شارك في توطين علامات النسب خلية والطماطم الإشارة

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

وضعنا مجموعتين من تتبع مجموعات في Rosa26 tdtomato (أعرب بتواجد مطلق في جميع الخلايا) / لجنة المساواة العرقية (أعرب تحديدا في غضروفية) الفئران: واحد مع 2.3Col1a1-GFP (محدد لبانيات) واحد مع المناعي (محددة لخلايا العظام). وتظهر البيانات أن التحول المباشر من غضروفية في خلايا العظام.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Jing, Y., Hinton, R. J., Chan, K. S., Feng, J. Q. Co-localization of Cell Lineage Markers and the Tomato Signal. J. Vis. Exp. (118), e54982, doi:10.3791/54982 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

تم استخدام نظام تتبع الخلية النسب في الغالب في دراسات علم الأحياء التطوري. استخدام لجنة المساواة العرقية recombinase يسمح لتفعيل مراسل في خط خلية معينة وجميع ذرية. هنا، استخدمنا النسب خلية تتبع تقنية لإثبات أن غضروفية تحول مباشرة إلى الخلايا بانية العظم وخلية عظمية خلال العظام الطويلة والتنمية لقمة الفك السفلي باستخدام نوعين من لجنة المساواة العرقية، Col10a1-لجنة المساواة العرقية وAggrecan-لجنة المساواة العرقية ERT2 (AGG-لجنة المساواة العرقية ERT2)، عبرت مع Rosa26 tdTomato. وعلامات جيدا معترف بها على حد سواء Col10 وaggrecan لغضروفية.

على هذا الأساس، وضعنا نسب طريقة خلايا جديدة تتبع بالتزامن مع الفلورسنت مصير الخلايا المناعية لتحديد من خلال تحليل التعبير عن علامات معينة من الخلايا. كانت، Runx2 (علامة للخلايا المكونة للعظم في مرحلة مبكرة) والعاج المصفوفة protein1 (علامة للخلايا في وقت متأخر من مرحلة المكونة للعظم DMP1)تستخدم لتحديد خلايا العظام المستمدة من خلية غضروفية وحالة التمايز بهم. هذا المزيج يوسع ليس فقط تطبيق تتبع الخلية النسب، ولكن أيضا يبسط جيل من الفئران المجمع. الأهم من ذلك، يتم عرض الحالات عدد، والمكان، والتفريق بين ذرية الخلية الأم في وقت واحد، وتوفير مزيد من المعلومات من سلالة خلية تتبع وحدها. وفي الختام، وشارك في التطبيق من الخلايا النسب تتبع تقنيات والمناعي هو أداة قوية للتحقيق في بيولوجيا الخلايا في الجسم الحي.

Introduction

خلال التنمية، ويمثل تكوين العظام غضروفي لأكثر من 80٪ من حجم الهيكل العظمي. ويعتقد على نطاق واسع أن تبدأ مع موت الخلايا المبرمج للغضروفية التصنع. وفي وقت لاحق، والخلايا من نخاع العظام الكامنة تغزو والشروع الأوعية الدموية، تليها ترسب العظام الجديد كوسا- العظام والخلايا المشتقة السمحاق 1،2. مصير خلية من خلايا غضروفية الضخامي (المراكز الصحية)، ومع ذلك، فقد كانت قضية للنقاش على مدى عقود 3. في البداية، كانت تعتبر المراكز الصحية لتكون نهاية التمايز مسار خلية غضروفية، وموت الخلايا المبرمج كان يعتقد عموما أن يكون مصير النهائي من المراكز الصحية. الآن، يقترح بعض الباحثين أن بعض المراكز الصحية يمكن البقاء على قيد الحياة على الأقل، وتسهم في تكوين العظام غضروفي. على الرغم من أنها اقترحت أن النمو كان غضروفية لوحة القدرة على تحورها إلى بانيات بناء على التركيب الدقيق، وتلطيخ المناعى، والدراسات في المختبر 46، فإن أيا من هذه الأساليب ثيحرث نهائية في إثبات مساهمة خلية غضروفية إلى النسب بناء العظم.

توفر تقنية خلية النسب تتبع طريقة أكثر دقة لدراسة مصير الخلية. تحدث لفترة وجيزة، وهو الانزيم recombinase، وهو ما يعبر عنه فقط في نوع معين من الخلايا، ويحفز على التعبير عن الجينات المراسل. وبهذه الطريقة، وهذا النوع من الخلايا وأحفادهم وصفت بشكل دائم 7. ويستخدم نظام لجنة المساواة العرقية، loxP عادة في تتبع النسب. ولجنة المساواة العرقية (انزيم recombinase) استئصال تسلسل إيقاف بين المواقع loxP اثنين وتفعيل مراسل في خط خلية معينة (الشكل 1A). في بعض الحالات، يمكن للمحقق اختيار نقطة زمنية مواتية لتفعيل لجنة المساواة العرقية باستخدام المخدرات، مثل تاموكسيفين، مما تسبب في لجنة المساواة العرقية لصهر إلى صيغة معدلة من مستقبلات هرمون الاستروجين (لجنة المساواة العرقية ERT2) 8. أصبحت صحفيين الفلورسنت القياسية في نسب تتبع التجارب لأنها تقلل بشكل كبير من التعقيدوتحسين دقة وكفاءة مصير خلية تتبع 8،9. tdTomato ويصبح الخيار الأفضل بين صحفيين الفلورسنت لأنه لديه ألمع البروتين الفلوري وأقوى epifluorescence، مما يجعلها تصور بسهولة 7 (الشكل 1A).

باستخدام النسب Rosa26 tdTomato نظام تتبع، وقد أظهرت مجموعتنا وباحثون آخرون أن المراكز الصحية يمكن تغيير النمط الظاهري في خلايا العظام خلال تنمية 10-14. ولتحقيق ذلك، قمنا بتطوير مجموعتين من تتبع معا مع Rosa26 tdtomato (التعبير في كل مكان في كل خلايا) / لجنة المساواة العرقية (الخاصة غضروفية) الفئران: 2.3Col1a1-GFP (محددة لبانيات) والمناعي (محددة لخلايا العظام). وتظهر البيانات أن كلتا الطريقتين هي سبل ناجعة لدراسة مصير خلية في الجسم الحي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم استعراض جميع البروتوكولات التي وافقت عليها اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) في جامعة تكساس A & M جامعة طب الأسنان.

تربية 1. الحيوان

  1. استخدام ثلاثة نماذج حيوانية في هذه الدراسة. للتحقيق في مصير غضروفية جنينية في تشكيل اللقمة، أول استخدام Col10a1-لجنة المساواة العرقية 15 الفئران وعبر لهم Rosa26 tdTomato (B6، 129S6- طن (ROSA) 26Sor tm9 (CAG-tdTomato) Hze / J) الفئران للحصول على Col10a1- لجنة المساواة العرقية وRosa26 tdTomato الفئران. بعد ذلك، عبر هذه الفئران مع 2.3Col1a1-GFP الفئران 16. استخدام Col10a1-لجنة المساواة العرقية. Rosa26 tdTomato. الفئران 2.3Col1a1-GFP لأداء التجارب خلية النسب تتبع (الشكل 1B).
  2. لدراسة مصير غضروفية ما بعد الولادة، اتبع الإجراء نفسه كما في الخطوة 1.1، ولكن استخدام ERT2 Aggrecan-لجنة المساواة العرقية (AGG-لجنة المساواة العرقية ERT2) 17،18 خط والحفاظ على AGG-لجنة المساواة العرقية ERT2. Rosa26 tdTomato. الفئران 2.3Col1a1-GFP لأداء التجارب خلية النسب تتبع (الشكل 1C). حقن عقار تاموكسيفين في يوم ما بعد الولادة 14.
  3. الجمع بين النسب خلية تتبع تقنية مع المناعي، عبر الفئران AGG-لجنة المساواة العرقية ERT2 والفئران Rosa26 tdTomato. استخدام الفئران التي تحمل كل الجينات في التجربة وحقن عقار تاموكسيفين في يوم ما بعد الولادة 3 (1D الشكل).

2. تحضير المواد

  1. حل مسحوق تاموكسيفين في 10٪ من الإيثانول و 90٪ زيت الذرة بتركيز 10 ملغ / مل. جرعة للحقن هي 75 ملغم / كغم.
  2. حل مسحوق امتصاص العرق (PFA) في برنامج تلفزيوني إلى تركيز 4٪، وذلك باستخدام 2 M هيدرات الصوديوم لضبط قيمة الرقم الهيدروجيني إلى 7.4. استخدام 4٪ PFA حل لإصلاح الأنسجة (تستخدم في قمة الفك السفلي والساق الخلفية هنا) بعد التضحية. بسبب ذلكسمية، والتعامل مع PFA في غطاء محرك السيارة مع قفازات وقناع.
  3. حل مسحوق EDTA في الماء المقطر لتركيز 10٪، وذلك باستخدام 2 M هيدرات الصوديوم لضبط قيمة الرقم الهيدروجيني إلى 7.4. استخدام 10٪ EDTA ليزيل الكلس في قمة الفك السفلي والساق الخلفية.
  4. حل مسحوق السكروز في برنامج تلفزيوني بتركيزات 15٪ و 30٪. استخدام محلول السكروز إلى يذوى الأنسجة بعد زوال الكلس.
  5. حل مسحوق هيالورونيداز في برنامج تلفزيوني بتركيز 2 ملغ / مل، ودرجة الحموضة 5.0. هذا الحل هو لاسترجاع المناعي المستضد.
  6. استخدام أنبوب 1.5 مل لإعداد عرقلة الحل الذي يحتوي على 3٪ زلال المصل البقري (BSA)، و 20٪ مصل الماعز في برنامج تلفزيوني لتلطيخ Runx2 أو DMP1 مناعي.
  7. استخدام أنبوب 1.5 مل لإعداد حل الأجسام المضادة الأولية التي تحتوي على 2٪ مصل الماعز في برنامج تلفزيوني لتلطيخ Runx2 أو DMP1 مناعي. تركيز الأجسام المضادة الأولية هو 1: 400 Runx2 و 1: 100 للDMP1.
  8. استخدام أنبوب 1.5 مل لإعدادالحل أرنب مفتش مثل التحكم لتلطيخ مناعي لتجنب نتائج إيجابية كاذبة. يحتوي الحل 2٪ مصل الماعز في برنامج تلفزيوني. تركيز مفتش أرنب للسيطرة Runx2 هو 1: 400. لDMP1، 1: 100. أداء تجربة والسيطرة تلطيخ في وقت واحد.
  9. استخدام أنبوب 1.5 مل لإعداد حل الضد الثانوية التي تحتوي على 2٪ مصل الماعز في برنامج تلفزيوني لتلطيخ Runx2 أو DMP1 مناعي. استخدام الأجسام المضادة الثانوية في التخفيف من 1: 500.

3. شريحة التحضير للمتحد البؤر المجهري (سلالته خلية تتبع فقط، لا المختلط مع المناعي)

  1. حقن عقار تاموكسيفين في AGG-لجنة المساواة العرقية ERT2 الفئران في نقطة زمنية ملائمة.
    1. أولا، إزالة الماوس من قفصه. ثم، استخدم اليسار الإبهام والسبابة للاستيلاء على الجلد على الجزء الخلفي من الماوس وتحويل أكثر من ذلك، وتعريض البطن. استخدام اليد اليمنى لاجراء الحقنة. نقطة الدخول المثلى للحقن هي على لترتقنية الحرية النفسية أو الجانب الأيمن من خثل، وتجنب الكبد والمثانة.
    2. الحفاظ على بالتوازي حقنة إلى رجليه الخلفيتين من الماوس وحقن داخل الصفاق. جرعة للحقن هي 75 ملغم / كغم. أوزان الفئران في عمر 2 أسابيع، 3 أسابيع و 4 أسابيع من العمر ما يقرب من 7-9 جرام، 11-13 جرام، و16-18 غرام على التوالي.
  2. تخدير الفئران مع مزيج زيلازين / Ketaset.
    1. لإعداد حل العاملة، أولا تمييع زيلازين وKetaset مع الماء المقطر لتركيز 1 ملغ / مل و 5 ملغ / مل على التوالي. بعد ذلك، خلط زيلازين وKetaset في نسبة 1: 2. جرعة للحقن 30 ميكرولتر / ز.
    2. حقن كما في الخطوة 3.1. تأكيد التخدير بواسطة معسر الكاحل الفأر. الفأر هو فاقد الوعي إذا كان لديه أي رد فعل.
  3. يروي الفئران مع PFA 4٪ بعد التخدير.
    1. بعد يفقد وعيه الماوس، وتحديد أربع أرجل من الماوس على لوحة لentirelذ فضح البطن.
    2. تشبع البطن مع الايثانول 70٪ وجعل الختان من أسفل البطن في الرقبة على طول خط الوسط. قرصة في وقت واحد سحب الجلد إلى الجانبين الجانبية للكشف عن غشاء البريتوني. استخدام مقص تشريح لجعل الختان الطولي.
    3. قطع وإزالة الأضلاع الأمامية لفضح القلب. ثقب في القلب من البطين الأيسر مع G حقنة 22، أمسك حقنة، وفي الوقت نفسه خفض فتحة في الأذن اليمنى.
    4. ببطء حقن PFA 4٪، وهو perfused على نظام القلب والأوعية الدموية في حين أن تمسح الدم من على قطع من الأذن اليمنى. حجم PFA لنضح 1 مل / جرام. تنفيذ هذه الخطوة في الدرجة الأولى لمجلس الوزراء السلامة البيولوجية التي من الصعب-أنبوبي لبناء نظام العادم.
  4. تقشر الجلد الماوس، ووضع الجسم كله في أنبوب الطرد المركزي البولي بروبلين 50 مل الذي يحتوي 40 مل من 4٪ PFA لإصلاح بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  5. استخدام مقص تشريح ورقم 3 ورقم 5 الملقط لإزالة بعناية الفك السفلي والساق الخلفية من الجسم وإزالة العضلات والأوتار على السطح. تنفيذ هذه الخطوة في الدرجة الأولى لمجلس الوزراء السلامة البيولوجية التي من الصعب-أنبوبي لبناء نظام العادم.
  6. قطع الفك السفلي إلى قطعتين في المنطقة البعيدة من الضرس الثالث. وبالمثل، وقطع عظم الفخذ والساق في midshaft لفضح تجويف نخاع العظام من أجل تسريع زوال الكلس. وضع الجزء الذي يتضمن عملية اللقمة وقمي وجنبا إلى جنب مع الساق الخلفية إلى 40 مل من EDTA 10٪ ليزيل الكلس في 4 درجة مئوية لمدة 2-4 أيام في أنبوب البولي بروبلين الطرد المركزي 50 مل.
  7. استخدام 50 مل من 15٪ سكروز إلى يذوى اللقمة والساق الخلفية بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في أنبوب البولي بروبلين الطرد المركزي 50 مل.
  8. استخدام 30٪ سكروز إلى يذوى اللقمة والساق الخلفية بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في 50 مل أنبوب البولي بروبلين الطرد المركزي.
  9. على المستوى السهمي، تضمين العينة معأكتوبر على لوحة القطع في الجهاز cryosection.
    1. وضع أفقي اللقمة أو الساق الخلفية في قالب المتصاعدة. غمر النسيج في أكتوبر وترك الأمر في الجهاز cryosection حتى تجمد أكتوبر
    2. جبل كتلة أكتوبر على لوحة القطع. انتظر حوالي 15 دقيقة قبل التقطيع للتأكد من أن أكتوبر هو المجمدة تماما.
  10. قطع اللقمة والساق الخلفية إلى أقسام 10 ميكرون. جمع المقاطع على الشرائح ومخزن في -20 درجة مئوية.
  11. احتضان الشريحة في C الغرفة 37 درجة لإزالة الماء قبل تلطيخ.
  12. تغسل الشرائح مرتين مع الماء المقطر لمدة 5 دقائق.
  13. تمحو الماء حول كل قسم. استخدام حاجز القلم مسعور لدائرة الفروع وإسقاط دابي أو غير الإستشعاع حل تصاعد مكافحة تتلاشى في الدائرة. وضع بعناية أسفل انزلاق الغطاء.

4. المناعى تلطيخ للRunx2 وDMP1

ملاحظة: الاشتراكات مفتشالمحول المتعدد العادي هو ضروري لتلطيخ المناعى لتجنب إشارات إيجابية كاذبة. تلطيخ للمجموعات التجريبية والضابطة يحتاج إلى أن يقوم في وقت واحد.

  1. احتضان الشرائح في C الغرفة 37 درجة لإزالة الماء قبل تلطيخ.
  2. تغسل الشرائح مرتين مع الماء المقطر.
  3. استخدام حاجز القلم مسعور إلى دائرة جميع أقسام على الشريحة. من هذه الخطوة، إضافة كل من الحل مستعد في دائرة لتغطية كامل أقسام.
  4. علاج المقاطع مع هيالورونيداز في غرفة رطبة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. حجم من الحل (في الخطوات 4،5-4،8) يعتمد على حجم القسم. استخدام 50 ميكرولتر من حل لاللقمة و 100 ميكرولتر من أجل العظام الطويلة. يغسل PBST (PBS التي تحتوي على 0.1٪ توين 20) ثلاث مرات.
  5. إعداد وتطبيق عرقلة الحل لكل قسم واحتضان لهم في غرفة رطبة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  6. احتضان المقاطع مع الابتدائيحل الأجسام المضادة (Runx2 أرنب لمكافحة فأر، أو أرنب لمكافحة فأر DMP1) في 4 درجات مئوية خلال الليل. يغسل مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات.
  7. احتضان المقاطع مع حل الضد الثانوية (الماعز المضادة للأرنب، اليكسا فلور 488) لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة. يغسل مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات.
  8. تمحو الماء حول القسم وإسقاط دابي في دائرة لتغطية القسم على الشريحة. وضع بعناية أسفل انزلاق الغطاء.

5. متحد البؤر المجهري

  1. التقاط الصور خلية فلوري باستخدام مجهر متحد البؤر عند أطوال موجية تتراوح بين 488 ميكرون (الأخضر) إلى 561 ميكرون (الحمراء). أخذ صور متعددة مكدسة في 200 هرتز (أبعاد 1024 × 1024) 19 باستخدام 10X، 20X، 63X والعدسات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

غضروفية تحويل مباشرة إلى خلايا العظام (بانيات وخلية عظمية) في الفك السفلي اللقمة وطويل العظام.

Aggrecan، جين حاسم لتكون الغضروف، يعبر عنها بشكل رئيسي في غضروفية مبكرة وناضجة 18. ونتيجة لذلك، فإن حقن عقار تاموكسيفين في 2 أسابيع من العمر في AGG-لجنة المساواة العرقية ERT2. تنشيط الفئران Rosa26 tdTomato مراسل الأحمر الطماطم في كل غضروفية وخلايا ابنتهما. أعطى خط 2.3Col1a1-GFP أدى إلى اللون الأخضر الاستشعاع في الكولاجين 1، معربا عن خلايا العظام، وتحديدا الخلايا بانية العظم وقبل خلية عظمية. وأشار اللون الأصفر (الأحمر جنبا إلى جنب مع الأخضر) وجود خلايا العظام المستمدة من خلية غضروفية أن أعرب عن الجينات الكولاجين 1. في الشكل 2A، فإن معظم الخلايا العظمية في عملية قمي تحت الغضروف كانت حمراء أو ذellow (أ الخلايا الحمراء التي بدأت تفرز الأخضر الاستشعاع Col1a1، وبالتالي تظهر الأصفر عندما تم فرضه على fluorophores اثنين). وقدمت هذه النتائج دليلا قويا على أن هذه الخلايا العظمية وقد استمدت من غضروفية. وقد لوحظت نتائج مماثلة أيضا أثناء نمو العظام الطويلة، حيث تم اشتقاق معظم خلايا العظم من غضروفية في كل من الكردوس (الشكل 2B) والكردوس (الشكل 2C).

لمزيد من التحقيق في هذه النتائج، عبرنا الفئران Col10al-لجنة المساواة العرقية مع Rosa26 tdTomato. الفئران 2.3Col1a1-GFP. Col10a1 هو علامة محددة للغاية لالهيدروجيني، أعرب فقط في المراكز الصحية وأحفادهم. وعلاوة على ذلك، Col10a1-لجنة المساواة العرقية هو غير محرض، الأمر الذي يعكس تمايز الخلايا من بداية Col10a1 التعبير (في E14.5). في الترابيق بالقرب من واجهة الغضاريف والعظام (مستوى متفوق) من العمر 3 أسابيع الفئران والأحمر والصورةكانت لى بعد خلايا الاستشعاع الصفراء الغالبة، في حين أن خلايا الاستشعاع الخضراء النادرة. في منطقة أكثر قليلا أدنى (المستوى المتوسط)، وكانت الغالبية العظمى من خلايا الاستشعاع الأصفر، مع عدد أقل قليلا أحمر الاستشعاع. ظهرت خلايا الاستشعاع الخضراء للسيطرة فقط في المنطقة الأكثر أدنى من عملية لقمي (مستوى أدنى) (الشكل 3)، وهذا يشير إلى الاتجاه الذي النمو قمي وساهم في الغالب من قبل خلايا العظام تحولت من المراكز الصحية. توزيع الخلايا الاستشعاع الحمراء والخضراء في عملية قمي يتسق أيضا مع اتجاه أدنى إلى أعلى من النمو قمي.

يوضح تقنية خلية النسب تتبع بوضوح أن موت الخلايا المبرمج هو ليس مصير الوحيد لالمراكز الصحية. كل من خطوط AGG-لجنة المساواة العرقية ERT2 وCol10a1-لجنة المساواة العرقية تشير إلى أن خلايا العظام المستمدة من خلية غضروفية هي المصدر الرئيسي لنمو العظام في عملية قمي وفي الكردوسوالكردوس في العظام الطويلة.

شارك في تطبيق مناعي تلطيخ وتتبع النسب خلية تمكن من تتبع من تمايز الخلايا.

ويمكن أيضا أن تتبع تقنية خلية النسب تكون مجتمعة مع المناعية الفلورية لتحديد نوع الخلية عن طريق الكشف عن علامة خلية محددة. هذا الأسلوب لديه العديد من المزايا لدراسة مصير الخلية. أولا، يمكن للباحث لا يزال تحديد خصائص الخلايا عن طريق تحديد علامات المناسبة، حتى من دون خط GFP الماوس محدد، الذي يوسع تطبيق لنسب خلية تتبع تقنية. ثانيا، فإنه يبسط جيل من الفئران المجمع. على سبيل المثال، نحن بحاجة فقط لتوليد AGG-لجنة المساواة العرقية ERT2. Rosa26 tdTomato الفئران مجمع لإنتاج اللون الأحمر بعد تفعيل لجنة المساواة العرقية (في يوم ما بعد الولادة 3)، بدلا من إنشاء AGG-لجنة المساواة العرقيةERT2. 2.3Col1a1-GFP. Rosa26 tdTomato الفئران، الأمر الذي يتطلب المزيد من الصلبان.

في هذه الدراسة، اخترنا اثنين من الأجسام المضادة للتلوين مناعي. كان واحدا ضد Runx2، وهو عامل نسخ حاسما خلال نضوج بناء العظم (المرحلة المبكرة من الخلايا المكونة للعظم)؛ كان البعض ضد DMP1، وأعرب في خلية عظمية ناضجة (المرحلة المتأخرة من الخلايا المكونة للعظم). في الشكل (4)، يمثل مخضر وRunx2 أو DMP1 التعبير الأجسام المضادة في عملية قمي القديمة 2-أسابيع. في الشكل 4A، ثلاثة أنواع من الخلايا الملونة في العظم تحت الغضروف موجودة. اللون الأصفر (استعلاء مضان أحمر وأخضر) في النواة يمثل خلايا العظام المستمدة من خلية غضروفية معربا عن Runx2، مشيرا إلى أن هذه الخلايا كانت بانيات غير ناضجة على سطح العظم. وبالإضافة إلى ذلك، كان هناك الحمراء الاستشعاع خلايا العظام التي لم يبد Runx2 (و الحمراءluorescence دون الخضراء فرضه). وتمثل هذه الخلايا خلايا العظام المستمدة من خلية غضروفية ناضجة في مصفوفة العظام. وكانت أقل زنزانات مشتركة ذوي نوى الاستشعاع الخضراء فقط، مشيرا إلى الخلايا المستمدة من العظام غير خلية غضروفية، مع التعبير Runx2 أو التحول الذي حدث قبل تفعيل لجنة المساواة العرقية. وتشير الصورة التي الخلايا العظمية الحمراء والذين يعانون من نوى الصفراء كانت السكان الخلية الأغلبية التي تسهم في تكوين العظام تحت الغضروف اللقمة.

من ناحية أخرى، كان تقريبا كل الحمراء، المشتقة من خلية غضروفية الخلايا العظمية في مصفوفة العظام تلطيخ DMP1 حول الهيئات المحمولة الخاصة بهم. كانت قليلة خلية عظمية إيجابية لDMP1 لكنها تفتقر إلى أجسام الخلايا الحمراء (الشكل 4B). هناك أيضا اثنين من التفسيرات المحتملة لهذه الخلايا: إما أنها الخلايا المستمدة من العظام غير خلية غضروفية، أو أنهم خلايا العظام المستمدة من خلية غضروفية التي حولت قبل حقن تاموكسيفين. وبالإضافة إلى ذلك، أي خلايا العظام الحمراءعلى سطح العظم أعرب DMP1، مشيرة إلى أنها لم تنضج خلية عظمية.

أخذت معا، فإن البيانات من التعبير أنماط كلا إرل- (Runx2) وعلامات في وقت متأخر من مرحلة (DMP1) من الخلايا المكونة للعظم متسقة مع نتائج السابقة باستخدام لجنة المساواة العرقية جنبا إلى جنب مع 2.3Col1a1-GFP. وهذه البيانات تظهر أن الجمع بين المناعي وRosa26 tdTomato البحث عن المفقودين هو وسيلة جيدة لدراسة مصير الخلية. الأهم من ذلك، أن المحققين يميز نوع من الخلايا، وتحديد مرحلة التمايز، ومراقبة أعداد الخلايا تحولت في وقت واحد باستخدام المناعي مع علامات مختلفة، والتي توفر المزيد من المعلومات من Rosa26 tdTomato تتبع وحدها.

شكل 1
الشكل 1. آلية النسب خلية تتبع والعشرينالبريد جيل من الفئران مجمع. أ) يتم استخدام نظام لجنة المساواة العرقية، loxP عادة في تتبع النسب. لجنة المساواة العرقية المكوس تسلسل إيقاف بين المواقع loxP اثنين، والبروتين tdTomato (الاستشعاع أحمر) يتم التعبير بشكل دائم في خط خلية معينة. ب) المذكورة ثلاثة نماذج حيوانية في هذه الورقة. استخدمنا 2.3 Col1a1-GFP. الفئران Rosa26 tdTomato وعبروا لهم الفئران Col10a1-لجنة المساواة العرقية. Col10a1-لجنة المساواة العرقية هو غير محرض، الأمر الذي يعكس تمايز الخلايا من بداية Col10a1 التعبير (في E14.5). C) Aggrecan-لجنة المساواة العرقية ERT2 (AGG-لجنة المساواة العرقية ERT2) هو خط لجنة المساواة العرقية أخرى عبرت أيضا مع 2.3Col1a1-GFP. الفئران Rosa26 tdTomato. تم تفعيل لجنة المساواة العرقية في 2 أسابيع من العمر من قبل حقن تاموكسيفين (تيم: تاموكسيفين). D) من أجل الجمع بين المناعي مع تتبع الخلية النسب، ولدت لنا AGG-لجنة المساواة العرقية ERT2. <م> الفئران Rosa26 tdTomato، تفعيل لجنة المساواة العرقية في يوم ما بعد الولادة 3، وأنجز Runx2 وDMP1 المناعي (تيم: تاموكسيفين). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. التحول من غضروفية لخلايا العظام (بانيات وخلية عظمية) في الفك السفلي اللقمة وطويل العظام عن طريق AGG-لجنة المساواة العرقية ERT2. 2.3Col1a1-GFP. Rosa26 tdTomato الفئران مجمع. أ) تم تفعيل لجنة المساواة العرقية التي كتبها تاموكسيفين في يوم ما بعد الولادة 14، وتمت التضحية الفئران في 4 أسابيع من العمر. كانت هناك ثلاث خلايا الملونة في قمية عملية: الأحمر النقي (خلايا العظام المستمدة من خلية غضروفية) والأصفر (الأحمر جنبا إلى جنب مع الأخضر، مشيرا إلى خلايا العظام المستمدة من خلية غضروفية أن أعرب عن الجينات الكولاجين 1)، والأخضر النقي (غير خلية غضروفية المشتقة من خلايا العظام مع الجين الكولاجين 1) . وكان معظم الخلايا العظمية في عملية قمي تحت الغضروف الأصفر أو الأحمر الخالص (السهام البيضاء)، في حين أن عدد قليل من خلايا العظام الخضراء (الأسهم الزرقاء). وتوفر هذه البيانات دليلا قويا على أن غضروفية تحويل مباشرة إلى خلايا العظام والمساهمة في تشكيل عملية قمي خلال تنمية (تيم: تاموكسيفين؛ C: الغضروف، ب: عظم). B، C) وغالبية خلايا العظام في الكردوس والكردوس كانت خلية غضروفية المشتقة (السهم الأبيض: خلايا العظام تتحول خلية غضروفية باللون الأصفر أو الأحمر الخالص، الأزرق السهم: خلايا العظام غير مشتقة خلية غضروفية في الخالص الخضراء، AC: مفصلي الغضروف، GP: ​​لوحة النمو).على بياض "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure3
الشكل 3. التحول من غضروفية لخلايا العظام في الفك السفلي اللقمة عن طريق Col10al-لجنة المساواة العرقية. 2.3Col1a1-GFP. Rosa26 tdTomato الفئران مجمع. أ) في عملية قمي من فئران عمرها 3 أسابيع، كانت خلايا العظام الخضراء أقلية متميزة في الترابيق بالقرب من واجهة الغضاريف والعظام (مستوى أعلى، A1)، في حين الأحمر وكانت بعض الخلايا الصفراء الغالبة. في المستوى المتوسط (A2)، كانت خلايا صفراء في الأغلبية، مع خلايا الدم الحمراء أقل قليلا. ظهرت خلايا خضراء لتكون في غالبية فقط في المنطقة الأكثر أدنى (A3). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4. المشارك توطين اثنين من العلامة الخلايا المكونة للعظم مع الخلفية لتعقب النسب في عملية اللقمة عن طريق القديم 2-أسابيع AGG-لجنة المساواة العرقية ERT2. Rosa26 tdTomato الفئران المركبة. أ) اللون الأصفر في نوى الخلايا العظمية يمثل المستمدة من خلية غضروفية معربا عن Runx2 (السهام البيضاء) على سطح العظم التربيقي تحت الغضروف اللقمة. خلايا العظام حمراء نقية بدون التعبير Runx2 تمثل خلايا العظام المستمدة من خلية غضروفية ناضجة في مصفوفة العظام (الأسهم الصفراء). وfeweكانت خلايا الحادي وأولئك الذين يحملون نوى الخضراء الوحيدة، التي تمثل خلايا العظام المستمدة إما غير خلية غضروفية أو الخلايا العظمية تحولت من غضروفية قبل تفعيل لجنة المساواة العرقية (تيم: تاموكسيفين). ب) في العظام تربيقية تحت الغضروف اللقمة، نفذت تقريبا كل الحمراء المشتقة من خلية غضروفية الخلايا العظمية في مصفوفة العظام DMP1 تلطيخ حول الهيئات الخليوي (السهام البيضاء). فقط عدد قليل من خلية عظمية كانت إيجابية للDMP1 ولكنها تفتقر إلى اللون الأحمر في الهيئات الخليوي (الأسهم الصفراء). هناك احتمالان لهذه الخلايا: خلايا العظام المستمدة غير خلية غضروفية أو خلايا العظام المستمدة من خلية غضروفية الناشئة قبل الحقن تاموكسيفين. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

بسبب القيود التكنولوجية، فمن الصعب دائما للتحقيق في سلوك الخلايا في الجسم الحي. ومع ذلك، فإن تقنية خلية النسب تتبع يبرهن على أن تكون أداة قوية لدراسة بيولوجيا الخلية 7-9. في هذه الدراسة، ونحن زيادة تحسين هذا البروتوكول من خلال الجمع بين ذلك مع المناعي. وبهذه الطريقة، يمكن تعريف مصير الخلية علامات المتعددة ذات الصلة، التي توسع تطبيق تتبع النسب. وعلاوة على ذلك، هذا التعاون توطين المناعي والطماطم إشارة يعرض في وقت واحد عدد من سلالة الخلية مؤسس، وموقعها، وحالة التمايز، وتوفير المزيد من المعلومات من سلالة خلية تتبع وحدها. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام علامات خلية محددة تبسيط جيل من الفئران مركب، والإسراع في التحقيق.

خصوصية لجنة المساواة العرقية هو أمر حاسم لإسناد لا لبس فيه من النسب ودقة 20،21 النتائج. ومن ايم جداportant لتحديد خطوط لجنة المساواة العرقية المناسبة للتحقق من مصير الخلية. في هذه الدراسة، اخترنا Col10a1، لأنه يعتبر علامة محددة لغضروفية الضخامي 10،11، وaggrecan، لأنه هو أيضا علامة معروفة تماما للغضروفية 18. وهناك أيضا نماذج لجنة المساواة العرقية جيدة تستخدم في مجالات أخرى. خط Scleraxis-لجنة المساواة العرقية (SCX-لجنة المساواة العرقية)، على سبيل المثال، هو مفيد في وتر والبحوث الرباط منذ scleraxis هو الحلزون حلقة حلزون عاملا أساسيا النسخ الذي هو علامة للحصول على وتر والرباط خلية النسب 22. ودعا لجنة المساواة العرقية آخر يستخدم DMP1-لجنة المساواة العرقية عادة في الدراسات skeleton- والمتعلقة الأسنان لDMP1 وأعرب للغاية في الخلايا المولدة للعاج وخلية عظمية 23،24.

مقارنة مع أنظمة لجنة المساواة العرقية غير محرض، وتفعيل محرض لجنة المساواة العرقية يمكن تقييد مكانيا وزمانيا 20. ومع ذلك، ينبغي النظر في بعض القيود عند تصميم التجربة وتفسير نتائجنماذج لجنة المساواة العرقية محرض. أولا، جرعة من عقار تاموكسيفين قد تتغير كفاءة تفعيل لجنة المساواة العرقية وعدد من الخلايا المسمى. والجرعات المنخفضة تسمية السكان من الاهتمام في مناطق ذات كثافة نسيلي 25. جرعات عالية يمكن أن يصنف بركة السلف كامل 7،26. وبالتالي، يجب اختيار الجرعة تبعا للغرض من هذه التجربة. ثانيا، تاموكسيفين لديها السمية المحتملة، وخاصة في الجرعات العالية 27،28. لهذا السبب، فمن الأفضل لتقليل الجرعة لتجنب الإجهاض في وقت متأخر الأجل عند حقن أثناء الحمل 29.

وفي الختام، وشارك في التطبيق من الخلايا النسب تتبع تقنيات والمناعي هو أداة قوية للتحقيق في بيولوجيا الخلايا في الجسم الحي. في المستقبل، يمكن أن المحققين يحاولون أداء في وقت واحد المناعي مع اثنين من الأجسام المضادة المختلفة على خلفية إشارة الطماطم. هذه الطريقة يمكن أن تظهر نمط التعبير عن اثنين علامات في مقطع واحد، مما يجعل من الاسهل لمحقق للمقارنة وتحليل النتائج. وعلاوة على ذلك، هذا التعاون التطبيق يمكن تحسينها من قبل في المناعي الموقع لتقليل تلطيخ غير محددة قد تكون موجودة من خلال المناعي التقليدي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tamoxifen  Sigma T5648 activate the Cre event 
Paraformaldehyde Sigma  P6148 fix the sample
Ethylenediaminetetraacetic acid Alfa Aesar A10713 decalcify the hard tissue
Sucrose  Sigma S0389 dehydrate the tissue
Hyaluronidase from bovine testes  Sigma H4272 retrieve antigen for immunochemical staining
Bovine serum albumin Sigma  A3059 blocking solution 
primary antibody for Runx2  Cell Signal D1L7F primary antibody for immunochemical staining
primary antibody for DMP1 provided by Dr. Chunlin Qin primary antibody for immunochemical staining
anti-rabbit IgG Sigma 18140 control for immunochemical staining
secondary antibody  Invitrogen A11008 second antibody for immunochemical staining
OCT Tissue-Tek 4583 embed the sample for frozen section
Tween 20 Fisher Scientific BP337 PBST
non-fluorescing antifade mountant Life technologies P36934 mounting slides
DAPI Life technologies P36931 nuclear staining
Hydrophobic Barrier Pen Vector Laboratories circle the section on the slide for for immunochemical staining 
Xylazine AnaSed anesthetization 
Ketaset  Zoetis anesthetization 
cryosection machine Leica CM1860 UV
confocal microscope Leica DM6000 CFS 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gibson, G. Active role of chondrocyte apoptosis in endochondral ossification. Microsc Res Tech. 43, (2), 191-204 (1998).
  2. Kronenberg, H. M. Developmental regulation of the growth plate. Nature. 423, (6937), 332-336 (2003).
  3. Shapiro, I. M., Adams, C. S., Freeman, T., Srinivas, V. Fate of the hypertrophic chondrocyte: microenvironmental perspectives on apoptosis and survival in the epiphyseal growth plate. Birth Defects Res C Embryo Today. 75, (4), 330-339 (2005).
  4. Kahn, A. J., Simmons, D. J. Chondrocyte-to-osteocyte transformation in grafts of perichondrium-free epiphyseal cartilage. Clin Orthop Relat Res. (129), 299-304 (1977).
  5. Roach, H. I. Trans-differentiation of hypertrophic chondrocytes into cells capable of producing a mineralized bone matrix. Bone Miner. 19, (1), 1-20 (1992).
  6. Park, J., et al. Dual pathways to endochondral osteoblasts: a novel chondrocyte-derived osteoprogenitor cell identified in hypertrophic cartilage. Biol Open. 4, (5), 608-621 (2015).
  7. Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148, (1-2), 33-35 (2012).
  8. Humphreys, B. D., DiRocco, D. P. Lineage-tracing methods and the kidney. Kidney Int. 86, (3), 481-488 (2014).
  9. Romagnani, P., Rinkevich, Y., Dekel, B. The use of lineage tracing to study kidney injury and regeneration. Nat Rev Nephrol. 11, (7), 420-431 (2015).
  10. Yang, G., et al. Osteogenic fate of hypertrophic chondrocytes. Cell Res. 24, (10), 1266-1269 (2014).
  11. Yang, L., Tsang, K. Y., Tang, H. C., Chan, D., Cheah, K. S. Hypertrophic chondrocytes can become osteoblasts and osteocytes in endochondral bone formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, (33), 12097-12102 (2014).
  12. Jing, Y., et al. Chondrocytes Directly Transform into Bone Cells in Mandibular Condyle Growth. J Dent Res. 94, (12), 1668-1675 (2015).
  13. Zhou, X., von der Mark, K., Henry, S., Norton, W., Adams, H., de Crombrugghe, B. Chondrocytes transdifferentiate into osteoblasts in endochondral bone during development, postnatal growth and fracture healing in mice. PLoS Genet. 10, (12), (2014).
  14. Purcell, P., Trainor, P. A. The Mighty Chondrocyte: No Bones about It. J Dent Res. 94, (12), 1625-1627 (2015).
  15. Gebhard, S., et al. Specific expression of Cre recombinase in hypertrophic cartilage under the control of a BAC-Col10a1 promoter. Matrix Biol. 27, (8), 693-699 (2008).
  16. Kalajzic, Z., et al. Directing the expression of a green fluorescent protein transgene in differentiated osteoblasts: comparison between rat type I collagen and rat osteocalcin promoters. Bone. 31, (6), 654-660 (2002).
  17. Akiyama, H., et al. Osteo-chondroprogenitor cells are derived from Sox9 expressing precursors. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, (41), 14665-14670 (2005).
  18. Henry, S. P., et al. Generation of aggrecan-CreERT2 knockin mice for inducible Cre activity in adult cartilage. Genesis. 47, (12), 805-814 (2009).
  19. Ren, Y., Lin, S., Jing, Y., Dechow, P. C., Feng, J. Q. A novel way to statistically analyze morphologic changes in Dmp1-null osteocytes. Connect Tissue Res. 55, 129-133 (2014).
  20. Pest, M. A., Beier, F. Developmental biology: Is there such a thing as a cartilage-specific knockout mouse? Nat Rev Rheumatol. 10, (12), 702-704 (2014).
  21. Tsang, K. Y., Chan, D., Cheah, K. S. Fate of growth plate hypertrophic chondrocytes: death or lineage extension? Dev Growth Differ. 57, (2), 179-192 (2015).
  22. Sugimoto, Y., Takimoto, A., Hiraki, Y., Shukunami, C. Generation and characterization of ScxCre transgenic mice. Genesis. 51, (4), 275-283 (2013).
  23. Feng, J. Q., et al. Generation of a conditional null allele for Dmp1 in mouse. Genesis. 46, (2), 87-91 (2008).
  24. Lu, Y., Xie, Y., Zhang, S., Dusevich, V., Bonewald, L. F., Feng, J. Q. DMP1-targeted Cre expression in odontoblasts and osteocytes. J Dent Res. 86, (4), 320-325 (2007).
  25. Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland. Nature. 506, (7488), 322-327 (2014).
  26. Blanpain, C., Simons, B. D. Unravelling stem cell dynamics by lineage tracing. Nat Rev Mol Cell Biol. 14, (8), 489-502 (2013).
  27. Huh, W. J., Khurana, S. S., Geahlen, J. H., Kohli, K., Waller, R. A., Mills, J. C. Tamoxifen induces rapid, reversible atrophy, and metaplasia in mouse stomach. Gastroenterology. 142, (1), 21-24 (2012).
  28. Lee, M. H., Kim, J. W., Kim, J. H., Kang, K. S., Kong, G., Lee, M. O. Gene expression profiling of murine hepatic steatosis induced by tamoxifen. Toxicol Lett. 199, (3), 416-424 (2010).
  29. Nakamura, E., Nguyen, M. T., Mackem, S. Kinetics of tamoxifen-regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreER(T) to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton. Dev Dyn. 235, (9), 2603-2612 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics