Progettazione e Realizzazione di un Illuminating automatizzato, Coltura, e di campionamento per microbica optogenetic Applicazioni

Bioengineering

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Summary

Abbiamo progettato una apparecchiatura per le colture in continuo per l'uso con i sistemi optogenetic per illuminare le culture di microbi e regolarmente celle di immagine negli effluenti con un microscopio invertito. La coltura, il campionamento, l'imaging, e l'analisi delle immagini sono completamente automatizzati in modo che le risposte dinamiche a illuminazione possono essere misurati per diversi giorni.

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Stewart, C. J., McClean, M. N. Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications. J. Vis. Exp. (120), e54894, doi:10.3791/54894 (2017).

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Abstract

sistemi optogenetic utilizzano proteine ​​geneticamente codificate che cambiano conformazione in risposta a specifiche lunghezze d'onda della luce per alterare i processi cellulari. Vi è la necessità per la coltura e misurare sistemi che incorporano programmati illuminazione e la stimolazione dei sistemi optogenetic. Vi presentiamo un protocollo per la costruzione e l'utilizzo di una apparecchiatura per le colture continua ad illuminare le cellule microbiche con dosi programmate di luce, e automaticamente acquisire e analizzare le immagini delle cellule nell'effluente. Il funzionamento di questo apparato come chemostat permette il tasso di crescita e l'ambiente cellulare per essere strettamente controllate. L'effluente della coltura cellulare continua è regolarmente campionata e le cellule vengono esposte mediante microscopia multicanale. La coltura, il campionamento, l'imaging, e l'analisi delle immagini sono completamente automatizzati in modo che le risposte dinamiche l'intensità di fluorescenza e la morfologia cellulare delle cellule campionate dal dell'effluente cultura sono misurati su più giornisenza l'input dell'utente. Abbiamo dimostrato l'utilità di questa apparecchiatura per le colture inducendo dinamicamente produzione di proteine in un ceppo di Saccharomyces cerevisiae progettato con un sistema optogenetic che attiva la trascrizione.

Introduction

Sistemi optogenetic utilizzano la luce per controllare un numero crescente di processi cellulari tra espressione genica, 1, 2, 3, 4, 5 localizzazione proteine, l'attività della proteina 6, 6, 7, 8 vincolante proteine, 8, 9, 10 e degradazione delle proteine. 11 Un metodo per coltura di cellule in un ambiente controllato con la stimolazione ottica programmata e per misurare la loro risposta su scale temporali biologicamente rilevanti è necessaria per sfruttare le potenzialità di questi strumenti per la ricerca in biologia cellulare e delle biotecnologie. Il nostro metodo si avvale di chemostasis a mantenere un tasso di crescita costante di cella in un ben miscelato, aevalutazione, e termostatato recipiente di vetro coltura 12, 13 che è esposto all'illuminazione programmato. Noi immagini singole celle nell'effluente coltura con un microscopio invertito per misurare la risposta della cultura all'illuminazione programmato. La coltura, il campionamento, l'imaging, e l'analisi delle immagini sono completamente automatizzati in modo tale che l'intensità di fluorescenza e la morfologia cellulare della coltura cellulare effluente può essere misurata su più giorni senza l'input dell'utente.

Questo protocollo può essere implementato in molti laboratori familiarità con crescente coltura cellulare e microscopia, e l'apparecchiatura utilizzata è poco costoso e fatto di componenti prontamente disponibili. Un recipiente di coltura trasparente è posizionato sopra una matrice di diodi emettitori di luce (LED) in grado di emettere 1 W / cm 2 -10 mW / cm 2 di luce. I microbi sono coltivate nel recipiente di coltura in continuo; una pompa peristaltica viene utilizzata per aggiungere media alladiluizione, un'altra viene utilizzata per prelevare cultura ad un tasso minore al microscopio, e la differenza sfugge attraverso un'uscita di overflow. Una piastra elettrica mantiene la temperatura. L'aria viene continuamente pompata nel recipiente di coltura per mantenere una pressione positiva nonché per mescolare ed aerare la cultura. Fatta eccezione per la pompa di aria, il potere di questi dispositivi è regolato da un microcontrollore che riceve anche input da un termometro e un computer desktop collegato. La coltura cellulare effluente viene pompata ad un dispositivo microfluidico sulla scena di un microscopio invertito. Non fluorescente e le immagini fluorescenti vengono acquisite automaticamente. Le cellule nelle immagini sono caratterizzati da un algoritmo che individua ciascuna cella come una regione di interesse (ROI) e misura le proprietà di ogni ROI.

Per dimostrare l'applicazione di questo protocollo, abbiamo misurato la risposta alla luce diverse intensità di cellule di Saccharomyces cerevisiae ingegnerizzate con un respon luce bluve sistema optogenetic che controlla la trascrizione della proteina fluorescente. S. cerevisiae, comunemente noto come lievito di birra, è stato scelto perché più sistemi optogenetic per controllare l'espressione genica in questo sistema esistono già 14, 15, 16. Inoltre, questo organismo modello è comunemente utilizzato per studi in biologia dei sistemi 17 e come telaio per applicazioni biotecnologiche 18, 19, 20. I nostri risultati rappresentativi dimostrano che questo protocollo può essere utilizzato per controllare la trascrizione di una cultura su più giorni variando intensità di luce di ingresso e misurando la produzione di un reporter fluorescente.

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Protocol

Figura 1

Figura 1: L'apparecchiatura per le colture continuo. Questo schema semplificato mostra come l'apparecchio deve essere montato quando viene utilizzato per la cultura, illuminare, e misurare le proprietà ottiche dei microbi. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: Panoramica del protocollo. I passi della regione ombreggiata deve essere ripetuta ogni volta che il protocollo è utilizzato. Controllo ad anello chiuso è possibile 34, ma non è implementato in questo protocollo.

1. Montare il termometro al circuito


Figura 3: Collegamenti per leggere i valori termometro. Questo diagramma mostra come il termometro digitale dovrebbe essere collegato al circuito stampato in modo che il microcontrollore può ottenere un feedback per controllare la temperatura della cultura. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

  1. Saldare la terra, dati, e le linee di tensione positiva del termometro digitale per i loro rispettivi fori passanti contrassegnati con "GD + V".
  2. Clip fuori un passaggio di un colpo di testa a 3-pin femmina e tagliare i restanti 2 perni con i tagliatori di filo, in modo tale che può andare bene nei due fori passanti etichetta "R2" e non ostacolare il microcontrollore. Saldare questo posto. Collegare i due perni saldati inserendo una resistenza da 4,7 kΩ nell'intestazione pin.

2. Collegare l'alimentazione ConComponenti trollo al circuito

Figura 4
Figura 4: Connessioni per controllare il potere al pad di riscaldamento. Questo diagramma mostra come le parti di PCB e accessori devono essere assemblati in modo da controllare la potenza al pad di riscaldamento. Le parti per controllare le pompe peristaltiche sono collegati in modo simile. Si noti che i componenti per il termometro sono state rimosse per chiarezza. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

  1. Tagliare 1 cm dai pin di cinque donne intestazioni a 3 pin. Saldare questi per le posizioni sulla scheda a circuito stampato (PCB) contrassegnato come "# 1", "# 2", "# 3", "# 4" e "CB E."
  2. Tagliare 1 cm dai pin di un colpo di testa a 6 pin e 8-pin femmina. Saldare questi fianco a fianco perla colonna di fori passanti etichettato K1 attraverso K14.
  3. Collegare il rilievo di riscaldamento per il circuito.
    1. Inserire le estremità di un resistore 100 k nel K1 fori passanti etichettati e K2 sul PCB. Inserire un transistore metallo-ossido-semiconduttore ad effetto di campo (MOSFET) nella posizione contrassegnata 1 # sul PCB, con l'etichetta del MOSFET rivolta verso la K1 attraverso K14 fori passanti in modo che il perno di origine è più vicino al "# "label, e il perno di scarico è più lontana dalla" etichetta # ".
    2. Tagliare la linea di terra della corrente di cavo di alimentazione 5 V continua (DC) e collegarlo a J2. Collegare la linea di terra della piastra elettrica per J1. Collegare K3 al pin 3 con una resistenza da 1 k. Corrente dovrebbe ora fluire solo da J1 a J2 quando il pin 3 è impostato a + 5V.z
      NOTA: Le funzioni impostate resistore / MOSFET come un interruttore che consente alla corrente di fluire dal pin J1 J2 quando il pin 3 del microcontrollore è impostato a +5 V.
  4. Collegarela pompa peristaltica lento.
    1. Inserire le estremità di un resistore 100 k nel K4 fori passanti etichettati e K5 sul PCB. Inserire un MOSFET nella posizione contrassegnata 2 # sulla PCB, con l'etichetta del MOSFET rivolta verso la K1 attraverso K14 fori passanti in modo che il perno di origine è più vicino all'etichetta "#", e il perno di scarico è più lontana dalla etichetta "#".
    2. Tagliare la linea di terra del cavo di alimentazione 12 V DC della pompa peristaltica lento. Collegare la pompa peristaltica di fronte alla fine J3 e la verruca parete di fronte alla fine J4. Collegare K6 al pin 4 con una resistenza da 1 k. Corrente dovrebbe ora fluire solo da J3 a J4 quando il pin 4 è impostata a +5 V.
  5. Collegare la pompa peristaltica veloce
    1. Inserire le estremità di un resistore 100 k nel K7 fori passanti etichettati e K9 sul PCB. Inserire un MOSFET nella posizione contrassegnata 3 # sul PCB, con l'etichetta del MOSFET rivolta verso la K1 attraverso K14 fori passanti s o che il perno di origine è più vicino all'etichetta "#", e il perno di scarico è più lontana dalla etichetta "#".
    2. Tagliare la linea di terra del cavo di alimentazione 12 V DC della pompa peristaltica veloce. Collegare la pompa peristaltica di fronte alla fine J5 e la verruca parete di fronte alla fine J6. Collegare K9 al pin 5 con una resistenza da 1 k. Corrente dovrebbe ora fluire solo da J5 a J6 quando il pin 5 è impostato a +5 V.

3. Collegare la matrice di LED al circuito

Figura 5
Figura 5: Connessioni per controllare la matrice di LED. Questo diagramma mostra come la matrice di LED deve essere collegato al PCB. Essa mostra inoltre che il PCB può essere impilata sul microcontrollore. Si noti che i componenti per il termometro e per il controllo di potenza DC ad altri dispositivi sono stati rimossi per chiarezza.es / ftp_upload / 54894 / 54894fig5large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

  1. Saldare il 6-pin, 10-pin, e le due connettori maschio femmina 8 pin nei fori attraverso-sui lati del PCB in modo tale che possono essere impilati in cima al microcontrollore.
  2. Saldare il 100 nF e 10 condensatori uF alle loro posizioni contrassegnate sul PCB, rilevando che il terminale negativo del 10 uF condensatore (terminale corto) deve essere collegato al foro passante contrassegnato con un segno negativo.
  3. Saldare il driver del LED al 2 da 12 serie di fori passanti, con la rientranza sul driver lontano dal fori passanti riservate alla matrice di LED.
  4. Saldare 2 colonne di connettori maschio maschi per fori attraverso marcate per la matrice di LED, e tagliare le estremità di questi sotto la basetta tale che essi non ostacolare il microcontrollore. Collegare questi per due strisce 8 fili di ponticelli femmina / femmina. Collegare un secondo gruppo di maschiconnettori maschio alla altra estremità dei ponticelli.
  5. Inserire la matrice di LED sulla mediana della basetta, e quindi inserire la seconda serie di connettori maschio alle colonne su entrambi i lati della matrice. Assicurarsi che i collegamenti elettrici sono le stesse come se la matrice di LED era stato collegato direttamente al circuito stampato con l'etichetta della matrice corrispondente alla colonna etichettata di fori passanti.
  6. Clip fuori un passaggio di un colpo di testa a 3-pin femmina e tagliare i restanti 2 perni con i tagliatori di filo, in modo tale che può andare bene nei due fori passanti etichetta "R1" e non ostacolare il microcontrollore. Saldare questo. Collegare i due perni saldati inserendo una resistenza 1 kOhm nell'intestazione pin.
    Nota: Il recipiente di coltura viene impilato sulla matrice LED. Se i nastri filo ostacolano la nave, li compensato dalla matrice. Quindi, utilizzare fili nucleo solido per colmare il divario tra i perni della matrice ei perni del nastro filo, in modo che i collegamenti elettrici non change.

4. Installare software e connettersi a Hardware

  1. Stack il PCB sul microcontrollore.
  2. Segui i link nella lista dei materiali per scaricare l'ambiente di sviluppo integrato (IDE) e il codice personalizzato per il microcontrollore.
  3. Collegare il microcontrollore al computer tramite un cavo microscopio AB bus seriale universale (USB). Compilare e caricare il codice personalizzato al microcontrollore.
  4. Scarica Micro-manager 21, 22 e 23 FIJI. Configurare Micro-Manager come un plug-FIJI copiando tutti i file ".dll", la directory "mmplugins", e la directory "mmautofocus" dalla directory in cui Micro-Manager è stato scaricato nella directory "Fiji.app". Inoltre, copiare i "plugins / Micro-Manager" di directory nella directory "Fiji.app/plugins".
  5. Scarica il "BioreactorController.jar" file di into la directory "Fiji.app/mmplugins".
  6. Aperto Micro-Manager da FIJI> Plugin> Micro-Manager> Micro-Studio Manager. Utilizzare l'hardware Configurazione guidata per configurare il software per controllare il microscopio. Includere il dispositivo "FreeSerialPort" nella procedura guidata con l'etichetta della porta a cui è collegato il cavo USB AB.

5. Marca e caratterizzare la custodia a prova di luce per il recipiente di coltura

  1. Stack tre pin 8 prese IC come componenti sulla basetta ad ogni angolo della matrice di LED tale che il recipiente di coltura può poggiare su di loro sopra la matrice.
  2. Fissare una porzione di carta diffusione sotto lo strato superiore delle prese, tale che la luce colpisce il recipiente di coltura dalla matrice LED è diffusa.
  3. Tagliare tre 8 "da 6" porzioni di schiuma nera. Tagliare una porzione che è la stessa dimensione della basetta elettronica (2.3 "x 3.5") dall'interno del primo two ed una porzione che è la dimensione del rettangolo fatta dai prese IC (0,9 "x 1.8") dall'interno del terzo. Stack questi strati sulla matrice di LED tale che lo strato finale contenente la "x 1.8" apertura 0,9 giace anche con la parte superiore delle prese IC, e circonda la matrice di LED.
  4. Tagliare un foglio aggiuntivo di schiuma nera a metà per fare un rettangolo 6 "da 24". Stendere questo in una colonna cava di schiuma nera che il recipiente di coltura può essere inserito in con spazio per i tubi e fili, in modo che questo termicamente e otticamente isolare il recipiente di coltura.
  5. Centra la colonna cava di schiuma nero sopra la matrice di LED, e segnare il confine della colonna sullo strato di schiuma nera sotto di essa. Questo confine segnerà dove dovrebbe essere centrato in futuro.
  6. Tagliare un 3 "x 3" porzione di schiuma nera. Utilizzare questo seguito come un coperchio che può essere attaccata alla parte superiore della colonna per bloccare la luce esterna.
  7. Fissare il sensore di potenza fotodiodo a th e la coltura tappo del vaso con del nastro adesivo, fissare il tappo e inserire il recipiente di coltura nel recinto.
  8. In Micro-Manager, andare al Plugin> bioreattore Controller. Impostare la matrice per illuminare in un sottoinsieme della gamma di possibili intensità a S 30 intervalli.
  9. Registrare le intensità luminose come visualizzato sulla console misuratore di potenza collegato al sensore di potenza. Queste misure consentiranno l'intensità effettiva della luce di essere noto quando viene impostato il numero di LED che si accendono e l'attuale ampiezza d'impulso modulata (PWM) per quei LED.

6. Preparare il recipiente di coltura

Figura 6
Figura 6: collegamenti nave. Questo diagramma mostra come la nave e tubi dell'apparecchio deve essere collegato prima di essere sterilizzati in autoclave.blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

  1. Mark l'altezza corrispondente a ogni 2 mL incremento di liquido nella gamma di 10 mL e 30 mL nel recipiente di coltura. Inserire 10 ml di acqua deionizzata sterile, segnare il livello di acqua, aggiungere 2 mL, segnare il livello dell'acqua, e ripetere fino a quando il livello di 30 ml è segnato. Coprire le marcature con nastro adesivo trasparente in modo che essi non sono facilmente rimossi, e smaltire il liquido.
  2. Inserire l'estremità lunga della porta alluminio attraverso la guarnizione, nel recipiente di coltura. Avvitare il tappo.
  3. Coprire un outlet port breve alluminio con 1/16 tubazione "ID silicio. Inserire l'estremità distale inserendo un luer lock femmina e quindi il collegamento di un connettore luer lock maschio. Questa uscita è complementare, e non verrà utilizzato (tubo 6 in figura 6 ).
  4. Collegare due segmenti brevi di 1/16 "tubo in silicone ID con le serrature luer maschio e femmina. Collegare un'estremità alla presa di porta di breve alluminio e collegare l'distal fine con un luer maschio e femmina luer spina della serratura. Il vaso viene inoculato attraverso questo tubo (tubo 7 / 7,1 in figura 6).
  5. Collegare due 1/16 "tubi d'identità alle estremità del 1/16" ID tubazione peristaltica e connettori. Collegare un'estremità a una porta in alluminio breve e l'altra (tubo 4 in figura 6). Successivamente, questo sarà collegato al pallone media.

7. Preparare il supporto Flask

  1. Collegare un "tubo di diametro interno (ID) silicone alla porta di alluminio più lungo. Il tubo deve essere abbastanza a lungo per raggiungere il pallone media. Collegare un 1/8" 1/16 luer lock ID maschio a un breve segmento di 1/16 " tubazione ID, collegare questo al tubo precedente ,, e quindi inserire questo breve segmento nel tappo di gomma sul pallone supporto (tubo 3 in figura 6).
  2. Bloccare il tubo. Questo collegamento permette all'aria di fluire dal pallone supporto al recipiente di coltura. Quando il pallone supporto viene poi pompata con ariad questo tubo è sbloccata, la cultura sarà misto, aerato e mantenuto ad una pressione positiva dalle bolle in arrivo.
  3. Inserire un "tubo ID sufficientemente lungo per raggiungere il fondo del pallone nel tappo, attraverso cui verranno trasferiti media. Collegare un'altra 1/16" 1/16 tube ID a questo, e quindi un tubo 3/16 "ID per che. Collegare questo con un "ID lock femmina 3/16 luer e un tappo luer lock maschio (tubo 1 / 1.1 in figura 6).
  4. Il terzo foro nel tappo deve essere riempito con un breve segmento di 1/16 "tubazione ID, collegato ad altri due segmenti di tubo diametro medio e collegato all'estremità distale (tubo 2 / 2,1 in figura 6). Questo verrà collegato ad una pompa a vuoto e successivamente ad una pompa acquario.
    NOTA: Se il tubo non può adattarsi facilmente attraverso i fori del tappo di gomma, tagliare le estremità del tubo ad un'inclinazione. Poi, l'estremità inclinata che viene spinto attraverso il foro può essere utilizzato per tirare il resto attraverso.

  1. Inserire un luer lock maschio in un segmento di 1/16 "tubi in silicone ID, e quindi inserire saldamente 0.022" (PTFE) tubazione ID politetrafluoroetilene. Separatamente, utilizzare un blocco luer femmina ad un 1/16 "ID tubo. Poi, filo un'estremità lungo il tubo di PTFE per collegare le serrature e l'altra ad una porta di alluminio breve (tubo 5 in figura 6).
  2. Collegare il "tubo ID silicone al 1/50" 1/50 esposto tubo e connettori peristaltica ID. Per questo, collegare tre segmenti di 1/50 "tubi ID e due segmenti di 0,022" tubi in PTFE ID, alternandoli. Collegare questo al pallone effluente via 1/16 "tubazione ID (tubo 5 in figura 6).
  3. Collegare un'estremità di un tubo 1/16 "ID silicone al tubo secondo più lungo del porto di alluminio e l'altra estremità al pallone effluente. Questo tubo di alluminio imposta il volume cultura e la cultura eccesso trabocca nel contenitore effluente (tubo 8 in
  4. Autoclavare il gruppo coltura a 121 ° C e 15 psi (sterilizzazione generale) per 30 min.
    Nota: I tubi attraverso cui viene riempito il pallone di supporto, attraverso il quale il matraccio supporto viene aspirata, e attraverso la quale il recipiente di coltura viene inoculato avere più segmenti di tubo in modo che se il segmento distale è contaminata, può essere rimosso per rivelare una sterile segmento.

9. Preparare il canale Microfluidic

  1. Mescolare polidimetilsilossano (PDMS) e catalizzatore in un rapporto 9: 1. Degas e versare sullo stampo maestro di silicio.
  2. Curare il PDMS per 2 ore a 65 ° C e poi tagliare dalla maschera con una lama di rasoio. Tagliare intorno alle PDMS finché non si sgancia dallo stampo. Evitare di spingere verso il basso e la rottura del wafer fragili.
  3. Utilizzare un foro di 1,2 millimetri ID biopsia perforatore a perforare ad entrambe le estremità del canale.
  4. Legame plasma il PDMS al vetro di copertura 24.
  5. Nastro il lungo estremità del vetro di copertura al telaio in alluminio appoggio in modo tale che il canale PDMS è centrato sul telaio in alluminio, e poi cuocere i PDMS ancora per 2 ore a 65 ° C.

10. Fill Media Flask

Figura 7
Figura 7: Aggiunta di media. Questo diagramma mostra come i media dovrebbero essere vuoto filtrato nel pallone media. Essa assicura che il supporto rimane sterile. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

  1. Fare mezzi appropriati. Se il sistema di coltura continua sarà gestito come un chemostat, utilizzare supporti limitate per una specifica sostanza.
    NOTA: Esempi di composizione standard dei supporti per gli studi con S. cerevisiae sono stati precedentemente pubblicati 25,= "xref"> 26, 27, 28, 29.
  2. Fissare il filtro a vuoto per un flacone da 100 ml, togliere la copertura dell'ugello, quindi rimuovere la spina bianca dal capezzolo del filtro a vuoto con una pinzetta sterile.
  3. Collegare il tubo di silicone 3/16 "ID per il capezzolo, altro tubo libera del pallone media per una pompa a vuoto (tubi 1 e, 2 in figura 7, rispettivamente), e assicurarsi che il tubo di collegamento del pallone media per il recipiente di coltura viene bloccato chiuse (tubo 3 nella Figura 7).
  4. Riempire il filtro con i media, accendere la pompa del vuoto, e poi filtrare il resto dei media. Bloccare il tubo in silicone 1/16 "ID collegata al vuoto (tubo 2 in figura 7) e spegnere la pompa del vuoto.
  5. Rimuovere le leurs dal segmento intermedio di 1/16 "tubo ID collegato alla pompa a vuoto in modo che una estremità incontaminato del tubo è accessibile. Inserire the blu fine di un filtro dell'aria siringa sterile in questo tubo.
  6. Bloccare il tubo 3/16 "ID silicone (tubo 1 in figura 7) e scollegare il luer maschio da esso. Staccare la spina dalla luer femmina del tubo di ingresso media del recipiente di coltura. Collegare questi maschili e femminili Luers per consentire ai media di essere pompata nel recipiente di coltura.
  7. Rimuovere il filtro a vuoto e tappare la bottiglia di media che è stata allegata al filtro a vuoto 100 mL.
  8. Un giorno prima del recipiente di coltura viene inoculato, inoculare una singola colonia del microbo optogenetic in una provetta con 4 ml di media raccolti nel passaggio precedente, e lasciate crescere durante la notte a 30 ° C o temperatura di crescita ottimale temperatura della coltura con agitazione.

11. Montare l'apparecchiatura Intorno al microscopio

  1. Posizionare il gruppo coltura continua vicino al microscopio con i media boccetta più alto del recipiente di coltura e la efflupallone ent inferiore del recipiente di coltura, in modo tale che il tubo composto da segmenti di 0,022 "tubi in PTFE ID (tubo 5 in figura 6) può raggiungere la fase microscopio. Trovare nastro adesivo lungo i tappi di gomma sul pallone di supporto e contenitore effluenti.
  2. Scollegare le estremità del 0.022 "ID tubazione PTFE da 1/50" tubo ID silicone li collegano (tubo 5 in figura 6), e collegare questi fini in ingresso e uscita del dispositivo microfluidico.
  3. Collegare l'estremità bianca del filtro dell'aria della siringa alla pompa dell'acquario. La pressione dell'aria spingerà supporto nel recipiente di coltura.
  4. Quando il supporto raggiunge il livello del porto effluenti, avvolgere il tubo "dispositivi di identificazione ingresso e connettori attorno alla pompa peristaltica lenta (tubo 4 in Figura 6) e 1/50" 1/16 campione tubo di uscita ID e connettori intorno veloce pompa peristaltica (tubo 5 in figura 6).
  5. Aerare il supporto per lo sbloccaggio l'aria tuessere compreso tra il fiasco dei media e recipiente di coltura.
  6. Nastro il pad riscaldamento e termometro per il recipiente di coltura in modo che la sua temperatura può essere controllata. Avvolgere il tubo media di tutto il recipiente di coltura quindi i media entrano saranno alla stessa temperatura del recipiente.
    NOTA: La corrente PWM al pad riscaldamento è regolato dal microcontrollore che utilizza l'ingresso dal termometro per mantenere il recipiente di coltura alla sua temperatura nominale.
  7. Inserire il recipiente di coltura nel recinto di schiuma nera sopra la matrice di LED, e assicurarsi che i tubi non vengano schiacciati.
  8. In Micro-Manager, andare al Plugin> bioreattore Controller. Impostare la "percentuale media pompa" campo per 0,1 e il "rapporto della pompa di esempio a" field a 0. La velocità di flusso sarà molto bassa, ma maggiore della velocità di evaporazione.
  9. Fissare il tubo di aria in entrata tra il pallone media e recipiente di coltura. Togliere il tappo dal tubo di inoculazione (tubo 7 in figura
  10. Coprire il contenitore in modo che la luce non penetra, e lasciare che la cultura crescere durante la notte.

12. Calibrare il pompaggio Tariffe

  1. In Micro-Manager, andare al Plugin> bioreattore Controller. Impostare il "rapporto di supporti pompa su" campo per 0,5 e il "rapporto di pompa di esempio a" campo a 0.
  2. Scollegare il tubo di troppo pieno dal pallone effluente (tubo 8 in figura 6) e il tubo di campionamento dal pallone effluente (tubo 8 in figura 6) e raccogliere effluenti in recipienti separati. Raccogliere effluente per 1 ora, inizio dopo le pompe sono state per 15 min.
  3. Calcolare la portata media nel recipiente di coltura dal volume raccolto nel recipiente come:
  4. Regolare il valore del "rapporto della pompa di supporto a" campo da questa stima lineare:
    Equaiton 2
    dove
    Equaiton 3
  5. Scorrere questa procedura di calibrazione finché la differenza tra la portata desiderata e la portata misurata è <0,2 ml / h, in cui la portata è in media su un periodo di 1 h.
  6. Aumentare il valore del "rapporto di campionamento sul campo" e calibrare in modo analogo fino a circa 4/5 del volume th sbarco l'incubazione viene pompato dalla pompa di campionamento e circa 1/5 del volume lascia attraverso il porto di overflow.
  7. Lasciate che la densità di cultura nel apparecchiatura per le colture continuo equilibrare in queste condizioni durante la notte.
    NOTA: Se le portate obiettivo non può essere raggiunto, il cambiamentoil tubo della pompa peristaltica. Il liquido viene pompato ad un tasso superiore quando si utilizza più grandi tubi di diametro. Seguire passo 14 e poi tornare al punto 8.4.

13. microscopio Immagini Raccogliere di microbi coltivate

  1. Riempire la fase Position List di Micro-Manager con un insieme di posizioni non sovrapposte in cui le immagini di cellule pompati nel canale microfluidico saranno nel piano focale.
  2. Aprire il plugin "bioreattore Controller". Selezionare la rotta desiderata tempo matrice di LED, i canali di imaging, e le altre impostazioni sperimentali dalle istruzioni. Raccogliere e analizzare le immagini.
  3. Mentre l'esperimento funziona, assicurarsi che il supporto nel pallone mezzi rimane chiaro. Se è nuvoloso, allora è stato contaminato.

14. Post-esperimento

  1. Smaltire i media, la cultura di cellule in eccesso e degli effluenti.
  2. Riempire il matraccio media con 200 ml di 20% EtOH miscelato con acqua deionizzata. Eseguire il chemostat come aveva in precedenzastato eseguito durante l'esperimento per lavare i detriti cellulari e dei media.
  3. Quando la soluzione di alcool è drenata dal pallone media, smontare completamente il chemostat.
  4. Lavare vetro e tubi con acqua tiepida e un detergente delicato, e risciacquare abbondantemente con acqua deionizzata. Lasciare asciugare.
  5. Aprire il file "microcontrollerRecords.csv" per rivedere la temperatura e lo stato matrice di LED nel corso dell'esperimento, il file "Summary.csv" per esaminare i dati di sintesi di ogni set di immagini ed i "risultati <n> .csv" file per esaminare i dati di sintesi ogni ROI di ogni periodo di tempo, dove n è il n ° set di dati.

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Representative Results

Questo apparecchio è stato utilizzato per stimolare una cultura di S. cerevisiae esprimere proteina fluorescente gialla (YFP) in risposta alla luce blu tramite un sistema di trascrizione inducibile optogenetic basata sulla coppia proteine CRY2 / CIB1 30. Le cellule sono state coltivate chemostatically nei media fosfato limitata, con un tasso medio di diluizione di 0,2 ± 0,008. Limitazione fosfato è comunemente usato in esperimenti S. cerevisiae chemostato per controllare il tasso di crescita e gli effetti della limitazione di fosfato sono ben caratterizzati. 31, 32, 33 effluente dal recipiente coltura continuamente diluito state campionate ad un dispositivo microfluidico su un microscopio invertito. Le immagini sono state analizzate automaticamente come mostrato in figura 8. Le singole celle sono stati identificati nelle immagini a contrasto di fase di fondo-sottratti e la loro concentrazione YFPzione è stata stimata dal loro fluorescenza misurata dalle immagini fluorescenti di sfondo-sottratto.

La fluorescenza di 169,677 cellule è stata analizzata da 33.600 immagini di effluenti acquisiti da 28 sedi nel dispositivo microfluidica sopra i 70 h dell'esperimento. Abbiamo utilizzato un microscopio invertito dotato di un sistema di illuminazione a fluorescenza e una fotocamera CMOS. Le immagini sono state acquisite YFP con un 500/20 nm di eccitazione filtro, un filtro 535/30 nm di emissione, e un dicroico T515lp. Le immagini sono state scattate con un obiettivo di contrasto di fase 40X, sotto l'illuminazione Köhler. Le immagini sono state registrate in profondità di colore a 16 bit con 87 pixel per micrometro quadrato. La cultura è stato esposto a diverse intensità di luce blu per 6 intervalli h, seguita da completa oscurità per intervalli di 6 h. La cultura era stato esposto alla luce prima della prima misurazione, motivo per cui la sua intensità di fluorescenza diminuisce durante il primo periodo di buio. </ P>

La Figura 9 mostra la fluorescenza dovuta alla produzione YFP all'attivazione del sistema optogenetic in risposta all'illuminazione del recipiente di coltura. Ciò dimostra l'utilità delle misurazioni singola cella di fluorescenza su una popolazione misurazioni medio-unicellulari rivelano che la distribuzione delle intensità di fluorescenza. Si noti il ​​valore anomalo a 42 h 26 min. Dopo aver esaminato le immagini corrispondenti, era evidente che c'erano grumi di cellule nella maggior parte delle immagini utilizzate per generare l'immagine composita di fondo, con conseguente artefatti che somigliavano cellule nell'immagine background-sottratto. Inoltre, una bolla dal recipiente di coltura è stata pompata al canale microfluidico e parti di suoi bordi si sbagliavano come cellule mediante l'algoritmo di analisi di immagine. Dal momento che né la bolla né i manufatti sottraendo lo sfondo corrispondevano alle cellule attuali, la loro intensità di fluorescenza misurataè inferiore alla auto-fluorescenza delle cellule. Questa cifra dimostra la qualità dei dati che possono essere acquisite automaticamente 3 d. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 8
Figura 8: rappresentazione visiva del algoritmo di analisi dell'immagine. Queste immagini sono state ritagliate e ampliato per qualità di visione. (A) sei immagini sono acquisite per generare l'immagine di sfondo-sottratto contrasto di fase della coltura cellulare. Dopo che l'immagine principale viene acquisita, cinque altre immagini sono acquisite con la pompa effluente-campionamento acceso brevemente tra ogni acquisizione di garantire che le cellule vengono spostati. Una immagine composita dello sfondo è generato dalle cinque immagini dei componenti. Il valore di ciascun pixell'immagine di sfondo in è il valore mediano dello stesso pixel attraverso le 5 immagini dei componenti. (B) L'immagine di sfondo sottratto viene poi convertito in un binario. Il binario viene poi dilatato e fori all'interno di sezioni continue del binario sono pieni. I contorni gialli corrispondono alle regioni selezionate di interesse (ROI), sulla base di criteri di dimensione e di circolarità. (C) Tali ROI sono mappati sull'immagine fluorescente, in cui la fluorescenza di ciascuna cella viene misurata come il valore del pixel più luminoso all'interno della ROI. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 9
Figura 9: Distribuzione della popolazione di intensità di fluorescenza nel tempo. In questi sottofigure il logaritmo di Fluor misurataescence viene visualizzato, seguendo una pratica standard in citometria a flusso. La linea A e B indica l'intensità di luce assorbita o diffratta dalla cultura, che viene misurata come differenza di intensità fra luce trasmessa attraverso mezzi sterili e di luce trasmessi attraverso coltura cellulare nel recipiente di coltura. Si è tracciata contro il secondo asse delle ordinate. (A) Una scatola e la trama soffio (5 ° percentile, 25 ° percentile, mediana, 75 ° percentile, 95 ° percentile) del logaritmo della fluorescenza misurato della popolazione nel corso del tempo. (B) Un istogramma 2-dimensionale dei dati medesimi, dove il colore corrisponde alla frequenza normalizzata di cellule con una fluorescenza misurata nell'intervallo bidone corrispondente. I colori sono stati scalati per la gamma di dati senza l'outlier a 42 h 26 min incluso. La frequenza normalizzata del valore anomalo nel più basso bidone di fluorescenzaè 0.7. (C) Un istogrammi dimensionali del logaritmo della fluorescenza misurata della popolazione prima della prima esposizione registrata alla luce e dopo la maggiore esposizione alla luce. Ciò dimostra che l'espressione indotta dalla luce di YFP in questo ceppo è bimodale. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Abbiamo progettato questo apparecchio ogni esigenza. Tutto il codice utilizzato è gratuito e open-source. Il processo di analisi delle immagini di default per le cellule del segmento è semplice e viene eseguito rapidamente. Analisi personalizzata può essere attuata facendo registrare input dell'utente mentre analizzando un'immagine rappresentativa con l'interfaccia grafica utente FIJI, convertendo l'ingresso a uno script BeanShell, e quindi impostando il plugin per chiamare lo script. Quando viene chiamato, questo script verrà inviato un array di stringhe chiamato "immagini" che contengono i percorsi dei file per la più recente serie di immagini di sfondo-sottratto. Le immagini ei dati vengono salvati come sono raccolti in modo che non si perdono se un esperimento termina bruscamente. Una matrice LED blu è stato scelto per indurre il sistema optogenetic ma potrebbe essere sostituito con LED di colore diverso. Ci sono ulteriori pin di ingresso e uscita disponibili sul microcontrollore e fori passanti per un interruttore MOSFET supplementare e relè sul PCB che rendono facileper questo sistema di essere adattato per scopi più complesse. Ad esempio, per rendere questo apparecchio operare come turbidostat, utilizzare i pin aggiuntivi sul microcontrollore per alimentare un LED e leggere i valori da un sensore di luce legato al recipiente di coltura, e quindi modificare il software per misurare la torbidità e diluire il vaso conseguenza .

Si deve prestare attenzione a garantire che la cultura non sia contaminata, per proteggere le apparecchiature sensibili microscopio, e per assicurare che le portate del fluido sono coerenti. Contaminazioni prima di quando il recipiente di coltura è intenzionalmente inoculato può essere rilevato da attendere alcuni giorni prima dell'inoculo nave e verificare che non vi è alcuna crescita all'interno. Per evitare fuoriuscite di coltura cellulare sull'obiettivo del microscopio, verificare che il dispositivo microfluidica non colerà dalla prima coltura cellulare di pompaggio attraverso di esso su un panno assorbente. Se il flusso di supporto nel recipiente di coltura è incoerente, di solito è perché il tubo attornoi rulli della pompa peristaltica è diventata troppo lenta. Se il flusso di aria dalla pompa acquario è incoerente, garantire che non vi siano pieghe a forma di U nel tubo effluenti in cui il liquido può unire e resistere incoerente flusso d'aria. Se il tubo si ostruisce, dopo un esperimento a causa dei media ha prosciugato dentro di esso, immergere i tubi intasati in un bagno di acqua calda per sciogliere lo zoccolo.

Ci sono limiti intrinseci a questo protocollo da considerare quando si pianifica un esperimento o l'analisi dei risultati. A seconda del grado di diluizione e la lunghezza del tubo utilizzato, vi è un ritardo di circa 10 minuti durante il quale la coltura cellulare viene pompato dal recipiente di coltura al microscopio. Pertanto, non è adatto per gli eventi che si verificano nel corso studiano tempi più brevi. Inoltre, mentre un esperimento può funzionare continuamente per circa dieci giorni, limitata solo dal volume del supporto, l'evoluzione della coltura cellulare deve essere considerata come la durata degli aumenti esperimento. il LimiTing nutrienti dei media ha effetti profondi sul metabolismo e l'espressione genica 35, 36, 37, 38, 39 e dovrebbe quindi essere determinato in base all'aspetto della fisiologia in fase di studio. Quando si analizzano i risultati, le immagini, specialmente le immagini dai dati periferiche punti-dovrebbero essere riviste per gli errori nel modo in cui ROI sono stati identificati dalla routine di analisi delle immagini. E 'possibile per bolle o artefatti di essere scambiato per le cellule, inclinazione in tal modo la fluorescenza misurata. Un modo semplice per eliminare tali misurazioni errate è quello di eliminare tutte le ROI con intensità di fluorescenza sotto l'intensità di auto-fluorescenza.

Questo protocollo sarà utile per la misurazione dell'intensità di fluorescenza e / o la morfologia cellulare di coltura cellulare effluenti in risposta alla luce in microrganismi che possono crescere in coltura continua, impostareTLE ad un piano focale coerente quando non agitato, e identificare automaticamente da un algoritmo di analisi di immagine. L'algoritmo di identificazione delle cellule di default usata qui sarà più direttamente applicabile ai microbi o meno sferiche che somigliano in erba lievito. Un'alternativa 40 di questo protocollo è quello di crescere i microbi in un insieme di culture in batch, e poi assaggiare un lotto per ogni punto di tempo e caratterizzare il campione mediante citometria di flusso. Tuttavia, i vantaggi del protocollo qui descritto sono che i campioni vengono prelevati dalla stessa cultura, molti campioni possono essere presi, e il processo è automatizzato. Questo protocollo migliora anche su di un metodo simile, in cui il lievito optogenetic erano continuamente colto e ripreso al microscopio 34 con l'acquisizione di immagini multiple in modo rapido e non polarizzazione identificazione ROI per fluorescenza. Un grande vantaggio di questo protocollo è che molte misure di singole cellule possono essere acquisite regolarmente per diversi giorni senzl'input dell'utente ut. Dopo aver misurato la risposta della coltura microbica all'esposizione alla luce, un passo successivo potrebbe essere quello di attuare in silico controllo ad anello chiuso della risposta.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

Vorremmo riconoscere Molly Lazar e Veronica Delgado per l'assistenza in fase di test del protocollo, Kieran Sweeney per utili discussioni e l'editing, e Taylor Scott, My An-adirekkun, e Stephanie Geller per la lettura critica del manoscritto. Megan Nicole McClean, Ph.D. detiene un premio alla carriera al interfaccia Scientifico del Fondo di Burroughs Wellcome.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Extensive lab manual GitHub NA An extensive, regularly updated lab manual is available in the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). This also includes a description of the microfluidic mold used to generate the representative results.
Fritzing Design Viewer Fritzing NA The free, open-sourced software to view and edit the .fzz type circuit board designs is available at "http://fritzing.org/download/"
Arduino Uno R3 (Atmega328 - assembled) Adafruit 50 Microcontroller. 1 required.
Arduino Stackable Header Kit SparkFun Electronics 10007 Female pin headers for connecting PCB to microcontroller. 1 required.
Adjustable 30W 110V soldering iron - XY-258 110V Adafruit 180 For making electrical connections to the PCB. 1 required.
Soldering iron stand Adafruit 150 For making electrical connections to the PCB. 1 required.
Mini Solder spool - 60/40 lead rosin-core solder 0.031" diameter - 100g Adafruit 145 For making electrical connections to the PCB. 1 required.
0.1 μF capacitor SparkFun Electronics COM-08375 Stabilizes voltage in PCB. 1 required.
10 μF capacitor SparkFun Electronics COM-00523 Stabilizes voltage in PCB. 1 required.
MAX7219CNG LED Matrix/Digit Display Driver - MAX7219 Maxim MAX7219CNG LED driver. 1 required.
8 pin IC Socket Mouser Electronics 575-144308 16 required. These will be stacked on top of each other to support the culture vessel above the LED matrix.
24 Pin IC socket Mouser Electronics 535-24-3518-10 Optional. Use this to reversibly attach the MAXIM 7219CNG driver to the PCB.
Digital multimeter Adafruit 2034 For troubleshooting electronics. 1 required.
Break Away Headers - 40-pin Male (Long Centered, PTH, 0.1") SparkFun Electronics PRT-12693 Male pin headers for connected LED matrix to printed circuit board. Ends can be trimmed with wire cutters. 1 set required. 
Flush diagonal wire cutters Adafruit 152 For trimming long pin headers and cutting power cables. 1 required.
Premium Female/Female Jumper Wires - 40 x 12" (300mm) Adafruit 793 Wire ribbon for connecting breadboard to LED matrix. Can be connected end-to-end with male pin-headers to be longer. 1 required.
Half-size breadboard Adafruit 64 The LED matrix will connect to this and the culturing vessel will rest above it.
Miniature 8x8 Blue LED Matrix Adafruit 956 Light source. Dominant wavelength is 470nm (blue). 1 required. Alternative miniature LED matrices from the same vendor are available with dominant wavelengths: 624 nm (red), 588 nm (yellow), 525 nm (green), 572 nm (yellow-green), and white.
Stackable header-3 pin SparkFun Electronics 13875 8 required.
Resistor Kit - 1/4W (500 total) SparkFun Electronics 10969 For electronics. 1 required.
 IRL520N MOSFET International Rectifier IRL520N Voltage regulating switch for controlling DC current. 4 required.
Hook-Up Wire - Assortment (Solid Core, 22 AWG) SparkFun Electronics PRT 11367 Wire for electronics. 1 required.
5V 2A (2000mA) switching power supply - UL Listed Adafruit 276 Power supply for the heating pad and Arduino. 2 required.
12 VDC 1000mA regulated switching power adapter - UL listed Adafruit 798 For peristaltic pumps. 2 required.
Electric Heating Pad - 10cm x 5cm Adafruit 1481 For heating the bioreactor. 1 required.
Low flow variable flow peristaltic pump Fisher Scientific 13-876-1 For pumping media. 1 required
Medium flow variable flow peristaltic pump Fisher Scientific 13-876-2 For pumping culture. 1 required.
9 VDC 1000mA regulated switching power adapter - UL listed Adafruit 63 For microcontroller power supply. Order 1.
High Temp Waterproof DS18B20 Digital temperature sensor + extras Adafruit 642 Thermometer for the bioreactor. 1 required.
Micromanager Micromanager NA The free, open-sourced microscope control software is available at "https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release"
FIJI ImageJ NA The free, open-sourced image analysis software is available at "http://fiji.sc/"
Arduino Integrated Development Environment Arduino NA The free, open-sourced IDE is available at "https://www.arduino.cc/en/Main/Software"
Custom code GitHub NA The custom microcontroller code and "Bioreactor Controller" plugin are available in the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).
USB Cable A to B - 6 Foot SparkFun Electronics CAB-00512 Used to download data to microcontroller. 1 required.
bioreactorTimecourse_example.csv GitHub NA The advantage of loading LED matrix values from a CSV file is that a program can be called by the plugin to update those values based on image analysis results, and those values can be reloaded to the microcontroller, enabling feed-back control. It is available from the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).
Tota-frost gels (diffusion paper) B&H B&H # LOFSFTL
MFR # T1-72
For LED matrix. 1 required.
Kitting Sheet Crosslink 1/4x12x24in Grainger, inc 20JL37 Black foam for culturing vessel enclosure. 4 required.
Standard Photodiode Power Sensor, Si, 200 - 1100 nm, 50 mW  Thorlabs S120VC For measuring light intensity. 1 required.
Labelling Tape Fisher Scientific 159015N For labelling and securing loose components. 1 required.
Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD Thorlabs PM100D For measuring light intensity. 1 required.
100mL GL45 hybridization glass bottle Bellco Glass, Inc. (7910-40150) Bioreactor vessel. 1 required.
Six port assembly Bellco Glass, Inc. Custom  For the bioreactor vessel. Tubing Specs: .125" OD x .055"ID. Port A: 1.0" long above cap slug and to bottom of tube. Ports B,C,E,F: 1.0" long above cap slug, 33 mm long below. Port D: 1.0" long above cap slug, 65 mm  long below. 1 required. Includes 45 mm diameter polypropylene open top screw cap and a white silicone gasket to ensure a tight seal between the cap and the vessel. 
Scotch Magic Tape 3105, 3/4 x 300 Inches, Pack of 3 Amazon B0009F3P3U Clear scotch tape. This is available from many other vendors. It is used to cover markings on the culturing vessel and to secure the coverglass with the PDMS channel to the aluminum support frame.
1/16" ID x 3/16" OD x 1/16" Wall Tygon Sanitary Silicone Tubing United States Plastic Corp. 57288 Tubing. ~25' required.
Cole-Parmer Twistit white rubber stopper, size 10 Cole-Parmer EW-62992-32 Media flask stopper and effluent flask stopper. 2 required.
2L Laboratory Flask Pyrex 4980 Media flask and effluent flask. 2 required.
Day pinchcock Fisher Scientific 5867 For pinching tubes shut. 3 required.
Replacement tubing assembly 1/16" ID Traceable Products 3372 The peristaltic pumps come with a set of tubes, but they wear out after weeks of use.
Replacement tubing assembly 1/50" ID Traceable Products 3371 The peristaltic pumps come with a set of tubes, but they wear out after weeks of use.
Male luer with lock ring x 1/16" hose barb, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45505-00 Connectors. ~10 luers are required.
Male luer with lock ring x 1/8" hose barb, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45505-04 Connectors. 5 required, one for each rubber stopper hole to fill with tubing.
Female luer x 1/16" hose barb adapter, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45502-00 Connectors. ~10 luers required.
Female luer x 3/16" hose barb adapter Cole-Parmer EW-45502-08 Connectors. ~10 luers required.
Cole-Parmer Luer Accessory, Female Luer Cap, Nylon, 25/Pk Cole-Parmer SC-45502-28
Cole-Parmer Luer Accessory, Male Luer Lock Plug, Nylon, 25/Pk Cole-Parmer EW-45505-56
Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID x 0.042"OD, 100 ft/roll Cole-Parmer EW-06417-21 Tubing. 1 roll required.
Masterflex platinum-cured silicone tubing, L/S 13, 25 ft Cole-Parmer EW-96410-13 Tubing. ~25' required.
3/16" ID x 1/4" OD x 1/32" Wall Tygon Sanitary Silicone Tubing United States Plastic Corp. 57293 Tubing. ~1' required.
Vacuum filter Fisher Scientific 974107 Nalgene vacuum filter for sterile filtering media.
Aquel Oxy-Boost 200 Rena Aquatic Supply AP200 Dual diaphram adjustable flow air pump for aerating and mixing media. 1 required. 
0.2 μm pore syringe filter Corning International 431229 This ensures that air from the aquarium pump does not contaminate the apparatus. 1 required.
Slygard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning Slygard 184 For microfluidic device. 1 required.
American Safety Razor GEM Scientific Single-Edge Razor Blades Fisher Scientific 17989000 For cutting tubes and PDMS. 1 blade required.
Harris Uni-Core hole puncher 1.2mm ID Sigma-Aldrich WHAWB100028 ALDRICH For punching inlet/outlet in microfluidic device. 1 required.
Microscope cover glass 22x60-1.5 Fisher Scientific 12-544-G For microfluidic device. 1 required.
Rectangular aluminum frame with a square window Custom Custom To support the microfluidic channel. Outer dimensions: 3 inches x 1.25 inches.
Inner dimmensions (cut out portion): 7/8 inches x 7/8 inches
Thickness: ~1/32 inches

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References

  1. Motta-Mena, L. B., Reade, A., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature chemical biology. 10, (3), 196-202 (2014).
  2. Hughes, R. M., Bolger, S., Tapadia, H., Tucker, C. L. Light-mediated control of DNA transcription in yeast. Methods. 58, (4), 385-391 (2012).
  3. Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature biotechnology. 20, (10), 1041-1044 (2002).
  4. Polstein, L. R., Gersbach, C. a Light-inducible spatiotemporal control of gene activation by customizable zinc finger transcription factors. J Am Chem Soc. 134, (40), 16480-16483 (2012).
  5. Polstein, L. R., Gersbach, C. a A light-inducible CRISPR-Cas9 system for control of endogenous gene activation. Nature Chemical Biology. 11, (3), 198-200 (2015).
  6. Yang, X., Jost, A. P. T., Weiner, O. D., Tang, C. A light-inducible organelle-targeting system for dynamically activating and inactivating signaling in budding yeast. Molecular biology of the cell. 24, (15), 2419-2430 (2013).
  7. Lee, S., Park, H., et al. Reversible protein inactivation by optogenetic trapping in cells. Nature methods. 11, (6), 633-636 (2014).
  8. Kennedy, M. J., Hughes, R. M., Peteya, L. A., Schwartz, J. W., Ehlers, M. D., Tucker, C. L. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nature Methods. 7, (12), 973-975 (2010).
  9. Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. Induction of protein-protein interactions in live cells using light. Nat Biotechnol. 27, (10), 941-945 (2009).
  10. Zoltowski, B. D., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. Blue light-induced dimerization of a bacterial LOV-HTH DNA-binding protein. Biochemistry. 52, (38), 6653-6661 (2013).
  11. Renicke, C., Schuster, D., Usherenko, S., Essen, L. O., Taxis, C. A LOV2 Domain-Based Optogenetic Tool to Control Protein Degradation and Cellular Function. Chemistry & Biology. 20, (4), 619-626 (2013).
  12. Novick, A., Szilard, L. Description of the chemostat. Science (New York, N.Y.). 112, (2920), 715-716 (1950).
  13. Monod, J. La technique de culture continue. Théorie et applications. Ann. Inst. Pasteur. 79, (4), 390-410 (1950).
  14. Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature Biotechnology. 20, 1041-1044 (2002).
  15. Kennedy, M. J., Hughes, R. M., Peteya, L. A., Schwartz, J. W., Ehlers, M. D., Tucker, C. L. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nature Methods. 7, 973-975 (2010).
  16. Olson, E. J., Tabor, J. J. Optogenetic characterization methods overcome key challenges in synthetic and systems biology. Nature chemical biology. 10, (7), 502-511 (2014).
  17. Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: An experimental organism for 21st century biology. Genetics. 189, (3), 695-704 (2011).
  18. Galanie, S., Smolke, C. D. Optimization of yeast-based production of medicinal protoberberine alkaloids. Microbial cell factories. 14, (1), 144 (2015).
  19. Gerngross, T. U. Advances in the production of human therapeutic proteins in yeasts and filamentous fungi. Nature biotechnology. 22, (11), 1409-1414 (2004).
  20. van Maris, A. J. A., Abbott, D. A., et al. Alcoholic fermentation of carbon sources in biomass hydrolysates by Saccharomyces cerevisiae: current status. Antonie van Leeuwenhoek. 90, (4), 391-418 (2006).
  21. Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using µManager. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 14 (2010).
  22. Edelstein, A. D., Tsuchida, M. A., Amodaj, N., Pinkard, H., Vale, R. D., Stuurman, N. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of biological methods. 1, (2), (2014).
  23. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  24. Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxygen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14, (3), 590-597 (2005).
  25. Saldanha, A. J., Brauer, M. J., Botstein, D. Nutritional homeostasis in batch and steady-state culture of yeast. Molecular Biology of the Cell. 15, 4089-4104 (2004).
  26. Boer, V. M., Tai, S. L., et al. Transcriptional responses of Saccharomyces cerevisaie to preferred and nonpreferred nitrogen sources in glucose-limited chemostat cultures. FEMS Yeast Research. 7, 604-620 (2007).
  27. Boer, V. M., Amini, S., Botstein, D. Influence of genotype and nutrition on survival and metabolism of starving yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 6930-6935 (2008).
  28. Brauer, M. J., Huttenhower, C., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response and metabolic activity in yeast. Molecular Biology of the Cell. 19, 352-367 (2008).
  29. Gresham, D., Dunham, M. J. The enduring utility of continuous culturing in experimental evolution. Genomics. 104, (6), 399-405 (2014).
  30. Liu, H., Yu, X., et al. Photoexcited CRY2 interacts with CIB1 to regulate transcription and floral initiation in Arabidopsis. Science (New York, N.Y.). 322, (5907), 1535-1539 (2008).
  31. McIsaac, R. S., Oakes, B. L., Wang, X., Dummit, K. A., Botstein, D., Noyes, M. B. Synthetic gene expression perturbation systems with rapid, tunable, single-gene specificity in yeast. Nucleic Acids Research. 41, (4), 1-10 (2013).
  32. McIsaac, R. S., Petti, A. A., Bussemaker, H. J., Botstein, D. Perturbation-based analysis and modeling of combinatorial regulation in the yeast sulfur assimilation pathway. Molecular biology of the cell. 23, (15), 2993-3007 (2012).
  33. McIsaac, R. S., Silverman, S. J., et al. Fast-acting and nearly gratuitous induction of gene expression and protein depletion in Saccharomyces cerevisiae. Molecular biology of the cell. 22, (22), 4447-4459 (2011).
  34. Melendez, J., Patel, M., Oakes, B. L., Xu, P., Morton, P., McClean, M. N. Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures. Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 6, (3), 366-372 (2014).
  35. Brauer, M. J., Huttenhower, C., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast. Molecular biology of the cell. 19, (1), 352-367 (2008).
  36. Boer, V. M., Crutchfield, C. A., Bradley, P. H., Botstein, D., Rabinowitz, J. D. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations. Molecular biology of the cell. 21, (1), 198-211 (2010).
  37. Markham, B. E., Byrne, W. J., Methods, E. Uptake, storage and utilization of phosphate by yeast. Journal of the Institute of Brewing. 73, 271-273 (1967).
  38. Kazemi Seresht, A., Palmqvist, E. A., Olsson, L. The impact of phosphate scarcity on pharmaceutical protein production in S. cerevisiae: linking transcriptomic insights to phenotypic responses. Microbial cell factories. 10, (1), 104 (2011).
  39. Shimizu, K. Regulation Systems of Bacteria such as Escherichia coli in Response to Nutrient Limitation and Environmental Stresses. Metabolites. 4, (1), 1-35 (2013).
  40. Olson, E. J., Hartsough, L. A., Landry, B. P., Shroff, R., Tabor, J. J. Characterizing bacterial gene circuit dynamics with optically programmed gene expression signals. Nature methods. 11, (4), 449-455 (2014).

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