기존의 UV 레이저 공 초점 현미경을 사용하여 트리거 세포 스트레스와 죽음

Neuroscience
 

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Morsch, M., Radford, R. A. W., Don, E. K., Lee, A., Hortle, E., Cole, N. J., Chung, R. S. Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (120), e54983, doi:10.3791/54983 (2017).

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Abstract

Introduction

형광 현미경 긴 제브라 피쉬 CNS의 유전자 개발 한에 특히 그 효과의 영향을 연구하기 위해 사용되었다. 고해상도 현미경 뇌 발달, 근육 생성, 많은 개발이 이벤트와 관련된 세포 과정의 상세한 매핑을 허용했다. 개별 세포의 죽음을 공부하는 것은 주로 표준 이미징 과정에서 선택적 세포 사멸을 유도하는 기술적 인 문제로, 더 도전하고있다. 그러나, 단일 셀 해상도 이미지 및 높은 타겟 절제 기술의 조합은 필연적 세포 - 세포 상호 작용뿐만 아니라 스트레스와 손상을 즉시 세포 반응의 조사를 허용한다. 이러한 과정을 이해하는 것은 특히 뉴런 - 아교 세포 상호 작용의 진행에 기여하는 것으로 나타났다 운동 신경 질환 (MND), 신경 퇴행성 질환, 중요질병 (3).

국방부, 또는 근 위축성 측삭 경화증 (ALS)는 뇌간, 운동 피질과 척수의 운동 신경에 영향을 미치는 치명적인 신경 퇴행성 질환이다. 이러한 신경 세포의 손실은 근육 손실을 초래하고, 환자는 3에서 죽을 - 진단 4 5 년. 근육 섬유에 척수 링크에서 운동 신경 및 근육 수축을 촉진에 필수적인 역할을한다. 이러한 뉴런이 통신 또는 사망의 실패는 점차적으로 근육을 약하게하고, 제비 도보, 말과 호흡 할 수있는 환자의 능력에 영향을 미친다. 살아있는 동물의 운동 신경 및 단기 결과의 죽음을 떠올리 더 나은 정상 세포 항상성과 질병에 관련된 동적 프로세스를 이해할 수있는 좋은 기회를 제공합니다.

제브라 피쉬는 신경 퇴행성 질환 (1)을 연구하는 매력적인 모델 시스템으로 등장했다. 이그러한 체외 수정, 짧은 발전 시간 신경계 광학 접속, 형질 전환의 용이함,이 모델 생물에 의해 제공되는 장점에 기인한다. 또한, 용이하게 복합 형질 전환 지브라 피쉬를 생성 할 수있는 능력은 다른 세포 유형의 다수의 표지 전략을 허용한다. 유전 적 절제는 특정 세포 유형이 아니라 광범위한 장애를 허용하지만 개별 셀 (5)을 대상으로의 미세 제어가 부족 죽일 접근한다. 레이저를 이용한 기술은, 다른 한편으로는, 미세한 공간적 제어를 제공하는 다른 동물 모델에 사용 하였다. 반면 같은 가장 접근 사용 특화된 기기, 레이저, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 이광자 셋업 펄스를 13연구 그룹은 최근 종래의 공 초점 현미경 (14)의 UV 레이저의 장점을 가지고있다.

여기에 설명 된 기술은 선택된 운동 뉴런에서 용량 의존적 방식으로 세포 스트레스 또는 사망을 일으킬 수있는 UV 레이저 매개 방식으로 고해상도의 공 초점 현미경을 결합한다. 또한, 세포 배양에 살아있는 동물에서 성공적으로 테스트되었습니다 일반적으로 설치 405 나노 레이저의 사용에 의존, 이러한 신경 세포의 죽음 이후 소교 통관 등의 세포 상호 작용의 세부 특성을 수 있습니다.

Protocol

참고 : 동물 실험의 설계, 수행 및보고 현재의 가이드 라인 (15)을 고려해야합니다. 이러한 작업은 지역 동물 복지 기관의 사전 승인을 받아야합니다 (우리의 경우, 맥쿼리 대학의 동물 윤리위원회).

1. 설치 및 UV 세포 절제의 Zebrafish의 준비

  1. 제브라 피쉬 (다니오 레 리오) 형광 단백질을 발현를 생성합니다.
    1. 제브라 피쉬에 대한 관심의 형광 단백질을 표현 제브라 피쉬 계란의 한 세포 단계에 플라스미드 주사를 수행 (다른 곳에서 16 설명) 또는 형광 형질 전환 라인을 사용합니다. 여러 세포 유형 레이블을 지정하려면, 관심의 질문에 적절한 설립 형질 전환 라인을 건너 화합물 형질 전환 제브라 피쉬 라인을 만들 수 있습니다. 저녁에 거짓 바닥 쌍의 짝짓기 탱크의 각면에 한 남성과 한 여성 제브라 피쉬를 놓고 빛의 시작과 디바이더를 제거(다른 곳에서 17 설명 된대로) 다음날 아침. 28 ° C에서 제브라 피쉬를 유지하고 기존의 프로토콜 17, 18에 따라이를 처리합니다.
    2. 플라스틱 차 여과기를 통해 배아를 포함하는 탱크의 물을 긴장에 의해 성공적으로 산란 후 배아를 수집합니다. 시스템 물과 계란을 씻어 페트리 접시에 달걀 물로 전송합니다.
    3. 수정을 결정하기 위해 광학 현미경을 검사합니다. 상점은 페트리 접시에 계란을 수정 된 28 ° C (18)에 인큐베이터에 배치합니다.
  2. 옵션 : 특정 세포 집단 레이블을하는 미세 주입을 수행합니다.
    주 :이 안정한 형질 전환 라인을 마련 할 필요없이, 발현 단백질의 시각화를 가능하게하는 다른 방법이다. 관심있는 단백질은 독성이 안정된 트랜스의 생성을 금지 할 때,이 방법은 또한 유리하다제닉 라인.
    1. 다른 19, 20, 21 바와 같이, 제브라 피쉬 배아 한 세포 단계로 플라스미드 작 제물을 주사.
      주 :이 방법은 관심있는 단백질의 모자이크 식을 초래한다. 관심의 단백질이 선택의 프로모터에서 구동되는 TOL2에 의해 형벌 (예, 25, 또는 MPEG1 (26)를 만났다, 24, -3mnx1 (23) (22) islet1)의 반복 (20)를 반전.
  3. 원하는 크기로 물고기 나이.
    1. 3 물고기를 올립니다 - 오일 게시물 수정 (DPF) 및 형광 화합물 현미경으로 배치합니다. 적절한 형광 발현의 동물을 화면과 밝은 표지 물고기를 선택합니다. 늦은 삽입을 위해 달걀 물을 다른 그릇에 적절한 유충을 분리(28 ° C 배양기에 저장)에 대한 연구.
      선택적 : 배아 색소의 형성을 억제하기 위해 24 시간 후 수정 (HPF)에 0.2 mM의 1- 페닐 -2- thioures (PTU) 링거 용액에 배치 될 수있다. 이 독성 및 부작용 생리 학적, 유전 적, 또는 형태 학적 영향을 미칠 수 있으므로 보관, PTU로 촬영해야합니다.
    2. 초기 개발 단계에서 연구 내용은 (<2 DPF), 수동 날카로운 집게를 사용하여 배아를 dechorionate. 효소 계란 물을 프로 나아 제 (2 ㎎ / ㎖)을 첨가하고, 28 ° C에서 10 분 동안이를 배양하여 배아 다수 Dechorionate.
    3. dechorionation을 완화하기 위해 플라스틱 파스퇴르 피펫을 통해 주기적으로 배아를 전달합니다. 배아의 대부분 달걀 물로 여러 번 세척하여 chorions 등장했으면 처리를 종료한다.
  4. 아가로 오스의 제브라 피쉬의 삽입을위한 솔루션을 준비합니다.
    1. 4g / L MS222 추가하여 마취 용액을 제조 (tricaine 주식 솔루션을, pH를 7.0)달걀 물을 함유하는 페트리 접시에 적가 하였다. 50 ㎎ / ℓ의 용량이 추천 시작점 (도 1A)이다.
    2. 달걀 물 - (1.5 % 0.8)와 1.5 ML의의 microcentrifuge 튜브로 나누어지는 저 융점 아가로 오스의 재고를 준비합니다. 예열 된 열 블록으로 나누어지는 배치 (38-40 °의 온도)가 설정 온도 평형하게 (~ 30 분;도 1b 참조).
    3. 옵션 : 장기 영상 (> 4 시간)의 경우, 35 mm의 유리 바닥 페트리 접시 내에서 작은 아가로 오스 원을 준비하고 (보충 그림 1)를 설정할 수 있습니다.
      참고 :이 추가 단계가 더 긴 시간 프레임을 통해 제브라 피쉬와 전체 아가로 오스 드롭의 움직임을 방지에 효과적이었다.
      1. 이렇게하려면 유리 바닥 접시의 내부 원을 따라 아가로 오스의 장소 ~ 300 μL 물고기 배치하는 중간에 작은 구멍이있는 도넛 모양의 원형을 제조 (단계 1.5.3을, 보충 그림 1) .
  5. 현미경 아가로 오스의 제브라 피쉬를 탑재합니다.
    1. 1 선택 - 절제에 대한 사전 심사 물고기의 3과 마취 용액과 접시에 (전송 피펫을 사용하여)을 전송하여 애벌레를 마취 (단계 1.4.1도 1C을 대략 5 분).
      참고 : 물고기는 얕은 아가미 운동과 감소 된 심장 박동을 표시 할 때 마취 더 이상 터치 유발 탈출 응답 표시되지 않습니다 (봉사자를, 실패 떨어진 후 부드럽게 수영 브러시로 자신의 꼬리를 터치하기). 물고기의 윤리적 인 치료를 위해 적절한 마취를 확인하고 형광등에 아가로 오스 또는 노출에 이전에 경련을 방지하기 위해.
    2. 마취 확인 후, (에 ~ 30 μL 설정 차단 200 μL 팁 포함) 조정 피펫을 사용하여 유충을 빨아하고 팁의 바닥에 가라 앉을 수 있습니다. 의 액체 방울을 방출하여 아가로 예열한다 (단계 1.4)에 전송 유충아가로 유충 (아가 들어가는 달걀 물의 양을 최소화하려고도 1D 참조).
    3. 아가로 오스에 둘러싸인 물고기를 빨아. 이전에 제조 된 유리 바닥 35 mm 접시에 신속하게 분배.
    4. 측면 (왼쪽 헤드) 그래서 몸과 꼬리가 평평 (그림 1E)을 아가로 오스 내에서 동물의 위치를 해부 현미경 및 표준 페인트 브러시 (긴 라이너, 크기 1)를 사용합니다. 여러 물고기로 작업하는 경우, 그들은 쉽게 나중에 공 초점 현미경을 사용하여 위치되도록 접시에 모든 물고기를 맞 춥니 다.
      참고 : 신속하게 위치와 정렬의이 절차를 수행 (아가로 오스가 차가운 온도에 노출 된 후 즉시 설정을 시작으로이 연습이 필요할 수 있습니다).
    5. 아가로 오스가 완전히 설정 될 때까지 15 분 - 10 아가로 오스 - 임베디드 물고기를 남겨주세요. 조심스럽게 ~ 2 mL의 달걀 물을 포함 tricaine (그림 1 층)와 35 mm 페트리 접시를 맨.

2. 공 초점 현미경 및 이미징 매개 변수를 설정

  1. 공 초점 현미경 단계에 포함 된 애벌레와 페트리 접시를 놓고 (밝은 필드를 사용하여) 동물 척수의 등쪽면에 초점을 맞 춥니 다. 적절한 배율 (40 배) 및 형광 설정에서 동물을 검사하고 관심의 구조를 시각화 (예를 들어, 레이블 뉴런 또는 소교 운동의 형광 강도) 이후의 절제 (그림 2)에 필요한 모든 이미징 매개 변수가 있는지 확인합니다. 우리는 정기적으로 우리의 시간 경과 연구를 수행하기 위해 40X 목표를 사용합니다.
  2. 선택적 : 몇 시간 동안 시간 경과 연구를 수행하기 위해, 셀 및 그 환경의 교란 생리적 반응을 확립 제거하기 위해 단일 또는 몇 시간 점 이전 기록하는 것이 바람직하다 (예를 들어, 소교 이동 기준선 속도를 확립 과 운동성).
  3. 구조체의 두께를 결정자외선 레이저 어블 레이션에 대한 관심 URE.
    1. 는 Z 드라이브를 사용하여 수동으로 초점을 상하로 관심의 구조 (예를 들어, 셀 소마)의 상단과 하단을 확인. 절제 될 Z 평면을 주 (예를 들어, 셀의 중심).
      주 : 경험에서,이 방법은 밝은 표지 된 척수 신경 (절제 후 쉽게 경과 시각화를 허용하는 높은 신호대 잡음비, 예를 들어,도 4)을 대상으로하여 가장 효율적이고 중간을 절제하여 셀 소마. 세포 핵 형광 정확한 타겟팅 및 높은 제거 효율을 보장하기 위해 이용 될 수있다.

3. 레이저 절제는 Zebrafish의 척수에서 개별 세포의 표적 수행

참고 :이 절제 및 시각화 방법를 들어, 공 초점 현미경 (라이카 SP5)을 사용 하였다. 세포 특이 이명 령에 대한 405 nm의 다이오드를 사용하여 제거 절차소란은 소프트웨어 (라이카 응용 프로그램 제품군, v2.7.3.9723)에 따라 자세히 설명되어 있습니다. 그러나, 405 nm의 레이저와 FRAP (photobleaching에 후 형광 복구) 또는 표백제 모듈이 장착되어있는 종래의 공 초점 현미경하지만 잠재적으로 약간 다르게 설정 및 파라미터의 이름과 같은 세포 조작의 수행을 허용 할 것이다.

  1. 소프트웨어 메뉴 (그림 3A, 1, 2) 상단의 드롭 다운 메뉴를 클릭하여 FRAP 마법사를 시작합니다. 레이저 어블 레이션에 대한 특정 파라미터의 셋업을 허용 다른 단계와 함께 새로운 윈도우 관찰 (도 3b를 3).
  2. 포맷, 스캔 속도 (도 3b, 4)을 선택하고, 평균하여 절제 방식의 이미지 파라미터를 결정 (도 3b, 5). 400 Hz에서 라인의 스캔 속도로 1,024 X 1,024의 이미지 형식(4)의 평균은 대부분 적용했다.
    주 : 이전에 취득 결정된 바와 같이 (예를 들면 여진 또는 발광 파라미터 등) 스펙트럼 검출을 변경할 필요가 일반적으로 없다.
    1. (단계 2.4에 기재된 바와 같이). 절제 용 Z 평면 아직 선택되지 않은 경우, "라이브"버튼을 눌러 형광체 구조 또는 절제 될 예정 원하는 Z 평면이 될 때까지 시료를 통해 집중 집중하고있는.
  3. 일반적인 이미지 파라미터가 설정되면, "표백"공정 (도 3c, 6) 특정 절제 요소를 제어하는 액세스.
    주 : 레이저 강도의 조합 (도 3c, 8), 스캔 속도 및 3.2 공정 (도 3B, 4, 5)로 설정한다 반복뿐만 아니라 다수 설정된 평균화 3.5 (그림 3E 단계12) 따라서, 표백 효율을 ROI의 UV 레이저의 전체 체류 시간을 결정할 것이다.
    1. 표백 절차 (그림 3C, 8)을 위해 그것을 활성화하여 405-nm의 레이저를 작동시킵니다.
      참고 : - 우리의 실험 설정에서 80 % 상기 설정으로 대부분의 성공은 60 사이에 405 나노 레이저 강도를 달성했다. 이 레이저 파워 출력 기기에 고유 모든 공 초점 설정에 따라 다를 것입니다주의하십시오.
    2. 따라서 체류 시간을 극대화, 검색 필드를 줄임으로써 선택된 ROI에 표백 강도를 최대화하기 위해 옵션 "에서 줌"(그림 3C, 7)를 사용합니다. 또한,이 과정에 대한 선택의 소프트웨어의 "블리치 점"옵션을 사용합니다.
  4. 화상 획득 바람 그리기 도구를 사용해서 제거를위한 하나 또는 다수의 ROI (도 3d, 10)을 선택흐름 (그림 3D, 9). 8 ㎛의 - 약 4 원형 그리기 도구, 예를 들어, 축삭 소구 대상.
    주 : 절제 영역은 애플리케이션에 따라 더 큰 영역으로 하나의 화소에서 조정 가능하다.
  5. 투자 수익 (ROI)을 설정 한 후, "시간 코스"버튼 (그림 3E, 11)을 선택하고 ROI를 (그림 3E, 12) 절제 / 스캔 할 사이클의 수를 확인합니다. 표백 공정 후에 바로 직전 화상 전체의 개요를 허용하도록 원하는대로 "사전 표백제"와 "포스트 - 표백"프레임을 선택한다.
  6. 필요한 모든 절제 매개 변수를 눌러 "실행 실험"(그림 3E, 13)과 절제의 효율성을 모니터링을 설정 한 후.
    참고 : 우리의 FRAP 설정에서 하나의 이미지는 전에 적절한 레이저 전자와 FRAP주기 후 촬영이됩니다xcitation (EGFP 발현 세포에 대한 예를 들어, 488 나노 미터 여기). 이러한 사전 및 사후 절제 사진을 선택한 절제 매개 변수를 얼마나 만족스럽게 ROI가 표백하고, 얼마나 효과의 빠른 판단을 할 수 있습니다.
  7. 레이저 강도를 조절하여이 과정을 반복 (도 3c를, 8), 스캔 속도 및 평균 (도 3b, 45), 그리고 경우에 반복 (도 3e, 12)은 선택된 ROI 아직 완료 후 높은 형광 강도를 나타낸다 FRAP주기.

4. "구조"또는 폐기 물고기를 포함하여 후속 절차를 수행

  1. 실험이 단말기의 경우, tricaine의 과다 복용으로 동물을 안락사. 계란 물을 제거하고 10 분 동안 마취 원액로 교체합니다. 안락사를 보장하기 위해, 심장 박동의 정지에 대한 현미경으로 확인합니다.
  2. 선택 과목:실험이 단말기가 아닌 경우, 미세 집게와 브러시 아가로 오스에서 조심스럽게 물고기를 제거합니다. 신선한 계란 물에 물고기를 배치하고 15 분 동안 관찰에서 복구 할 수 있습니다. 일반 수영 동작을 반환하는 경우, 인큐베이터에 물고기를 반환합니다.
  3. 기관의 승인 GMO의 폐기물 흐름에 따라 형질 전환 동물을 폐기 할 것.

Representative Results

여기에 기재된 방법은 상업적 공 초점 현미경의 FRAP 모듈을 사용하여 제브라 척수 운동 신경의 제거를 허용한다. 같은 특이 적 프로모터의 제어하에 뉴런에서 녹색 형광 단백질을 발현하는 형질 전환 지브라 피쉬 라인 - 3mnx1, islet1 또는 충족을 사용 하였다. (예 -3mnx1이나 충족) 모터 뉴런 프로모터에 의해 구동되는 GFP의 발현은 세포 기관 주 축삭 및 근육으로 연장되는 주연 지점 (도 4비디오 1)의 고해상도 시각화를 허용한다.

3. 성공적인 절제는 단계에 설명 된 70 % ~의 레이저 파워와 일반 설정에서 80의 - 3 ~ 5 일짜리 물고기의 척수의 신경 세포가 성공적으로 (60)의 전체 체류 시간, 절제 한 형광이 절제 후 즉시 페이드 때 달성결코 (그림 5, CD를) 다시 시작합니다. (예 : 488-nm의 레이저 라인 등) 다른 레이저 라인을 제거하려는 시도는 영구적 인 변색을 초래하지 않았고, 형광 짧은 시간 프레임 내에서 복원되었습니다. 중요한 것은,이 기술은 예 넥신 V의 존재 somal 변성 일관된 형태 변화 및 절제된 신경 세포의 축색 돌기 (27)에 blebbing로 UV-절제 뉴런 사멸 세포 사멸의 특징 특징을 보여 주었다.

이 접근법의 특이성 세포의 징후없이 단일 표적 뉴런 변환 된 photoconvertible 형광 카에데 (즉, UV 광에 노출 된 후 녹색에서 적색의 발광 스위치) (도 5, AB)를 사용하는 실험에서 확인되고 몇 시간에 걸쳐 파괴. 높은 레이저 파워의 사용 대신 t 리드오 절제 사이트 (그림 5, CD)에 근접 세포 (~ 20 μm의)의 대상으로 신경 세포 (사망 제외) (아무 광 또는 형광의 재현) 및 광의 소멸.

이 레이저 어블 레이션 유도 기술의 한 가지 중요한 이점은, 방법의 용량 의존성이다. 다른 강도를 가진 표적 세포, 미세 조정의 다중 층 (8도 3c), 주사 속도와 라인 평균 (도 3b, 4 및 5)에서, ROI의 크기가 절제 할 수있는 레이저 출력을 조정하여 사용할 (도 3d, 10) 및 반복 (도 3e, 12). 특히,이 방법은 대신에 세포 사멸을 유도하는 개별 세포 세포 스트레스를 적용하는데 이용 될 수있다. 예를 들어, 미세 조정이되었습니다신경 세포의 죽음 동안 세포 과정을 평가하는 것은 매우 가치. 낮은 UV 레이저 강도로 절제 한 긴 축삭 돌기 모터 뉴런 특성 "에 blebbing"대상 소마에서 시작하고 시간이 지남에 따라 축삭을 따라 (40 계속 (형성과 세포 소포의 조각), 밝혀 - 90 분을도 4 ; 3 차원) 영상 (1)이 절제의 영화를 렌더링합니다. 결과적으로, 서로 다른 레이저 어블 파라미터 따라서 유도 세포 스트레스 수준과 죽음의 시간 코스를 변조하는 것은 실험적 연구 높은 수준의 유연성을 허용한다.

그림 1
그림 1 : 라이브 영상에 대한 제브라 피쉬의 임베딩. (AF)의 라이브 이미징을위한 절차를 포함하기 : (A) Tricaine는 제브라 피쉬 a를 마취시키다하기 위해 달걀 물에 추가 50 ㎎ / ℓ의 TA 개시 선량률. (B) 저 융점 아가로 오스 (0.8 - 1.5 %)을 제조하고 38까지 가온 - 40 ° C. 전송 피펫을 사용하여 (C)는 상기 상영 및 선택 제브라 피쉬는 tricaine 솔루션과 함께 접시에 전송됩니다. 성공적인 진정 후, 물고기 예열 오스 (D)로 전송된다 (얕은 아가미 운동, 심장 박동, 터치 유발 응답의 부족을 감소). 이어지는 희석을 방지하기 위해, 아가 로스에 옮기고 계란 물의 양을 최소화한다. 유리 바닥 35 mm 접시에 제브라 피쉬를 포함 - (50 μL ~ 30) (E)는 아가로 오스의 방울을 전송합니다. 해부 현미경으로이 작업을 수행하고 부드럽게 바람직한 방향으로 제브라 피쉬를 정렬 브러시를 사용합니다. 아가로 오스가 설정 될 때까지 15 분, 그리고 요리 (F)에 tricaine 용액 ~ 2 mL를 넣어 - (10)를 기다립니다.ANK ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : 3 DPF 제브라 피쉬의 척수에서 신경 세포의 시각화 및 미세 아교 세포. 3 일 된 형질 전환 제브라 피쉬의 척수에서 미세 아교 세포 및 신경 세포의 시각화 표현 (A) GFP 양성 신경 세포 (islet1 : GFP)와 (B) mCherry 양성 미세 아교 세포 (MPEG1 : GAL4, UAS : mCherry). (C) 함께 밝은 필드 이미지와 신경 세포와 미세 아교 세포 채널의 합성 이미지. (C)의 개략적 삽입 물고기의 방향을 도시하고, 표시 영역을 설명합니다. 스케일 바는 30 μm의 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.


그림 3 : (프로토콜에 설명 된대로, 3 단계) UV 레이저 어블 레이션 과정의 단계. 단계는 공 초점 소프트웨어 (라이카 응용 프로그램 제품군)의 FRAP 소프트웨어 모듈을 제어 할 수 있습니다. (A) UV 레이저 어블 레이션을 수행하기위한 도구와 FRAP 모듈 시작. 레이저의 체류 시간을 결정 형태, 속도, 평균 등 절제 등 FRAP 설정 용 Z 평면 설정 (B). 레이저 강도와 표백 효율을 극대화하는 옵션 "에서 줌"의 (C) 제어. 절제한다 (D)이자 (ROI)의 하나 또는 복수의 영역의 선택. 표백 시간 코스를 설정 (E)는 표백제 사이클 ROI 영역의 레이저 총 체류 시간을 결정한다. 그녀를 클릭하세요 전자는이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

그림 4
그림 4 : UV-절제 신경 세포의 선행 성 변성. 자외선 절제 척추 신경의 신경 퇴행의 시간 경과 영상. (AF) 하나의 척수 신경 세포의 자외선 조사 (만족 : GAL4, UAS : EGFP; a 및 원) 축삭 분할 한 다음, (AC)을 축소하고 시간이 지남에 따라 반올림 신경 세포의 소마 결과 (CF, 화살촉) . 축삭 변성은 소마 (절제의 사이트)에서 시작하고 마지막으로, 소마의 형광이 사라지고 전체 축삭이 "에 blebbing"(DF)를 보여 주었다까지 축삭의 말단으로 선행 성을 진행. 스케일 바는 20 μm의 =. 이 절제의 3D 렌더링 시간 경과 영화는 비디오 1에 표시됩니다.에스 / ftp_upload / 54983 / 54983fig4large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
도 5 : 모터 뉴런의 형광 photoconvertible (카에데)를 사용하여 단일 세포 UV 조사의 효과의 확인. 뉴런의 형광 photoconvertible 카에데의 활성화를 통해 단일 셀 UV 조사의 유효성. 카에데으로 표시 뉴런의 (AD) UV 조사. 10 초 동안 30 %의 레이저 출력의 단일 뉴런 (원)의 (A)는 광 대상 개별 신경 세포 (B)에서 (녹색에서 적색)의 광 카에데되었다. 변환 된 셀이 몇 시간 동안 생존 열화의 시각적 표시 등에 blebbing이나 반올림을 보여주지 않습니다. 단일 신경 세포의 제거 (C ; 높은 레이저 파워 (10 초 95 %)와 원)은 약 20 ㎛의 반경 내 주변 뉴런의 소수에 그 신경 세포 (D 즉시 실종)와 카에데의 후속 광 결과. 스케일 바는 20 μm의 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

비디오 1
비디오 1 :도 4에 도시 된 UV 절제 뉴런의 3 차원 표면 렌더링 (Imaris).
도 4에 도시 된 신경 세포의 시간 경과 비디오 시각화 소프트웨어 (Imaris, 비트 평면)을 이용하여 렌더링하는 표면이다. 그것은 anterogradely 셀의 선단을 향해 축삭 단편화 하였다 절제된 소마의 수축 과정을 강조한다.euron_ablation-3D_rendered.mov "대상 ="_ 빈 ">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 1 : 오랜 이미징을위한 선택 아가로 오스 캐스팅.
장기 획득 동안 물고기와 아가로 오스의 이동을 방지하려면 도넛에게 유리 바닥 35mm 요리 (A)의 중간에 가장자리를 따라 아가로 오스의 모양의 원형을 준비합니다. 10 분 ~에 대한 아가로 오스 세트를하자 아가로 오스 (B)의 드롭 내부 원형으로 물고기를 옮겼다. 매립에 대한 아가로 오스의 양을 최소화 (물고기를 배향 한 후 외부로 초과 아가로 오스 브러시)보십시오. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

레이저 절제의 접근 방법

레이저를 이용한 제거 기술은 세포의 개인 또는 소규모 그룹의 정확한 타겟팅을 할 수 있습니다. 고해상도 현미경 및 제브라 피쉬와 같은 동물 모델에서 유전자 조작과이 기술을 결합하면 연구자들이 체계적으로 개별 세포의 운명 부상 후 상호 작용을 연구 할 수 있습니다.

여기에 설명 된 UV (405 ㎚), 레이저 어블 레이션 프로토콜은 개별 세포 스트레스 또는 사망을 선택적 (용량 의존적 방식으로), 뉴런, 신경교 이웃 동안 및 축색 무사 방치 할 수있는 방법을 설명합니다. 우리는 성공적 세포 배양 실험에서이 방법을 이용하고 여기 제브라 척수에 대한 구체적인 방법을 기술하고있다. 우리는 선택적으로 다른 셀 (도 5를 참조하면, 그리고 네트워크 내에서 각각의 뉴런을 강조하여 제브라 척수이 방법의 구현을 보여준다 (그림 5, CD).

이전에, 이러한 질소 펄스 레이저 또는 이광자 레이저 시스템과 같이 전문 레이저 시스템은, 조직 손상 및 모터 신경 transections 10, 11, 12, 13을 유도하기 위해 요구되었다. 이 레이저 시스템은 성공적으로 동맥과 정맥 6 혈전증, 급성 신부전 (7), 심장 손상 8과 같은 세포 손상을 야기하고, 칼슘 파도 뇌 손상 9 후 소교 반응을 연구하는데 이용되고있다. 또한, Soustelle 연구팀은 초파리 (14) <상피의 손상과 신경 교세포를 유도하기 위해 기존의 공 초점 설정 (351 나노 미터와 364 nm의 UV 레이저를) 사용/ SUP>.

ALS를 이해하기위한 Zebrafish의 모델의 관련성 (및 기타 인간의 질병)

제브라 특히 개발 연구 28, 29, 30, 널리 사용되는 모델 생물이다. 그들이 어떤 한계를 가지고 있지만, 인간의 질병을 모델링하고 병원성 분자 메커니즘의 이해를 제공하기 위해 자신의 잠재력은 엄청나 다. 제브라 피쉬 모델 MND 연구를위한 잘 확립 된 중요한 통계 분자량 31, 32, 33, 34을 이끌어왔다. 형질 전환 제브라 피쉬 라인을 빠르게 생성 할 수있다 (4 - 5 개월) 및 특정 세포 유형, 그들 ALS의 현재 동물 모델에 귀중한 추가 할 기능의 선택적 추적을 할 수 있습니다. 제브라 피쉬 배아 / 애벌레는 광학적으로 투명하고 독특한 체험관을 제공뇌 또는 용이 설치류 모델에서 달성 (또는 인간) 될 수 척수에서 단일 세포 수준에서 장기간 실시간 이미징을 허용 정신 장점. 이러한 단일 셀 어블 분자 기법과 함께 사용하면,이 생체 내에서 정확한 분자 메커니즘을 연구하는 실험 고유 플랫폼을 제공한다.

모터 뉴런은 선택적 UV 레이저 어블 레이션을 사용하여 타겟팅 할 수 있습니다

제브라 피쉬의 척수 신경 세포는 출생 후 10 시간 이내에 개발을 시작 후 약 48 시간 (35), (36) 설정됩니다. 이 급속한 발전은 짧은 시간 프레임과 높은 처리량이 신경 세포의 시각화 할 수 있습니다. 운동 뉴런은 ALS에서, 운동 피질 (상위 운동 뉴런), 뇌간, 척수 (하위 운동 뉴런)에 영향을받는 뇌와 근육 사이에 필수적인 링크를 제공. 이러한 신경 세포의 손실은 불가피 무에 이르게scle 위축과 약점. 제브라 피쉬의 척수의 운동 신경은 별개의 돌기에 의해 -3MNX1 같은 모터 신경 세포 특이 적 프로모터의 사용으로 식별 할 수 있습니다. 이러한 돌출 된 신경 세포의 세포 소마를 타겟팅하는 시간 (그림 4비디오 1)를 통해 축삭 돌기를 따라 선행 성 변성를 한 것으로 밝혀졌습니다. 척추 운동 뉴런의 단일 셀 해상도의 영상은 추가로 레이저 어블 레이션 (그림 4 참조 (27)의 보조 비디오 3 참조) 후 포스파티딜 세린의 전위 및 그에 따른 넥신 V-라벨을 확인했다. 우리는 우리의 UV 레이저 어블 레이션 방법 후 뉴런을 죽음에 넥신 V의 활성화를보고 있지만이 가속화 과정에서 발생되는 죽음의 폭포가 정확하게 신경 퇴행 또는 정상 세포 항상성 동안 발생하는 신경 세포의 죽음과 일치하는지, 우리는 확신 할 수 없습니다.

이 박리 방법은 재현성이 높은 반면특정 다른 매립 전략은 또한 UV 어블 레이션의 효율에 영향을 미칠 수있다. 우리의 경험에서, 우리는 우리의 생선 내장 아가 층을 최소화하기위한 가장 성공적이었다. 의한 감쇠가 발생 산란 효과가 궁극적으로 세포에 의해 수신 된 UV 전력을 감소시킬 수있다 계란 추가의 물 층 중간 매립 두꺼운 층 빔 경로.

향후 다른 형질 전환 어류 라인의 교차점은 레이저 - 유도 된 세포 파괴 등 신경교 다른 영향 세포의 반응 (12 시간까지) 즉각적이고 단기간의 시각화를 허용 할 것이다. 예를 들어, ALS 같은 신경 퇴행성 질환에서 성상 세포와 비 세포 자치 독성 연구 스포트 라이트에왔다 무겁게 산발적 인 및 가족 ALS (37), (38)의 병원성에 연루되어있다. 그러나 메커니즘 폐해 독성 및 선택성을 기초모터쪽으로 신경 불분명 남아 있습니다. 우리와 다른 사람은 최근 미세 아교 세포가 신경 세포를 죽음의 말림을 연구하기 위해이 방법을 이용했다 및 신경 세포의 잔재 (27), (39), (40)의 간격을 시각화.

고해상도 현미경 신경 염증 마커와 박리 기술을 결합하여 미래의 연구자들은 단일 세포의 기능 및 상호 전지 시스템의 이해를 확장하는 것을 허용 할 것이다. 생체 내 환경에서 이러한 프로세스의 특성 발달 설정에서뿐만 아니라 세포의 상호 작용이 3 손상 될 수 MND, (41)를 포함하는 신경 퇴행성 질환의 모델뿐만 아니라 중요합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose low melting Fisher-Scientific Dissolve in egg water with tricaine (0.02%) at 0.8 - 1.5%
Tricaine Argent Labs MS-222 0.02%
Harvard standard wall Borosilicate with filament Capillary Glass World Precision Instruments, Inc. GC100F-10 (short)
GC100F-15 (long)
Pull to a resistance of 2 - 7 MΩ
Egg water  0.6 g Instant Ocean sea salt, 4 mL of 1 mg/mL methylene blue in 10 L deionized water
1-phenyl-2-thiourea (PTU) Sigma P7629
Pronase Sigma 10165921001
Heat block Select BioProducts Digital block heater (SBD110_)
Microinjection apparatus World Precision Instruments, Inc. Microinjection was performed by hand under a steromicroscope (Leica) with a loaded glass needle and a Picospritzer II (General Valve corporation)
Stereoscope Leica Bright field illumination microscopy was performed on a Leica M165FC stereo dissection microscope (Leica)
Microscope Leica  SP5
35 mm glass bottom dish MatTek Corporation P35G-0-20-C

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References

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