باستخدام هذه التقنية الأكمام في نموذج ماوس لزرع الابهري-فيديو التعليمية

Medicine
 

Summary

نحن نقدم نموذجا زرع الابهري أورثوتوبيك باستخدام تقنية الأكمام في الفئران. وهي طريقة ملامسة سريعة جداً، التي يمكن استخدامها في الدراسات المتعلقة بأمراض الأوعية الدموية.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Rowinska, Z., Gorressen, S., Merx, M. W., Koeppel, T. A., Zernecke, A., Liehn, E. A. Using the Sleeve Technique in a Mouse Model of Aortic Transplantation - An Instructional Video. J. Vis. Exp. (128), e54915, doi:10.3791/54915 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

أورثوتوبيك زرع الابهري باستخدام تقنية الأكمام يقلل الإصابة بالشريان الاورطي مع معدل الفشل فقط 10-20%. وكان الوقت ل anastomose الشريان الاورطي في الفئران باستخدام الأسلوب الأكمام قصيرة وسهلة في المتوسط 20 دقيقة، سمحت الدراسات الطعوم iso/الو. وصف المقال التالي الإجراء زرع الابهري المستخدمة في المختبر. تم تخديره الفئران بمزيج من إيسوفلوراني حجم 1.5% والأكسجين 100% من خلال قناع لوجه. عند هذه النقطة، كان الجزء من الشريان الاورطي بين الشرايين الكلوية والتشعب فصله عن الوريد الأجوف، أعد بحرية وكلامبيدات الأجزاء الدانية والبعيدة بخياطة حرير مفردة. قبل إزالة الشريان الاورطي، تم حقن حلاً مالحة التي تحتوي على الهيبارين الأجوف فينا أقل شأنا. ثم تم قطع الشريان الاورطي بين المشابك واستخدمت الهيبارين مالحة حل لمسح التجويف. استخدمت تقنية الأكمام مع شعيرات خيوط من أجل زرع الشريان الاورطي البطني في موقف أورثوتوبيك.

Introduction

كما أشار في دراسة سابقة، قد أولى اهتمام كبير لزرع الابهري مورين من النماذج التي تسمح بالتمييز بين الاستجابات المحددة الأوعية الدموية الناجمة عن الفساد نفسها وبعض العوامل المنهجية المرتبطة ببيئة أرتيريوجينيك 1 , 2 , 3-العامل الرئيسي الذي يضطلع بدور حاسم هنا هو توافر خروج المغلوب والفئران المعدلة وراثيا. مشاركتها في مثل هذا نموذج يتيح إمكانية تعيين وتحديد مسارات الفيزيولوجية المرضية الجديدة المرتبطة بتطور المرض الأوعية الدموية التنكسية، مثل تصلب الشرايين وتمدد الأوعية الدموية في تشكيل4، 5.

تجدر الإشارة إلى أن الضرر في الأوعية المخصصة للزرع قد تظهر أثناء تطعيم الاسكيمية/ضخه جوهرية. ذلك لا يمكن استبعاد حدوث مشاكل معينة مع السلامة الاختلاس أو فعل التهابية غير متوقع خلال الفترة اللاحقة للعمليات الجراحية ربما يحول دون التغييرات الفيزيولوجية المرضية في الأوعية الدموية من الأمراض التنكسية3 ،،من45،،من67. ملامسة كم هو الأسلوب في النهاية البديلة لملامسة الشرياني السفن التي يبلغ قطرها أقل من ملليمتر واحد وطبقت بنجاح في زرع الكلي والقلب في الفئران التي تم تكييفها لاحقاً إلى الابهر زرع في الفئران التي دامبرين et al. 8 , 9 , 10 , 11.

يتم تصغير الضرر الابهري باستخدام تقنية زرع الأكمام مع معدل فشل تقنية منخفضة جداً، نظراً لأنها دائمة إلا 20 دقيقة في المتوسط. أظهرت النتائج السابقة خصائص وظيفية وهيكلية ممتازة إيسوجرافت في فيفو بعد زرع الأعضاء باستخدام تقنية الأكمام1. وصف دامبرين et al. أن بعد كان منحنى التعلم قصيرة معدل نجاح أكثر من 78%10. مضاعفات مثل تجلط الدم نادرة، على سبيل المثال لم يلاحظ Engelbrecht et al. تجلط الدم باستخدام تقنية الأكمام في زرع الكلي في الفئران8.

نموذج مورين زرع الابهر مع أناستوموسيس كم أداة سريعة وسهلة لدراسة ردود الفعل iso/allograft في السفينة زرع. هذا الفيديو يوضح الإجراء الابهري زرع أجريت في المختبر. قد تكون مفيدة في تحديد آليات الأمراض التنكسية الأوعية الدموية المرضية الكامنة وراء هذا النموذج الزرع وقد تسهم في مزيد من التقييم للتدخلات الدوائية والجزيئية12.

Protocol

وافق على "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (IACUC) الإجراءات التي تنطوي على الموضوعات الحيوان في جامعة آخن الجامعة التقنية الراينية، من الألف إلى الياء 84-02.04.2012.A234-

ملاحظة: الإجراء الذي يتجلى في استخدام الفئران النوع المتوحش الذكور البالغين مع خلفية CD1. تبقى الفئران في وحدة مختبرات متخصصة قبل وبعد الجراحة، ضمان الوصول المناسب إلى الغذاء والرقابة البيطرية المتخصصة، والعلاج. إذا كان يتم شراء الحيوانات من خارج، تسمح تأقلم أسبوعا واحداً قبل إجراء الجراحة.

1-التحضير للجهة المانحة

  1. استخدام المواد المعقمة والصكوك للحفاظ على ظروف معقمة أثناء الجراحة لتجنب العدوى.
  2. تخدير كل الماوس مع خليط من 1.5% بحجم إيسوفلوراني والأكسجين 100% من خلال قناع لوجه. وضع الماوس على منصة في موقف ضعيف والشريط جميع مراحلها على طاولة العمليات. تحقق من أن ردود الفعل معسر القدمين الخلفيتين للتأكد من أن يتم تخديره الماوس بما فيه الكفاية. ضع مرهم العيون في العيون لمنع تجفيف أثناء الإجراء.
  3. إزالة جميع الشعر من البطن جل مزيل الشعر باستخدام
  4. أو استخدام ماكينة حلاقة. تنفيذ العملية تحت ظروف معقمة. تطهير البطن مع التناوب يدعك الكلورهيكسيدين والمياه المعقمة.
  5. إزالة
  6. الشريان الاورطي الجهات المانحة عن طريق شق البطن خط الوسط مع مقص أو مشرط. سحب الأمعاء يدوياً إلى اليمين. بلطف يدوياً تعكس الأمعاء إلى جانب استخدام مسحوق قفازات مجاناً-
    1. وضع الأمعاء على قطعة من الشاش تبلل بالمحلول الملحي للحفاظ على رطوبة.
    2. تشريح الشريان الاورطي البطني بعناية فائقة من الأنسجة المحيطة استخدام تشريح حادة مع ملاقط بعيداً.
    3. منفصلة في الجزء من الشريان الاورطي بين الشرايين الكلوية والتشعب من الوريد الأجوف مع ملاقط.
    4. تأمين جميع فروع صغيرة من هذا الجزء جداً بعناية باستخدام 11-0 شعيرات خياطة واحد.
    5. قبل إزالة الشريان الاورطي، حقن 0.5 ملليلتر (مل) من المحلول الملحي الذي يحتوي على 50 ش الهيبارين إلى الأجوف فينا أدنى.
    6. اسمحوا الحيوان المانحة اكسسانجويناتي بعد إزالة الجزء من الشريان الاورطي.
    7. شطف الاختلاس تماما مع المحلول الملحي، وثم نقلها فورا إلى حاوية للمياه المالحة المثلج.

2. إعداد المستلم

  1. تخدير الحيوان المتلقي مع خليط من 1.5% بحجم إيسوفلوراني والأكسجين 100% من خلال قناع لوجه، ثم إزالة الشعر وتطهير (القسم 1). جعل شق خط منتصف من الرهابه إلى الحوض مع مشرط، وسحب جدران البطن. ضع مرهم العيون في العيون لمنع جفاف أثناء الإجراء.
  2. التفاف الأمعاء في المحلول الملحي مبلل شاش وتشريد جداً برفق بالحيوان ' s الحق.
  3. ديسيكت إينفرارينال الشريان الاورطي الحرة بين الشرايين الكلوية بروكسيمالي والتشعب ديستالي مع ملاقط.
  4. تأمين جميع فروع صغيرة من هذا الجزء جداً بعناية باستخدام 11-0 شعيرات خياطة واحد.
  5. المشبك الأجزاء الدانية والبعيدة من الشريان الاورطي مع خياطة حرير واحد 6-0-
  6. تقسيم الشريان الاورطي في الوسط بين المشابك وينتهي المحلول الملحي هيبارينيزيد لطرد فتح التجويف قص ري-
  7. ضع
  8. الاختلاس في موقف أورثوتوبيك مع نهاية السفينة تغذية إدراجها في السفينة المتلقية تليها خياطة مع شعيرات 11-0 مع الحرص على تجنب أي التواء في الشريان الاورطي بمحاذاة بشكل صحيح في البلدان المانحة والمتلقية ( الشكل 1) 10-
  9. بعناية الإفراج عن الحروف المركبة بعد إجراء تفتيش ملامسة. إطلاق سراح المشبك القاصي أولاً. ينتج عن هذا الضغط المنخفض الضغط على الجدران معا قبل الإفراج عن الجانب ذات الضغط العالي الدانية.
  10. نتخلل الاختلاس فورا والتحقق من نبض مرئياً. إزالة بقايا الحرير برفق. طول التراكب الأمثل بين البلدان المانحة والمتلقية الشريان الاورطي 1-2 مم-
  11. إرجاع محتويات البطن إلى تجويف البطن وإغلاق الجامعة الجرح مع تشغيل 3-0 polyglycolic حمض خياطة.
  12. إعطاء البوبرينورفين الماوس (0.05 مغ/كغ وزن جسم تحت الجلد (SC)) قبل إنهاء التخدير.
  13. لا تترك حيوان غير المراقب حتى أنها تدرك إدراكا كاملا. إدارة الألم العلاج مع بوبرينوفيني 0.05 مغ/كغ من وزن الجسم تدار SC ثلاث مرات في يوم لمدة ثلاثة أيام بعد العملية التي أقرتها هيئة الرقابة المؤسسية.
  14. للنسيج الحصاد، تخدير الفئران المستفيدة كالموصوفة أعلاه وتدفق السفن مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) تليها 4% فورمالدهايد/برنامج تلفزيوني، (pH = 7.4) بثقب القلب. قم بإزالة الطعوم بلطف. بعد التثبيت بين عشية وضحاها في 4% فورمالدهايد/برنامج تلفزيوني، مزيد من العينات العملية وتضمين في البارافين.

Representative Results

الفئران تعافي من التخدير خلال 15-30 دقيقة مع عدم الإخلال المادي الملحوظ، على الرغم من أن هناك مخاطر مرتفعة تجلط الدم. واستخدمت تحليل الموجات فوق الصوتية خلال المتابعة بعد العملية الجراحية. أظهرت الفئران نوع البرية المستخدمة في الدراسة أية تغييرات في أبعاد على التجويف. وبناء على ذلك، لوحظت التضيق ولا تشكيلات التوسعات. الحيوانات زرع لم يحمل اللوحة وضع جدران الأوعية (الشكل 2).

يمكن استخدام الإجراءات المصبوغة التقليدية مثل إيمونوهيستولوجي لتحديد هذه اللوحة، نمط من خلايا العضلات الملساء، وتراكم الضامة. وفي دراستنا غذائها وتلطيخ المناعي أنجزت 6 أسابيع بعد التطعيم لاختبار سلامة الاختلاس. تلطيخ نسيجية (الهيماتوكسيلين وويوزين (أنه) والمناعي تلطيخ (العضلات الملساء أكتين (SMA) وبلعم (MAC2)) (الشكل 3) تبين لنا لم تتغير أنماط توزيع خلايا العضلات الملساء وبطانة الخلية غشائي سليمة، ولا تراكم الخلايا في البطانية. تشير هذه النتائج إلى أن تم الكشف عن لا التنشيط الآفة أو خلية كبيرة في الأوعية الدموية المطعمة (الشكل 3).

Figure 1
الشكل 1 : كم تقنية- وكان زرع الشريان الاورطي البطني باستخدام تقنية الأكمام. في هذا الإجراء، كان وضع الشريان الاورطي للمانحين في وضع أورثوتوبيك مع لدغات سطحية موجودة في السفينة التغذية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : المضاعفات وصور الموجات فوق الصوتية- عرض أمثلة للمضاعفات (نيكروبسي) الطعوم 6 أسابيع بعد زرع (A) وثلاثي الأبعاد بالموجات فوق الصوتية (ب)، وعرض الوضع ب-(ج). المتابعة بعد العملية الجراحية أجريت باستخدام الموجات فوق الصوتية. تظهر الصور السالكيه الاختلاس مع أي تغيير في أبعاد التجويف. بالإضافة إلى ذلك، لوحظ لا التضيق أو تشكيلات التوسعات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : غذائها والصور إيمونوهيستوتشيميستري. الصور التمثيلية غذائها و immunohistochemistry الحيوانات المزروعة في 6 أسابيع بعد زرع الأعضاء. لا آفات هامة لوحظت في زرع أورتاس بعلم الأنسجة (الهيماتوكسيلين وويوزين، أنه، 100 X التكبير، ومقياس بار = 50 ميكرومتر)، المناعي تلطيخ (العضلات الملساء أكتين SMA (أحمر)، أو MAC2 بلعم (الأخضر)، 200 X التكبير، ومقياس بار = 25 ميكرومتر). كانت الملون الأنوية مضادة من DAPI (أزرق). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

قبل هذه الدراسة تم زرع نماذج أخرى مختلفة في الفئران تحليل دقيق3،،من67،10،13،14. تم اختيار نموذج زرع الابهري باستخدام هذه التقنية الأكمام مع التعديلات التي دامبرين et al. كما أنها مطابقة لمعايير لدينا وأظهر موثوقية عالية لملامسة الأكمام مقارنة بالأساليب التقليدية للنهاية خياطة 1 , 10.

هذا الأسلوب مواتية في نواح كثيرة مع الوقت عبر المشبك وقللت التقليل من الأضرار إلى الشريان الاورطي أثناء الجراحة. وقد لوحظ حدوث انخفاض تجلط الدم بالإضافة إلى تجنب عدم توافق محتملة في عيار السفينة بين الجهات المانحة والمتلقية. الملاحظات المذكورة أعلاه تجعل هذه التقنية مناسبة جداً للتحقيق في أمراض الأوعية الدموية في زرع الابهري في الفئران.

في دراسة لمتابعة التي أجريت بالموجات فوق الصوتية 8 أسابيع بعد زرع الأعضاء، لم يتم اكتشاف أي تغيرات هامة. وهذا تأكيد الافتراضات أن أي ضرر يلحق بالشريان الاورطي أثناء جراحة الحد الأدنى1.

إجراءات تطعيم المعروضة في هذه المقالة ضمانات عدم الإخلال في سلامة الاختلاس ووظيفتها. ولذلك، يمكن استنتاج أن هذا نموذج تجريبي زرع قد تخدم كأداة قيمة لإجراء تحقيقات الجزيئية والدوائي في المستقبل من الأمراض التنكسية السفينة في الفئران المهندسة وراثيا.

ونحن نعتقد أن الدليل الفيديو يمكن أن تعمل كتدريس المواد التي توضح استخدام هذا النموذج أرتيريو-الشرياني بسيطة، وأنها سوف تسهم في مواصلة المناقشة المثمرة بشأن العديد من القضايا الهامة في أمراض الأوعية الدموية. يمكن استخدام هذا الأسلوب ملامسة سريعة جداً لدراسة أمراض الأوعية الدموية في الفئران المهندسة وراثيا. يمكن استخدامه أيضا كتعديل في نموذج الأوعية الدموية جنبا إلى جنب مع زرع الأعضاء.

وهناك نقاط حرجة أثناء الإجراء. وضع خياطة نفسها هي الخطوة الأكثر أهمية. وقد الجراح الحرص على تجنب أي التواء في الشريان الاورطي بالمحاذاة الصحيحة للجهات المانحة والمتلقية. تتم إزالة المشابك بعناية بعد التفتيش ملامسة. ينبغي دائماً صدر المشبك القاصي أولاً أسفر الضغط المنخفض الضغط على الجدران معا قبل الإفراج عن الجانب ذات الضغط العالي الدانية. أن النزيف نتيجة اتباع تسلسل الإصدار غير صحيح.

Disclosures

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgements

نود أن نشكر فايتسوريك الغجر وبيتر كورديباتشا لمساعدتها التحرير ممتازة، وديكر ليون وهيوتير فراج لمساعداتها التقنية الممتازة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Halsey Needle Holder Fine Science Tools 12001-13
Dumont #5 Forceps - Fine Science Tools 11254-20
Lexer-Baby Scissors Fine Science Tools 14079-10
Castroviejo Micro Needle Holder Fine Science Tools 12060-01
Vannas Scissors Aesculap, Germany Typ OC498R
Castroviejo Suture Forceps Geuder, Germany 19015
6-0 silk black (Silk) Deknatel, Research Triangle Park NC, USA 18020-60- FST
11-0 monofilament (Ethilon) Ethicon, Norderstedt, Germany EH7438G
3-0 polyglycolic acid suture (Serafit) Serag-Wiessner, Naila, Germany 60203214
Isofluorane Any genericon
Heparin Any genericon
0.9% saline Any genericon
Buprenorphine Any genericon
Bepanthene eye and nose cream Bayer, Germany
Microscop Zeiss Opmi MDO/S5
Vaporiser Eickemeyer TEC3
Ultrasound Vevo, Canada 770,2100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rowinska, Z., et al. Non- invasive in vivo analysis of a murine aortic graft using high resolution ultrasound microimaging. Eur J Radiol. 81, (2), 244-249 (2012).
  2. Daugherty, A. Mouse models of atherosclerosis. Am J Med Sci. 323, (1), 3-10 (2002).
  3. Xu, Q. Mouse models of arteriosclerosis: from arterial injuries to vascular grafts. Am J Pathol. 165, (1), 1-10 (2004).
  4. Daugherty, A., Cassis, L. A. Mouse models of abdominal aortic aneurysms. Arterioscler Thromb Vasc .Biol. 24, (3), 429-434 (2004).
  5. Zernecke, A., Shagdarsuren, E., Weber, C. Chemokines in atherosclerosis: an update. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28, (11), 1897-1908 (2008).
  6. Chereshnev, I., et al. Mouse model of heterotopic aortic arch transplantation. J Surg Res. 111, (2), 171-176 (2003).
  7. Koulack, J., McAlister, V. C., Giacomantonio, C. A., Bitter-Suermann, H., MacDonald, A. S., Lee, T. D. Development of a mouse aortic transplant model of chronic rejection. Microsurgery. 16, (2), 110-113 (1995).
  8. Engelbrecht, G., Kahn, D., Duminy, F., Hickman, R. New rapid technique for renal transplantation in the rat. Microsurgery. 13, (6), 340-344 (1992).
  9. Baxter, K., Hao, P. M., Howden, B. O., Saunder, A., Jablonski, P. Modified technique of abdominal heart transplantation in the rat. J Heart Lung Transplant. 17, (11), 1057-1064 (1998).
  10. Dambrin, C., Calise, D., Pieraggi, M. T., Thiers, J. C., Thomsen, M. Orthotopic aortic transplantation in mice: a new model of allograft arteriosclerosis. J Heart Lung Transplant. 18, (10), 946-951 (1999).
  11. Siemionow, M. Histopathology of microarterial anastomoses: end-to-end versus end-in-end (sleeve) technique. J Hand Surg Am. 15, 619-625 (1990).
  12. Charo, I. F., Ransohoff, R. M. The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation. N Engl J Med. 354, (6), 610-621 (2006).
  13. Sun, H., et al. Improved surgical technique for the establishment of a murine model of aortic transplantation. Microsurgery. 18, (6), 368-371 (1998).
  14. Guo, L., Agarwal, A., George, J. F. Orthotopic aortic transplantation in mice for the study of vascular disease. J Vis Exp. (69), e4338 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics