쥐 배아 중족골의 문화 : 연골 골화의 생리 학적 모델

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Developmental Biology
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Houston, D. A., Staines, K. A., MacRae, V. E., Farquharson, C. Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification. J. Vis. Exp. (118), e54978, doi:10.3791/54978 (2016).

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Abstract

Introduction

골격 이온 항상성에 걸쳐 운동에서 다양한 기능을 갖는 고도로 복잡 동적 복잡한 기관이다. 뼈와 연골의 구성, 골격은, 구조 생화학 적 및 기계적 무결성 1의 유지 운영 기능적으로 서로 다른 세포 집단으로 구성되어 있습니다. 골격의 주요 기능 중 하나는 발전 및 성장의 역할이다. 이러한 프로세스는 꽉 내분비 및 유전 적 제어를 통해 규제하는 여러 세포 인구의 오케스트레이션을 필요로한다.

평탄 뼈 견갑골, 두개골 및 흉골 제외한 포유류 골격 연골 내 골화으로 알려진 과정을 통해 형성된다. 조절 분자 둘 공간적이 프로세스는, 중배엽이 주로 유래 중간 엽 세포의 축합으로 시작한다. 전사 인자의 SOX9의 영향으로, 세포 일에응축의 전자 내부 표현 및 유형 II 콜라겐과 aggrecan과 같은 연골 특정 세포 외 기질 (ECM) 성분을 분비, 연골 세포로 분화. 응축의 마진에서 세포는 미래의 뼈 3 서술, I 콜라겐과 연골막을 형성 유형을 표현한다. 나중에, 연골막의 osteoprogenitors는 전사 인자, Runx2와 osterix 4의 발현 감독, 조골 세포로 분화. 이 조골 세포의 우위로 연결이 층은 뼈의 중간 부분 주변의 광물 뼈 고리를 형성하는 골막을 이름이 변경됩니다. 연골 지지체의 골막과 침략의 혈관 침투, 그것으로 데려 haematopoetically 연골 세포 잔해와 연골 매트릭스 (5)의 많은 부분을 재 흡수 뼈 재 흡수 세포, 파골 세포를 유도 발생합니다. 형성된 공간은 일차 골화에 야기한 osteoprogenitors 의해 채워진다점진적으로 골간의 핵심을 차지하고 골막와 합병 센터. 기타 세포는 골수 일으킨다. 출생 주변 혈관 osteoprogenitors 이차 골화 중심을 형성하는 현상 골간의 양측 (골단)에서 다양한 연골 매트릭스를 관통. 골단 성장판 - - 모든 긴 뼈 (6)의 선형 성장을 조정하는 책임이있는 긴 뼈의 양쪽 끝에서 골단과 골간 사이에 위치한 연골의 밴드이다.

성장판에서 연골 세포는 처음 증식 및 이후 전사 및 성장 인자의 연속 식으로 조정 형태 학적으로 서로 다른 영역을 통해 진행. 이러한 일련의 이벤트의 절정이 연골 전구체의 중심 연골 세포의 세포주기 및 비대에서 출구이다. 비대 연골 세포 강력 X 형 콜라겐 매트릭스 메탈로 표현-13 (MMP13)와 종 방향 성장의 방향으로 자신의 상당한 볼륨 확대는 포유 동물 7,8에서 뼈의 성장에 가장 큰 기여를 제공합니다. 또한, 비후성 연골 매트릭스 소체의 방출을 통해 주변 ECM을 무기화 멤브레인 경계 구조는 포스파타제의 포함 (조직 비특이적 알칼리 포스파타제 (TNAP) 및 PHOSPHO1) 칼슘 채널링 단백질 (annexins 통해 비정질 인산 칼슘의 제조에 전문 ) 9-11. 이 석회화 연골은 파골 세포의 모집 및 매트릭스 흡수의 결과로 기본 골수에서 혈관에 의해 침략된다. 이것은 그들이 빠르게 광물이다 유골의 층을 아래로 누워 석회화 연골 잔재의 표면에 조골 세포의 이동 및 정렬옵니다. 기본 spongiosa의 짠 뼈는 나중에 보조 spongiosa (12)의 층상 뼈 리모델링된다. 에 골단 융합 결과연골 골화 (13)의 중단.

교란 현상 및 / 또는 뼈의 성장 길이 14을 방지하도록 연골 내 골화 많은 호르몬 분비 호르몬 및 성장 인자에 의해 엄격한 규제 받고있다. 이러한 프로세스를 뒷받침 분자 및 세포 메커니즘의 이해는 인간의 이익으로 임상 발전의 추구에 따라서 필수적이다. 유사점과 다른 나이, 위치와 종의 성장 판 사이의 차이에 대한 이전의 연구는 크게 성장판 역학 (15, 16)을 둘러싼 생리 학적 메커니즘에 대한 우리의 이해를 향상되었습니다. 자신의 환경에서 연골 세포의 제거는 Col2a1 (17)와 같은 주요 마커의 발현 감소와 함께, 탈분화로 이어질 수 그러나 고립 된 연골 세포의 연구는 어렵다.

마우스 에릭손 기관 체외 이식편 문화, 파이네덜란드의 교수 엘리자베스 버거와 동료에 의해 oneered, 문화 생체 (18)에서 본 것을 모방 뼈의 성장 속도로 연골 골화와 뼈의 성장을 연구하기위한 고도의 생리적 생체 모델입니다. 유니 클리, 중족골 기관 배양 따라서 문화 19 ~ 21 세포에 비해 생체 내 상황에 가까운 조건을 제공 연골의 다른 단계에서 연골 세포의 시험을 허용하고 세포 - 세포 및 세포 - 기질 상호 작용을 유지합니다. 또한,이 모델은 기본 연골 세포 배양에서 수 없습니다 선형 뼈의 성장을 직접 검사 수 있습니다. 또한 따라서 성장판 로컬 효과의 구체적인 분석을 허용 조직 및 지방 요소의 분리를 허용한다.

중족골의 문화는 다양한 매개 변수의 조사를 할 수 있습니다. 전체 길이와의 광물 지역의 일일 측정초보 표준 위상차 현미경과 화상 해석 소프트웨어로 수행 될 수있다. 동일계 하이브리드 화 및 면역 조직 염색의 조직학은 용이 셀룰러 분자 실체, 기존의 세포 배양 방법에 비해 큰 장점의 공간 해상도를 허용 중족골 부에서 수행 될 수있다. 면역 조직 화학적 방법은 연골 세포 (22) 증식에 의한 탐지 및 5- 브로 모 -2'- 데 옥시 우리 딘 (BrdU의) 흡수의 정량화를 포함한다. 또한 중족골 조직의 추가적인 처리는 mRNA 발현 (RT-qPCR에), 단백질 및 세포 내 신호 분석 (웨스턴 블롯) 또는 지질 조성물 (질량 분석법) 하류의 분석을 허용하도록하여 수행 될 수있다. 현재까지 대부분의 연구는 산후 동물에서 배양 된 배아 중족골이 아닌 중족골을 사용합니다. 그들은 빠르게 성장하고 EXPLO 수 있습니다 : 두 모델은 정보가 될 수하는 동안, 배아 뼈의 연구는 몇 가지 장점이 있습니다제한없는이 광물 처리 23-25의 개시 및 진행을 공부합니다.

이 프로토콜은 구체적으로 배아 일 15 (E15) 쥐의 배아의 뒷다리에서 배아 중족골의 복잡한 해부에 대해 설명합니다. 또한, 해부학 적으로 별개의 중족골의 성장과 광물이 표시됩니다.

Protocol

동물 주제와 관련된 절차 공급 또는 과학적인 목적에 사용 사육 동물의 주거 및 관리에 대한 실천의 코드를 출판 영국 동물 (과학적 절차) 법 1986과 동물이 홈 오피스에 따라 유지 하였다 준수 실시 하였다.

주 : 야생형 C57BL / 6J 마우스를 사용하여 수행 실험은 잘 확립하고 설명한다. 자신의 성장과 광물 가격은 여기에 설명 된 것과 다를 수 있지만 다른 마우스 변종에서 배아 중족골 마찬가지로, 체외에서 배양 할 수있다.

1. 해부 조건 및 악기의 제조

  1. 미디어 및 배아 초보의 불임을 보장하기 위해 층류 후드에있는 모든 미디어 준비, 조직의 해부와 문화 작업을 수행합니다.
  2. 문화와 해부 미디어를 사용하기 전에 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 적어도 1 시간 동안 평형을 허용합니다.
  3. 해부를 소독가위, 뒤몽 # 5 뒤몽 # 고압 증기 멸균에 의한 극상 Vannas 마이크로 가위와 함께 4 핀셋 (8cm 직선, 3mm 블레이드). 오토 클레이브 후, 70 % 에탄올에 사용하기 전에 절개 장치 젖어.

해부 문화 미디어 2. 준비

  1. 해부 매체를 준비
    1. 인산 완충 식염수 (PBS) (1시 13분)에서 α-최소 필수 미디어 (뉴 클레오 시드없이 αMEM)을 희석하고, 필터는 0.22 μm의 33 mm 직경의 주사기를 통해 멸균 전에 2 밀리그램 / m의 L에 소 혈청 알부민 (BSA)을 재현 탁 필터.
      주 : 해부 매체가 될 수 있고, 필터 멸균 무기한 -20 ℃에서 분취 량으로 저장.
  2. 문화 매체를 준비
    1. (각 웰의 24 웰 배양 판) 배지 300 ㎕의 문화 배아 중족골. / V 승 BSA 0.2 %를 첨가하여 배지를 준비; / ㎖의 L-ASCO 5 μg의rbic 산 포스페이트; 1 mM의 β-글리세 (βGP, 옵션 - 결과 섹션 참조) 0.05 ㎎ / ㎖의 겐타 마이신 및 1.25 μg의 αMEM에 암포 테리 신 B 및 필터 0.22 μm의, 33mm 직경의 주사기 필터를 통해 살균.

3. 쥐 배아 에릭손 해부와 문화

  1. 영국에 본사 지침에 따라 자궁 전위에 의해, 15 일 된 배아를 품고, 임신 마우스를 추려
  2. 동물 부정사를 놓고 70 % 에탄올로 분사하여 피부를 소독. 사용 해부 가위는 피부와 복강을 노출 복막을 모두 관통, 중간 선에 큰 절개를합니다.
  3. 체강의 등 지역에서 동물의 두 자궁 뿔을 찾습니다. 먼저 해부 가위로 조심 절개하여 mesometrium에서 각각의 자궁을 확보 한 다음 마지막으로 자신의 기지에서 무료로 자궁 뿔을 절단하여 자궁 뿔을 제거합니다. PLAC해부 매체로 전자 자궁 뿔.
  4. 자궁 경적을 따라 주입 사이트간에 절단하여 각각의 배아를 분리하고 집게를 사용하여 자신의 개인 주머니에서 배아를 제거합니다. 영국에 본사 지침에 따라 잘린에 의해 도태 배아
  5. 70 % 에탄올로 분사하여 피부의 소독 후, 근위 대퇴골 주위를 절개하여 태아의 뒷다리를 제거하기 위해 Vannas에게 마이크로 가위를 사용합니다. 제거 가능한이 뒷다리만큼 보장한다. 에릭손 해부하기 전에 해부 매체에 잠긴 배양 접시에 두 다리를 놓습니다.
  6. 해부 현미경에서 곤란과 안정 뒷다리를 들고 # 4 핀셋을 사용하는 동안 # 5 핀셋을 사용하여 전원을 당겨, 배아 발을 둘러싸고있는 피부를 제거하기 시작합니다. 이것은 가장 효과적으로 경골의 주위에 피부를 잡고 지골 향해 당겨 행해진 다. 이 단계에서 위의 사용은 잘라매우 얇은 피부가 필요하지 않습니다.
  7. 조심스럽게 # 4 핀셋으로 배아 다리의 tarsals을 잡고 # 5 핀셋을 사용하여 버립니다 tarsals 근처에 떨어져 곤란하여 첫 번째와 다섯 번째 중족골를 제거합니다.
  8. 같은 위치에서 개최 된 다리로, 나머지 세 지골과 중족골 사이의 결합 조직을 방해하기 위해 # 5 핀셋을 사용합니다. 중족골에서 지골을 제거 할 지골과 중족골 사이의 관절에 # 5 핀셋의 끝을 삽입합니다.
  9. 마지막으로, tarsals과 중족골 사이의 결합 조직을 방해하는 5 핀셋 #을 사용합니다. 다시 tarsals에서 tarsals 및 중족골 부드럽게 무료 중족골 사이의 공동 공간에 # 5 핀셋의 끝을 배치합니다.
  10. 부드럽게 신선한 해부 매체에서 # 4 핀셋과 장소 지금 무료 중족골을 선택합니다.
    참고 : 조심 해부 각 배아에서 6 중족골을 제공해야한다.
  11. 필요한 모든 중족골이 해부되었을 때, carefu개별적으로 배양 배지 300 μl를 함유하는 미리 가온 된 24 웰 플레이트로 에서야 장소 중족골. 최대 14 일 동안 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 문화 중족골.
    참고 :이 자신의 광물 기능 (26)에 영향을 미치는으로 문화의 적어도 5 일까지 E15 문화의 미디어를 변경하지 마십시오. 이에 대한 이유는 불분명하지만, 선형 성장 매트릭스 광물은 중족골 해제 성장 인자에 의한 자극에 의존 할 수있다.

4. 분석 및 중족골 문화의 조작

  1. 해부 (0 일)의 날 디지털 카메라 부착 및 이미지 분석 소프트웨어와 함께 현미경을 사용하여 초기 길이 측정을합니다. 그것은 문화의 몇 일 후에 나타날 때 중앙 광물 영역의 길이를 측정합니다.
  2. 필요에 따라 주기적으로, 어떤 점 m에서 문화의 마지막 날까지 (보통 매일 2 일) 추가로 측정을etatarsal 뼈 (소개에서 설명)가 필요합니다 결과에 의존 처리됩니다.
  3. 다양한 외생 적 요인 중족골 기관 배양의 보충 매체는 성장 인자, 호르몬과 문화 (22, 24)의 일 0에서 약리 에이전트를 예. 이러한 종류의 모든 연구에서 치료 중족골이 필요합니다 제어 할 수 있습니다.
    참고 :이 제어 뼈가 반대쪽 다리에서 해당 퇴화 것을 권장하지만, 선형 성장 또는 배양 E15 2 차의 광물 잠재력에 어떤 차이가 없었다, 3 번째와 4 번째 중족골 (아래 참조, 그림 2) .

Representative Results

이 방법의 목적은 길이 방향의 뼈의 성장과 ECM 광물의 검사를 위해 배아 중족골과 문화를 분리하는 것이 었습니다. 광학 현미경에 의해 가시화로 본원에 기술 된 프로토콜을 사용하여 배아 중족골 성공적 해부 하였다. 그림 1에 나타낸 바와 같이 실시 중족골 뼈의 측정은, 자신의 ECM 세로 길이 성장하고 무기화 할 능력 나타났다 (그림 2, 3). 행렬의 광물 먼저 뼈 퇴화의 중간 골간에 언급되어 쉽게 광학 현미경으로 관찰된다. 칼 세인의 흡수가 새로 형성된 광물의 향상된 시각화를 제공 할 수 있지만, 어떤 염색이 필요하지 않습니다.

날짜 22,27,28에 배아 중족골을 이용한 연구가 해부 2 차를 풀링 한 3 번째와 4 번째 (CENTRAL 세) 중족골은 체외 성장과 광물에서 가정하는 것은 비교할 수 있습니다. 쥐 중족골의 생체 발달은, 그러나, 3 번째와 4 번째 자리가 이전에 다른 모든 중족골과 지골 (29)에 광물의 증거를 가지고 있음을 알 수있다. 개별적으로 분리 및 배양 E15 2 차의 성장과 광물 잠재력의 평가, 3 번째와 4 번째 중족골 문화 7 일 (그림 2) 후 광물의 모양이나 정도에 유의 한 차이를 보이지 않았다. 베이스 라인에서 백분율 증가의 차이는 배양 기간 동안 발견되지 않았다. 광물 전위의 차이가 관찰되지되었을 때 2 3 4 번째 중족골 풀링의 표준 프로토콜 미래 연구를위한 유효 나타납니다.

전통적으로, 연구자들은 미디어에 βGP 추가ECM 광물을 촉진하기 위해 문화 배아 중족골에 사용됩니다. 그러나, 세포 배양 실험에서, TNAP βGP 효소를 함유하는 골 형성 배지에 첨가하면, 히드 록시 아파타이트 이소성 무기물 증착에도 여전히 셀 (30)의 부재에서 발생하는 것으로 나타났다. 에릭손 광물 기능에 다양한 광물 기판 및 작용제의 효과를 조사하기 위해, 우리는 보충의 범위를 포함하는 배양 배지에서 E15의 중족골을 배양, 이미지 및 길이 측정은 매일 기록 하였다. 결과 E15 중족골 뼈가 계속 성장 βGP의 부재들은 ECM을 무기화 것으로 나타났다. 중족골이 βGP (그림 3)의 존재하에 배양로 아스 코르 빈산에서 배양 E15 중족골 뼈는 미디어 길이와 광물에 필적하는 증가를 보였다.

또한 렌티 바이러스를 배양 metata로 외래 DNA를 형질 사용될 수 있음을 보여 주었다rsals. 여기에서 우리는 성공적으로 중족골 당 2 × 10 6 녹색 형광 단백질 (GFP) 바이러스 입자와 문화 (해부의 일)의 일 0에 중족골 뼈를 형질 전환. 바이러스 전달을 사용하려면, 폴리 브렌 동시에 1 문화에 추가되었습니다 : 500. 문화는 공 초점 현미경 (사용 4로 배양되기 전에 발생하는 E15의 에릭손 광물에 필요한 5 분 동안 6 diamidino-2-페닐 인돌 (DAPI) 얼룩, '더 미디어 변화에 7 일 동안 방치 한 후 직접 시각화 하였다 그림 4). 개념 실험의 우리의 증거가 명확 효과적인 전달을 보여줍니다. 그러나 그들의 형질 효과적인 유전자 조작을 평가 중족골의 전체에 걸쳐 부분을 검사 신중하다.

그림 1
그림 1 : 표준 방법론 t를 측정하는 데 사용그 길이와 배아 중족골의 무기화 영역. (A) 문화의 날 0에 E15의 중족골의 총 길이 측정 (해부의 날) 중족골의 중심을 촬영. 문화 칠일 후 중족골의 총 길이 방향의 길이 (B) 측정. 중족골에서 약간의 곡률을합니다. (C) 문화 7 일 후에 광물 영역 길이의 측정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
E15 마우스의 뒷다리 w에서 성장과 해부학 고유 E15 중족골 이미징의 광물 용량 및 제 2의 측정, 3, 4 중족골 : 그림 2.수행으로. (A) 배양 기간 동안 2, 3, 4 중족골의 직렬 이미지. 문화의 매일의 일 0에서 길이 (B) 비율 증가. 배양 기간 동안 제 2, 3, 4 중족골의 (C) 미네랄 길이 중족골 총 길이의 비율로 나타냈다. 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차 (SEM)로서 표시된다 (N = 6). (D) 문화의 매일의 C57BL / 6J 중족골의 길이. 데이터는 표시되는 평균 ± 표준 편차 (N = 6). 블랙 바 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 : 야생 형 성장 광물 화 용량각종 골 형성 매질에서 E15 중족골 배양 하였다. (A) 만 아스코르브 산, 1mM의 βGP 3 밀리미터 포스 포 콜린, 1.5 mM의 염화칼슘 또는 매체를 포함하는 3 mM의 염화칼슘 배양 중족골의 일련의 이미지. 중족골의 일 0 길이 (B)의 백분율 증가는 다양한 보조제 배양 하였다. 다양한 매체에서 배양 중족골의 (C) 미네랄 길이 중족골 총 길이의 비율로 나타냈다. 데이터는 평균 ± 등을 평균의 표준 오차 (SEM)에 표시된다 (N = 6). 블랙 바 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4 : GFP 바이러스 P와 E15 중족골의 형질기사. (A) E15 중족골 뼈는 개념의 증거에 대한 GFP 바이러스 입자로 형질 감염시켰다. (B) 뼈는 DNA의 시각화를위한 DAPI로 염색 하였다. (C) 이중 이미지는 중족골의 전체에 걸쳐 GFP 바이러스의 성공적인 형질 감염을 나타내었다. 화이트 바 = 0.5 mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

쥐의 배아 중족골의 문화는 연골의 성장과 광물의 높은 생리 학적 모델을 제공합니다. 초기 연구는 E15 마우스 중족골이 골격의 성장과 분화의 정상적인 패턴을 겪는 것을 확인했다. 연골 (연골) 및 뼈 (조골 세포와 파골 세포) 세포 및 해당 콜라겐 매트릭스는 생체 내에서 관찰 된 것과 구별된다. 그러나,이 모델의 어떤 인식 된 제한이있다. 파골 세포 분화의 속도는 (그러나 연골 분화를 생략)이다 뼈 성장을 손상한다. 뼈 성장을 생체 내에서 관찰되는 것보다 약 50 % 느린와 로컬 요인 (예를 들어, IGF-1, BMP 형식 등) (31)의 생산에 영향을 미치는 요인으로 전신 결핍에 기인 할 수있다. 또한, 잘 뼈 기계적 환경에 민감한 것으로 인식되고, 이는 또한 C 응답 배양 중족골에 대한 경우이다기계적로드 (32, 33)에 hanges. 따라서, 언로드 상황으로서이 프로토콜 광물에 기재된 미네랄 흡수가 손상 될 수있다. 그럼에도 불구하고, 중족골 모델 직접 관내 배양 시스템에서 2D와 3D로 불가능 선형 뼈의 성장을 측정하는 능력을 제공한다.

우리는 처음 참 E15 쥐 중족골과의 박리 및 배양에 관련된 프로토콜의 포괄적 인 설명을 제공하고, 실험 2 차, 3 및 4 중족골 풀링의 유효성을 확인한다.

E17 / E18에서 중족골은 일반적으로 (문화 십사일 이상, 즉) 오랜 기간 동안 생체 성장을 자신의 특별한 잠재력으로 인해 뼈 성장의 메커니즘을 조사하는 데 사용됩니다. 이들은 배아 종 뼈 성장에 성장 인자의 역할을 조사하기 위해 확립 된 모델이다.또한, 생후 중족골의 절개 및 배양 일반적으로는 산후 뼈의 성장 및 태아의 뼈 성장 21 다르게 조절되는 것을 알 수있는 바와 같이 산후 뼈 성장을 둘러싼 메커니즘을 묘사하는데 사용된다. 배양 출생 중족골에서 관찰 된 뼈의 성장은 장기간의 연구에서 자신의 잠재력을 제한하고이 출생 후의 단계에서 뼈의 성장에 더 체계적인 영향을 강조하지만 배아 초보 25,34에서 관찰 된 것보다 훨씬 작다. 실제로, 마우스 3 일된 생후 중족골는 일반적으로 측정 성장 34를 얻는데 사용될 수있는 최신 단계이다.

여기에서 우리는 E15에서 배아 중족골 뼈의 분리에 대한 우리의 프로토콜을 설명합니다. E15의 중족골에 hydroxyapaptite 미네랄의 부재는 또한 길이 비교할 뼈 성장을 둘러싸뿐만 메커니즘을 조사하는 모델이지만 개시를 제공하는 것을 의미골격 광물. 터미널 비대 연골 세포 영역의 광물 행렬은 이후 광물 인 뼈 특정 매트릭스 (유골)을 누워 골아 세포 침입을위한 발판을 제공하고, 이러한 초기 광물로 성공적이고 기능적인 골 형성 (35)에 매우 중요합니다. 실제로 E15의 중족골을 이용하여 최근 보고서 수는 광물 처리 28,36,37의 조사를 위해 자신의 독특한 능력을 확인했다. 또한, 연구진은 뼈 성장 / 광물 설정 외부 모델로서 배아 중족골의 전위를 강조 혈관 (38)의 모델로 E15의 중족골의 사용을 설명했다.

우리가 설명하는 프로토콜은 층류 후드, 절개를 수행하기위한 해부 현미경 및 적출 초보의 문화에 대한 CO 2 배양기를 포함한 만 표준 실험실 장비를 필요로한다. 또한, 아주 기본적인 막 다른매체 αMEM, BSA, 항생제, 항진균제 및 L- 아스 코르 빈산 함유 진짜야 (하이드 록시 프롤린 및 히드 록시 리신의 합성 공동 인자, 콜라겐 (39)의 생산을위한 두 가지 필수 아미노산) 등의 동물 혈청로서 정의 첨가제의 사용을 피 . 전통적으로, 연구자들은 문화 배아 중족골에 사용되는 미디어에 βGP을 추가 한하지만 우리의 결과에 계시, 추가로 인산 소스의 사용이 문화 시스템의 성공적인 광물 필요하지 않습니다. 이 ECM 광물을 뒷받침하는 메커니즘을 이해하는 우리의 추구에서 중요한 발견이다.

중족골 이전 긴 뼈 (40)의 발달 조절에 성장 인자 β를 변화시키는 역할을 탐색 된 Smad2의 우성 음성 형태를 포함하는 아데노 바이러스로 감염되었다. 여기에서 우리는 t을 나타내는 GFP 바이러스 입자 야생형 E15의 중족골 뼈의 성공적인 형질 공개모자 렌티 기술 용이 중족골 배양에서 유전자 발현을 조작하기 위해 채택 될 수있다. 마찬가지로, 중족골 기관 배양 물 시스템은 더 골 성장 과정에서 특정 유전자의 역할을 이해하기 위해 유전자 변형 마우스의 뼈의 성장을 비교하기에 우수한 모델이다. 이전의 연구는 연골 내 골 성장 사이토 카인 시그널링 억제 -2- (SOCS2)의 역할을 결정하기 위해 중족골 기관 배양 시스템을 사용하고있다. SOCS2의 결핍 마우스에서 중족골 뼈를 사용하여, 그 성장 호르몬은 성장 인자와 같은 인슐린 그들의 길이 성장 독립적를 시뮬레이션 할 수있다 나타났다 (IGF-1), 성장 호르몬 치료 (34)에 반응하지 않는 야생형 중족골 달리 41. 이것은 중족골 배양 상이한 유전자 및 / 또는 연골 내 골 성장 외인성 요인의 영향을 조사하기 위해 조작 될 수있는 정도를 강조한다.

요약하면, 우리는 detai이조작 할 수있다 배아 중족골 뼈의 성공적인 추출 및 배양하는 방법을지도하고 다양한 분석을 이용하여 조사 하였다. 이 생체 모델은 따라서 단일 층 또는 3 차원 배양 세포보다 더 생리 학적 모델을 제공 할뿐만 아니라 연골의 다른 단계에서 연골 세포가 들어 있으므로, 세포 - 세포 및 세포 - 기질 상호 작용을 유지합니다. 에릭손 기관 배양 따라서 연골 골화을 담당하는 분자 메커니즘을 조사에 대해 고유 한 모델이며, 뼈 생리학 및 병태 생리 양에 대한 우리의 이해를 증진하는 것이 필수적이다

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissection scissors World Precision Instruments 14393 Autoclave sterilise before use
Dumont #5 tweezers World Precision Instruments 500342 Autoclave sterilise before use
Dumont #4 tweezers World Precision Instruments 500339 Autoclave sterilise before use
SuperFine Vannas scissors World Precision Instruments 501778
Absolute ethanol Fisher Scientific E/0650DF/17 Dilute to 70% v/v in dH2O
α-MEM without nucleosides Thermo Fischer Scientific  22561021
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A3059
Syringe filters (0.22 μm) 33 mm diameter Merck Millipore SLGP033RS
Phosphocholine chloride calcium salt tetrahydrate Sigma Aldrich P0378 Add directly to the media prior to experimentation
L-ascorbic acid-2-phosphate Sigma Aldrich A8960 Make up stock soution at 5mg/ml and aliquot at -20 °C
Calcium chloride dihydrate Sigma Aldrich C5080 Make up stock soution at 150mM and aliquot at -20 °C
β-glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma Aldrich G9422 Make up stock soution at 1mM and aliquot at -20 °C
Gentamicin Thermo Fischer Scientific  15710049
Amphotericin B Thermo Fischer Scientific  15290018
Nunc cell-culture treated 24-well plates Thermo Fischer Scientific  142475
Polybrene Sigma Aldrich H9268
DAPI Thermo Fischer Scientific  D3571

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Farquharson, C., Staines, K. The skeleton: no bones about it. J. Endocrinol. 211, 107-108 (2011).
  2. Berendsen, A. D., Olsen, B. R. Bone development. Bone. 80, 14-18 (2015).
  3. Kronenberg, H. M. Developmental regulation of the growth plate. Nature. 423, 332-336 (2003).
  4. Komori, T. Regulation of bone development and extracellular matrix protein genes by RUNX2. Cell Tissue Res. 339, 189-195 (2010).
  5. de Crombrugghe, B., Lefebvre, W. Regulatory mechanisms in the pathways of cartilage and bone formation. Curr. Opin. Cell Biol. 13, 721-727 (2001).
  6. Hall, B. K. Bones and Cartilage: Developmental and Evolutionary Skeletal Biology. Elsevier Academic Press. (2005).
  7. Farquharson, C., Jefferies, D. Chondrocytes and longitudinal bone growth: The development of tibial dyschondroplasia. Poult. Sci. 79, 994-1004 (2000).
  8. Cooper, K. L., et al. Multiple phases of chondrocyte enlargement underlie differences in skeletal proportions. Nature. 495, 375-378 (2013).
  9. Wuthier, R. E., Lipscomb, G. F. Matrix vesicles: structure, composition, formation and function in calcification. Front. Biosci. 16, 2812 (2011).
  10. Roberts, S., Narisawa, S., Harmey, D., Millan, J. L., Farquharson, C. Functional involvement of PHOSPHO1 in matrix vesicle-mediated skeletal. J. Bone Miner. Res. 22, 617-627 (2007).
  11. Cui, L., Houston, D. A., Farquharson, C., MacRae, V. E. Characterisation of matrix vesicles in skeletal and soft tissue mineralisation. Bone. 87, 147-158 (2016).
  12. Brighton, C. T. Structure and Function of Growth Plate. Clin. Orthop. 22-32 (1978).
  13. Shim, K. S. Pubertal growth and epiphyseal fusion. Annals of pediatric endocrinology & metabolism. 20, 8-12 (2015).
  14. Staines, K. A., Pollard, A. S., McGonnell, I. M., Farquharson, C., Pitsillides, A. A. Cartilage to bone transitions in health and disease. J. Endocrinol. 219, R1-R12 (2013).
  15. Hunziker, E. B., Schenk, R. K., Cruzorive, L. M. Quantitation of Chondrocyte Performance in Growth-Plate Cartilage During Longitudinal Bone-Growth. Journal of Bone and Joint Surgery-American. 69A, 162-173 (1987).
  16. Breur, G. J., Vanenkevort, B. A., Farnum, C. E., Wilsman, N. J. Linear Relationship Between The Volume Of Hypertrophic Chondrocytes And The Rate Of Longitudinal Bone-Growth In Growth Plates. J. Orthop. Res. 9, 348-359 (1991).
  17. Ma, B., et al. Gene expression profiling of dedifferentiated human articular chondrocytes in monolayer culture. Osteoarthritis Cartilage. 21, 599-603 (2013).
  18. Thesingh, C. W., Burger, E. H. The role of mesenchyme in embryonic long bones as early deposition site for osteoclast progenitor cells. Dev. Biol. 95, 429-438 (1983).
  19. Scheven, B. A., Hamilton, N. J. Longitudinal bone growth in vitro: effects of insulin-like growth factor I and growth hormone. Acta endocrinologica. 124, 602-607 (1991).
  20. Coxam, V., Miller, M. A., Bowman, M. B., Miller, S. C. Ontogenesis of IGF regulation of longitudinal bone growth in rat metatarsal rudiments cultured in serum-free medium. Archives of physiology and biochemistry. 104, 173-179 (1996).
  21. Andrade, A. C., Chrysis, D., Audi, L., Nilsson, O. Methods to study cartilage and bone development. Endocr Dev. 21, 52-66 (2011).
  22. Mushtaq, T., Bijman, P., Ahmed, S. F., Farquharson, C. Insulin-like growth factor-I augments chondrocyte hypertrophy and reverses glucocorticoid-mediated growth retardation in fetal mice metatarsal cultures. Endocrinology. 145, 2478-2486 (2004).
  23. Owen, H. C., Miner, J. N., Ahmed, S. F., Farquharson, C. The growth plate sparing effects of the selective glucocorticoid receptor modulator, AL-438. Mol. Cell. Endocrinol. 264, 164-170 (2007).
  24. MacRae, V. E., Farquharson, C., Ahmed, S. F. The restricted potential for recovery of growth plate chondrogenesis and longitudinal bone growth following exposure to pro-inflammatory cytokines. J. Endocrinol. 189, 319-328 (2006).
  25. Chagin, A. S., Karimian, E., Sundstrom, K., Eriksson, E., Savendahl, L. Catch-up growth after dexamethasone withdrawal occurs in cultured postnatal rat metatarsal bones. J. Endocrinol. 204, 21-29 (2010).
  26. Haaijman, A., et al. Inhibition of terminal chondrocyte differentiation by bone morphogenetic protein 7 (OP-1) in vitro depends on the periarticular region but is independent of parathyroid hormone-related peptide. Bone. 25, 397-404 (1999).
  27. Haaijman, A., Dsouza, R. N., Bronckers, A., Goei, S. W., Burger, E. H. OP-1 (BMP-7) affects mRNA expression of type 1, II, X collagen, and matrix Gla protein in ossifying long bones in vitro. J. Bone Miner. Res. 12, 1815-1823 (1997).
  28. Staines, K. A., et al. MEPE is a novel regulator of growth plate cartilage mineralization. Bone. 51, 418-430 (2012).
  29. Kaufman, M. The atlas of mouse development. 3, Academic Press. (1992).
  30. Boskey, A. L., Roy, R. Cell Culture Systems for Studies of Bone and Tooth Mineralization. Chem. Rev. 108, 4716-4733 (2008).
  31. Minkin, C., et al. Skeletal development and formation of osteoclast-like cells from in situ progenitors in fetal mouse metatarsals cultured in chemically defined. Bone Miner. 12, 141-155 (1991).
  32. Kleinnulend, J., Veldhuijzen, J. P., Burger, E. H. Increased calcification of growth plate cartilage as a result of compressive force in vitro. Arthritis Rheum. 29, 1002-1009 (1986).
  33. Kleinnulend, J., Veldhuijzen, J. P., Vanstrien, M. E., Dejong, M., Burger, E. H. Inhibition of osteoclastic bone-resorption by mechanical stimulation in vitro. Arthritis Rheum. 33, 66-72 (1990).
  34. Dobie, R., et al. Increased linear bone growth by GH in the absence of SOCS2 is independent of IGF-1. J. Cell. Physiol. 230, 2796-2806 (2015).
  35. Heilig, J., Paulsson, M., Zaucke, F. Insulin-like growth factor 1 receptor (IGF1R) signaling regulates osterix expression and cartilage matrix mineralization during endochondral ossification. Bone. 83, 48-57 (2016).
  36. Huesa, C., et al. The functional co-operativity of tissue-nonspecific alkaline phosphatase (TNAP) and PHOSPHO1 during initiation of skeletal mineralization. Biochemistry and Biophysics Reports. 4, 196-201 (2015).
  37. Staines, K. A., et al. Endochondral Growth Defect and Deployment of Transient Chondrocyte Behaviors Underlie Osteoarthritis Onset in a Natural Murine Model. Arthritis & Rheumatology. 68, 880-891 (2016).
  38. Song, W., et al. The fetal mouse metatarsal bone explant as a model of angiogenesis. Nature Protocols. 10, 1459-1473 (2015).
  39. Libby, P., Aikawa, M. Vitamin C, collagen, and cracks in the plaque. Circulation. 105, 1396-1398 (2002).
  40. Alvarez, J., Serra, R. Unique and redundant roles of Smad3 in TGF-beta-mediated regulation of long bone development in organ culture. Dev. Dyn. 230, 685-699 (2004).
  41. Pass, C., MacRae, V. E., Huesa, C., Ahmed, S. F., Farquharson, C. SOCS2 is the critical regulator of GH action in murine growth plate chondrogenesis. J. Bone Miner. Res. 27, 1055-1066 (2012).

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