Сравнительное исследование наркотиков Способы доставки ориентированы на внутреннем ухе мышей: Bullostomy * These authors contributed equally

Biology
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Murillo-Cuesta, S., Vallecillo, N., Cediel, R., Celaya, A. M., Lassaletta, L., Varela-Nieto, I., Contreras, J. A Comparative Study of Drug Delivery Methods Targeted to the Mouse Inner Ear: Bullostomy Versus Transtympanic Injection. J. Vis. Exp. (121), e54951, doi:10.3791/54951 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Мы представляем два минимально инвазивные микрохирургической техники у грызунов специфической доставки лекарств в среднее ухо так, что она может достичь внутреннего уха. Первая процедура состоит из перфорации барабанной буллы, названный bullostomy; второй является transtympanic инъекции. Оба эмулировать клинические процедуры человека находящийся в барабанной полости.

Хитозан-глицерофосфат (CGP) и Ringer's Лактат буфер (RL), были использованы в качестве биологически совместимых транспортных средств для местной доставки лекарственных средств. CGP представляет собой нетоксичный биоразлагаемый полимер, широко используемый в фармацевтических применениях. Это представляет собой вязкую жидкость при комнатной температуре, но застывает до полутвердого твердой фазе при температуре тела. RL представляет собой изотонический раствор, используемый для внутривенного администрации в организме человека. Небольшой объем этого автомобиля точно помещается на круглое окно (RW) нише с помощью bullostomy. Transtympanic инъекции заполняет среднее ухо и позволяет меньше контроля, но более широкий доступ к внутреннему уху.

Обе процедуры пригодны в качестве способов доставки лекарственных средств в мышь среднего уха, хотя transtympanic инъекции оказались менее инвазивным по сравнению с bullostomy.

Introduction

Нарушение слуха является наиболее частым сенсорно дефицита человека и влияет на 5,3% мирового населения и 30% лиц в возрасте старше 65 лет ( http://www.who.int/topics/deafness/en~~HEAD=pobj , обновление 2016 г.). Потеря слуха влияет на приобретение языка у детей и ускоряет снижение когнитивных функций у пожилых людей. Таким образом, это является серьезной проблемой здравоохранения с огромным социально-экономическим последствиям. Это может быть вызвано генетическими дефектами, факторы окружающей среды или сочетанием обоих 1, что , в конце концов вызывает повреждение и гибель клеток волос и нейронов в улитке. Эти клетки не восстанавливаются в организме млекопитающих, поэтому клеточная потеря и сопутствующая потеря слуха не может быть отменено. Клинические варианты основаны на протезах, в том числе слуховых аппаратов и кохлеарных, среднего уха и имплантатов костной проводимости 2. К сожалению, нет никакой конкретной медицинской восстановительное Треаtments для слуха и, таким образом, несколько исследовательских линий сосредоточены на разработке профилактических и репаративной терапии. Новые терапевтические варианты включают генной и клеточной терапии, а также развитие малых молекул для фармакологической терапии 2.

Одной из наиболее важных проблем в кохлеарного фармакологической терапии для доставки лекарственных средств. Системное лечение имеют ограниченную эффективность в улитке из - за кроваво-лабиринтного барьеру 3, непрерывное эндотелий в контакте с кохлеарный кровеносных сосудов, который действует в качестве физического и биохимического барьера для поддержания внутреннего гомеостаза жидкости уха, тем самым ограничивая проход лекарственного средства для внутреннего уха. Он проницаем только для небольших жирорастворимых соединений, хотя проницаемость может быть увеличена во время кохлеарного воспаления, а также с использованием мочегонных или осмотических агентов. Объем препарата, который в конечном итоге достигает улитку после того, как системное введение снижается;Таким образом, высокие дозы, которые могут привести к органической токсичности необходимы. Кроме того, печеночный метаболизм препарата может образовывать токсичные или неактивных метаболитов 4, 5, 6, 7. В отличие от этого , местные вмешательства позволяют размещать известного ограниченного количества лекарственного средства в среднее или внутреннее ухо без нежелательных побочных эффектов 4, 7, 8, 9. В современной клинической практике, находящийся в барабанной полости администрации ограничены определенными кохлеарные патологий, таких как гентамицин при болезни Меньера 10, кортикостероиды внезапной глухоты, болезни Меньера, иммуноопосредованную и шума потери слуха в результате , 11, 12, 13, 14, 15 и инсулиноподобный фактор роста 1 (IGF1) в внезапной глухоты 4, 16, 17.

Препараты для местной администрации должны сохранить хрупкое гомеостаз (рН и осмолярности) кохлеарной жидкостей. Кроме того, очень важно, чтобы поддерживать стерильность в течение всего процесса, чтобы избежать бактериального загрязнения спинно-мозговой жидкости. Наполнитель используется для доставки лекарственного средства должен быть биологически совместимым, nonototoxic и соответствующей консистенции. Жидкие растворы рекомендуются для intracochlear инъекций, но не пригодны для находящийся в барабанной полости маршрута из-за зазора через евстахиеву трубу. В этом случае препараты обычно переносятся полутвердые гели для повышения их свойств в среднем ухе , 4, 18, 19. Альтернативная доставка систмс , используемые в качестве носителей для увеличения прохождение препарата внутреннего уха являются наночастицы 20 и аденовирусы 21 Здесь мы сравнили два транспортных средства: CGP и раствора Рингера. CGP представляет собой гидрогель, образованный хитозана, линейный полисахарид, состоящий из D-глюкозамина и N-ацетил-D-глюкозамина, полученного из панцирей ракообразных, а также бета-глицерофосфат, полиола, который образует щит воды вокруг хитозана цепей и поддерживает его в жидкая форма. CGP является термочувствительным и может быть понижена лизоцимы, что позволяет обеспечивать непрерывное высвобождение лекарств в среднем ухе 22, 23, 24, 25. Хитозан-база гидрогели являются подходящими транспортные средства для клинических применений , таких как доставки лекарств из - за их отсутствия иммуногенности и отсутствия активации местных воспалительных реакций 23, 24. На дрэр стороны, буфер RL является непирогенными изотонический раствор (273 мОсм / л и рН 6,5), предназначенных для внутривенного введения в организме человека как источник воды и электролитов, особенно в кровопотери, травмы или ожогам из-за побочных продуктов лактата метаболизма в печени противодействовать ацидоз.

Здесь мы описываем и сравнить два хирургических методов, которые были усовершенствованы для локальной доставки лекарственного средства к мыши внутреннего уха. Профиль безопасности обоих методов оценивали с помощью функциональных, морфологических и молекулярных тестов. Слух оценивали с помощью Слуховые Ответ головного мозга (ABR) 26, 27 выполнены до и после микрохирургии в разное время. Процедуры конечной точки были использованы для рассекают улитку и сравнить анатомический, клеточный и молекулярный влияние этих двух микрохирургических процедур.

Protocol

Убедитесь в том, что процедуры обращения с животными в соответствии с международными и национальными правилами. Протокол следует Европейское Сообщество 2010/63 / EU и испанском языках RD 53/2013 руководящих принципов, соответственно.

Погрузочно-разгрузочные работы 1. Общие положения животных

  1. Кормовые мышей вволю со стандартной диеты и питьевой воды. гигиенического контроля и благополучия следуя Федерации для лабораторных животных, научных ассоциаций (FELASA) рекомендаций.

Оценка 2. Слуховой

Примечание: Дорожка функциональное воздействие микрохирургических процедур путем проверки слуха до и много раз после операции (в этой работе 2, 7, 14 и 28 d postmicrosurgery) с неинвазивных процедур , таких как ABR 9.

  1. Для тестирования ABR, обезболить мышей с протоколами следственных короткой продолжительности т.е. внутрибрюшинного введения кетамина (100 мг / кг массы тела (BW) и ксилазина (10мг / кг, BW). В качестве альтернативы, проводить слушания испытания под ингаляционным наркозом.
    Примечание: Так как параметры ABR могут влиять анестетика протокола 28, используют один и тот же один на протяжении всего эксперимента.
  2. Проверьте глубину анестезии, проверяя схождение щепотку рефлекс.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Когда вывод рефлекс исчезает, животное достигло соответствующую глубину анестезии, чтобы выполнить слуховое тестирование.
  3. Защитить глаза от иссушения и вторичного сухой кератоконъюнктивит путем местного введения слезных добавок, таких как гидроксипропилметилцеллюлоза на основе гелей.
  4. Держите мышь при физиологической температуре (37,5-38 ° С) в течение всей процедуры. Во избежание электрических помех, используйте теплую воду насос и грелки. Монитор температуры тела с ректальных зондов. Всегда соблюдайте осторожность, чтобы не перегреть животное.
    Примечание: Мы рекомендуем чистить грелку с поверхностным дезинфицирующим между мышами.0; для анестезии индукции и восстановления, электрические грелки, лампы накаливания или инфракрасного света могут быть использованы.
  5. процедура ABR
    Примечание: Для регистрации ABR, использовать компьютерную рабочую станцию ​​с въездного звуковой карты для создания форм сигнала (цифрового сигнала в аналоговый, DA выход, преобразование) и оцифровывать электрические формы сигнала отклика (аналого-цифровой, вход AD), аттенюатор, осциллограф и А усилитель с низким сопротивлением. Современные слуховые рабочие станции (т.е. Tucker Davis Techonologies) включают в себя все эти компоненты в одной компактной системе.
    1. Поместите наркозом мышь в положении лежа на грелки внутри звукоиндуцированного смягчающих камеры , чтобы избежать окружающего шума и помех реверберации (рисунок 1).
    2. Deliver акустические раздражители в наружный слуховой проход. Используйте предустановленные раздражители или новые сигналы, разработанные с помощью соответствующего программного обеспечения. Подключите выход рабочей станции DA к выбранной колонки.
      Примечание: Freможно было бы использовать Е-поле или закрытые поля динамиков, вставленные в наружный слуховой проход. Первые являются предпочтительными при работе с мышами из-за трудностей в введения зонда и звуковой калибровки в закрытых системах. Свободные поля колонки стимулируют оба уха и вызывают бинауральных ответ. Для получения преимущественно монофонических ответов с свободного поля динамиков, контралатеральной активность должна быть устранена путем окклюзии (т.е. с беруши) или путем маскировки шума.
      1. Поместите динамик в свободном поле на фиксированном расстоянии (обычно 5-20 см), обращенной к головку или выбранное ухо с центром динамика совмещенным с наружного слухового прохода. Убедитесь в том, что никакие препятствия не находятся между динамиком и ухом, и что ушная раковина полностью открыт.
    3. Поместите нержавеющей стали подкожных игольчатых электродов следующим образом: I) активный (положительный) электрод в кожу головы между ушами (над вершиной черепа), II) упоминалась (отрицательный) электрод, в околоушныхобласть ниже ушной раковины, и III) заземляющий электрод в области задней конечности, хвоста или задней (рисунок 1).
      1. Проверьте электрическое сопротивление в положительных и отрицательных электродов. Убедитесь, что сопротивление меньше 3 кОм (в идеале 1 кОм). Если она выше, переставить, чистый спиртом или замените электроды.
    4. Для записи ABR, генерируют широкополосные щелчки и чистые частоты тона и присутствует при уменьшении интенсивности от 90 до 10 дБ относительно уровня звукового давления (SPL) в 5-10 дБ SPL с шагом 27, 29, 30.
      1. Настоящее краткое щелчок или тон лопнуть раздражители (1-5 мс) , начиная с высоким уровнем (т.е. 80 или 90 дБ SPL) и уменьшения интенсивности в 5-10 шагов SPL дБ. Зарегистрируйте электрический отклик в первые 10 мс после стимуляции (вызванные ABR ответы появляются на 6-8 мс).
        ПРИМЕЧАНИЕ: По этой причине ставки стимуляциине должно быть выше, чем 50 стимулов / с (нормальный показатель) 20-50.
    5. Amplify, запись и усреднить вызвавший электрический ответ на каждый стимул и интенсивности. Используйте усилитель с низким уровнем шума и хорошим отношением сигнал-шум, и подключить его к входу AD.
      Примечание: пограничные маршрутизаторы имеют очень низкие амплитуды, как правило, ниже 1 мкВ (от пика до пика), и должны быть записаны с использованием усилителя с очень низким уровнем шума. У нормальных мышей слуха, прозрачные волны ABR возникают после того, как в среднем 100 - 200 ответов, тем не менее , чтобы получить высокие качества записи, или в случае нарушений слуха, более повторений рекомендуется (750-1000) 27.
    6. Визуально определить порог ABR во время испытания.
      Примечание: Порог ABR является самой низкой интенсивности звуковых раздражителей , что вызывает надежную ABR записи с волнами я IV четко видимой и среднего пика до пика напряжения 2 SD выше средней фоновой активности 31. Эти данные должны быть подтверждены дюотбой оперативный анализ, наряду с другими параметрами, в том числе и пик interpeak латентности и амплитуды волн.
    7. Выполнить анализ данных либо вручную, либо автоматически.
      1. Для ручного анализа, определить 4-5 ABR волн (I, II, III ... и т.п.) И выделить пики (P1, P2, P3 ...) и долин (N1, N2, N3 ...) для каждой волны. После завершения анализа, экспортировать данные в электронную таблицу или текстовый файл.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Специальное программное обеспечение для записи электрической реакции, как правило, выполняет анализ автоматически. Дополнительные измерения могут быть определены в записи ABR в ответ на фиксированной интенсивности (т.е. 70 или 80 дБ SPL) или при интенсивности относительно отдельных порогов клик (т.е. 15 дБ SPL над порогом).
  6. Провести статистический анализ данных ABR с использованием соответствующего программного обеспечения. В зависимости от экспериментального проектирования, использование стандартной паре T-тест или дисперсионного анализа (ANOVA) для сравнения основной ABR парамеОслабляет в различных группах 26, 30.
    Примечание: В продольных исследованиях, многие функциональные данные собраны из того же животного в различных временных точках (т.е. до и после микрохирургии). В этом случае общая линейная модель повторен тест мера обеспечивает детальный анализ отклонений.

3. Подготовка автомобиля

  1. Подготовить и использовать решения транспортных средств в стерильных условиях.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Жидкие растворы обычно очищается быстро через евстахиеву трубу. Различные инъекционные системы доставки могут быть использованы для увеличения времени пребывания препарата в среднем ухе, в том числе гидрогели и наночастицы 32.
    1. Для приготовления CGP-гидрогель, растворить 75% деацетилированного хитозана в 0,2 М уксусной кислоте с получением раствора хитозана 1.5-2% (вес / вес). Добавить 9% глицерофосфата (вес / вес) к этому раствору 7. Приготовьте растворнепосредственно перед введением и хранить гидрогель при 4 ° С до использования.
      Примечание: CGP-гидрогелевые умеренно вязким, но до сих пор инъекционный при этой температуре. Ниже 4 ° С он переходит в твердую фазу, блокируя его применение. После нанесения CGP претерпевает фазовый переход к полутвердого геля приблизительно через 15 мин при 37 ° С.
    2. Аликвоту (0,5 мл), коммерческий буфер Р.Л. и хранят при температуре 4 ° С до использования.

4. микрохирургических операций

  1. Индуцируют общей анестезии кетамином на основе комбинации седативных средств и анальгетиков (т.е. кетамина 100 мг / кг, медетомидин 0,05 мг / кг и phentanile 0,025 мг / кг) путем внутрибрюшинной инъекции, а затем летучими веществами (т.е. изофлурановой).
    1. После введения инъекционные агенты, отрегулируйте обезболивающий лицевую маску к морде мыши и подключите питание O 2 к изофлуран паров. Поддерживать ингаляционной анестезии во времямикрохирургия и контролировать обезболивающий плоскости с ног-пинча рефлекс и паттерна дыхания. Начните хирургической подготовки, когда рефлекс полностью упразднена, а мышь представляет регулярное дыхание.
    2. Поддержание температуры тела с электрогрелки в течение всей процедуры и защищают глаза от кератита роговичного с гидроксипропилметилцеллюлоза, на основе геля.
  2. Подготовьте чистую хирургическую область с помощью стерильными пеленками. Стерилизовать микрохирургических инструментов с стеклянными бусинка стерилизатор до операции. Поддержание стерильных условий в течение всей хирургической процедуры (стерильные перчатки, портьеры, хирургические инструменты и т.д.).
  3. микрохирургия
    1. Bullostomy
      Примечание: Bullostomy является односторонней процедурой. Operate одно ухо мыши и использовать контралатеральной ухо в качестве контроля.
      1. Поместите мышь в положении лежа на спине пролежни. Подготовить хирургическую область на вентральной поверхности шеи с использованием Клипперсудалить мех. Очистите кожу на основе йодповидон антисептическим раствором и покрыть ее стерильными пеленками.
      2. Используя скальпель, сделайте продольный разрез 2 см от нижней челюсти к ключице.
      3. Под увеличением с хирургическим микроскопом идентифицировать подчелюстной железы и отделяют как с пинцетом. Отвод подчелюстной железы и локализовать происхождение двубрюшной мышцы и лицевого нерва.
      4. Сделайте надрез в происхождении двубрюшной мышцы с ножницами, и убрать его вентрально, подвергая основной нижне-медиальной барабанной буллы.
      5. Сделайте отверстие в гутрашса путем бурения в него с 27 G иглой (рис 2А). Локализуйте стремянный артерии и мембраны каудально RW к нему (рис 2B). Очистите кровь из пробуренной области с поглощаемой желатиновой губкой.
      6. С помощью 34 G катетер и стекла микро шприц, медленно вводят 3-5 мкмЛ раствора транспортного средства (CGP-гидрогеля или RL) через bullostomy непосредственно на нишу RW, заполняя его (рисунок 2в). Уплотнение bullostomy с 1-2 каплями клея ткани.
      7. Возвращение подчелюстной железы в исходное положение и закройте разрезы кожи с 5-0 шелковой хирургической нити. Применение хлоргексидина на основе антисептическим вокруг разреза, чтобы избежать инфекции раны. Примечание: Рассасывающиеся и не рассасывающиеся шовные материалы могут быть использованы. Non-рассасывающиеся шовные материалы должны быть удалены через 2 недели. Шелк не рекомендуется для закрытия кожи, поскольку его использование связано с надреза инфекции и реакции местных тканей.
    2. Двустороннее transtympanic инъекции
      1. Поместите курсор в боковом положении пролежни и подготовить асептический хирургическую область ниже наружного слухового прохода , как описано в 4.3.1.1.
      2. Сделать 0,5 см продольный разрез в вертикальной части наружного слухового прохода вблизи козелок и SАЗДЕЛ внутреннюю кожную складку ушной раковины (по желанию).
      3. Расположить барабанную перепонку в конце наружного слухового прохода с использованием операционного микроскопа (рис 2E) и определить верхние Парс flaccida и низшие Pars TENSA, которая делится на переднюю и заднюю секции посредством рукоятки молоточка (рис 2F) ,
      4. Сделайте небольшой myringostomy в каудальной части Рагз flaccida. Сделайте дополнительный разрез в Парс TENSA барабанной перепонки, чтобы обеспечить воздушную эвакуацию во время инъекции 33. Осторожно вводят 10-15 мкл транспортного средства (CGP-гидрогеля или RL) раствора со стеклянной микро шприц , соединенный с 34 G катетера через Рагз flaccida, близко к нише RW до среднего уха не ясно полностью.
      5. Закройте разрезов кожи с 5-0 шелковым швом и хирургической чистоте, как описано в 4.3.1.7.
      6. Поместите курсор на его другой стороне и опеели контралатеральной ухо (шаги 4.3.2.1 к 4.3.2.5).
  4. Держите мышь на грелку, пока он не пришел в сознание достаточное для поддержания грудины лежачее. Не возвращать животное, которое перенес операцию на компании других животных, пока полностью не выздоровел.
  5. Монитор состояния организма, активности и наличие признаков боли или стресса. Обеспечение анальгетики , при необходимости (например , бупренорфин 0,05 мг / кг, Карпрофен 5-10 мг / кг). Обзор операционной раны ежедневно и удалить закрытий кожи 7-14 дней после операции после того, как будет установлено, что рана зажила.

5. Морфологическая оценка Кохлеарным цитоархитектуры

  1. Эвтаназии мышь в конце эксперимента (в данной работе 28 дней postmicrosurgery), внутрибрюшинной передозировки пентобарбитала (100 мг / кг), чтобы изучить долгосрочные последствия операции.
  2. Выполните transcardial перфузии с холодным 0,1 М фосфатным буферомФизиологический раствор (PBS), рН 7,5, а затем 4% (вес / объем) параформальдегида (PFA) в 0,1 М PBS, рН 7,5 , как описано 26.
    ВНИМАНИЕ: параформальдегид очень токсичен; избегать контакта с кожей, глазами или слизистых оболочек. Избегайте вдыхания порошка во время измерения и подготовки.
  3. Используйте стереомикроскопа рассекать из внутреннего уха от височной кости , как описано 34, 35 без разделения вестибулярные и кохлеарные компоненты внутреннего уха.
  4. Закрепить изолированное внутреннее ухо с 4% (вес / объем) PFA в 0,1 М PBS, рН 7,5 при 4 ° С в течение 12 ч при осторожном встряхивании. Промыть 3 раза в течение 5 мин с помощью 0,1 М PBS, рН 7,5.
  5. Декальцинировать образцов с 10% этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), полученного в 0,1 М PBS, рН 6,5 при 4 ° С в течение 10 суток, при постоянном встряхивании, изменяя ЭДТА раствор каждые 3 d.
  6. Когда cochleae приобретает мягкую консистенцию, удалить ЭДТА и промыть 3 раза в течение 5 мин с помощью 0,1 М PBS, рН 7,5, Wiго встряхивании при комнатной температуре.
  7. Вставить образцы в парафин , как описано 34 и сделать толщиной 7 мкм кохлеарные секции параллельно Modiolus.
  8. Для оценки кохлеарный цитоархитектуры, секции окрашиваются гематоксилином и эозином (H & E) 30 и использовать световой микроскоп , соединенный с цифровой камеры для захвата изображения с 4 - кратным и 20x объективов.

6. Cochlear Gene Expression

  1. Очистите рабочую поверхность и хирургических инструментов с обеззараживающим раствором РНКазы.
  2. Эвтаназии мышь, как описано в 5.1 и быстро рассекают из внутреннего уха от височной кости с помощью микроскопа. Погрузитесь внутреннее ухо в стеклянной посуде, содержащей рибонуклеиновой кислоты (РНК) и протектор реагента стабилизатора.
  3. Удалите остатки каменистой кости с ювелирными пинцетом и аккуратно отделить улитку из вестибюля с помощью глазных ножниц Vanna в 35.
  4. Немедленно Transfэр улитка в 2 мл микроцентрифужных трубки с 80 протектора и стабилизатора мкл раствора РНК и замораживать ткани, помещая трубку в сухом льду. Сохранение кохлеарные образцы при температуре -70 ° С до использования.
  5. Изолировать кохлеарный РНК , как описано 35 и определить его качество и количество спектрофотометрически.
  6. Сформировать кохлеарный кДНК из равных количеств суммарной РНК мыши с использованием обратной транскрипции коммерческого набора.
  7. Выполните QRT-PCR для амплификации комплементарной дезоксирибонуклеиновой кислоты (кДНК) в трех экземплярах для измерения генных транскриптов 35, 36.
    Примечание: В данной работе про- и противовоспалительных генов транскриптов IL1B, IL6, Tgfb1, TNFa, IL10 и Dusp1 были измерены.
  8. Расчет относительных коэффициентов экспрессии путем нормализации пороговых значений целевого цикла транскрипт уровней (Ct) к среднему арифметическому опорного уровня генов и относительной количественной оценке путем нормализацииПроблема группы уровни транскриптов к среднеарифметической группе 37 калибратора.

Representative Results

Слух был испытан ABR до и в несколько раз после того, как микрохирургии , чтобы оценить влияние на слуховой функции (рис 1А). Регистры ABR проводились под анестезией , чтобы избежать движения и напряжения артефактами животных и , следовательно , улучшить его воспроизводимости 27. Интраперитонеально комбинации кетамина на основе или ингаляционная изофлуран обычно использовались обезболить животных во время испытаний ABR. Сочетание кетамин / ксилазин обеспечивает короткого действия (2-3 мин) индукции и стабильной, безопасной фазы технического обслуживания при выполнении регистров ABR. Следует отметить , что изофлуран может повлиять на чувствительность измерений ABR 38. Для регистров ABR, подкожные электроды расположены в определенных местах (рис 1б) и измеряют электрическое сопротивление. Если импеданс 3 кОм или выше, электрод позиционирование должно быть проверено, чтобы избежать альтциям по амплитуде ABR волн.

Доставка находящийся в барабанной полости осуществляется у мышей двух микрохирургических операций (рисунок 2). Воздействие буллы во время bullostomy включает в себя втягивание подчелюстных желез и двубрюшной мышцы. Эта процедура проводится с особой осторожностью , так как сонная артерия и блуждающий нерв очень близки (рис 2А). Затем булла бурится локализовать стремянный артерию и мембрану RW (рис 2B). Для того, чтобы избежать растрескивания кости, небольшой 0,5 мм отверстие сделано с 27 G иглой перед бурением. 34 G катетер направляется через bullostomy к мембране RW и небольшим объемом транспортного средства доставляется к оконной нише (фиг.2с). Transtympanic инъекция выполняется через разрез в Рагз flaccida барабанной перепонки с иглой 27 G; большего размера может спровоцировать науха в мембране. Перед инъекцией, мы рекомендуем сделать дополнительный разрез в Парс TENSA , чтобы отток воздуха во время введения транспортного средства (рис 2F). Крайне важно, чтобы избежать повреждения стремянный артерии, ветви внутренней сонной артерии, что привело бы к угрожающей жизни кровотечения.

Мыши с bullostomy или transtympanic операций сохранились слух на протяжении всего эксперимента, аналогичные неоперированных управления (рисунок 3). ABR пороги в ответ на щелчки и тон всплесков существенно не изменилась после того, как микрохирургии по сравнению с исходными значениями. Не было обнаружено существенных различий между bullostomy и transtympanic подходов. Морфологические исследования были проведены, чтобы подтвердить правильность доставки транспортного средства в среднее ухо и оценить потенциальные изменения, вызванные процедурами, изложенными в кохлеарного цитоархитектуры. Ни в одном из главных кохлеарных регионов сhowed морфологические изменения и животных из обеих процедур представили аналогичную морфологии всех кохлеарных структур (рис 4а). Кроме того, также были изучены кохлеарные профили экспрессии генов про- и противовоспалительных цитокинов. Несмотря на отсутствие функциональных различий в данных ABR между этими двумя процедурами, bullostomy вызвало сильную воспалительную реакцию , чем transtympanic подход (рис 4В).

Рисунок 1
Рисунок 1. Экспериментальный дизайн и оценка слуха. (А) Схема экспериментальной процедуры. Слух оценивали с ABR до и после микрохирургии. Кохлеарные образцы были получены через 28 дней после микрохирургии. (В) Наркотизированных мыши в лежачем положении над грелку внутри звуковой-смягчающих камеры, с подкожного ElectrodЕ. С., помещенные в кожу головы между ушами над вершиной черепа (активный, положительный); в околоушной области ниже ушной раковины (ссылка, негатив) и в задней части (земля). Выступающий в свободном поле помещается на фиксированном расстоянии (5 см), обращенной к правому уху. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2. микрохирургии для применения на транспортном средстве. (А) Брюшной вид барабанной буллы. Bullostomy осуществляется каудальнее лицевого нерва с иглой 27 G. (Б) RWN и стремянный артерии можно наблюдать через перфорацию. (C) 34 G катетер направляется через bullostomy по направлению к нише RW. (D) Через месяц после bullostomy, небольшой костистыешрам присутствует в месте открытия (стрелки). (E) Боковой вид уха, показывающий разрез в наружный слуховой проход и барабанную перепонку (квадрат). (F) Деталь барабанной перепонки. Прокол был сделан на каудальном верхнем квадранте барабанной перепонки с помощью 27 G иглы (черная звездочка, в Рагз flaccida); инъекция была сделана через эту перфорацию с использованием 34 G катетера. Дополнительное отверстие было сделано в краниальном нижнего квадранта мембраны (белые звездочки, в Рагз TENSA) до инъекции , чтобы сбалансировать давление на барабанной перепонке. (G) Вид 34 G катетера через прокол барабанной перепонки. (H) Вид на кохлеарного область через 24 ч после микрохирургии. RWN заполнена раствором носителя (звездочка). Lat, боковая; Ro, ростральной; Есть, спинной; Ма, молоточек; Co, улитка; OW, овальное окно; RWN, круглое окно нишу. Масштабные полоски = 200 мкм в A, D, F; Масштабные полоски = 100 мкм в B, C, H; Масштабные полоски = 1000 мкм E, G. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Оценка слуха. Эволюция ABR порогов (среднее значение ± SEM, в дБ SPL) в ответ на кнопку (A) и тон разрыва (В) раздражители, до и 7, 14 и 28 дней после микрохирургии у самцов восемь-недельных C57BL / 6J мышей. Bullostomy (оранжевый; п = 11); transtympanic впрыска (синий; п = 6); неоперированных (серый; п = 11), пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

JPG "/>
Рисунок 4. Cochlear Морфология и анализ экспрессии генов. (А) Морфология основных кохлеарные структур на основе улитку. Haematoxilin-эозином в середине modiolar парафиновых срезов (7 мкм), ушей от неоперированных мышей и мышей через один месяц после вмешательства микрохирургии по bullostomy или transtympanic инъекции. Ла Скала медиа - купе (а, б, в) представлены все основные компоненты. Подробная информация о каждой из этих структур (пронумерованных ящиков) показаны в последующих изображениях: спираль ганглий (1), орган Корти (2), спиральная связка (3) и полоской vascularis (4). Внутренняя волосковых клеток (звездочка); наружные волосковые клетки (головка стрелки). Масштабные полоски = 100 мкм в, Ь, с; Шкала баров = в-1,2,3,4 50 мкм. (B) Cochlear экспрессия маркеров воспаления 28 d после микрохирургии. Сравнение между bullostomy (оранжевый) и transtympanic инъекции (синий) и неоперированных мышей (белый). *: Неоперированных vs.управляемые группы; ^: Сравнение между группами управляемых. Уровни экспрессии генов представлены в виде 2 - ΔΔCt, или п-кратное различие по сравнению с неоперированных group.Values представлены как среднее ± SEM из трех повторностях из образцов пулом 3 мышей на состояние. Статистическая значимость: ** р ≤0.01; *** Р ≤0.001; ^^ Р ≤0.01; ^^^ Р ≤0.001. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Discussion

Местные доставки лекарственного средства к внутреннему уху может быть сделано непосредственно intracochlear инъекции или косвенно введения находящийся в барабанной полости, помещая препарат в среднем ухе 4, 19, 39. Intracochlear администрация обеспечивает контролируемое и точное доставки лекарственного средства к улитке, избегая диффузии через окно мембран, базальных к верхушечный градиенты концентрации и зазор через евстахиеву трубу. Тем не менее, это, как правило , весьма инвазивной процедурой , которая требует сложной и деликатной микрохирургии 7, 39. В этом контексте, промышленность разрабатывает новые, с покрытием, имплантируемые устройства для замедленного высвобождения лекарственного средства 40, 41. С другой стороны, введение является находящийся в барабанной полости минимально инвазивной и легко выполнить процедуру, которая дает возможность вдувать больших объемов Дковрике в среднее ухо, хотя фармакокинетика не так легко контролировать. Большинство препарата очищается через евстахиеву трубу , а оставшаяся доля должна диффундировать через мембрану RW для достижения улитку 18. RW является местом максимального поглощения веществ из среднего уха в перилимфе заполненные барабанной канала улитки 7. Это полупроницаемой структура три слоя, хотя ее проницаемость зависит от характеристик наркотиков (размер, концентрации, растворимость и электрического заряда) и трансмембранный транспортных систем (диффузия, активный транспорт или фагоцитоз) 42. Овальное окно и ушные капсулы являются альтернативными , но менее эффективные входы в улитке 43, 44.

Здесь мы показываем, и сравнить два микрохирургические методы адресной доставки лекарств в мышь среднего уха: bullostomy и transtympaПроцедуры NIC инъекции. Общие критические шаги к этим процедурам относятся: я) оценку слуха до и после микрохирургии, б) получение однородного раствора носителя в стерильных условиях, III) тщательный контроль за обезболивающий процедуры и контроль температуры тела животных и констант, IV ) медленное размещение соответствующего объема транспортного средства с таргетингом на RW, и IV) принимать кохлеарные образцы для завершения молекулярного и морфологического анализа.

Позадиушной и брюшные подходы к bullostomy были описаны 7, 45. Мы использовали вентральной приближение , потому что в нашем опыте это привело к снижению заболеваемости и обеспечили более широкий доступ к RW 46. Transtympanic инъекции обычно проводят через Рагз TENSA барабанной перепонки, передней или задней к молоточка 12 рукоятки. Вэто работа , которую мы провели модификацию методики, инъекции через Pars flaccida за пределами молоточка с предыдущим дополнительным пункции Парс TENSA , чтобы позволить воздуху эвакуацию во время инъекции.

Transtympanic инъекция была менее агрессивна, чем bullostomy, хотя оба микрохирургические были быстрые (20 и 5 мин на ухо для bullostomy и transtympanic подхода соответственно), с короткими послеоперационными раза восстановления сил и отсутствие заболеваемости. Самое главное, что обе процедуры слуха и благоустроенный параметры ABR были идентичны тем, которые определены до микрохирургии. Transtympanic подход занимает меньше времени, чем bullostomy и могут быть выполнены в обоих ушах одного и того же животного в течение того же вмешательства. Преимущества transtympanic инъекции, таким образом, что она может быть выполнена на двусторонней основе, и повторяться, если это необходимо. С другой стороны, bullostomy обеспечивает прямой визуальный доступ к мембране RW и позволяет Filliнг нишу RW. В отличие от этого, transtympanic инъекции не допускает контроль размещения транспортного средства в нише RW.

Процедуры, приведенные в этой работе описывают, как выполнить доставку местное лекарственное средство транспортное средство в среднее ухо для доклинических приложений, таких как оценка ототоксичность и оценки эффективности при потере слуха. Две процедуры микрохирургии описаны, которые обеспечивают альтернативные методы с определенными преимуществами и недостатками. Оба сохраняют слух и не вызывают морфологические изменения. Местное воспаление описывается как потенциальное осложнение bullostomy. Набор дополнительных методов описаны также для послеоперационных процедур, в том числе слуха, морфологических и воспалительных оценок экспрессии маркеров. Будущие приложения для этих методов включают доклинической оценки новых методов лечения для потери слуха, в том числе генетических, клеточных и фармакологических подходов, на животных моделях. administrat находящийся в барабанной полостиионы обеспечивают доставку лечения в среднем ухе, в контакте с круглым мембраной окна, облегчая проход в перилимфой без очевидного кохлеарного повреждений.

Acknowledgments

Авторы выражают благодарность Genomics и сооружения неинвазивный нейрофункциональной оценки (IIBM, CSIC-UAM) за техническую поддержку. Эта работа была поддержана грантами испанской "Ministerio де Economia у Competitividad" (FEDER-SAF2014-53979-R) и Европейского Союза (FP7-AFHELO и FP7-PEOPLE-TARGEAR) к IVN.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine (Imalgene) Merial # 2529 CAUTION: avoid contact of the drug with skin or eyes or accidental self-inflicted injections
Xylacine (Xilagesic)  Calier # 6200025225
Lubricant eye gel (Artific) Angelini # 784710
Water pump  Gaymar # TP472
Surface disinfectant José Collado SA # CR-36
Subdermal needle electrodes  Spes Medica # MN4013D10SM
Low Impedance Headstage  (RA4LI) Tucker-Davis Technologies
Speakers (MF1 Multi-Field Magnetic Speaker) Tucker-Davis Technologies
System 3 Evoked Potential Workstation Tucker-Davis Technologies The System is composed of: RP2 processor, RA16 base station, PA5 attenuator, SA1 amplifier, MA3 microphone amplifier, RA4LI impedance headstage and RA4A medusa pre-amplifier 
SigGenRP software Tucker-Davis Technologies
Warming pads (TP pads) Gaymar # TP3E
Statistics software (SPSS) IBM
Chitosan (deacetylated) Sigma-Aldrich # C3646
Acetic acid (glacial) VWR # 20103.295 CAUTION: flammable liquid, skin corrosion, respiratory and skin sensitizer
Glycerophosphate Sigma # SLBG3671V
Ringer´s lactate buffer Braun # 1520-ESP
Medetomidine (Domtor) Esteve # 02400190
Phentanile (Fentanest) Kern Pharma # 756650.2 CAUTION:   avoid contact of the drug with open wounds or accidental self-inflicted injections
Isoflurane (IsoVet) Braun # 469860 CAUTION: Avoid exposures at ceiling concentrations greater than 2 ppm of any halogenated anesthetic agent over a sampling period not to exceed 1 h.
Surgical microscope (OPMI pico) Zeiss
Sterile drape (Foliodrape) Hartmann # 277546
Sterilizer  Fine Science Tools # 18000-45
Scalpel blade Swann Morton # 0205 CAUTION
Scalpel handle Fine Science Tools # 91003-12
Povidone iodine-based antiseptic (Betadine) Meda Pharma SAU # M-12207
Adventitia scissors (SAS18-R8) S&T # 12075-12
Curved scissors CM Instrumente # AJ023-18
Forceps CM Instrumente # BB019-18
Gelatine sponge (Spongostan) ProNaMAc # MS0001
Microlance 27 G Becton Dickinson # 302200
Microliter syringe (701 RN SYR) Hamilton # 80330
Catheter (Microfil 34 G) World Precision Instruments  # MF34G-5
Tissue Adhesive (Vetbond) 3M # 1469SB
Needle holder (Round handled needle holder)  Fine Science Tools # 12075-12
Silk surgical suture (Braided Silk 5/0) Arago # 990011
Chlorhexidine (Cristalmina) Salvat # 787341
Pentobarbital  (Dolethal) Ventoquinol # VET00040 CAUTION:   avoid contact of the drug with open wounds or accidental self-inflicted injections
Stereomicroscope (Leica) Meyer Instruments # MZ75
Vannas Micro-dissecting (Eye) Scissors Spring Action Harvard Apparatus # 28483
Jeweller’s forceps (Dumont) Fine Science Tools # 11252-00
RNase Decontamination Solution  (RNaseZap) Sigma-Aldrich # R2020
RNA Stabilization Solution  (RNAlater) Thermo Fisher Scientific # R0901
Purification RNA kit (RNeasy) Qiagen # 74104
cDNA Reverse Transcription Kit Thermo Fisher Scientific # 4368814
Gene expression assay (TaqMan probes) Thermo Fisher Scientific Il1b: Mm00446190_m1
Il6: Mm00446190_m1
Tgfb1: Mm01178820_m1
Tnfa: Mm99999068_m1
Il10: Mm00439614_m1
Dusp1: Mm00457274_g1
Hprt1: Mm00446968_m1
Real-time PCR System (7900HT) Applied Biosystems # 4329001
Paraformaldehyde (PFA) Merck # 1040051000 TOXIC: PFA is a potential carcinogen
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Merck # 405491 CAUTION:  harmful if inhaled, may cause damage to respiratory tract through prolonged or repeated exposure if
inhaled.
Hematoxylin solution Sigma-Aldrich # HHS16
Eosin Y Sigma-Aldrich # E4382 Hazards: causes serious eye irritation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dror, A. A., Avraham, K. B. Hearing impairment: a panoply of genes and functions. Neuron. 68, (2), 293-308 (2010).
  2. Muller, U., Barr-Gillespie, P. G. New treatment options for hearing loss. Nat Rev Drug Discov. 14, (5), 346-365 (2015).
  3. Okano, T. Immune system of the inner ear as a novel therapeutic target for sensorineural hearing loss. Front Pharmacol. 5, 205 (2014).
  4. Rivera, T., Sanz, L., Camarero, G., Varela-Nieto, I. Drug delivery to the inner ear: strategies and their therapeutic implications for sensorineural hearing loss. Curr Drug Deliv. 9, (3), 231-242 (2012).
  5. Horie, R. T., et al. Stealth-nanoparticle strategy for enhancing the efficacy of steroids in mice with noise-induced hearing loss. Nanomedicine (Lond). 5, (9), 1331-1340 (2010).
  6. Kanzaki, S., et al. Novel in vivo imaging analysis of an inner ear drug delivery system: Drug availability in inner ear following different dose of systemic drug injections. Hear Res. 330, (Pt A), 142-146 (2015).
  7. Paulson, D. P., et al. A novel controlled local drug delivery system for inner ear disease). Laryngoscope. 118, (4), 706-711 (2008).
  8. Fetoni, A. R., Troiani, D., Eramo, S. L., Rolesi, R., Paludetti Troiani, G. Efficacy of different routes of administration for Coenzyme Q10 formulation in noise-induced hearing loss: systemic versus transtympanic modality. Acta Otolaryngol. 132, (4), 391-399 (2012).
  9. Murillo-Cuesta, S., et al. Direct drug application to the round window: a comparative study of ototoxicity in rats. Otolaryngol Head Neck Surg. 141, (5), 584-590 (2009).
  10. Pullens, B., van Benthem, P. P. Intratympanic gentamicin for Meniere's disease or syndrome. Cochrane Database Syst Rev. (3), (2011).
  11. Lavigne, P., Lavigne, F., Saliba, I. Intratympanic corticosteroids injections: a systematic review of literature. Eur Arch Otorhinolaryngol. (2015).
  12. Park, S. H., Moon, I. S. Round window membrane vibration may increase the effect of intratympanic dexamethasone injection. Laryngoscope. 124, (6), 1444-1451 (2014).
  13. Phillips, J. S., Westerberg, B. Intratympanic steroids for Meniere's disease or syndrome. Cochrane Database Syst Rev. (7), (2011).
  14. Trune, D. R., Canlon, B. Corticosteroid therapy for hearing and balance disorders. Anat Rec (Hoboken). 295, (11), 1928-1943 (2012).
  15. Wei, B. P., Stathopoulos, D., O'Leary, S. Steroids for idiopathic sudden sensorineural hearing loss. Cochrane Database Syst Rev. 7, (2013).
  16. Varela-Nieto, I., Silvia, M. -C., Rodriguez-de la Rosa, L. ourdes, Lassaletta, L. uis, Contreras, J. ulio IGF-I deficiency and hearing loss: molecular clues and clinical implications. Pediatr Endocrinol Rev. 10, (4), 12 (2013).
  17. Nakagawa, T., et al. Audiometric outcomes of topical IGF1 treatment for sudden deafness refractory to systemic steroids. Otol Neurotol. 33, (6), 941-946 (2012).
  18. Liu, H., et al. Evaluation of intratympanic formulations for inner ear delivery: methodology and sustained release formulation testing. Drug Dev Ind Pharm. 40, (7), 896-903 (2014).
  19. Nakagawa, T., Ito, J. Local drug delivery to the inner ear using biodegradable materials. Ther Deliv. 2, (6), 807-814 (2011).
  20. Buckiova, D., et al. Minimally invasive drug delivery to the cochlea through application of nanoparticles to the round window membrane. Nanomedicine. 7, (9), 1339-1354 (2012).
  21. Stover, T., Yagi, M., Raphael, Y. Cochlear gene transfer: round window versus cochleostomy inoculation. Hear Res. 136, (1-2), 124-130 (1999).
  22. Ahmed, T. A., Aljaeid, B. M. Preparation, characterization, and potential application of chitosan, chitosan derivatives, and chitosan metal nanoparticles in pharmaceutical drug delivery. Drug Des Devel Ther. 10, 483-507 (2016).
  23. Bhattarai, N., Gunn, J., Zhang, M. Chitosan-based hydrogels for controlled, localized drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 62, (1), 83-99 (2010).
  24. Rao, S. B., Sharma, C. P. Use of chitosan as a biomaterial: studies on its safety and hemostatic potential. J Biomed Mater Res. 34, (1), 21-28 (1997).
  25. Supper, S., et al. Thermosensitive chitosan/glycerophosphate-based hydrogel and its derivatives in pharmaceutical and biomedical applications. Expert Opin Drug Deliv. 11, (2), 249-267 (2014).
  26. Riquelme, R., et al. A comparative study of age-related hearing loss in wild type and insulin-like growth factor I deficient mice. Front Neuroanat. 4, 27 (2010).
  27. Willott, J. F. Measurement of the auditory brainstem response (ABR) to study auditory sensitivity in mice. Curr Protoc Neurosci. Chapter 8 Unit8 21B (2006).
  28. Cederholm, J. M., et al. Differential actions of isoflurane and ketamine-based anaesthetics on cochlear function in the mouse. Hear Res. 292, (1-2), 71-79 (2012).
  29. Cediel, R., Riquelme, R., Contreras, J., Diaz, A., Varela-Nieto, I. Sensorineural hearing loss in insulin-like growth factor I-null mice: a new model of human deafness. Eur J Neurosci. 23, (2), 587-590 (2006).
  30. Murillo-Cuesta, S., et al. Insulin receptor substrate 2 (IRS2)-deficient mice show sensorineural hearing loss that is delayed by concomitant protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) loss of function. Mol Med. 18, 260-269 (2012).
  31. Ngan, E. M., May, B. J. Relationship between the auditory brainstem response and auditory nerve thresholds in cats with hearing loss. Hear Res. 156, (1-2), 44-52 (2001).
  32. El Kechai, N., et al. Recent advances in local drug delivery to the inner ear. Int J Pharm. 494, (1), 83-101 (2015).
  33. Grewal, A. S., Nedzelski, J. M., Chen, J. M., Lin, V. Y. Dexamethasone uptake in the murine organ of Corti with transtympanic versus systemic administration. J Otolaryngol Head Neck Surg. 42, 19 (2013).
  34. Camarero, G., et al. Delayed inner ear maturation and neuronal loss in postnatal Igf-1-deficient mice. J Neurosci. 21, (19), 7630-7641 (2001).
  35. Rodriguez-de la Rosa, L., et al. Comparative gene expression study of the vestibular organ of the Igf1 deficient mouse using whole-transcript arrays. Hear Res. 330, (Pt A), 62-77 (2015).
  36. Sanchez-Calderon, H., et al. RNA microarray analysis in prenatal mouse cochlea reveals novel IGF-I target genes: implication of MEF2 and FOXM1 transcription factors. PLoS One. 5, (1), e8699 (2010).
  37. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, (4), 402-408 (2001).
  38. Ruebhausen, M. R., Brozoski, T. J., Bauer, C. A. A comparison of the effects of isoflurane and ketamine anesthesia on auditory brainstem response (ABR) thresholds in rats. Hear Res. 287, (1-2), 25-29 (2012).
  39. Borkholder, D. A., Zhu, X., Frisina, R. D. Round window membrane intracochlear drug delivery enhanced by induced advection. J Control Release. 174, 171-176 (2014).
  40. Astolfi, L., et al. Cochlear implants and drug delivery: In vitro evaluation of dexamethasone release. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 102, (2), 267-273 (2014).
  41. Roche, J. P., Hansen, M. R. On the Horizon: Cochlear Implant Technology. Otolaryngol Clin North Am. 48, (6), 1097-1116 (2015).
  42. Duan, M. -l, Zhi-qiang, C. Permeability of round window membrane and its role for drug delivery: our own findings and literature review. Journal of Otology. 4, (1), 34-43 (2009).
  43. Mikulec, A. A., Plontke, S. K., Hartsock, J. J., Salt, A. N. Entry of substances into perilymph through the bone of the otic capsule after intratympanic applications in guinea pigs: implications for local drug delivery in humans. Otol Neurotol. 30, (2), 131-138 (2009).
  44. Kang, W. S., et al. Intracochlear Drug Delivery Through the Oval Window in Fresh Cadaveric Human Temporal Bones. Otol Neurotol. 37, (3), 218-222 (2016).
  45. Lajud, S. A., et al. A regulated delivery system for inner ear drug application. J Control Release. 166, (3), 268-276 (2013).
  46. Jero, J., Tseng, C. J., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. A surgical approach appropriate for targeted cochlear gene therapy in the mouse. Hear Res. 151, (1-2), 106-114 (2001).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics