Sviluppo di un modello diretto Pulp-capping di valutazione dei polpa dentale guarigione delle ferite e riparativa dentina formazione nei topi

Medicine

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Summary

Descriviamo un metodo passo-passo di eseguire incappucciamento diretto su topi denti per la valutazione della polpa guarigione della ferita e la formazione dentina riparativa in vivo.

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Song, M., Kim, S., Kim, T., Park, S., Shin, K. H., Kang, M., Park, N. H., Kim, R. Development of a Direct Pulp-capping Model for the Evaluation of Pulpal Wound Healing and Reparative Dentin Formation in Mice. J. Vis. Exp. (119), e54973, doi:10.3791/54973 (2017).

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Abstract

Protocol

I topi sono stati acquistati da Jackson Laboratory e conservati in un Vivarium priva di agenti patogeni e la Divisione di Medicina di Laboratorio UCLA animali (àlam). Gli esperimenti sono stati eseguiti secondo le linee guida istituzionali approvate dal comitato per la ricerca degli animali del Cancelliere (ARC # 2016-037).

1. mouse anestesia

  1. Utilizzare otto settimane di età femminile topi C57 / BL6 (n = 3).
  2. Anestetizzare i topi utilizzando soluzioni (5 mg / kg di peso del mouse) ketamina (80-120 mg / kg di peso del mouse) / xilazina e somministrare per via intraperitoneale (ip) alla dose di 10 ml / kg.
  3. Preparare ketamina (80 - 120 mg / kg) / xilazina (5 mg / kg) soluzioni e somministrarli via intraperitoneale (ip) alla dose di 10 ml / kg.
  4. Verificare che i topi sono completamente anestetizzati eseguendo un pinch punta.

2. Procedura Pulp-tappatura

  1. Posizionare il supporto bocca nella bocca del mouse.
  2. Fissare il supporto bocca sul tavolo in modo che l'haL'annuncio è rivolto verso l'alto.
  3. Posizionare il microscopio (10X) sulla parte superiore della bocca in modo che il primo molare superiore è completamente visibile.
  4. Uso del ¼-tutto fresa in un manipolo ad alta velocità a 200.000 rpm, rimuovere la parte smalto del dente nel mezzo finché la polpa è visibile attraverso la dentina trasparente. Non esporre la polpa con la fresa.
  5. Utilizzo di un K-file di endodonzia # 15 (diametro di 150 micron), forare attraverso la dentina ed esporre la polpa.
    NOTA: Particolare attenzione dovrebbe essere presa in modo che i detriti dentina non viene spinto nella polpa. Ciò può essere evitato ruotando il file K trimestrale e quindi tirando il K-FILE out.
  6. Mescolare MTA con H 2 O sterile secondo le istruzioni del produttore. Consegnare e posizionare il MTA sulla polpa esposta con la punta di un esploratore. Utilizzare il lato posteriore del cono di carta (fine) per imballare la MTA nella polpa esposta con lievi colpetti. Il lato più spesso del punto di carta sia piatta e quindi consenteper il corretto condensazione del MTA nella polpa esposta.
  7. Etch il dente per 15 s posizionando il mordenzante acido fosforico al 35% dove solo copre il dente. Fare particolare attenzione a limitare il posizionamento del mordenzante, in quanto può irritare i tessuti gengivali.
    NOTA: Il mordenzante viene in una siringa e viene utilizzato per irruvidire superfici dentali in modo che gli adesivi dentali possono fluire in mediare bonding micromeccanica sul dente. Poiché sono viscoso, può essere indipendente applicando piccole quantità direttamente sul dente.
  8. Utilizzare aspirazione negativo-pressione per rimuovere il mordenzante. Utilizzare un batuffolo di cotone che viene leggermente imbevuto con H 2 O per rimuovere i residui del mordenzante. Ripetere questa operazione fino a quando il mordenzante viene completamente rimosso dal dente.
  9. Utilizzando un panno di aria compressa, asciugare delicatamente il dente.
  10. Applicare gli adesivi dentali utilizzando retro della punta di carta.
  11. Rendere lo strato adesivo sottile con aria compressa per 3 s.
  12. Cure gli adesivi dentali per 20 s utilizzando l'unità di polimerizzazione-luce.
  13. Posizionare il composito fluido in piccole quantità sul dente che è stato ricoperto con MTA. Utilizzare la punta di un esploratore di fluire il composito nelle scanalature dei denti.
  14. Curare il composito per 30 s usando una unità fotopolimerizzabile per polimerizzare esso. Verificare che il composito è completamente guarito e duro con l'esploratore.

3. Post-op cura

  1. Somministrare Carprofen (5 mg / kg) per via sottocutanea (SC) immediatamente dopo la procedura pulp-capping.
  2. Mettere i topi su una piastra elettrica a bassa potenza per tenere gli animali al caldo prima che si svegliano.
  3. Riportare i topi per vivaio per l'edilizia abitativa.

4. Tissue Procurement

  1. Dopo 5 - 6 settimane eutanasia i topi mediante dislocazione cervicale in una condizione di anestesia completa con isoflurano.
  2. Rimuovere con attenzione il mascellare superiore fuori dalla base del cranio e metterlo in un tubo da 50 ml. Fissare il entire mascellare che contiene sia il dente pasta-livellata e dente uncapped controlaterale in 4% paraformaldeide in PBS, pH 7,4, a 4 ° C per una notte, e quindi memorizzare in una soluzione di etanolo al 70%.
    NOTA: Paraformaldeide è tossico e cancerogeno. L'uso corretto paraformaldeide deve essere monitorata come descritto nelle procedure operative standard (SOP).
  3. Eseguire la scansione del mascelle mouse utilizzando la scansione μCT. Per fissare il mascelle durante la scansione, avvolgere i campioni con una garza imbevuta con il 70% di etanolo e metterli nel tubo di coltura cellulare da 15 ml.

5. μCT Scansione

  1. Preparare i campioni per la scansione μCT. In breve, avvolgere i campioni con una garza imbevuta con il 70% di etanolo e fissarli in un generico coltura cellulare tubo conico da 15 ml. Montare il tubo sul palco scansione μCT, come indicato nelle istruzioni del produttore.
  2. Impostare la sorgente di raggi X per una corrente di 145 μA, una tensione di 55 kVp, e un tempo di esposizione di 200 ms.
  3. Eseguire acquisizione di immagini con lo scanner μCT con una risoluzione di 20 micron e con un filtro Al 0,5 mm.
  4. Ricostruire l'immagine e visualizzarla 11.
  5. Una volta che la scansione μCT, avviare la decalcificazione con 5% EDTA e 4% di saccarosio in PBS (pH 7,4) per 2 settimane.

6. Trattamento dei tessuti e la colorazione

  1. Incorporare i tessuti decalcificati in paraffina. Prima di embedding, tagliare mascellare effettuando un taglio sagittale immediatamente anteriore al primo molare. Mentre incorporamento, posizionare questa superficie verso il basso, in modo tale che la sezione longitudinale del primo molare è la superficie di taglio.
  2. Utilizzando il microtomo, preparare 5 scivoli micron di spessore. Le aree polpa-tappatura solito coincidono con la radice distopalatal (DP), che può essere utilizzato come punto di riferimento. Determinare l'area precisa di interesse esaminando l'istologia sotto il microscopio ottico e confrontando le immagini μCT.
  3. Per colorazione H & E, deparaffinize e reidratare i vetrini con xilene (2x) ed etanolo in serie diluito (100% EtOH 2x, il 95% EtOH 2x, e il 70% EtOH 1x).
  4. Sciacquare i vetrini con acqua corrente.
  5. Macchia con la soluzione ematossilina per 2,5 minuti e risciacquare con acqua di rubinetto.
  6. Immergere i vetrini in etanolo al 95% per 1 min.
  7. Macchia con la soluzione Eosina per 1 minuto e sciacquare con acqua di rubinetto.
  8. Disidratare con etanolo serialmente diluito (70% EtOH 1x, 95% EtOH 2x, e il 100% EtOH 3x) e xilene (3x).
  9. Montare i vetrini con soluzione di montaggio.

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Representative Results

Qui, abbiamo dimostrato le procedure passo-passo per eseguire polpa di tappatura su topi denti. Uno degli aspetti chiave della polpa di tappatura nei topi è di avere l'apparato adeguato. A questo proposito, avendo il microscopio con un ingrandimento di potenza 10X è essenziale (Figura 1A). Per creare una preparazione di Classe-I-come nel dente, abbiamo utilizzato una fresa da ¼ di giro in un manipolo elettrico ad alta velocità a 200.000 giri al minuto (Figura 1B). In alternativa, altri motori, comprese quelle che utilizzano aria compressa, possono essere usati per preparare un dente.

Nella Figura 2A-2E, sono mostrati passi rappresentativi per l'esecuzione di incappucciamento pulpare. La preparazione Class-I-like è stata eseguita (Figura 2B). Perché un getto d'acqua può annegare i topi durante la procedura, il suo uso non è raccomandato. Per questo motivo, è essenziale per preparare il dente con dolce e intermittent colpi per evitare il surriscaldamento. L'uso di aria compressa è consigliabile anche per fornire effetti di raffreddamento. Mentre esponendo la polpa con un file endodontico, fare attenzione a non spingere i detriti dentina nella polpa, in quanto ciò potrebbe interferire con l'interpretazione dei dati in formazione dentina riparativa (Figura 2C). Ciò può essere evitato utilizzando l'aria compressa. Analogamente, il MTA deve essere posizionato sulla pasta esposto senza spingere troppo nella polpa. Posizionamento MTA può essere ottenuto utilizzando retro della punta di carta con movimenti delicati autofilettanti (Figura 2D). Dopo posizionamento MTA, il dente deve essere pulita con H 2 O pellets cotone imbevute per eliminare qualsiasi traccia MTA nelle scanalature, che possono interferire con il legame del composito sul dente. I metodi convenzionali di restauro in composito sono utilizzati, tra cui l'incisione della superficie del dente, adescamento ed il legame con gli adesivi, e l'immissione e curare i compositi fluidi (Figura 2E).

Sei settimane dopo la polpa di tappatura, i topi sono stati raccolti, e la vista dall'alto è stato fotografato per confermare che il composito era ancora intatto (figura 3A). scansione μCT mostrato una significativa recessione di spazio polpa nel gruppo pulp-capped (Figura 3B), suggerendo che la dentina riparativa si è formata nella polpa. I campioni tessuti decalcificati sono stati sottoposti a colorazione H & E di esaminare ulteriormente istologicamente la formazione di dentina riparativa in vivo. Nel gruppo di controllo, strati odontoblastic (OB) erano prominente evidenti attorno ai bordi della dentina (Figura 4A - 4C). Al contrario, il gruppo pulp-tappatura aveva notevoli quantità di dentina riparativa (RD) ricavata nello spazio pulpare (Figura 4D - 4F). È interessante notare che un esame più rivelato che dentina riparativo (RD) espone una caratteristica tipica di dentina (ad esempio, s Linee triated rappresentano tubuli dentinali, freccia rossa), così come quella delle ossa (per esempio, osteociti rappresentano osteoblasti intrappolati, punte di freccia nera). Quando colorati per dentina Matrix Protein 1 (DMP1), un marker di differenziazione odontogena 12, abbiamo trovato un significativo aumento dell'espressione DMP1 nella polpa del dente pasta-capped rispetto a quella del dente livellata (Figura 5A e 5B) , indicando che dentina riparativo è formata all'interno della polpa.

Figura 1
Figura 1: L'installazione Attrezzature per la procedura di Pulp-capping. (A) Un microscopio (10X) per la visualizzazione del dente mouse. (B) Il manipolo ad alta velocità e il motore motore elettrico per la preparazione di un preparato classe I per esporre la polpa.= "_ Blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: Fasi rappresentante nel procedura di livellamento. (A) del dente non preparato sul primo molare mascellare in un topo. (B) la rimozione dello smalto iniziale utilizzando la fresa quarto di giro. (C) l'esposizione della polpa utilizzando il file endodontica. (D) MTA posizionamento nella polpa esposta. (E) il posizionamento di restauro composito sul dente. La barra rappresenta 500 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: presentazione clinica e μCT scanning del Dente Pulp-capped e Uncapped nei topi. (A) Vista occlusale del mascellare del mouse sul dente della pasta-capped (a sinistra) e il dente non ridotti (a destra). (B) Le immagini μCT sezione trasversale della mascelle. La barra rappresenta 500 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4: evidenza istologica di riparativa dentina Formazione in vivo. (AC) colorazione H & E del livellata primo molare mascellare in un mouse a 100X, 200X e 400X. (DE) colorazione H & E del primo molare mascellare pulp-capped in un mouse a 100X, 200X e 400X. La barra rappresenta 100 micron (OB = odontoblast strati; RD = dentina riparativa; frecce nere =osteociti; freccia rossa = tubuli dentinali). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5: la colorazione immunoistochimica di DMP1. (A) DMP1 colorazione del livellata primo molare mascellare in un mouse a 400X. (B) DMP1 colorazione del primo molare mascellare pulp-capped in un mouse a 400X. La barra rappresenta il 100 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Attualmente, ci sono diversi modelli sperimentali differenti disponibili per convalidare gli effetti in vivo di materiali dentali, ponteggi, o fattori di crescita sulla differenziazione delle cellule staminali odontogena polpa dentale (DPSCs) 13. Questi modelli includono ectopica trapianto autologo di DPSCs in un organo, come la capsula renale, o il trapianto sottocutaneo di DPSCs in topi immunocompromessi con ponteggi 14,15. Tuttavia, questi metodi sono limitate dal fatto che il loro effetto sulla odontogenic DPSCs non viene eseguito nell'ambiente pasta ortotopico. D'altra parte, il trapianto ortotopico nelle procedure pasta o pasta-tappatura su un dente sono utilizzati in animali più grandi 16,17. Anche se questi modelli sono utili per valutare il potenziale odontogenic nell'ambiente ortotopico, l'uso di tali modelli è in gran parte di natura osservativa, fornendo limitati approfondimenti meccanicistici sulla polpa di guarigione delle ferite e la formazione di dentina riparativa. In questo articolo, vi presentiamo un metodo dettagliato per eseguire pulp-capping nei topi. Questa procedura passo-passo include anestetizzare i topi, la preparazione della cavità di Classe-I-like, ponendo i materiali pulp-capping, la raccolta del mascellare, analizzando con la μCT scansione e valutazione di un campione di tessuto per la formazione di dentina riparativa. Il nostro modello di topo pulp-capping sarà determinante per indagare i meccanismi molecolari fondamentali della polpa guarigione delle ferite in vivo nel contesto della dentina riparativa consentendo l'uso di topi transgenici o knockout, che sono ampiamente disponibili nella comunità di ricerca.

Studi recenti hanno dimostrato diversi modelli murini in cui è stata osservata la formazione di dentina 18,19. Saito et al. creato una preparazione di Classe-I-like senza esposizione della polpa, che stimola reazionaria, non riparativa, la formazione di dentina. Sia dentina reazionario e dentina riparativa sono classificati come dentina terziaria, Che forma a seguito di stimolazione esterna al dente. Tuttavia, a differenza di dentina reazionaria, che è formato da odontoblasts esistenti, dentina riparativa è formata da cellule odontoblast-come, ad esempio DPSCs, quando la polpa viene esposta e gli strati odontoblastic sono aperti un varco 20. Pertanto, non rappresenta una procedura effettiva pasta incappucciamento nella clinica. In un altro studio, il vetro ionomero è stato utilizzato per tappare la esposizione della polpa 19. Tuttavia, uno studio clinico ha dimostrato che il vetro ionomero indotta infiammazione cronica, ma non riparativa dentina 21. A questo proposito, il nostro modello di topo pulp-tappatura meglio rappresenta l'effettiva procedura pulp-capping nei pazienti.

È interessante notare che quando abbiamo raccolto topi dopo più di 6 settimane, formazione dentina riparativa verificato tutta la camera pulpare e canali radicolari (Figura 4). Tale osservazione è piuttosto inaspettato, come abbiamo anticipato la formazione di dentina riparativa in giugnoction tra il materiale pulp-capping e la polpa. Tuttavia, potenti mineralizzazione della polpa si osserva anche in ambito clinico, soprattutto nei pazienti giovani relativamente 22. Perché le 8 settimane di età topi utilizzati in questo studio sono considerati "giovani adulti" 23, una possibilità esiste per cui questi topi ancora ospitano un significativo potenziale di odontogenic. Pertanto, sarebbe utile per esaminare gli effetti di invecchiamento della formazione dentina riparativa nei topi.

I nostri esami istologici hanno rivelato che, anche se dentina riparativa era chiaramente formata nel dente pasta-capped, c'erano caratteristiche sia dentina e ossa formazione, come dimostra la presenza di tubuli dentinali (freccia rossa) e osteociti (frecce nere) nella riparativa dentina (Figura 5). Queste osservazioni suggeriscono che la formazione dentina riparativo può essere indotta da residente localmente cellule staminali polpa dentale odontoblast simili, nonché infiltrating cellule staminali mesenchimali dal midollo circostante.

Rispetto alle cellule dentina-formatura, abbiamo trovato alcuna cellule dentina-riassorbono all'interno della polpa, come determinato da tartrato fosfatasi acida resistente (TRAP) colorazione (dati non mostrati). In effetti, l'infiammazione della polpa o periapicale induce la formazione degli osteoclasti sulle superfici ossee intorno al dente, ma non sulle superfici della dentina a causa di come-ancora-sconosciuto meccanismi 24. Da segnalare, c'era una chiara demarcazione tra la dentina esistente e la dentina riparativa di recente formazione (figura 4). Un precedente studio ha dimostrato un fenomeno simile; quando un dente viene estratto, in presenza di bifosfonati o anticorpo anti-RANKL, entrambi i quali inibiscono le funzioni di osteoclasti, vi erano chiare demarcazioni tra osso lamellare esistenti e di nuova formazione di tessuto osseo 25. Questa nozione supporta ulteriormente l'assenza di cellule dentina-riassorbono nella polpa. Collettivamente, il nostro modello di topo stabilito farebbe provide opportunità uniche per esaminare i meccanismi di polpa di guarigione delle ferite e la formazione di dentina riparativa in vivo.

Vi è un limite al modello di topo pulp-tappatura. trucchi genetici tra gli esseri umani e topi sono chiaramente differenti. Il genoma completo è stato sequenziato negli esseri umani e topi, e non vi è circa l'85% di somiglianza nelle regioni codificanti proteine tra topi e nell'uomo 26,27. In linea con questo concetto, è stato suggerito che i risultati relativi alla polpa di tappatura in animali non riflette necessariamente il parere negli esseri umani 28. Tuttavia, i modelli animali sono ampiamente utilizzati nella comunità di ricerca di ricapitolare malattie umane in vivo, come l'artrite collagene-indotta per l'artrite reumatoide 29, perdita di massa ossea ovariactomy indotto per l'osteoporosi 30, lipopolisaccaride (LPS) la somministrazione di shock sistemico 31, e la legatura posizionamento per parodontite 32. Come tale, il mou pulp-tappaturaModello SE sarà essenziale per esaminare i meccanismi molecolari di polpa di guarigione delle ferite e la formazione di dentina riparativa in vivo. Tuttavia, proprio come gli altri modelli animali, l'interpretazione e la validazione dei risultati del modello di topo pulp-capping deve essere valutata con attenzione.

In sintesi, questo studio dimostra polpa di successo capping nei topi. A differenza di altri modelli noti, questo modello di topo pulp-capping fornirà uno strumento di ricerca prezioso nel campo della rigenerazione polpa e la formazione di dentina riparativa in quanto fornisce: 1) l'opportunità di utilizzare ampiamente disponibili ceppi di topi geneticamente modificati per chiarire i meccanismi alla base del livello molecolare e 2) un modo economicamente efficace per ottenere risultati statisticamente significativi aumentando le dimensioni del campione. Ulteriori studi attendono, tra cui quantificazione oggettiva della formazione dentina riparativa in vivo, effetti di età-dipendente di formazione dentina riparativa, valuzione di materiali pulp-capping clinicamente disponibile, e la validazione dei determinanti molecolari che sono necessari per la corretta polpa la guarigione delle ferite e la rigenerazione dentina riparativa.

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Acknowledgments

Questo studio è stato sostenuto da R01DE023348 (RHK) da NIDCR / NIH e la Research Grant Facoltà (RHK) dal Consiglio per la ricerca del Senato Accademico della divisione di Los Angeles della University of California.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BM-LED stereo microscope MEIJI Techno Microscope 
Optima MCX-LED  Bien Air Dental 1700588-001 Electic motor engine
isoflurane Henry schein animal health NDC 11695-0500-2
1/4 round bur Brasseler 001092T0
Endodontic K-file Roydent 98947
ProRoot MTA Dentsply PROROOT5W MTA
Paper point Henry schein 100-3941
Ultra-Etch Ultradent product Inc. Phosphoric acid etchant
OptiBond SoloPlus Kerr 29669 Adhesives
Coltolux LED Coltene/whaledent Inc. C7970100115 Curing light unit
Characterization tint Bisco T-14012 Flowable composite
Skyscan Breuker 1275 uCT scanner
Microm Thermo HM355S Microtome
Hematoxyline-1 Thermo Scientific 7221
Eosin-Y Thermo Scientific 7111
Cytoseal 60 Thermo Scientific 8310-16 Mounting solution

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References

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