Co-localisation des marqueurs de cellules de la lignée et le signal de tomate

Developmental Biology

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Summary

Nous avons développé deux ensembles de traçage des combinaisons dans Rosa26 tdTomato (ubiquitaire exprimé dans toutes les cellules) / Cre (spécifiquement exprimé dans les chondrocytes) souris: une avec 2.3Col1a1-GFP (spécifique à ostéoblastes) et une avec immunofluorescence (spécifique aux cellules osseuses). Les données démontrent la transformation directe des chondrocytes dans les cellules osseuses.

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Jing, Y., Hinton, R. J., Chan, K. S., Feng, J. Q. Co-localization of Cell Lineage Markers and the Tomato Signal. J. Vis. Exp. (118), e54982, doi:10.3791/54982 (2016).

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Abstract

Le système de traçage de la lignée cellulaire a été utilisé principalement dans les études de biologie du développement. L'utilisation de la recombinase Cre permet l'activation du rapporteur dans une lignée cellulaire spécifique et toute la descendance. Ici, nous avons utilisé la lignée cellulaire de traçage technique pour démontrer que les chondrocytes transforment directement en ostéoblastes et ostéocytes pendant os long et le développement de condyle mandibulaire en utilisant deux types de Cre, Col10a1-Cre et Aggrecan-Cre ERT2 (Agg-Cre ERT2), traversé avec Rosa26 tdTomato. Les deux col10 et aggrécane sont des marqueurs bien reconnus pour chondrocytes.

Sur cette base, nous avons développé une nouvelle lignée méthode cellules traçage en conjonction avec fluorescent cellule sort immunohistochimie à définir en analysant l'expression de marqueurs cellulaires spécifiques. Runx2 (un marqueur pour les cellules ostéogéniques stade précoce) et la dentine matrice protein1 (DMP1; un marqueur pour les cellules ostéogéniques en fin de ligne) étaientutilisé pour identifier les cellules osseuses chondrocytes dérivés et leur état de différenciation. Cette combinaison non seulement élargit l'application de la lignée cellulaire traçage, mais simplifie également la génération de souris composés. Plus important encore, les statuts nombre, l'emplacement et la différenciation des descendants de la cellule mère sont affichées simultanément, fournissant plus d'informations que la lignée cellulaire de traçage seul. En conclusion, la co-application de la lignée cellulaire techniques de traçage et immunofluorescence est un outil puissant pour étudier la biologie des cellules in vivo.

Introduction

Pendant le développement, la formation osseuse endochondrale représente plus de 80% du volume du squelette. Il est largement admis qu'il commence par l'apoptose des chondrocytes hypertrophiques. Ensuite, les cellules de la moelle osseuse sous - jacente envahir et d' initier une angiogenèse, suivie par le dépôt osseux nouveau par marrow- osseuse et les cellules dérivées de 1,2 périoste. Le destin cellulaire de chondrocytes hypertrophiques (HCS), cependant, a été un sujet de débat depuis des décennies 3. Dans un premier temps, CAH ont été considérés comme la fin de la voie de la différenciation des chondrocytes, et l'apoptose a été généralement considérées comme le sort ultime de CAH. Maintenant, certains chercheurs suggèrent qu'au moins certains CAH pourraient survivre et contribuer à la formation d'os endochondral. Bien qu'ils ont proposé que la croissance des chondrocytes de la plaque avaient la capacité de transdifférencier en ostéoblastes basé sur ultrastructure, la coloration immunohistochimique, et des études in vitro 46, aucune de ces méthodes wERE définitive à démontrer la contribution des chondrocytes à la lignée des ostéoblastes.

La technique lignée cellulaire de traçage fournit une manière plus rigoureuse pour étudier le destin des cellules. Brièvement parlant, une enzyme recombinase, ce qui est exprimé uniquement dans un type particulier de cellules, stimule l'expression du gène rapporteur. De cette façon, ce type de cellule et leurs descendants sont marqués de façon permanente 7. Le système Cre-loxP est couramment utilisé dans la lignée de traçage. Cre (l'enzyme recombinase) excise la séquence d'arrêt entre les deux sites loxP et activer le rapporteur dans une lignée cellulaire spécifique (figure 1A). Dans certains cas, l'enquêteur peut choisir un point de temps favorable pour activer Cre en utilisant un médicament, comme le tamoxifène, causant Cre à fusionner à une forme modifiée du récepteur des oestrogènes (Cre ERT2) 8. reporters fluorescents sont devenus la norme dans la lignée de traçage des expériences, car ils réduisent considérablement la complexitéet d' améliorer la précision et l' efficacité du destin cellulaire traçage 8,9. tdTomato devient le meilleur choix parmi les reporters fluorescents , car il a la plus brillante protéine fluorescente et l'épifluorescence plus forte, ce qui rend facilement visualisées 7 (figure 1A).

En utilisant la lignée Rosa26 tdTomato système de traçage, notre groupe et d' autres chercheurs ont montré que CAH peut changer leur phénotype des cellules osseuses au cours du développement 10-14. Pour ce faire , nous avons développé deux ensembles de traçage des combinaisons avec Rosa26 tdTomato (expression omniprésente dans toutes les cellules) / Cre (spécifique à chondrocytes) souris: 2.3Col1a1-GFP (spécifique à ostéoblastes) et immunofluorescence (spécifique aux cellules osseuses). Les données démontrent que les deux méthodes sont des moyens viables pour étudier le destin des cellules in vivo.

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Protocol

Tous les protocoles ont été examinés et approuvés par le Comité institutionnel des animaux soin et l'utilisation (IACUC) au Texas A & M University College of Dentistry.

Elevage 1. Animal

  1. Utiliser trois modèles animaux dans cette étude. Pour enquêter sur le sort des chondrocytes embryonnaires dans la formation de condyle, la première utilisation Col10a1-Cre 15 souris et les croiser avec Rosa26 tdTomato (B6; 129S6- Gt (ROSA) 26Sor TM9 (CAG-tdTomato) Hze / J) souris pour obtenir Col10a1- souris Cre et Rosa26 tdTomato. Ensuite, traverser ces souris avec 2.3Col1a1-GFP souris 16. Utilisez Col10a1-Cre; Rosa26 tdTomato; Souris 2.3Col1a1-GFP pour réaliser les expériences lignée cellulaire de traçage (figure 1B).
  2. Pour étudier le sort des chondrocytes postnatales, suivez la même procédure que dans l' étape 1.1, mais utiliser le ERT2 Aggrecan-cre (Agg-Cre ERT2) 17,18 ligne et de garder le Agg-Cre ERT2; Rosa26 tdTomato; Souris 2.3Col1a1-GFP pour réaliser les expériences lignée cellulaire de traçage (figure 1c). Injecter tamoxifène le jour postnatal 14.
  3. Pour combiner la lignée cellulaire de traçage technique avec immunofluorescence, traverser souris Agg-Cre ERT2 et souris Rosa26 tdTomato. Utiliser des souris qui portent les deux gènes dans l'expérience et injecter le tamoxifène le jour postnatal 3 (figure 1D).

2. Préparation du matériel

  1. Dissoudre la poudre tamoxifène dans 10% d'éthanol et l'huile de maïs à 90% à une concentration de 10 mg / ml. La posologie pour l'injection est de 75 mg / kg.
  2. Dissoudre la poudre de paraformaldehyde (PFA) dans du PBS à une concentration de 4%, en utilisant 2 M d'hydrate de sodium pour ajuster la valeur du pH à 7,4. Utiliser une solution PFA 4% pour fixer le tissu (le condyle mandibulaire et patte arrière sont utilisés ici) après le sacrifice. En raison de sala toxicité, la poignée PFA dans le capot avec des gants et un masque facial.
  3. Dissoudre la poudre d'EDTA dans de l'eau distillée à une concentration de 10%, en utilisant 2 M d'hydrate de sodium pour ajuster la valeur du pH à 7,4. Utiliser 10% d'EDTA pour détartrer le condyle mandibulaire et patte arrière.
  4. Dissoudre la poudre de saccharose dans du PBS à des concentrations de 15% et 30%. Utilisez la solution de saccharose à déshydrater le tissu après décalcification.
  5. Dissoudre la poudre de hyaluronidase dans du PBS à une concentration de 2 mg / ml, pH 5,0. Cette solution est pour la récupération de l'antigène immunofluorescence.
  6. Utiliser un tube de 1,5 ml pour préparer une solution de blocage contenant 3% d'albumine de sérum bovin (BSA) et du sérum de chèvre à 20% dans du PBS pendant Runx2 ou DMP1 coloration immunofluorescente.
  7. Utiliser un tube de 1,5 ml pour préparer une solution d'anticorps primaire contenant du sérum de chèvre à 2% dans du PBS pendant Runx2 ou DMP1 coloration immunofluorescente. La concentration de l'anticorps primaire est de 1: 400 pour Runx2 et 1: 100 pour DMP1.
  8. Utilisez un tube de 1,5 ml pour préparerla solution IgG de lapin comme témoin pour immunofluorescence afin d'éviter des résultats faussement positifs. La solution contient de 2% de sérum de chèvre dans du PBS. La concentration de l'IgG de lapin pour le contrôle de Runx2 est de 1: 400; pour DMP1, 1: 100. Effectuer l'expérience et le contrôle coloration simultanément.
  9. Utiliser un tube de 1,5 ml pour préparer une solution d'anticorps secondaire contenant du sérum de chèvre à 2% dans du PBS pendant Runx2 ou DMP1 coloration immunofluorescente. Utiliser l'anticorps secondaire à une dilution de 1: 500.

3. Préparation de la lame pour microscopie confocale (Cell Lineage Tracing seulement, aucune combinaison avec immunofluorescence)

  1. Injecter tamoxifène dans le-cre Agg ERT2 souris à un point de temps favorable.
    1. D'abord, enlever une souris de sa cage. Ensuite, utilisez le pouce et l'index gauche pour saisir la peau sur le dos de la souris et retournez-le, exposant l'abdomen. Utilisez la main droite pour tenir la seringue. Le point d'entrée optimal pour l'injection est sur la lauche ou sur le côté droit de hypogastre, en évitant le foie et de la vessie.
    2. Conserver la seringue parallèlement aux pattes postérieures de la souris et injecter par voie intrapéritonéale. La posologie pour l'injection est de 75 mg / kg. Les poids des souris à l'âge de 2 semaines, 3 semaines et 4 semaines d'âge sont d'environ 7-9 g, 11 - 13 g et de 16 - 18 g, respectivement.
  2. Anesthésier la souris avec une combinaison xylazine / Ketaset.
    1. Pour préparer la solution de travail, tout d'abord diluer la xylazine et Ketaset avec de l'eau distillée à une concentration de 1 mg / ml et 5 mg / ml, respectivement. Ensuite, mélanger le Xylazine et Ketaset dans un rapport 1: 2. La posologie pour l'injection est de 30 ul / g.
    2. Injecter comme dans l'étape 3.1. Confirmez le anesthetization en pinçant la cheville de la souris. La souris est inconsciente si elle n'a pas de réaction.
  3. Perfuser les souris avec 4% PFA après anesthésie.
    1. Après la souris perd conscience, fixer les quatre pieds de la souris sur une planche à entirely exposer l'abdomen.
    2. Saturer l'abdomen avec 70% d'éthanol et faire une excision de l'abdomen inférieur au cou le long de la ligne médiane. Pincez et simultanément tirer la peau sur les côtés latéraux pour révéler la membrane péritonéale. Utilisez des ciseaux de dissection pour faire une excision longitudinale.
    3. Couper et retirer les côtes avant d'exposer le coeur. Percer le cœur du ventricule gauche avec un 22 G seringue, tenez la seringue, et simultanément couper une fente dans l'oreillette droite.
    4. Lentement injecter 4% PFA, qui est perfusé le long du système cardio-vasculaire, tandis que les bouffées de sang sur la coupe de l'oreillette droite. Le volume de la PFA pour la perfusion est de 1 ml / gramme. Effectuez cette étape dans une enceinte de sécurité biologique de classe I qui est dur canalisé vers le système d'évacuation du bâtiment.
  4. Décollez la peau de la souris et de mettre le corps entier dans un tube de centrifugeuse en polypropylène de 50 ml contenant 40 ml de 4% PFA pour fixer une nuit à 4 ° C.
  5. Utilisez des ciseaux de dissection et # 3 et # 5 forceps pour retirer soigneusement la mandibule et la patte arrière du corps et de supprimer les muscles et les tendons sur la surface. Effectuez cette étape dans une enceinte de sécurité biologique de classe I qui est dur canalisé vers le système d'évacuation du bâtiment.
  6. Couper la mandibule en deux morceaux à la région distale de la troisième molaire. De même, couper le fémur et le tibia dans les midshaft pour exposer la cavité de la moelle osseuse afin d'accélérer la décalcification. Mettez la partie qui comprend le processus de condyle et condyle et le long de la patte arrière dans 40 ml de 10% d'EDTA à détartrer à 4 ° C pendant 2 - 4 jours dans un tube en polypropylène centrifugeuse de 50 ml.
  7. Utiliser 50 ml de 15% de saccharose pour déshydrater le condyle et la patte arrière pendant une nuit à 4 ° C dans un tube de centrifugeuse de polypropylene de 50 ml.
  8. En utilisant 30% de saccharose pour déshydrater le condyle et la patte arrière pendant une nuit à 4 ° C dans un tube de centrifugeuse de polypropylene de 50 ml.
  9. Le long du plan sagittal, il faut insérer l'échantillon avecOctobre sur la plaque de coupe dans la machine à cryosection.
    1. Horizontalement jeter les condyle ou la patte arrière dans le moule de montage. Immerger le tissu dans l'OCT et le laisser dans la machine cryosection jusqu'à l'OPO se fige.
    2. Monter le bloc octobre sur la plaque de coupe. Attendez environ 15 minutes avant de couper pour faire en sorte que l'OPO est complètement gelé.
  10. Couper le condyle et la patte arrière en sections de 10 um. Collecter les sections sur des lames et conserver à -20 ° C.
  11. Incuber la lame dans une chambre C de 37 ° pour éliminer l'eau avant la coloration.
  12. Laver les lames deux fois avec de l'eau distillée pendant 5 min.
  13. Essuyez l'eau autour de chaque section. Utilisez un stylo barrière hydrophobe pour encercler les sections et déposez DAPI ou d'une solution de montage anti-fade non fluorescent dans le cercle. déposer doucement sur la lamelle.

4. Coloration immunohistochimique pour Runx2 et DMP1

NOTE: Le con IgGcontrôle est nécessaire pour une coloration immunohistochimique pour éviter des signaux faux positifs. La coloration pour les groupes expérimentaux et de contrôle doit être exécuté simultanément.

  1. Incuber les lames dans une chambre C de 37 ° pour éliminer l'eau avant la coloration.
  2. Laver les lames deux fois avec de l'eau distillée.
  3. Utilisez le stylo barrière hydrophobe pour entourer toutes les sections sur la diapositive. A partir de cette étape, ajouter la totalité de la solution préparée dans le cercle pour couvrir complètement les sections.
  4. Traiter les sections avec de la hyaluronidase dans une chambre humide à 37 ° C pendant 30 min. Le volume de la solution (dans les étapes 4.5 - 4.8) dépend de la taille de la section. Utilisez 50 pi de solution pour le condyle et 100 pi pour l'os long. Laver avec du PBST (PBS contenant 0,1% de Tween 20) trois fois.
  5. Préparer et appliquer la solution de blocage à chaque section et de les incuber dans une chambre humide pendant 1 heure à température ambiante.
  6. Incuber les sections avec primaireune solution d'anticorps (Runx2 de lapin anti-souris ou un lapin anti-souris DMP1) à 4 ° C pendant une nuit. Laver avec du PBS trois fois.
  7. Incuber les sections avec une solution d'anticorps secondaire (chèvre anti-lapin Alexa Fluor 488) pendant 2 heures à la température ambiante. Laver avec du PBS trois fois.
  8. Essuyez l'eau autour de la section et déposez DAPI dans le cercle pour couvrir la section sur la diapositive. déposer doucement sur la lamelle.

5. Microscopie confocale

  1. Capturer des images de cellules à fluorescence en utilisant un microscope confocal à des longueurs d'onde allant de 488 um (vert) à 561 um (rouge). Prendre plusieurs images empilées à 200 Hz (dimensions de 1,024 × 1,024) 19 en utilisant 10X, 20X et 63X lentilles.

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Representative Results

Chondrocytes Transform directement dans les cellules osseuses (ostéoblastes et ostéocytes) dans le mandibulaire condyle et Long Bone.

Aggrécane, un gène essentiel pour la chondrogenèse, est principalement exprimé dans les chondrocytes matures précoces et 18. Par conséquent, l'injection de tamoxifène à 2 semaines d'âge dans Agg ERT2-Cre; Souris Rosa26 tdTomato activés le journaliste rouge tomate dans tous les chondrocytes et leurs cellules filles. La ligne 2.3Col1a1-GFP a donné lieu à une couleur vert fluorescent dans le collagène 1 exprimant les cellules osseuses, en particulier les ostéoblastes et les pré-ostéocytes. La couleur jaune (rouge combiné avec verte) indique la présence de cellules osseuses chondrocytes dérivées qui expriment le gène du collagène 1. Sur la figure 2A, la plupart des cellules osseuses dans le condyle sous le cartilage étaient rouges ou yellow (un globule rouge qui avait commencé à sécréter vert fluorescent COL1A1, apparaissant ainsi en jaune lorsque les deux fluorophores ont été superposées). Ces résultats ont fourni des preuves solides que ces cellules osseuses ont été dérivées des chondrocytes. Des résultats similaires ont également été observés pendant longtemps le développement des os, où la majorité des cellules osseuses sont issues de chondrocytes à la fois dans l'épiphyse (figure 2B) et la métaphyse (figure 2C).

Pour approfondir ces résultats, nous avons croisé des souris Col10al-Cre avec Rosa26 tdTomato; 2.3Col1a1-souris GFP. Col10a1 est un marqueur très spécifique pour CAH, exprimé uniquement dans les CAH et leurs descendants. En outre, Col10a1-Cre est non inductible, ce qui reflète la différenciation des cellules depuis le début de l' expression Col10a1 (à E14,5). Dans le trabécules près de l'interface cartilage-os (niveau supérieur) de 3 semaines, âgé de souris, rouge et scellules fluorescentes jaunes ertains étaient prédominants, tandis que les cellules fluorescentes vertes étaient rares. Dans une zone légèrement plus inférieure (niveau intermédiaire), la majorité des cellules sont fluorescentes jaune, avec un peu moins rouge fluorescent. Les cellules fluorescentes vertes semblaient dominer seulement dans la zone la plus inférieure du condyle (niveau inférieur) (figure 3) .Cette tendance indique que la croissance du condyle est principalement contribué à par les cellules osseuses transformées de CAH. La distribution des cellules fluorescentes rouges et vertes dans le processus de condyle est également compatible avec la direction inférieure à supérieure de la croissance du condyle.

La technique lignée cellulaire de traçage démontre clairement que l'apoptose est pas le seul sort HCS. Les deux lignes Agg-Cre ERT2 et Col10a1-Cre indiquent que les cellules osseuses chondrocytes dérivés sont la principale source pour le développement de l' os dans le condyle et l'épiphyseet métaphyse en os long.

Co-application de immunofluorescence et Cell Lineage Tracing permet le suivi de la différenciation des cellules.

La technique de traçage de la lignée cellulaire peut également être combiné avec immunohistochimie fluorescent pour déterminer le type de cellules par la détection d'un marqueur spécifique de la cellule. Cette méthode présente plusieurs avantages pour l'étude du destin cellulaire. Tout d'abord, le chercheur peut encore définir les caractéristiques des cellules en sélectionnant les marqueurs appropriés, même sans la ligne GFP spécifique de la souris, ce qui élargit l'application de la lignée cellulaire de traçage technique. D'autre part, cela simplifie la génération de souris composés. Par exemple, nous avons seulement besoin de générer Agg-Cre ERT2; Souris composés Rosa26 tdTomato pour produire la couleur rouge après avoir activé Cre (au jour postnatal 3), au lieu de créer Agg-CreERT2; 2.3Col1a1-GFP; Rosa26 tdTomato souris, ce qui nécessite plus de croix.

Dans cette étude, nous avons choisi deux anticorps pour immunofluorescence. L'un était contre Runx2, un facteur de transcription critique au cours de la maturation des ostéoblastes (stade précoce des cellules ostéogéniques); l'autre était contre DMP1, exprimée en ostéocytes mature (stade tardif de cellules ostéogéniques). Dans la figure 4, la fluorescence verte représente l'expression d'anticorps Runx2 ou DMP1 dans le 2 semaines ancien processus condylien. Sur la figure 4A, trois types de cellules colorées dans l'os sous - chondral sont présents. La couleur jaune (superposition de la fluorescence rouge et vert) dans le noyau représente les cellules osseuses chondrocytes dérivées exprimant Runx2, indiquant que ces cellules étaient des ostéoblastes immatures sur la surface de l'os. En outre, il y avait une fluorescence rouge des cellules osseuses qui ne manifestent Runx2 (rouge fluorescence sans verte superposées). Ces cellules représentent des cellules osseuses de chondrocytes matures dérivées de la matrice osseuse. Les cellules les moins courantes étaient celles avec seulement noyaux verts fluorescents, indiquant les cellules osseuses non-chondrocytes dérivés avec expression Runx2 ou une transformation qui a eu lieu avant l'activation Cre. L'image suggère que les cellules osseuses rouges et ceux qui ont des noyaux jaunes sont les populations cellulaires majoritaires qui contribuent à la formation de l'os sous-chondral condylienne.

D'autre part, presque toutes, des cellules osseuses des chondrocytes dérivés du rouge dans la matrice osseuse avait une coloration DMP1 autour de leurs corps cellulaires. Peu ostéocytes étaient positifs pour DMP1 mais manquaient de corps cellulaires rouges (figure 4B). Il existe également deux explications possibles pour ces cellules: soit qu'ils sont des cellules osseuses non chondrocytes dérivées, ou ils sont des cellules osseuses chondrocytes dérivées qui ont transformé avant l'injection tamoxifène. En outre, aucune des cellules osseuses rougessur la surface de l'os exprimé DMP1, ce qui indique qu'ils ne mûrissent ostéocytes.

Pris dans leur ensemble, les données des profils d'expression à la fois précoce (Runx2) et des marqueurs de stade tardif (DMP1) des cellules ostéogéniques sont compatibles avec le résultat précédent à l'aide Cre combinée avec 2.3Col1a1-GFP. Ces données démontrent que la combinaison de l' immunofluorescence et Rosa26 tdTomato traçage est une bonne façon d'étudier le destin des cellules. Plus important encore , les chercheurs peuvent distinguer le type de cellule, identifier le stade de différenciation, et d' observer le nombre de cellules transformées en même temps en utilisant immunofluorescence avec différents marqueurs, qui fournit plus d' informations que Rosa26 tdTomato traçage seul.

Figure 1
Figure 1. Le Mécanisme de cellules Lineage Tracing et ee génération des souris composés. A) Le système Cre-loxP est couramment utilisé dans la lignée de traçage. Cre excise la séquence d'arrêt entre les deux sites loxP, et la protéine tdTomato (fluorescence rouge) est exprimée de façon permanente dans la lignée cellulaire spécifique. B) Trois modèles animaux sont mentionnés dans le présent document. Nous avons utilisé 2,3 COL1A1-GFP; Souris Rosa26 tdTomato et les ont croisées avec des souris Col10a1-Cre. Col10a1-Cre est non-inductible, qui reflète la différenciation des cellules dès le début de l' expression Col10a1 (à E14.5). C) Aggrecan-Cre ERT2 (Agg-Cre ERT2) est une autre ligne Cre également croisé avec 2.3Col1a1-GFP; Souris Rosa26 tdTomato. Cre a été activé à l'âge de 2 semaines par une injection tamoxifène (Tm: tamoxifène). D) Afin de combiner l'immunofluorescence avec la lignée cellulaire suivi, nous avons généré des Agg-Cre ERT2; <em> souris Rosa26 tdTomato, activées Cre au jour postnatal 3, et procédé à Runx2 et DMP1 immunofluorescence (Tm: tamoxifène). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. La transformation de chondrocytes à des cellules osseuses (ostéoblastes et ostéocytes) dans le mandibulaire condyle et Long os en utilisant Agg-Cre ERT2; 2.3Col1a1-GFP; Rosa26 tdTomato souris composés. A) Cre a été activé par le tamoxifène le jour postnatal 14, et les souris ont été sacrifiées à l' âge de 4 semaines. Il y avait trois cellules de couleur dans le Procédé condylienne: rouge pur (cellules osseuses chondrocytes dérivées), jaune (rouge combiné avec le vert, ce qui indique des cellules osseuses chondrocytes dérivées qui expriment le gène du collagène 1), et le vert pur (non chondrocytes dérivées de cellules osseuses avec le gène du collagène 1) . La plupart des cellules osseuses dans le processus du condyle sous le cartilage étaient jaune ou rouge pur (flèches blanches), tandis que quelques cellules osseuses étaient verts (flèches bleues). Ces données fournissent des preuves solides que les chondrocytes transformer directement dans les cellules osseuses et de contribuer à la formation du condyle au cours du développement (Tm: tamoxifène; C: cartilage; B: os). B, C) La majorité des cellules osseuses dans l'épiphyse et la métaphyse ont été chondrocytes dérivées (flèche blanche: cellules osseuses chondrocytes transformé en jaune ou rouge pur, bleu flèche: cellules osseuses non-chondrocytes dérivés en vert pur; AC: articulaire cartilage; GP: plaque de croissance).blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure3
Figure 3. La transformation de chondrocytes à des cellules osseuses dans le condyle mandibulaire Utilisation de Col10al-Cre; 2.3Col1a1-GFP; Rosa26 tdTomato souris composés. A) Dans le processus condylien de souris 3 semaines d'âge, les cellules osseuses verts étaient une minorité distincte dans le trabécules près de l'interface cartilage-os (niveau supérieur, a1), tandis que le rouge et certaines cellules jaunes étaient prédominants. Dans le niveau intermédiaire (a2), les cellules jaunes étaient majoritaires, avec un peu moins de globules rouges. Les cellules vertes semblaient être dans la majorité que dans la zone la plus inférieure (a3). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. La Co-localisation de deux marqueurs de cellules ostéogéniques avec l'arrière - plan de Lineage traçage dans le processus Condylar Utilisation 2-week-old Agg-Cre ERT2; Rosa26 tdTomato Les souris composés. A) La couleur jaune dans les noyaux des cellules osseuses représente chondrocytes dérivées exprimant Runx2 (flèches blanches) sur la surface de l'os trabéculaire au-dessous du cartilage condylien. Les cellules osseuses rouges pure, sans expression Runx2 représentent des cellules osseuses de chondrocytes matures dérivées de la matrice osseuse (flèches jaunes). Le fewecellules st étaient ceux portant seulement des noyaux verts, représentant les cellules osseuses soit non-chondrocytes dérivés ou des cellules osseuses transformées de chondrocytes avant l'activation Cre (Tm: tamoxifène). B) Dans l'os trabéculaire au-dessous du cartilage condylien, presque toutes les cellules de l' os de chondrocytes dérivés du rouge dans la matrice osseuse réalisée DMP1 coloration autour de leur corps cellulaire (flèches blanches). Seuls quelques-uns des ostéocytes étaient positifs pour DMP1 mais manquaient de couleur rouge dans leurs corps cellulaires (flèches jaunes). Il existe deux possibilités pour ces cellules: les cellules osseuses non-chondrocytes dérivés ou des cellules osseuses chondrocytes dérivés résultant avant l'injection du tamoxifène. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

En raison des limites technologiques, il est toujours difficile d'enquêter sur le comportement des cellules in vivo. Cependant, la technique lignée cellulaire de traçage se révèle être un outil puissant pour étudier la biologie des cellules 7-9. Dans cette étude, nous améliorons encore ce protocole en le combinant avec immunofluorescence. De cette façon, le destin des cellules peut être défini par plusieurs marqueurs associés, ce qui élargit l'application de la lignée de traçage. De plus, cette co-localisation de immunofluorescence et la tomate de signal affiche simultanément le nombre de descendants de la cellule fondatrice, leur emplacement et leur état de différenciation, en fournissant plus d'informations que la lignée cellulaire de traçage seul. En outre, l'utilisation de marqueurs spécifiques des cellules peut simplifier la génération de souris de composés, ce qui accélère l'enquête.

La spécificité de Cre est crucial pour l'attribution sans équivoque de la lignée et l'exactitude des résultats 20,21. Il est très important pour sélectionner les lignes Cre appropriées pour vérifier le sort de la cellule. Dans cette étude, nous avons choisi Col10a1, car il est considéré comme un marqueur spécifique de chondrocytes hypertrophiques 10,11, et l' aggrécane, car il est aussi un marqueur bien connu pour chondrocytes 18. Il y a aussi de bons modèles Cre utilisés dans d'autres domaines. La ligne Scleraxis-Cre (SCX-Cre), par exemple, est utile dans le tendon et la recherche sur le ligament depuis scleraxis est une hélice-boucle-hélice facteur de transcription de base qui est un marqueur pour les tendons et des ligaments 22 lignée cellulaire. Un autre Cre appelé DMP1-Cre est couramment utilisé dans les études skeleton- et liées à dents parce DMP1 est fortement exprimé dans odontoblastes et ostéocytes 23,24.

Par rapport aux systèmes Cre non inductibles dont l'activation inductible par Cre peut être limité temporellement et spatialement 20. Cependant, certaines limitations doivent être pris en considération lors de la conception de l'expérience et l'interprétation des résultats dedes modèles inductibles Cre. Tout d'abord, la dose de tamoxifène peut modifier l'efficacité de l'activation Cre et le nombre de cellules marquées. Les faibles doses seront étiqueter la population d'intérêt à une densité clonale 25; des doses élevées peuvent étiqueter l'ensemble du pool progénitrices 7,26. Ainsi, la dose doit être choisie en fonction du but de l'expérience. Deuxièmement, le tamoxifène a une toxicité potentielle, en particulier dans les hautes doses 27,28. Pour cette raison, il est préférable de diminuer la dose pour éviter des avortements tardifs lors de l' injection pendant la grossesse 29.

En conclusion, la co-application de la lignée cellulaire techniques de traçage et immunofluorescence est un outil puissant pour étudier la biologie des cellules in vivo. Dans l'avenir, les enquêteurs peuvent tenter d'effectuer simultanément immunofluorescence avec deux anticorps différents sur le fond du signal de tomate. Cette méthode peut montrer le modèle d'expression pour les deux marqueurs dans une section, ce qui rend plus facile pour leenquêteur pour comparer et analyser les résultats. En outre, cette co-application peut encore être améliorée par immunofluorescence in situ pour diminuer la coloration non spécifique qui peut exister par immunofluorescence classique.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tamoxifen  Sigma T5648 activate the Cre event 
Paraformaldehyde Sigma  P6148 fix the sample
Ethylenediaminetetraacetic acid Alfa Aesar A10713 decalcify the hard tissue
Sucrose  Sigma S0389 dehydrate the tissue
Hyaluronidase from bovine testes  Sigma H4272 retrieve antigen for immunochemical staining
Bovine serum albumin Sigma  A3059 blocking solution 
primary antibody for Runx2  Cell Signal D1L7F primary antibody for immunochemical staining
primary antibody for DMP1 provided by Dr. Chunlin Qin primary antibody for immunochemical staining
anti-rabbit IgG Sigma 18140 control for immunochemical staining
secondary antibody  Invitrogen A11008 second antibody for immunochemical staining
OCT Tissue-Tek 4583 embed the sample for frozen section
Tween 20 Fisher Scientific BP337 PBST
non-fluorescing antifade mountant Life technologies P36934 mounting slides
DAPI Life technologies P36931 nuclear staining
Hydrophobic Barrier Pen Vector Laboratories circle the section on the slide for for immunochemical staining 
Xylazine AnaSed anesthetization 
Ketaset  Zoetis anesthetization 
cryosection machine Leica CM1860 UV
confocal microscope Leica DM6000 CFS 

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References

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