La cuantificación histológica de miocardio infarto crónico en ratas

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Valentin, J., Frobert, A., Ajalbert, G., Cook, S., Giraud, M. N. Histological Quantification of Chronic Myocardial Infarct in Rats. J. Vis. Exp. (118), e54914, doi:10.3791/54914 (2016).

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Abstract

Introduction

El infarto de miocardio (IM) es una causa principal de muerte y discapacidad en todo el mundo. La enfermedad coronaria es la causa principal; MI resulta de la isquemia consecutiva a eventos coronarios tales como oclusión. Cuando la reperfusión no se realiza dentro de las primeras 6 horas, la isquemia induce necrosis miocárdica irreversible. En los pacientes, la caracterización de MI se apoya en diferentes herramientas de diagnóstico, incluidos los signos clínicos, la electrocardiografía, la evaluación de los niveles plasmáticos de biomarcadores, ecocardiografía, resonancia magnética y análisis histológicos 1. MI aguda y crónica se clasifican como dos fases diferentes de lesión de acuerdo con la temporización de la necrosis del miocardio en relación con el momento de la oclusión coronaria. La fase aguda, que se producen durante los primeros 7 días, se asocia con la pérdida de cardiomiocitos, inflamación extensa, y el reclutamiento de fibroblastos. La fase sub-aguda, caracterizada por la cicatrización del tejido cardiaco y la formación de una cicatriz, se produceentre 1 y 4 - 6 semanas. La expansión del infarto, adelgazamiento de la pared del ventrículo, y dilatación del ventrículo caracterizan la fase crónica. Amplia remodelación del ventrículo izquierdo da lugar progresivamente en la insuficiencia cardíaca grave 2.

MI permanente inducido por la arteria descendente anterior izquierda ligadura (LAD) representa el modelo estándar de roedores de infarto de miocardio crónico. Los imitadores de ligadura coronaria de la oclusión coronaria. El tamaño del infarto depende del sitio de la ligadura. Caracterización de la lesión isquémica del miocardio en un modelo de roedor se realiza clásicamente utilizando los niveles plasmáticos de biomarcadores, como la troponina I y T 3, ecocardiografía, resonancia magnética, y la histología 4,5. los niveles de biomarcadores se correlacionan con el grado de muerte de los cardiomiocitos. La ecocardiografía evalúa el deterioro de la función ventricular izquierda como resultado de alteraciones de la contractilidad regional. Además, las técnicas de imagen no invasivas, como la resonancia magnética o de alta resoluciónecocardiografía, permite la evaluación de la reducción de la motilidad, el volumen de la zona de la cicatriz con una reducción de la perfusión y el miocardio viable y el adelgazamiento de la pared. LV dimensiones permiten la evaluación precisa del tamaño del infarto. Por último, la cuantificación de miocardio viable y muertos se puede realizar usando postmortem manchas específicas de cortes histológicos de corazones cosechadas y permite la verificación del tamaño del infarto (IS). Otra característica importante es la evaluación del índice de expansión del infarto (EI) 6. La IE está asociada con el infarto transmural y se inicia dentro de los primeros 3 días. La EI se caracteriza por una reducción progresiva del espesor de pared, un aumento en el tamaño de la cavidad LV, y los consiguientes cambios en la forma del LV.

Con el fin de evaluar la eficacia terapéutica de nuevos tratamientos - en particular, las estrategias de regeneración basada en células, matrices, y el gen de evaluación entrega precisa de MI en roedores es de suma importancia.Cuando se mide en una sola sección transversal obtenida a nivel del músculo papilar, el tamaño se puede estar sesgado debido a la gran variabilidad que existe en el desarrollo del infarto después de la ligadura LAD; el infarto ápice puede ser entonces occulted. Es importante destacar que las metodologías más precisa el tamaño MI determinado se han descrito para los ratones o ratas de 7-9 10. Sin embargo, IS es insuficiente para cuantificar con precisión la remodelación del VI o reducciones terapéuticamente inducidos (o prevenciones) de la remodelación. De hecho, ¿se expresa habitualmente como un porcentaje del volumen total del VI evaluada en secciones transversales del corazón. Aunque este método es válido para IM agudo, el adelgazamiento de la pared del VI se producen durante la remodelación permanece bajo-evaluado 11,12. Una cuantificación morfométrica completa del tamaño del infarto y los cambios estructurales debe cuantificar varios parámetros, tales como longitudes endocárdicos y epicárdicos y diámetros, así como el infarto y las zonas sanas. Se describe un apr metodológicaoach para evaluar con precisión MI y remodelación en un modelo de rata crónica.

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Protocol

Todos los animales recibieron atención humanitaria de conformidad con la Convención Europea de los Animales. Los procedimientos quirúrgicos se realizaron de conformidad con la Ley de Protección de Animales de Suiza después de obtener el permiso de la Oficina Veterinaria del Estado, Friburgo, aprobado por la Oficina Veterinaria Federal Suizo, Suiza.

1. La recolección del corazón

NOTA: Todas las intervenciones quirúrgicas se realizaron bajo anestesia con isoflurano. Se hicieron esfuerzos para disminuir el sufrimiento de los animales. En particular, todos los animales recibieron una inyección subcutánea de 0,1 mg / kg de buprenorfina pre-anestesia. El protocolo quirúrgico para la inducción de infarto de miocardio se ha descrito previamente en otra parte 13.

  1. Realizar una esternotomía en un animal myocardially infartado bajo anestesia (animal intubado, 2,5% de isoflurano, la anestesia adecuadas confirmados por la pata reflejo pellizco).
    1. Abra el animal por el corte de la piel y luego los músculoscon tijeras quirúrgicas. Cortar las costillas en la izquierda y la derecha, y luego quitar el pecho.
    2. Retire las adherencias que quedan después de la cirugía anterior (LAD ligadura). Cortar la aorta y quitar el corazón. Ponga el tejido en KCl 1 M (en PBS), y luego se lava con PBS.

2. Preparación del tejido

  1. Poner el corazón infartado longitudinalmente en una matriz de corazón de rata acrílico. Mantenerlo a -20 ° C durante 1 hora.
  2. Cortar el corazón directamente en la matriz usando una hoja de afeitar con una transversal. Asegúrese de que cada porción es de 2 mm de espesor. Cortar aproximadamente 5-7 diapositivas para cada corazón (basado en el nivel de remodelación); esto se denomina muestreo sistemático.
  3. En este paso, la realización de la tinción de cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) es opcional (mantener la orientación de la base-vértice rebanadas del corazón).
    1. Incubar en 1% TTC en PBS durante 50 min a 37 ° C. Incubar en 4% de paraformaldehído (PFA) durante 20 min a 1 hr. Ponga las secciones entrn dos placas de vidrio con espaciadores de 2 mm y tomar fotografías con un microscopio estéreo lógico junto con una cámara en 15 aumentos.
      ¡PRECAUCIÓN! Paraformaldehído es tóxico.
  4. La congelación de diapositivas (1 opción st)
    1. Ponga cada diapositiva en un molde de plástico (10 x 10 x 5 mm) con medio para cryotomy (temperatura de corte óptima, OCT) de montaje, mantener la orientación (coloque el lado orientado al ápice de la sección hacia abajo en el fondo del molde). Congelar los bloques con los vapores de 2-metilbutano en nitrógeno líquido refrigerante durante 10 - 15 min. Por último, almacenar el tejido a -80 ° C.
  5. Paraffinization (2 ª opción)
    1. Colocar cada diapositiva de la incrustación de cassettes (mantener la orientación colocando el lado orientado ápice de la sección hacia abajo en la parte inferior de la casete) y luego en PFA al 4% durante 24 horas. Póngalo en una máquina durante la noche procesador de tejidos.
      1. Incubar en etanol al 70% durante 2 horas. Incubar en etanol 95% durante 2 horas. Incubar en etanol 100% durante 3 horas. Incubar en xilol durante 4 horas. Incubar en parafina (fundido a 60 ° C en un horno) durante 5 hr. Por último, hacer bloques mediante la incorporación de cada diapositiva corazón en parafina.

3. Masson-Goldner Trichrome tinción

  1. Hacer secciones de tejido de los bloques de parafina con un microtomo manual (grosor: 5 m) o de bloques de OCT con un criostato se establece en -18 ° C (espesor: 7 m).
  2. Manchar una diapositiva de cada parte del corazón de cada rata (3 - 4 secciones transversales por diapositiva) con Masson-Goldner tricrómico tinción (véase el anexo).
    NOTA: Empezar desde este paso para las secciones de parafina.
    1. Fundir las diapositivas a 60 ° C en un horno. Bajo una campana extractora, ellos Desparafinar en xilol dos veces durante 10 minutos cada uno. Rehidratan en 100% de etanol, 95% de etanol, 70% de etanol, y agua destilada durante 3 min cada uno.
      NOTA: Empezar desde este paso para la sección criogénicas.
    2. Fijarlos en Bouin solución durante la noche. Entonces, enjuagarlos con agua corriente del grifo durante 10 - 15 min. Enjuague con agua destilada. Incubarlos en hematoxilina de Mayer durante 3 min.
    3. Retire las diapositivas y dejarlas en agua destilada durante 5 minutos. A continuación, se incuba en ácido fucsina-Ponceau para 5 min. Enjuague en ácido acético al 1% durante 1 min.
    4. A continuación, los incuban en ácido fosfomolíbdico Naranja G durante 1 minuto. Enjuagarlos en ácido acético al 1% durante 1 min, incubarlos en tinte de color verde claro durante 10 minutos, y enjuague en ácido acético al 1% durante 1 min.
    5. Deshidratar en 70% de etanol (30 seg), 95% de etanol (30 seg), y 100% de etanol (5 min). Ponga una gota de medio de montaje de resina en las secciones de tejido, los cubren con cubreobjetos, y dejarlos secar.

Análisis de tamaño 4. infarto

  1. Adquirir una imagen de cada portaobjetos en un microscopio estereoscópico (ampliación 15X) acoplado con una cámara. Fotografiar una regla con el mismo ajustes.
  2. Utilice el software de análisis de imagen para medir el grosor de la cicatriz en el medio del infarto, el espesor del tabique, el área de la cavidad del ventrículo izquierdo (VI), el área de infarto, y la zona de tejido LV usando.
    1. Establecer la escala con la imagen regla (Figura 1A).
      1. Haga clic en mediciones después seleccione Establecer factor de conversión. Dibuje una línea en la barra de calibración. Haga clic derecho sobre la imagen y haga clic en la calibración final. Tenga en cuenta el valor de la barra y, a continuación, haga clic en Aceptar.
    2. Seleccione la LV de la foto del corazón manchado (Figura 1B). Utilice la herramienta de segmento múltiple. Seleccione el punto por punto y LV, haga clic derecho Copiar / pegar en cualquier lugar.
    3. Medir el grosor de la cicatriz y el tabique con la función única medición segmento (Figura 1C
    4. Detectará automáticamente el LV cavidad, infarto, y las zonas de baja tensión utilizando la herramienta de medición de área automático en modo RGB (Figura 1D).
      1. Haga clic en la herramienta. Sólo Bordes y activar Contigua en el modo RGB. Por último, haga clic dentro del área de interés para detectarlo. Si es necesario, utilizar herramientas de precisión.
  3. Calcular el tamaño del infarto como la relación entre el área de infarto al área LV.
  4. Calcular el índice de expansión de la siguiente manera: [área de la cavidad LV / toda la zona LV] / [grosor del infarto / grosor del septo], con toda la zona LV incluyendo tanto la cavidad del VI y zonas de tejido LV.
  5. Por último, el cálculo de un "promedio" de cada corazón de la siguiente manera: [promedio de índice de expansión de las diapositivas infartados] * [Número de diapositivas infartados / Número total de diapositivas].

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Representative Results

Seis semanas después de la ligadura de LAD, los corazones se recogieron de ratas Lewis. secciones de tejido de 2 mm se obtuvieron de vértice a la base. Un procedimiento de tinción de TTC se realizó para visualizar el área de infarto, que aparece en blanco, y el miocardio sano, que aparece en rojo (Figura 2). Dependiendo del sitio de la ligadura de la LAD, el tamaño del infarto varía. Para grandes MI, se observaron infartos transmurales desde el vértice a la base (Figura 2A). Infartos más pequeños presentan tejido infartado blanca visible desde el vértice hasta la mitad de la sección del corazón (Figura 2B). Para pequeños infartos no transmurales, se observó tejido fibrótico en sólo una o dos secciones de la cúspide (Figura 2C).

Delgadas secciones de 5 micras de cada rebanada del corazón fueron cortadas y teñidas con Masson-Goldner tricrómico. Fotos de toda la sección transversal del corazón eranadquirido bajo un microscopio estereoscópico (Figura 3). Los tejidos sanos aparecieron en el tejido conjuntivo rojo y el verde. La discriminación entre cada color se puede realizar fácilmente con un software de análisis de imágenes.

Los espesores de infarto y el tabique, el área de la cavidad LV y el área total LV se midieron y calcularon para calcular el EI (Tabla 1). La IE se calculó para cada sección. Dependiendo del tamaño del corazón, el número de secciones varió de 5 a 7. Para cada corazón, la IE es un promedio de la EI de cada sección. El EI varió desde 0 hasta 0,278 y reveló una amplia gama de infartos de miocardio, con un CV de 58%. En comparación, el promedio del porcentaje de infarto al LV varió desde 0 hasta 0,241, con un CV de 54% (Tabla 1). La IE y el porcentaje de infarto se correlacionaron significativamente; un análisis no paramétrico de Spearman proporciona un coeficiente de correlación r-vaLue de 0,491 (p = 0,005) (Figura 4A). Para primeros valores Ei, tales como 0,11 y 0,13, el porcentaje de infarto varió desde 5,8 hasta 24,1%.

La función cardíaca se evaluó mediante ecocardiografía de alta resolución a las 6 semanas post-LAD ligadura en animales anestesiados y se realizó una vez antes de la recolección del corazón. La IE calculado a partir de la cuantificación histológica correlacionó significativamente con el objetivo EF. Un análisis de Spearman no paramétrico proporciona un valor r de -0,709 (p = 0,005) (Figura 4B).

Figura 1
Figura 1. Paso a paso ilustración del uso del Software de Análisis de Imagen. Las mediciones de color de delimitación automática y longitud incluyen los varios pasos. A. Calibración: La escala de la imagen se creó. Una foto deuna regla fue tomada en las mismas condiciones que la sección del corazón. La longitud de la regla fue marcado para definir el factor de conversión a escala. Se llevó a cabo la conversión de píxeles a milímetros. B. Selección del LV: El ventrículo derecho fue cortada de la imagen utilizando la herramienta de selección de software. C. LV medición de la pared y el espesor del septo: La herramienta de medición solo se utilizó para cuantificar distancias. Las barras de escala indican 3 mm. D. área de cuantificación automática: delimitación automática del color se realizó en el modo RGB. Auto-selección se llevó a cabo después de seleccionar el modo de selección automática. selección basada en el color puede ser modificado; el investigador realizó un control visual del tejido verde seleccionada y aumenta o disminuye la región seleccionada como sea necesario. Las barras de escala indican 3 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2
Figura 2. Secciones del corazón teñidas con TTC. secciones de 2 mm del corazón lleno fueron teñidas con TTC. miocardio sano apareció en los tejidos fibróticos en rojo y blanco. Se presentan tres corazones con diferentes tamaños de infarto. R: infarto grande transmural, B: infarto medio, y C: infarto pequeño. Las barras de escala indican 3 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
Figura 3. Secciones del corazón teñidas con Masson-Goldner tricrómico. secciones de 5 micras se cortaron de cada sección del corazón obtenido 6 semanas post-LAD ligación. StaINED secciones se colocaron bajo un microscopio estereoscópico. Imágenes de las secciones completas se obtuvieron con 15 aumentos. La imagen representativa, obtenida a nivel de los músculos papilares (flecha) hacia atrás, muestra miocardio sano en los tejidos de color rojo y fibróticos en verde. La imagen ilustra la delimitación automática de color con el software de análisis de imágenes, así como el sitio en el que se midió el espesor del infarto y el tabique (líneas negras). Las barras de escala indican 3 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. Correlación entre la expansión del índice (IE) y el porcentaje del infarto relativos al LV (A) o la fracción de eyección (FE) (B). La regresión lineal (línea de color negro) y el 95% confideintervalos NCE (líneas de puntos) son representados. Se dice que el valor r de Spearman no paramétrico. R: El porcentaje de infarto y la IE correlacionó significativamente (r = 0,567; p = 0,003). El índice de expansión del infarto (EI) se calculó como [área LV cavidad / toda la zona LV] / [grosor del infarto / espesor septum]. Toda la zona LV se midió como la cavidad LV combinado y área de tejido LV. El porcentaje del infarto se calculó como área de tejido área de tejido LV / infarto. B: La función evaluó a las 6 semanas después de la ligadura de LAD utilizando una ecocardiografía de alta resolución se correlacionó significativamente con la IE. Ambos parámetros se correlacionaron significativamente (r = -0,709; p = 0,005). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

tabla 1
Mesa1: Parámetros medidos en las secciones del corazón teñidos con Masson Goldner.

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Discussion

Los pasos críticos dentro del Protocolo

tejido fibrótico puede evaluarse con precisión en un modelo de rata MI crónica utilizando muestreo sistemático del corazón y de la imagen cosechada análisis de secciones histológicas-tricromáticas manchado obtenidos a partir de la base al ápice. Dos pasos son especialmente importantes para el éxito de la implementación del protocolo. En primer lugar, el uso de KCl para la recolección del corazón permite que el músculo cardíaco se mantenga en un estado relajado. Este paso es importante para las comparaciones de dimensiones de infarto de diferentes corazones. En segundo lugar, la fijación durante la noche de la sección en solución Bouin es crítica para obtener la tinción tricrómica brillante.

Modificaciones y solución de problemas

La ausencia de tinción puede ser debido a dificultades durante la fijación de la sección en solución Bouin, como la reducción de tiempo de incubación o expirado soluciones Bouin. La tinción con TTC es opcional y could usarse para visualizar el tamaño del infarto en una forma rápida, pero no cuantitativo. Es importante señalar que TTC puede ser realizado por el mismo corazón antes de la inclusión en cualquiera PTU o parafina.

Limitaciones de la Técnica

El presente enfoque permite que uno a elegir entre las secciones del corazón incluidos en parafina y crio-preservados y se puede utilizar para la inmunotinción. Sin embargo, el corazón completo tiene que ser seccionada, y el tejido no puede ser utilizado para un análisis adicional, tal como transferencia de Western o RT-PCR para la proteína y la expresión génica análisis.

Importancia de la Técnica en Materia de Métodos Alternativos / Existentes

Debido a que los procedimientos de cuantificación y, en particular, el número de secciones analizadas varían ampliamente entre las investigaciones, que define el número mínimo de secciones necesarias para obtener una cuantificación fiable es de suma importancia. Takagawa correot al. 9 demostraron que la fiabilidad se maximiza con un número de segmento corazón mínimo de 6 - 8 secciones de todo el corazón de un ratón con intervalos de 1 mm. En el presente protocolo, 5 - 7 se obtuvieron secciones de todo el corazón de rata cuando se realiza de 2 mm de espesor de corte. Por otra parte, las secciones de 2 mm son un estándar y el tamaño de uso frecuente para la tinción de TTC. Además, la toma de muestras sistémica es simple de aplicar y presenta un aspecto periódica que permite la caracterización de la totalidad del corazón.

De cada una de las rodajas de 2 mm, las secciones 5-micras fueron cortadas y teñidas. Para cada sección 5-m, se llevaron a cabo la cuantificación del grosor del tabique, el grosor de la cicatriz y la longitud, el área total de la cicatriz, área total LV, y área de la cavidad LV, y el promedio de cada parámetro se calculó por animal. Utilizamos Masson-Goldner tinción de secciones delgadas en vez de TTC tinción de secciones de 2 mm para mejorar la precisión tanto de la detección automática del color y la evaluaciónde longitudes. De hecho, la tinción de TTC es sobre todo interesante para los modelos de reperfusión de isquemia de fase temprana o para la detección de la zona de riesgo 8,14, en lugar de para la fase crónica.

MI inducida de ligadura de LAD pueden variar en función del sitio de ligadura. En el modelo de infarto crónica presentado, el tamaño de ligación se modificó intencionalmente para cada animal, y los resultados para varias condiciones de tamaño del infarto y la remodelación estaban presentes después de 6 semanas. En consecuencia, el valor calculado de la IE reveló una amplia gama de infartos de miocardio y apoyó la diferencia observada en la función cardíaca se correlacionó con la FE. Cuando se produjo extensa adelgazamiento del segmento infartado, el área del infarto se redujo en gran medida en el caso de fibrosis transmural. En esta condición, la definición del tamaño del infarto mediante el cálculo del área del tejido del infarto en relación con todo el LV (expresado como un porcentaje de la LV) evaluaría débilmente la extensión del infarto. La falta de cXAMEN para la dilatación LV remodelación inducida y adelgazamiento extremo de la pared del infarto LV puede subestimar el tamaño del infarto, mientras que un infarto presente en la ausencia de adelgazamiento de la pared podría sobre-estimar el tamaño del infarto, como se representa por los valores fuera de la confianza del 95% intervalo. Esta deficiencia puede ser eliminada mediante el cálculo de la IE.

Se ha demostrado que el cambio de la configuración del VI se correlaciona positivamente con el IE y adelgazamiento de la pared 15, 16. Aunque la IE puede ser un predictor de la función LV, es importante hacer hincapié en que la ecocardiografía y análisis histológicos son métodos complementarios para evaluar el infarto de miocardio en el nivel funcional y el tejido, respectivamente. La ecocardiografía permite el estudio longitudinal y análisis histológicos proporcionar ensayos de punto final fundamentales que permiten la cuantificación adicional de la morfología del VI, como el grosor de la pared.

Las aplicaciones futuras o hacia detrásEl dominio de esta técnica er

El muestreo sistémica de todo el corazón y el cálculo de la EI son de particular interés en la evaluación de MI crónica. Además, este método será adecuado para la evaluación de la eficacia del tratamiento, en particular para nuevos tratamientos, tales como por células y tratamientos que tienen por objeto reducir el tamaño del infarto y la remodelación de la matriz de base. la cuantificación fiable de la expansión del infarto es de suma importancia para las comparaciones entre los animales no tratados y tratados, como punto final análisis histológicos se opone a la comparación de pre tamaño del infarto y el tratamiento posterior.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrylic rat heart matrix 2 mm 72-5015 Harvard Appartus
Inspira advanced volume controlled ventilator Harvard Apparatus 557058
Catheter Insyte 14 G BD 381267
O.C.T BDHA361603E VWR
TTC T8877-10G Sigma Aldrich
Mayer hematoxylin MHS32-1L Sigma Aldrich
Acid Fuchsin
CI 42685
F8129-50G Sigma Aldrich
Ponceau Xylidin
CI 16150
P2395-25G Sigma Aldrich
Orange G
CI 16230
O3756-100G Sigma Aldrich
Light green
CI 42095
L5382-25G Sigma Aldrich
KCl P9333-500G Sigma Aldrich
Xylol 10315083 HoneyWell
Ethanol absolute 10303990 HoneyWell
2-methylbutane M32631-1L Sigma Aldrich
Stereogical microscope SM2800 Nikon
Formaldehyde 99340 Reactolab
Embedding cassette K113.1 Carl Roth
Bersoft Image measurement Software Bersoft.com Licensed software

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References

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