID rør lang nok til at nå bunden af ​​kolben til proppen, hvorigennem medier vil blive overført. Tilslut et andet 1/16" ID rør til denne ene, og derefter en 3/16 "ID rør til det. Sæt dette med en 3/16 "ID luer lås og en mandlig luer lock stik (rør 1 / 1.1 i figur 6).
  4. Det tredje hul i proppen skal fyldes med et kort segment af 1/16 "ID slange, forbundet til to andre segmenter af rør medium diameter og sat ved den distale ende (rør 2 / 2.1 i figur 6). Dette vil være forbundet til en vakuumpumpe og senere til et akvarium pumpe.
    BEMÆRK: Hvis slangen ikke nemt kan passe gennem hullerne i gummiproppen, klippe enderne af slangen på skrå. Derefter kan den skrå ende, som skubbes gennem hullet anvendes til at trække resten igennem.

  1. Indsæt en mandlig luer lock til et segment af 1/16 "ID silikoneslanger, og derefter isætte 0,022" ID polytetrafluorethylen (PTFE) slange. Særskilt, vedhæfte en kvindelig luer lock til en 1/16 "ID rør. Derefter tråd ene ende langs PTFE rør til at forbinde låse og den anden til en kort aluminium-port (rør 5 i figur 6).
  2. Tilslut den udsatte 1/50 "ID silikone rør til 1/50" ID peristaltisk rør og stik. Til dette, skal du tilslutte tre segmenter af 1/50 "ID slange og to segmenter af 0,022" ID PTFE slange, skiftevis dem. Tilslut dette til afløbet kolben via 1/16 "ID-rør (slangen 5 i figur 6).
  3. Forbind den ene ende af en 1/16 "ID silikone rør til den anden længste rør i aluminium port og den anden ende til spildevandet kolbe. Denne aluminiumsrøret indstiller lydstyrken kultur, og overskydende kultur rækker ind effluenten beholder (rør 8 i
  4. Autoklaver dyrkningen samling ved 121 ° C og 15 psi (generel sterilisering) i 30 min.
    Bemærk: Rørene, hvorigennem mediet kolben fyldes, hvorigennem mediet kolben vacuumed, og gennem hvilket dyrkningsbeholderen inokuleres har flere segmenter af rør, således at hvis det distale segment er forurenet, kan den fjernes for at afsløre en steril segment.

9. Forbered Mikrofluid Channel

  1. Bland polydimethylsiloxan (PDMS) og hærder i en 9: 1-forhold. Degas og hæld på silicium mester skimmel.
  2. Hærde PDMS i 2 timer ved 65 ° C og derefter skære den fra masken med et barberblad. Skære rundt PDMS indtil den frigøres fra formen. Undgå at trykke ned og bryde den skrøbelige wafer.
  3. Brug en 1,2 mm ID biopsi hul Puncher at hulle i begge ender af kanalen.
  4. Plasma-bond PDMS til dækglasset 24.
  5. Tape lange ender af dækglasset til den bærende aluminiumsramme, således at PDMS kanal er centreret på rammen aluminium, og derefter bage PDMS igen i 2 timer ved 65 ° C.

10. Fyld Media Kolbe

Figur 7
Figur 7: Tilføjelse medier. Dette diagram viser, hvordan medier bør være vakuumfiltreret i mediet kolben. Det sikrer, at medierne fortsat er steril. Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Foretag passende medier. Hvis den kontinuerlige dyrkning vil blive drevet som en chemostat, bruge medier begrænset til bestemte næringsstoffer.
    BEMÆRK: Eksempler på standard medier sammensætning til undersøgelser med S. cerevisiae er tidligere publiceret 25,= "xref"> 26, 27, 28, 29.
  2. Fastgør vakuum-filter til en 100 ml flaske, fjerne brystvorten dækslet, og fjern derefter det hvide stik fra brystvorten af ​​vakuum filter med sterile pincetter.
  3. Forbind 3/16 "ID silikone rør til niplen, medierne kolben øvrige frie rør til en vakuumpumpe (rør 1 og 2 i figur 7, henholdsvis), og sikre, at røret medierne kolben til dyrkningsbeholderen forbinder er fastspændt lukke (rør 3 i figur 7).
  4. Fyld filteret med medierne, tænde vakuumpumpen, og derefter filtrere resten af ​​medierne. Spænd 1/16 "ID silikone slange forbundet til vakuum (rør 2 i figur 7) og sluk for vakuumpumpen.
  5. Fjern Leurs fra den mellemliggende segment af 1/16 "ID slange forbundet til vakuumpumpen, så en uforurenet ende af røret er tilgængelig. Indsæt the blå ende af en steril sprøjte luftfilter ind i dette rør.
  6. Spænd 3/16 "ID silikone slanger (rør 1 i figur 7) og afbryd den mandlige luer fra det. Træk stikket ud Luer af dyrkning fartøjets medier indløbsrør. Forbind disse mandlige og kvindelige Luers at gøre det muligt for medierne at være pumpet ind i dyrkningsbeholderen.
  7. Tag vakuum filter og cap 100 ml flaske medier, som blev knyttet til vakuum-filter.
  8. En dag før dyrkning fartøj vil blive podet, pode en enkelt koloni af optogenetic mikrobe i et reagensglas med 4 ml af de medier, der er indsamlet i det foregående trin, og lad det vokse natten over ved 30 ° C eller kulturens optimal vækst temperatur temperatur under omrøring.

11. Apparatet samles Omkring mikroskop

  1. Indstil den kontinuerlige dyrkning samling nær mikroskopet med medierne kolbe højere end dyrkningsbeholderen og effluent kolbe lavere end dyrkningsbeholderen, således at røret sammensat af segmenter af 0,022 "ID PTFE-slange (slangen 5 i figur 6) kan nå mikroskopbordet. Sikker tape ned gummipropperne på medierne kolben og spildevand beholder.
  2. Træk stikket enderne af 0,022 "ID PTFE-slange fra 1/50" ID silikone tube forbinder dem (slangen 5 i figur 6), og sæt disse ender i indløbet og udløbet af den mikrofluidapparatet.
  3. Tilslut det hvide ende af sprøjten luftfilter til akvariet pumpen. Lufttrykket vil skubbe medier i dyrkningsbeholderen.
  4. Når mediet når niveauet af udløbet port, pak 1/16 "ID medier indløbsslangen og konnektorer omkring den langsomme peristaltisk pumpe (rør 4 i figur 6) og 1/50" ID prøveudløbsporten slanger og konnektorer omkring den hurtige peristaltisk pumpe (slangen 5 i figur 6).
  5. Luftes medierne ved unclamping luften tuvære mellem medierne kolben og dyrkning fartøj.
  6. Tape varmepuden og termometer til dyrkningsbeholderen så dens temperatur kan reguleres. Coil medierne slangen rundt om dyrkning fartøj, så de kommer ind medier vil være på samme temperatur som fartøjet.
    BEMÆRK: PWM strøm til varmepuden er reguleret af mikrocontrolleren som bruger input fra termometeret til at holde dyrkningsbeholderen ved dens nominelle temperatur.
  7. Sæt dyrkning fartøj i det sorte skum kabinet over LED-matrix, og sikre, at rørene ikke er klemt.
  8. I Micro-manager, gå til Plugins> bioreaktor Controller. Indstil "Medie udvekslingsforhold på" -feltet til 0,1 og "Sample udvekslingsforhold på" -feltet på 0. Strømningshastigheden vil være meget lav, men større end fordampningshastigheden.
  9. Spænd den indkommende luft rør mellem medierne kolben og dyrkning fartøj. Fjern stikket fra podning rør (rør 7 i figur
  10. Dæk indkapslingen, således at intet lys kommer ind, og lade kulturen vokse natten.

12. Kalibrer pumpningen Priser

  1. I Micro-manager, gå til Plugins> bioreaktor Controller. Indstil "Media pumpe forholdet på" feltet til 0,5 og "Sample pumpe forholdet på" feltet til 0.
  2. Afbryd overløbsrør fra effluenten kolbe (rør 8 i figur 6) og prøverøret fra effluenten kolbe (rør 8 i figur 6) og opsamles spildevand i separate beholdere. Saml spildevand i 1 time, begynder efter pumperne har været på i 15 min.
  3. Beregn strømningshastigheden af ​​medier i dyrkning skib fra den opsamles i beholderen som volumen:
  4. Juster værdien af ​​"Media pumpe forholdet på" felt ved denne lineære estimat
    Equaiton 2
    hvor
    Equaiton 3
  5. Gentage gennem denne kalibreringsprocedure, indtil forskellen mellem den ønskede strømningshastighed og den målte strømningshastighed er <0,2 ml / time, hvor strømningshastigheden i gennemsnit over en periode på 1 time.
  6. Øg værdien af "prøve forholdet på" feltet og kalibrere det på samme måde, indtil omtrent 4/5 th af lydstyrken forlader dyrkning fartøj pumpes ud af prøvetagningspumpen og omtrent 1/5 th af den mængde forlader igennem overløbet port.
  7. Lad kulturen tæthed i den kontinuerlige dyrkning apparat ækvilibrere under disse betingelser natten over.
    BEMÆRK: Hvis målet flow ikke kan nås, ændreden peristaltiske pumpe slangen. Væske pumpes med en højere hastighed, når der anvendes rør med større diameter. Følg trin 14 og derefter vende tilbage til trin 8.4.

13. Saml Mikroskop Billeder af dyrkede Mikrober

  1. Fyld Stage Position liste i Micro-manager med et sæt ikke-overlappende positioner, hvor billeder af celler pumpes ind i mikrofluid kanal vil være i brændplanet.
  2. Åbn "bioreaktor Controller" plugin. Vælg den ønskede LED matrix tidsforløb, imaging-kanaler, og andre eksperimentelle indstillinger fra anvisningerne. Indsamle og analysere billeder.
  3. Mens eksperimentet løber, sikrer, at medierne i medierne kolben forbliver klar. Hvis det er overskyet, så er det er blevet forurenet.

14. Post-eksperiment

  1. Bortskaf medier, overskydende cellekultur og spildevand.
  2. Refill medierne kolbe med 200 ml 20% EtOH blandet med deioniseret vand. Kør kemostat som det havde tidligereblevet kørt under eksperimentet at udvaske cellerester og medier.
  3. Når alkoholen løsning har drænet fra medierne kolbe, demontere kemostat fuldt.
  4. Vask glasvarer og rør med varmt vand og et mildt rengøringsmiddel, og skyl grundigt med demineraliseret vand. Lad det tørre.
  5. Åbn "microcontrollerRecords.csv" fil til at gennemgå temperatur og LED matrix status i løbet af forsøget, til "Summary.csv" fil gennemgå de summariske data fra hvert sæt af billeder og "Results <n> .csv" filer, der anmelder, der sammenfatter hver ROI fra hver tidsperiode, hvor n er n th datasæt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dette apparat blev anvendt til at stimulere en kultur af S. cerevisiae, der udtrykker gult fluorescerende protein (YFP) som respons på blåt lys via en inducerbar optogenetic transskription system baseret på CRY2 / CIB1 proteinpar 30. Celler blev dyrket chemostatically i phosphat-begrænset medium med en gennemsnitlig fortynding på 0,2 ± 0,008. Fosfat begrænsning er almindeligt anvendt i S. cerevisiae Kemostater eksperimenter for at kontrollere væksten og virkningerne af fosfat begrænsning er godt karakteriseret. 31, 32, 33 Spildevand fra den kontinuerligt fortyndede dyrkningsbeholder blev samplet til en mikrofluidanordning på et omvendt mikroskop. Billederne blev automatisk analyseret som vist i figur 8. Individuelle celler blev identificeret i baggrunden-korrigeret fase-kontrast billeder og deres YFP koncention blev estimeret ud fra deres fluorescens målt fra baggrunden-korrigeret fluorescerende billeder.

Fluorescensen af ​​169,677 celler blev analyseret fra 33.600 billeder af spildevand erhvervet fra 28 steder i mikrofluidapparat over 70 timer af forsøget. Vi anvendte et omvendt mikroskop udstyret med et fluorescens-belysningssystem og en CMOS kamera. YFP billeder blev erhvervet med 500/20 nm excitation filter, et 535/30 nm emission filter, og en T515lp dichroic. Billeder blev taget med en 40X fasekontrast mål, under Köhler belysning. Billeder blev registreret i 16-bit farvedybde med 87 pixels pr mikrometer potens. Kulturen blev udsat for varierende intensiteter af blåt lys i 6 timers intervaller, efterfulgt af fuldstændig mørke i 6 timers intervaller. Kulturen havde været udsat for lys forud for den første måling, og derfor dens fluorescensintensitet falder under den første mørke periode. </ P>

Figur 9 viser fluorescens som følge af YFP produktion ved aktivering af optogenetic som reaktion på belysning af dyrkningsbeholderen. Det viser anvendeligheden af ​​encellede målinger af fluorescens over en population gennemsnit-encellede målinger afslører befolkningen fordeling af fluorescensintensitet. Bemærk outlier ved 42 timer 26 min. Efter at have gennemgået de tilsvarende billeder, var det tydeligt, at der var klumper af celler i de fleste af de billeder, der anvendes til at frembringe det sammensatte billede af baggrunden, hvilket resulterer i artefakter, der lignede celler i baggrunden-korrigeret billede. Desuden blev en boble fra dyrkningsbeholderen pumpes til mikrofluid kanal og dele af dens kanter misforstod celler ved billedanalysen algoritme. Da hverken boblen eller de artefakter fra subtrahere baggrunden svarer til de faktiske celler, deres målte fluorescensintensiteter lavere end autofluorescens af cellerne. Denne figur viser kvaliteten af ​​de data, der automatisk kan erhverves i løbet af 3 dage. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 8
Figur 8: visuel afbildning af billedet analyse algoritme. Disse billeder er blevet beskåret og udvidet for at lette visning. (A) Seks billeder erhvervet at generere baggrundssubtraktion fase kontrast billede af cellekulturen. Efter hovedbilledet er erhvervet, er fem ekstra billeder erhvervet med spildevandet-prøvetagningspumpen kortvarigt tændt mellem hver erhvervelse at sikre, at cellerne er fordrevet. En sammensat billede af baggrunden er genereret fra de fem komponentbilleder. Værdien af ​​hver pixeli baggrundsbilledet er medianværdien af ​​samme pixel på tværs af de 5 komponent billeder. (B) Baggrundsbilledet-korrigeret omdannes derefter til et binært. Det binære derefter dilateret og hullerne i kontinuerlige sektioner af den binære fyldes. De gule linjer svarer til udvalgte områder af interesse (ROI), baseret på kriterier størrelse og cirkularitet. (C) Disse ROI er afbildet på det fluorescerende billede, hvor fluorescensen af hver celle måles som værdien af den lyseste pixel i ROI. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 9
Figur 9: Befolkningsfordeling af fluorescensintensiteter over tid. I disse subfigures logaritmen af ​​målte fluorescence vises, efter normal praksis i flowcytometri. Linien i A og B angiver intensiteten af lys, der absorberes eller diffrakteret af den kultur, som måles som forskellen i intensitet mellem lys transmitteret gennem sterile medier og lys, der transmitteres gennem cellekultur i dyrkningsbeholderen. Det er afbildet mod den anden ordinat-aksen. (A) En kasse og whisker plot (5-percentil, 25-percentil, median, 75-percentil, 95-percentilen) af logaritmen af den målte fluorescens af populationen over tid. (B) En 2-dimensional histogram af de samme data, hvor farve svarer til den normaliserede frekvens af celler med en målt fluorescens i området af den tilsvarende bin. Farverne blev skaleret til den række af data uden outlier på 42 t 26 min medfølger. Den normaliserede frekvens af outlier i den laveste fluorescens biner 0,7. (C) endimensionale histogrammer af logaritmen af den målte fluorescens af befolkningen før den første indspillede udsættelse for lys og efter den største udsættelse for lys. Den viser, at lyset-induceret ekspression af YFP i denne stamme er bimodal. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har designet dette apparat med fleksibilitet i tankerne. Alt den anvendte kode er gratis og open-source. Standard billedanalyse proces at segmentere celler er enkel og kører hurtigt. Tilpasset analyse kunne gennemføres ved at optage brugerinput mens analysere et repræsentativt billede med FIJI grafisk brugergrænseflade, omdanne input til en Beanshell script, og derefter indstille plugin til at kalde scriptet. Når det kaldes, vil dette script blive sendt en String-array kaldet "billeder", der indeholder filen veje til den seneste sæt background-korrigeret billeder. Billeder og data gemmes som de er indsamlet, så de ikke går tabt, hvis et eksperiment ender brat. En blå LED-array blev valgt til fremkaldelse vores optogenetic system, men det kunne erstattes med lysdioder med forskellige farver. Der er yderligere input og output pins til rådighed på microcontroller samt gennemgående huller til en ekstra MOSFET switch og relæ skifte på printet, der gør det nemtfor dette system, der skal tilpasses til mere komplekse formål. For eksempel for at gøre dette apparat fungerer som en turbidostat, anvende de ekstra stifter på microcontroller til at drive en LED og læse værdier fra en lys-sensor spændes på dyrkningsbeholderen, og derefter ændre softwaren til at måle turbiditet og fortyndes fartøjet i overensstemmelse hermed .

Der skal udvises forsigtighed for at sikre, at kulturen ikke er forurenet, at beskytte følsomme mikroskopi udstyr, og for at sikre, at de fluidstrømningshastigheder er konsistente. kan detekteres forureninger før når dyrkningsbeholderen bevidst inokuleres ved at vente et par dage før inokulering fartøjet og verificere, at der ikke er nogen vækst inde. For at undgå at spilde cellekultur på mikroskopet mål, kontrollere, at mikrofluidapparat ikke vil lække ved først pumpning celle kultur gennem det over en absorberende klud. Hvis strømmen af ​​medier i dyrkningsbeholderen er inkonsekvent, er det som regel fordi røret rundtrullerne i den peristaltiske pumpe er blevet for løs. Hvis strømmen af ​​luft fra akvariet pumpen er inkonsekvent, sikre, at der ikke er nogen U-formede bøjninger i spildevandet rør, hvor væske kan samle og inkonsistent modstå luftstrøm. Hvis slangen bliver tilstoppet efter et eksperiment, fordi mediet er tørret op inde i den, sættetid de tilstoppede rør i et varmt vandbad for at opløse træsko.

Der er iboende begrænsninger i denne protokol til at overveje, når man planlægger et eksperiment eller analysere resultater. Afhængigt af fortyndingshastighed og rørlængde anvendes, er der en forsinkelse på ca. 10 min, hvorunder cellekulturen pumpes fra dyrkningsbeholderen til mikroskopet. Derfor er det ikke velegnet til at studere begivenheder over kortere tidshorisonter. Også, mens et eksperiment kan køre uafbrudt i omkring ti dage kun begrænset af mængden af ​​medier, udviklingen af ​​cellen kultur skal betragtes som varigheden af ​​eksperimentet stiger. Den LimiTing næringsstof af medierne har dybtgående virkninger på metabolisme og genekspression 35, 36, 37, 38, 39 og bør derfor fastsættes på grundlag af aspekt af fysiologi under undersøgelse. Ved analyse resultater, billederne-især billederne fra fjerntliggende datapunkter-bør revideres for fejl i den måde, at ROIs blev identificeret af billedanalyse rutine. Det er muligt for at tage fejl bobler eller artefakter for celler, hvorved skævvridning den målte fluorescens. En enkel måde at fjerne sådanne fejlagtige målinger er at kassere alle ROI'er med fluorescensintensiteter under auto-fluorescensintensitet.

Denne protokol vil være nyttig til måling fluorescensintensitet og / eller cellulær morfologi af spildevand cellekultur som respons på lys i organismer, der kan vokse i kontinuerlig kultur, sættle til en ensartet fokalplan, når den ikke omrøres, og automatisk identificeret ved et billedanalysesystem algoritme. Standard celleidentifikationsnummer algoritme, der anvendes her, vil være mest direkte anvendelse på omtrent sfæriske mikrober, der ligner knopskydende gær. Et alternativ 40 til denne protokol er at vokse mikrober i et sæt af batch-kulturer, og derefter prøve et hold for hvert tidspunkt og karakterisere prøven ved flowcytometri. Men fordelene ved protokollen beskrevet her, er, at der udtages prøver fra den samme kultur, kan tages mange prøver, og processen er automatiseret. Denne protokol forbedrer også på en lignende metode, hvor optogenetic gær var kontinuerligt dyrket og filmede under et mikroskop 34 ved at erhverve flere billeder hurtigt og ikke at påvirke ROIs identifikation af fluorescens. En stor fordel ved denne protokol er, at mange målinger af de enkelte celler kan regelmæssigt erhverves over flere dage without brugerinput. Efter måling reaktionen af mikrobielle kultur for lys eksponering kan et næste skridt være at gennemføre i silico lukket sløjfestyring af responset.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgements

Vi vil gerne anerkende Molly Lazar og Verónica Delgado om hjælp til at teste protokollen, Kieran Sweeney for nyttige diskussioner og redigering, og Taylor Scott, My An-adirekkun, og Stephanie Geller for kritisk læsning af manuskriptet. Megan Nicole McClean, Ph.D. har en karriere Award på den videnskabelige interface fra Burroughs Wellcome fonden.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Extensive lab manual GitHub NA An extensive, regularly updated lab manual is available in the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). This also includes a description of the microfluidic mold used to generate the representative results.
Fritzing Design Viewer Fritzing NA The free, open-sourced software to view and edit the .fzz type circuit board designs is available at "http://fritzing.org/download/"
Arduino Uno R3 (Atmega328 - assembled) Adafruit 50 Microcontroller. 1 required.
Arduino Stackable Header Kit SparkFun Electronics 10007 Female pin headers for connecting PCB to microcontroller. 1 required.
Adjustable 30W 110V soldering iron - XY-258 110V Adafruit 180 For making electrical connections to the PCB. 1 required.
Soldering iron stand Adafruit 150 For making electrical connections to the PCB. 1 required.
Mini Solder spool - 60/40 lead rosin-core solder 0.031" diameter - 100g Adafruit 145 For making electrical connections to the PCB. 1 required.
0.1 μF capacitor SparkFun Electronics COM-08375 Stabilizes voltage in PCB. 1 required.
10 μF capacitor SparkFun Electronics COM-00523 Stabilizes voltage in PCB. 1 required.
MAX7219CNG LED Matrix/Digit Display Driver - MAX7219 Maxim MAX7219CNG LED driver. 1 required.
8 pin IC Socket Mouser Electronics 575-144308 16 required. These will be stacked on top of each other to support the culture vessel above the LED matrix.
24 Pin IC socket Mouser Electronics 535-24-3518-10 Optional. Use this to reversibly attach the MAXIM 7219CNG driver to the PCB.
Digital multimeter Adafruit 2034 For troubleshooting electronics. 1 required.
Break Away Headers - 40-pin Male (Long Centered, PTH, 0.1") SparkFun Electronics PRT-12693 Male pin headers for connected LED matrix to printed circuit board. Ends can be trimmed with wire cutters. 1 set required. 
Flush diagonal wire cutters Adafruit 152 For trimming long pin headers and cutting power cables. 1 required.
Premium Female/Female Jumper Wires - 40 x 12" (300mm) Adafruit 793 Wire ribbon for connecting breadboard to LED matrix. Can be connected end-to-end with male pin-headers to be longer. 1 required.
Half-size breadboard Adafruit 64 The LED matrix will connect to this and the culturing vessel will rest above it.
Miniature 8x8 Blue LED Matrix Adafruit 956 Light source. Dominant wavelength is 470nm (blue). 1 required. Alternative miniature LED matrices from the same vendor are available with dominant wavelengths: 624 nm (red), 588 nm (yellow), 525 nm (green), 572 nm (yellow-green), and white.
Stackable header-3 pin SparkFun Electronics 13875 8 required.
Resistor Kit - 1/4W (500 total) SparkFun Electronics 10969 For electronics. 1 required.
 IRL520N MOSFET International Rectifier IRL520N Voltage regulating switch for controlling DC current. 4 required.
Hook-Up Wire - Assortment (Solid Core, 22 AWG) SparkFun Electronics PRT 11367 Wire for electronics. 1 required.
5V 2A (2000mA) switching power supply - UL Listed Adafruit 276 Power supply for the heating pad and Arduino. 2 required.
12 VDC 1000mA regulated switching power adapter - UL listed Adafruit 798 For peristaltic pumps. 2 required.
Electric Heating Pad - 10cm x 5cm Adafruit 1481 For heating the bioreactor. 1 required.
Low flow variable flow peristaltic pump Fisher Scientific 13-876-1 For pumping media. 1 required
Medium flow variable flow peristaltic pump Fisher Scientific 13-876-2 For pumping culture. 1 required.
9 VDC 1000mA regulated switching power adapter - UL listed Adafruit 63 For microcontroller power supply. Order 1.
High Temp Waterproof DS18B20 Digital temperature sensor + extras Adafruit 642 Thermometer for the bioreactor. 1 required.
Micromanager Micromanager NA The free, open-sourced microscope control software is available at "https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release"
FIJI ImageJ NA The free, open-sourced image analysis software is available at "http://fiji.sc/"
Arduino Integrated Development Environment Arduino NA The free, open-sourced IDE is available at "https://www.arduino.cc/en/Main/Software"
Custom code GitHub NA The custom microcontroller code and "Bioreactor Controller" plugin are available in the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).
USB Cable A to B - 6 Foot SparkFun Electronics CAB-00512 Used to download data to microcontroller. 1 required.
bioreactorTimecourse_example.csv GitHub NA The advantage of loading LED matrix values from a CSV file is that a program can be called by the plugin to update those values based on image analysis results, and those values can be reloaded to the microcontroller, enabling feed-back control. It is available from the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).
Tota-frost gels (diffusion paper) B&H B&H # LOFSFTL
MFR # T1-72
For LED matrix. 1 required.
Kitting Sheet Crosslink 1/4x12x24in Grainger, inc 20JL37 Black foam for culturing vessel enclosure. 4 required.
Standard Photodiode Power Sensor, Si, 200 - 1100 nm, 50 mW  Thorlabs S120VC For measuring light intensity. 1 required.
Labelling Tape Fisher Scientific 159015N For labelling and securing loose components. 1 required.
Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD Thorlabs PM100D For measuring light intensity. 1 required.
100mL GL45 hybridization glass bottle Bellco Glass, Inc. (7910-40150) Bioreactor vessel. 1 required.
Six port assembly Bellco Glass, Inc. Custom  For the bioreactor vessel. Tubing Specs: .125" OD x .055"ID. Port A: 1.0" long above cap slug and to bottom of tube. Ports B,C,E,F: 1.0" long above cap slug, 33 mm long below. Port D: 1.0" long above cap slug, 65 mm  long below. 1 required. Includes 45 mm diameter polypropylene open top screw cap and a white silicone gasket to ensure a tight seal between the cap and the vessel. 
Scotch Magic Tape 3105, 3/4 x 300 Inches, Pack of 3 Amazon B0009F3P3U Clear scotch tape. This is available from many other vendors. It is used to cover markings on the culturing vessel and to secure the coverglass with the PDMS channel to the aluminum support frame.
1/16" ID x 3/16" OD x 1/16" Wall Tygon Sanitary Silicone Tubing United States Plastic Corp. 57288 Tubing. ~25' required.
Cole-Parmer Twistit white rubber stopper, size 10 Cole-Parmer EW-62992-32 Media flask stopper and effluent flask stopper. 2 required.
2L Laboratory Flask Pyrex 4980 Media flask and effluent flask. 2 required.
Day pinchcock Fisher Scientific 5867 For pinching tubes shut. 3 required.
Replacement tubing assembly 1/16" ID Traceable Products 3372 The peristaltic pumps come with a set of tubes, but they wear out after weeks of use.
Replacement tubing assembly 1/50" ID Traceable Products 3371 The peristaltic pumps come with a set of tubes, but they wear out after weeks of use.
Male luer with lock ring x 1/16" hose barb, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45505-00 Connectors. ~10 luers are required.
Male luer with lock ring x 1/8" hose barb, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45505-04 Connectors. 5 required, one for each rubber stopper hole to fill with tubing.
Female luer x 1/16" hose barb adapter, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45502-00 Connectors. ~10 luers required.
Female luer x 3/16" hose barb adapter Cole-Parmer EW-45502-08 Connectors. ~10 luers required.
Cole-Parmer Luer Accessory, Female Luer Cap, Nylon, 25/Pk Cole-Parmer SC-45502-28
Cole-Parmer Luer Accessory, Male Luer Lock Plug, Nylon, 25/Pk Cole-Parmer EW-45505-56
Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID x 0.042"OD, 100 ft/roll Cole-Parmer EW-06417-21 Tubing. 1 roll required.
Masterflex platinum-cured silicone tubing, L/S 13, 25 ft Cole-Parmer EW-96410-13 Tubing. ~25' required.
3/16" ID x 1/4" OD x 1/32" Wall Tygon Sanitary Silicone Tubing United States Plastic Corp. 57293 Tubing. ~1' required.
Vacuum filter Fisher Scientific 974107 Nalgene vacuum filter for sterile filtering media.
Aquel Oxy-Boost 200 Rena Aquatic Supply AP200 Dual diaphram adjustable flow air pump for aerating and mixing media. 1 required. 
0.2 μm pore syringe filter Corning International 431229 This ensures that air from the aquarium pump does not contaminate the apparatus. 1 required.
Slygard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning Slygard 184 For microfluidic device. 1 required.
American Safety Razor GEM Scientific Single-Edge Razor Blades Fisher Scientific 17989000 For cutting tubes and PDMS. 1 blade required.
Harris Uni-Core hole puncher 1.2mm ID Sigma-Aldrich WHAWB100028 ALDRICH For punching inlet/outlet in microfluidic device. 1 required.
Microscope cover glass 22x60-1.5 Fisher Scientific 12-544-G For microfluidic device. 1 required.
Rectangular aluminum frame with a square window Custom Custom To support the microfluidic channel. Outer dimensions: 3 inches x 1.25 inches.
Inner dimmensions (cut out portion): 7/8 inches x 7/8 inches
Thickness: ~1/32 inches

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Motta-Mena, L. B., Reade, A., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature chemical biology. 10, (3), 196-202 (2014).
  2. Hughes, R. M., Bolger, S., Tapadia, H., Tucker, C. L. Light-mediated control of DNA transcription in yeast. Methods. 58, (4), 385-391 (2012).
  3. Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature biotechnology. 20, (10), 1041-1044 (2002).
  4. Polstein, L. R., Gersbach, C. a Light-inducible spatiotemporal control of gene activation by customizable zinc finger transcription factors. J Am Chem Soc. 134, (40), 16480-16483 (2012).
  5. Polstein, L. R., Gersbach, C. a A light-inducible CRISPR-Cas9 system for control of endogenous gene activation. Nature Chemical Biology. 11, (3), 198-200 (2015).
  6. Yang, X., Jost, A. P. T., Weiner, O. D., Tang, C. A light-inducible organelle-targeting system for dynamically activating and inactivating signaling in budding yeast. Molecular biology of the cell. 24, (15), 2419-2430 (2013).
  7. Lee, S., Park, H., et al. Reversible protein inactivation by optogenetic trapping in cells. Nature methods. 11, (6), 633-636 (2014).
  8. Kennedy, M. J., Hughes, R. M., Peteya, L. A., Schwartz, J. W., Ehlers, M. D., Tucker, C. L. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nature Methods. 7, (12), 973-975 (2010).
  9. Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. Induction of protein-protein interactions in live cells using light. Nat Biotechnol. 27, (10), 941-945 (2009).
  10. Zoltowski, B. D., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. Blue light-induced dimerization of a bacterial LOV-HTH DNA-binding protein. Biochemistry. 52, (38), 6653-6661 (2013).
  11. Renicke, C., Schuster, D., Usherenko, S., Essen, L. O., Taxis, C. A LOV2 Domain-Based Optogenetic Tool to Control Protein Degradation and Cellular Function. Chemistry & Biology. 20, (4), 619-626 (2013).
  12. Novick, A., Szilard, L. Description of the chemostat. Science (New York, N.Y.). 112, (2920), 715-716 (1950).
  13. Monod, J. La technique de culture continue. Théorie et applications. Ann. Inst. Pasteur. 79, (4), 390-410 (1950).
  14. Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature Biotechnology. 20, 1041-1044 (2002).
  15. Kennedy, M. J., Hughes, R. M., Peteya, L. A., Schwartz, J. W., Ehlers, M. D., Tucker, C. L. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nature Methods. 7, 973-975 (2010).
  16. Olson, E. J., Tabor, J. J. Optogenetic characterization methods overcome key challenges in synthetic and systems biology. Nature chemical biology. 10, (7), 502-511 (2014).
  17. Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: An experimental organism for 21st century biology. Genetics. 189, (3), 695-704 (2011).
  18. Galanie, S., Smolke, C. D. Optimization of yeast-based production of medicinal protoberberine alkaloids. Microbial cell factories. 14, (1), 144 (2015).
  19. Gerngross, T. U. Advances in the production of human therapeutic proteins in yeasts and filamentous fungi. Nature biotechnology. 22, (11), 1409-1414 (2004).
  20. van Maris, A. J. A., Abbott, D. A., et al. Alcoholic fermentation of carbon sources in biomass hydrolysates by Saccharomyces cerevisiae: current status. Antonie van Leeuwenhoek. 90, (4), 391-418 (2006).
  21. Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using µManager. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 14 (2010).
  22. Edelstein, A. D., Tsuchida, M. A., Amodaj, N., Pinkard, H., Vale, R. D., Stuurman, N. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of biological methods. 1, (2), (2014).
  23. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  24. Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxygen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14, (3), 590-597 (2005).
  25. Saldanha, A. J., Brauer, M. J., Botstein, D. Nutritional homeostasis in batch and steady-state culture of yeast. Molecular Biology of the Cell. 15, 4089-4104 (2004).
  26. Boer, V. M., Tai, S. L., et al. Transcriptional responses of Saccharomyces cerevisaie to preferred and nonpreferred nitrogen sources in glucose-limited chemostat cultures. FEMS Yeast Research. 7, 604-620 (2007).
  27. Boer, V. M., Amini, S., Botstein, D. Influence of genotype and nutrition on survival and metabolism of starving yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 6930-6935 (2008).
  28. Brauer, M. J., Huttenhower, C., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response and metabolic activity in yeast. Molecular Biology of the Cell. 19, 352-367 (2008).
  29. Gresham, D., Dunham, M. J. The enduring utility of continuous culturing in experimental evolution. Genomics. 104, (6), 399-405 (2014).
  30. Liu, H., Yu, X., et al. Photoexcited CRY2 interacts with CIB1 to regulate transcription and floral initiation in Arabidopsis. Science (New York, N.Y.). 322, (5907), 1535-1539 (2008).
  31. McIsaac, R. S., Oakes, B. L., Wang, X., Dummit, K. A., Botstein, D., Noyes, M. B. Synthetic gene expression perturbation systems with rapid, tunable, single-gene specificity in yeast. Nucleic Acids Research. 41, (4), 1-10 (2013).
  32. McIsaac, R. S., Petti, A. A., Bussemaker, H. J., Botstein, D. Perturbation-based analysis and modeling of combinatorial regulation in the yeast sulfur assimilation pathway. Molecular biology of the cell. 23, (15), 2993-3007 (2012).
  33. McIsaac, R. S., Silverman, S. J., et al. Fast-acting and nearly gratuitous induction of gene expression and protein depletion in Saccharomyces cerevisiae. Molecular biology of the cell. 22, (22), 4447-4459 (2011).
  34. Melendez, J., Patel, M., Oakes, B. L., Xu, P., Morton, P., McClean, M. N. Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures. Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 6, (3), 366-372 (2014).
  35. Brauer, M. J., Huttenhower, C., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast. Molecular biology of the cell. 19, (1), 352-367 (2008).
  36. Boer, V. M., Crutchfield, C. A., Bradley, P. H., Botstein, D., Rabinowitz, J. D. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations. Molecular biology of the cell. 21, (1), 198-211 (2010).
  37. Markham, B. E., Byrne, W. J., Methods, E. Uptake, storage and utilization of phosphate by yeast. Journal of the Institute of Brewing. 73, 271-273 (1967).
  38. Kazemi Seresht, A., Palmqvist, E. A., Olsson, L. The impact of phosphate scarcity on pharmaceutical protein production in S. cerevisiae: linking transcriptomic insights to phenotypic responses. Microbial cell factories. 10, (1), 104 (2011).
  39. Shimizu, K. Regulation Systems of Bacteria such as Escherichia coli in Response to Nutrient Limitation and Environmental Stresses. Metabolites. 4, (1), 1-35 (2013).
  40. Olson, E. J., Hartsough, L. A., Landry, B. P., Shroff, R., Tabor, J. J. Characterizing bacterial gene circuit dynamics with optically programmed gene expression signals. Nature methods. 11, (4), 449-455 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics