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Summary

생체 전체 기관 이미징 내에서 조직 또는 치료 군간 형광 표지 된 화합물의 상대적 농도를 결정하기위한 빠른 방법이다. 더욱 노동 집약적 인 반면 반대로 정량적 형광 조직학, 표지 분자의 절대 조직 레벨의 정량을 허용한다.

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McGowan, J. W. D., Bidwell, III, G. L. The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules. J. Vis. Exp. (118), e54987, doi:10.3791/54987 (2016).

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Abstract

형광 표식은 시험 관내 및 생체 내 실험은 다양한 조건하에 표지 된 분자의 운명을 조사하기위한 잘 확립 된 방법이다. 형광 프로브는 소형 분자 형광 라벨의 첨가 반응 속도 또는 화합물의 생체 분포에 영향을 미칠 가능성이 투여 큰 분자의 생체 분포를 결정하는데 특히 유용하다. 다양한 방법이 필요한 노력의 양이 현저하게 변화하고 생체 분포를 조사하기 위해 존재 얻어진 측정 완전히 정량적이지만, 생체 분포 분석을위한 신속하고 효율적인 시스템을 제공 할 수있는 결합 된 여러 방법들을 사용 여부.

생체 전체 기관 촬상 신속하고 조직 내 또는 조직 치료 집단의 여러 유형의 형광 분자 사이의 상대 농도를 비교하는 데 사용될 수있는 방법이다. 이미징 작은지면을 사용하여손상 조직 내에 살아있는 동물 또는 전체 기관 촬상 형광 설계된 형태 전체적인 생체 분포의 정확한 정보를 제공하면서 시간과 노동력을 절감 추가 처리없이 결정될 수있다. 이 공정은 화합물의 조직 특이성을 결정하기 위해 시도하는 실험에서 또는 다수의 상이한 화합물의 비교에 적합하다. 반면에, 양 조직 조직학은 표지 된 화합물의 정량적 인 측정 값을 생성하기 위하여 조직의 광범위한 추가 처리를 필요로한다. 정확하게 생체 분포를 평가하기 위해, 관심있는 모든 조직 슬라이스를 스캔하고, 조직 또는 그룹 간 비교를 위하여 표준 곡선에 대하여 분석한다. 정량적 조직 조직학은 조직 내에서 절대 화합물의 농도를 결정하기위한 금 표준이다.

여기서, 우리는 두 가지 방법은 다른 투여 방법 (A)의 능력을 평가하기 위해 함께 효과적으로 사용될 수있는 방법을 설명차 복합 수정 대상 및 중추 신경계 (1)에 형광 표지 된 분자를 제공합니다.

Introduction

형광 표지는 화합물의 생체 분포를 결정하는 많은 실험실 장비에 공통 인 범위를 사용하는, 쉽게 활용하고 효과적인 방법이다. 형광은 비교적 저렴하고 광범위하게 이용할 수 있으며, 다수의 표지 분자는 간섭없이 동시에 이용 될 수있는 파장의 다양한 온. 대부분의 형광 물질은 표적 화합물에서 다른 반응성 그룹에 대한 화학 결합의 범위를 가지며, 접합 과정은 반응성 부위 점유율 타입 일반적 쉽다. 또한, 형광 표지 된 화합물의 측정에 필요한 장비는 많은 실험실에서 일반적이다. 형광 현미경 이미 저들 및 슬라이드 스캐너 모두 형광 라벨의 사용이 매우 접근 할 수 있도록 다양한 상황에서 사용될 수있다. 형광 라벨은 종종 생체와 화합물의 생체 분포 및 반응 속도를 결정하는 데 사용예 IVIS 스펙트럼 이미 저와 같은 양적 조직의 조직 학적 2,3에 의해 라이브 영상 장치와 오.

실시간 이미징 장치를 사용하여 생체 전체 기관 이미징의 사용으로 인해 사용 신속 tissues4의 추가 처리를 필요로하지 않고 표지 된 화합물의 상대적 농도의 정확한 비교를 생성하는 능력의 용이성으로 시간이 지남에 따라 증가했다. 생체 전체 기관 촬상 쉽게 분석 및 비교를 동시에 할 수 있지만, 그 조직 내에서 절대 화합물 농도의 정량적 측정 값을 생성하지 않는다. 이것은 그대로 장기 내의 광 산란 효과 때문이다. (조금 적게, 흡광도와) 광 산란 조직의 크기와 밀도에 따라 다양하기 때문에, 전체 기관 이미징 크거나 조밀 한 기관에서 조직의 수준을 과소 평가 할 수 있습니다. 한 두께를 모방해야하므로 절대적 농도 측정에 적합한 표준을 수립하기 어렵다각 개별 기관의 밀도. 한편, 전체 기관 이미징 에이전트의 상대적인 조직 수준을 얻는 신속한 방법이며, (예를 들면 약물 표적 연구에서와 같이) 여러 관련 분자의 상대적 생체 분포를 비교하기에 적합하다. 또 다른 전략은 정량적 형광 조직학 정량적 오토 라디오 그래피의 방법으로부터 유도 된 기술을 활용하는 시험 제제의 절대 5,6- 조직 수준을 얻을 수있다. 오히려 상상 장치에 전체 동물 또는 기관을 배치보다 양적 조직의 조직 학적 각 조직 스캔 슬라이드에 장착, 분리, 개별적으로 분석해야합니다. 시험 제제의 표준 제조하고 기관 샘플과 동일한 두께로 슬라이스된다. 동일한 두께로 모든 장기 및 표준을 절단함으로써, 빛의 산란 또는 흡수로 인한 변동을 제거하고, 조직 형광 강도 절대 승낙을 결정하는 표준 곡선에 적합 할 수있다정액. 제대로하는이 방법은, 정량적 인 반면, 노동 집약적 쉽게 걸린이다. 전체 기관 촬상 비교하면 양적 조직학 및 노동의 상당히 높은 비용보다 복잡한 특성상 각 공정은 형광 표지 된 화합물의 생체 분포를 검사하는 경우에 사용하는 대부분의 실용적이다 검사 가치가된다. 이 프로토콜을 통해, 이러한 방법으로 또는 SynB1 또는 타트 세포 투과 펩티드를 첨가하지 않고 효율적 로다 민 - 표지 된 엘라스틴 같은 폴리펩티드 (ELP)의 생체 분포를 비교하기 위해 함께 사용될 수있는 방법의 상세한 설명을 제공한다 비내 (IN) 및 정맥 내 (IV) 투여 경로.

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Protocol

참고 :이 프로토콜의 모든 동물의 사용은 미시시피 의료 센터의 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었다.

동물과 조직 1. 치료

  1. 관리 및 희생
    1. 5 분 동안 3 % 이소 플루 란을 이용하여 동물을 마취하고 발가락 핀치 반사의 유무를 관측함으로써 마취 깊이를 확인. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 수의학 연고를 적용합니다.
    2. 동물의 체중 및 1.5mL 용량 튜브 중 로다 민 - 표지 ELP, SynB1-ELP 또는 타트-ELP의 50 밀리그램 / kg 용량을 피펫. 이후 단계에서 표준 곡선의 제제의 투여 표지 화합물의 100 μL를 저장합니다.
      주 : 기준 형광 표지 효율의 변동에 의한 차이를 방지하기 위해 동물에게 투여 표지 단백질의 동일한 배치로 제조 될 수 있다는 것이 중요하다. 적절 배경 fluores을 제거하기 위해서나중에 형광 측정에서 cence은, 미처리 된 동물은 처리 된 동물과 동일한 방법 / 시약을 사용하여 희생해야합니다.
    3. 이전에 꼬리 정맥 또는 (고간에 1 cm 절개를 통해 액세스) 대퇴 정맥을 사용하여 한 바와 같은 IV 주입을 관리. 사타구니 절개를 만드는 경우 진통제를 들어, 5 ㎎ / ㎏의 용량으로 피하 투여 카프로 펜, 및 상처 클립으로 고정하기 전에 절개 사이트 sensorcaine 적용. 비강 (IN) 경로를 통해 관리하기 위해, 부정사 위치에 동물을 배치합니다.
    4. 2 μL 피펫을 사용하여, 표지 화합물의 1 μL 드롭을 그립니다. 간단히 콧 구멍에 액세스 할 수 있도록 마취 칼라에서 동물의 머리를 밀어 넣습니다.
    5. 단일 레즈의 개방에 피펫의 팁을 놓고 천천히 방울 비강에 레즈를 실행할 수 있도록 플런저를 우울. 전체 용량이 광고가 될 때까지 콧 구멍마다 드롭 교대, 매 1 분을 반복사역.
      참고 : IN을 통해 관리되는 최대 볼륨 10 초과하지 않아야합니다 - 쥐 15 μL를.
    6. 개별 케이지로 각각 이동하기 전에 최종 투여 후 10 분 동안 마취하에 앙와위에서 동물을 둡니다.
      참고 :이 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 무인 동물을 두지 마십시오.
    7. 1 시간 투여 후, 이전과 동물을 다시 마취와에서 (PO 4, 9,000.0 ㎎ / ℓ의 NaCl, 726 ㎎ / ℓ 나 2 HPO 4 · 7H 2 O 210.0 ㎎ / ℓ의 KH 2) PBS를 사용하여 transcardial 관류를 통해 그들을 희생 20 ㎖의 총 10 mL / 분.
      주 : 희생 동물의 조직 관류의 모든 혈액을 제거하는 표지 된 화합물의 혈관 외 농도를 결정할 필요가있다. 관류 시약은 배경 형광 변경 될 수 있습니다 및 일관성을 유지해야합니다. 희생 방법은 일관되어야그룹 내. 희생 다른 방법은 혈관 내 혈액의 농도를 변화 조직의 배경 형광 변화 될 수있다.
  2. 조직의 컬렉션
    1. 제거 된 조직을 세정 대해 전술 한 바와 같이 PBS를 준비한다.
      주의 : 다른 버퍼 관류 액으로 사용 된 경우, 동일한 완충액에서 조직을 헹군다.
    2. 간단한 절개하여 심장, 폐, 위, 간, 비장, 신장을 제거합니다. 실험실을 사용하여 건조 두드려 또는 과잉 습기를 멀리 심지와 영상 매트에 조직을 배치하는 잎사귀 전에 간단히 PBS로 씻어.
    3. 마우스를 목을 벨과 뼈 절단기 또는 rongeurs를 사용하여 두개골의 상단을 제거합니다. 집게를 사용하여 조심스럽게 그대로 후각 전구를 유지, 뇌를 제거합니다. 건조 린스, 그리고 제공된 영상 매트에 놓습니다.
    4. 빠른 배출 (7)을 통해 척수를 제거하려면, PBS로 10 ML의 주사기를 작성하고 무디게 18 게이지 바늘을 연결합니다.
      참고 : 18 게이지 적합을많은 마우스 라인의 성인 척추관. 필요한 직경은 동물의 크기에 따라 달라집니다.
    5. 잘린 사이트에서 척추 운하의 개통은 깨끗하게 절단 및 혈액의 무료 것을 보장하기 쉬운 위치에 동물을 배치합니다.
    6. 척추 주위에서 피부를 제거합니다. 날카로운 뼈 커터 나 가위를 사용하여 엉덩이에 직접 주동이의 허리 부분의 척추를 잘라.
    7. 간단히 척추 운하를 시각화 PBS로 씻어. 부드럽게 척추 운하에 바늘을 삽입합니다.
      참고 : 바늘이 아늑한 느낌을해야 앞뒤로 삽입시 약간 느린 회전을 필요로 할 수있다. 바늘이 느슨한 느낌이 경우, 더 주동이의 절단이 가능하다 또는 큰 직경의 바늘이 필요할 수 있습니다.
    8. 엄지와 검지를 사용하여 삽입 된 바늘 주위 척주에 압력을 적용한다. 중간 및 일정한 압력과 플런저를 우울. 척수는 척추의 주동이의 개방 그대로 밖으로 배출합니다기둥.
      참고 : 합리적으로 5 년에 완료 할 수있는 모든 주요 장기의 완전한 제거, 세척, 건조 - 7 분. 이 짧은 시간 과도한 빛에 노출과 조직에서 표지 단백질의 침출 될 수 있습니다 PBS에서 확장 스토리지에 대한 필요성을 방지 할 수 있습니다.

2. 전체 기관 예 생체 형광 이미징

  1. 영상 매개 변수
    1. 화상 획득 소프트웨어를 시작한다. 인수 제어판의 오른쪽 하단에서 "초기화"를 클릭하십시오.
    2. 에서 "영상 모드"는 "형광"체크 상자를 선택합니다. 에서 "노출 시간", "AUTO"를 선택합니다.
    3. 에서 "비닝 (binning)", "작은"를 선택하고 2로 F / 중지를 설정합니다.
    4. 535 nm의 여기 및 580 nm의 방출 필터를 선택합니다.
      참고 :이 사용되는 라벨에 따라 달라집니다.
    5. "보기 B의 필드"를 선택하고 타지을 설정0.3 cm에 t 높이.
      참고 :이 이미지화 할 수있는 조직에 따라 달라질 수 있습니다.
    6. 온도 표시 (기계를 의미하는 것은 완전히 초기화) 녹색으로 변되면, 조직이 완전히 서로 분리되는 것을 보장 제공 검은 색 매트에 조직을 배치합니다. 모든 조직이 선택한 영역의 격자 내에 있다는 것을 보장 이미 저에 매트를 놓습니다. 로브의 중첩을 감소시키기 위해 이러한 전체 간 등 크고 비 균일 한 조직을, 배치한다.
      주 : 조직은 단일 동물 또는 유사한 유형의 조직을 모두 수용 할 수 있도록 하나의 이미지를 허용하는 하나의 그룹으로 함께 배치 될 수있다. 이것은 쉽게 나중에 분석 및 조직을 만든다. 형광 강도에 큰 차이가 다양한 조직간에 존재하는 경우 하나의 노출 시간은 모든 조직의 강도에 적합하지 않을 수 있기 때문에, 화상을 단독으로 또는 동일한 조직 유형의 그룹으로하는 것이 최상이다.
    7. 클릭 "취득."
    8. 촬영 후 즉시 조직을 제거하고 저장 또는 4 단계에 설명 된대로, 양적 조직학을 위해 그들을 고정.

3. 표준 및 이미지 처리

  1. 기준
    1. PBS에 희석하여 15 개의 일본어 농도부터 동물의 치료에 사용되는 각 단백질의 2 배 희석액을 만든다.
      주 : 농도 범위가 예상되는 조직 농도를 포함하는 것을 목표로해야하며 출발 농도에 따라, 원래의 샘플의 추가 희석을 필요로 할 수있다.
    2. 블랙 96- 웰 플레이트의 각 웰에 각 표준 100 μL 피펫. 배경 형광의 측정치를 얻기 위해 순수한 PBS 잘 하나를 포함한다.
    3. 이미지 티슈 이미징에 사용되는 동일한 매개 변수를 사용하여 표준.
    4. 이미지 수집 소프트웨어에서 "도구 팔레트" "ROI 도구"에서 선택이자의 "지역 (ROI) "원과 잘 하나 주변의 투자 수익 (ROI)을 그립니다. 투자 수익 (ROI)이 다른 가득 우물의 모든 복사를 클릭 "는 ROI를 측정한다."
    5. 다른 기준의 값으로부터 순수한 PBS 평균 방사 효율의 값을 뺀다; 이 배경 형광을 제거합니다. 산점도에 알려진 농도에 대한 값을 플롯.
      주 : 선형 트렌드 라인의 생성 식은 다음 상대 형광 값을 계산하는데 사용될 수있다.
  2. 이미지 처리
    1. 이미지 수집 소프트웨어에서 자유 ROI 도구를 선택하고 개별 조직의 각 주위에 ROI를 그립니다. '측정'을 클릭합니다.
    2. 얻어진 평균 방사 효율의 측정을 각 조직 유형의 비 처리 된 동물로부터 측정 된 값을 감산하여 이전에 생성 된 표준 곡선에 그 값을 플롯.
      참고 얻어진 상대 형광 값은 신속하고 정확한 스냅 샷을 제공하는표지 화합물의 생체 분포.

4. 양 조직의 조직학

  1. 슬라이스에 대한 조직의 준비 및 냉동
    1. 만들거나 사용하기에 충분한 선택된 조직을 동결 크기와 그라 이오 스탯의 컨테이너를 구입할 수 있습니다. 적절한 크기와 모양의 물체에 포장 알루미늄 호일은 잘 작동합니다.
    2. 드라이 아이스와 500 ㎖의 비이커의 절반을 채우고 부분적 냉동 컨테이너 잠수함 드라이 아이스 위에 충분한 액체가되도록 이소프로판올 ~ 350 mL를 첨가하여 이소프로판올 드라이 아이스의 혼합물을 준비한다.
      참고 : 액체 질소가 종종 최적의 절단 온도 화합물 OCT (), 임베디드 조직의 파괴를 초래하고 피해야한다.
    3. 현재 기포가 없음을 보장 10월에 부분적으로 냉동 컨테이너를 입력합니다. 거품이 존재하는 경우, 집게를 사용하여 용액으로부터 기포를 작동 또는 유사한 구현.
    4. 조직을 제거PBS 및 건조 그것을 철저하게, 하나 부드럽게 닦아 연구실 또는 실험실에 민감한 조직의 가장자리를 닦아 감동과 액체가 떨어져 심지 할 수 있도록하여 두드리기에 의해.
    5. 조직 아래에 거품을 소개 않도록하면서, 냉동 컨테이너 내부 OCT를에 부드럽게 조직을 놓습니다. 조직이 제자리에 있으면 조직이 완전히 덮여 때까지 OCT를 추가 할 수 있습니다.
    6. 이소프로판올 용기 내부의 노출 된 경우 OCT 접촉 할 수없는 수만큼 냉동 컨테이너를 담근다. 한 필요에 따라 -80 ℃에서 저장하기 전에 완전히 동결은 OCT 및 조직 90의 (또는 더 큰 조직에 대한 잠재적 인 이상) - (30)를 허용합니다.
  2. 슬라이스에 대한 표준의 준비.
    1. 준비 적절 배럴의 단부를 제거하여 1 ㎖의 일회용 주사기 라벨 주사기의 전체 길이는 하나의 직경이되도록. 이 냉동 실린더 나중에 밀려 될 수 있습니다.
    2. 우리이전에 PBS로 이루어졌다으로 OCT를, 투여 화합물의 15 단계의 두 가지 직렬 희석을 만들 보내고 있지만, 1 mL의 최종 결과 볼륨. 배경 형광 값의 제거를위한 순수의 OCT 하나의 샘플을 포함합니다.
    3. 10월의 점도는 적절한 혼합이 어려워집니다. 튜브를 반전하고 OCT를 완전히 다시 반전 전에 정착 할 수 있습니다. 균일 한 혼합물을 보장하기 위해 20 시간 -이 (10)를 반복합니다. 혼합 동안 빛으로부터 4 ° C에서 멀리 표준 용액을 유지합니다.
    4. 혼합 한 후, 다시 이전과 같이, 이소프로판올 및 드라이 아이스의 혼합물을 준비한다.
      주 : 액체 질소는 또한 이소프로판올 / 드라이 아이스 혼합물 대신에 사용하고 그들이 얼어 후 주사기 신속 제거를 제공 할 수있다.
    5. 가능한 한 적은 수의 거품을 소개 돌보는, 주사기로 OCT의 표준을 그립니다. OCT의 용액을 그린 후, 즉시 이소프로판올에 직접 주사기 Dip와 용액이 완전히 정지 할 수 있도록20 초 - 10 주사기 내부. 한 필요를 위해 -80 ° C에서 주사기를 저장합니다.
  3. 조직 및 표준의 절단
    1. -20 ° C에서 모두 조직과 표준을 놓고 모든 샘플은 온도에 와서하려면 충분한 시간이 필요합니다.
      주의 : 이상적 가공 온도는 일반적으로 대부분의 조직에 대해 -10 ° C 범위의 주위 하강하지만 궁극적으로 조직의 크기 및 지방 함량에 따라 실험적으로 정제되어야한다.
    2. 이전에 8 바와 같이 저온 유지 장치를 사용하여, 20 μm의 두께 조각으로 조직을 잘라 슬라이드에 그들을 탑재합니다. -20 ° C에서 슬라이드를 저장하고 절단시 스캔 할 때까지 거리에 가능한 한 많은 빛에서 보관하십시오.
      참고 :이 부분은 적절하게 조직의 전체 두께에 걸쳐 분포 측정 할 것은 여기에서 중요하다.
    3. 그라 이오 스탯 척에 기준을 마운트하려면 냉장고에서 주사기를 가지고 3 외부를 따뜻하게 - HOL 5의땡 그 손입니다. OCT를 실린더의 짧은 섹션 (~ 1cm)까지 플런저를 밀어하면 주사기의 밖에 있습니다.
      1. 면도칼을 사용하여, 실린더의 실수로 제자리에 고정하는 OCT를 사용, 척에 수직으로 인한 실린더 섹션을 배치합니다. 잘 정의 원을 초래한다이 구성은 차단된다.
    4. 하나의 슬라이드 전체 표준 곡선을 나타내도록, 하나의 슬라이드에 각 희석에서 한 조각을 배치, 20 μm의에서 실린더를 슬라이스. 스캔 할 준비가 될 때까지 -20 ° C에서 슬라이드를 저장합니다.
  4. 검사 및 정량
    1. 스캔 배열 소프트웨어를 시작하고 레이저 시동 절차를 시작하기 "(543) 레이저"를 클릭합니다. 레이저를 준비하는 15 분 동안 기다립니다.
    2. 레이저가 준비되면, -20 ° C에서 슬라이드를 제거하고 온도에 와서 큰 빛 보호 용기로 이동하고 3 분 동안 건조. 이 SLI에 수분 축적을 방지 할 수 있습니다드 스캐너.
    3. 슬라이드 스캐너의 슬라이드 콘센트에 슬라이드를 넣습니다. 클릭하여 "검색"을 선택 "쉬운 검색을 실행합니다."
    4. 50 μm의 스캔 해상도를 설정합니다.
    5. "형광"에서 최초의 "사용"체크 상자를 선택하고 "TRITC을."80 %의 PMT 게인을 설정합니다.
      참고 :이 설정은 형광 및 표지 분자의 농도에 따라 달라집니다.
    6. 좌측에서, 스캔 영역 전체 슬라이드를 포함하는 것을 보장한다. 클릭 "시작합니다."
    7. 스캔 한 후, "파일"을 선택하고 "다른 이름으로 저장"다음이 .tif로 이미지를 저장합니다.
      참고 : 조직 및 표준의 슬라이드는 같은 설정을 검사해야합니다.
    8. ImageJ에로 생성 된 이미지를로드하고 조직 및 표준 주위의 ROI를 선택합니다. 은 "분석"탭에서 "측정 설정"을 선택하고 "회색 값을 의미한다."를 클릭합니다(220), 측정 ".
      참고 : 이전 기술과 마찬가지로, 배경 형광 모든 측정 값에서 차감해야합니다.
    9. 표준 곡선을 만들기 위해 알려진 농도에 대한 기준에서 평균 회색 값 측정을 플롯.
      주 : 조직으로부터 얻어진 측정치는 각 조직에서 평균 및 조직 내 농도를 결정하는 표준 곡선을 플롯 팅한다.

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Representative Results

세포 침투 펩타이드 (SynB1-ELP와 문신-ELP) 9 수정 ELP 및 ELP의 두 가지 버전으로 알려진 약물 전달 벡터 : 아래의 데이터는 세 가지 화합물의 전달을 설명합니다. 세 화합물은 테트라 메틸 -5- 말레이 미드로 표지 두 투여 경로를 통해 전달 된 (IN 및 IV). 이 실험의 목적은 중추 신경계 (CNS) (3)에 가장 침투 초래하는 화합물, 및 투여 경로를 결정하는 것이었다.

그림 1A 표시 담당자 생체 처리 된 동물 기관의 전체 기관의 이미지. 열지도 오버레이는 조직 내에서 방사 효율의 형광 수준을 보여줍니다. 각 조직 주위와 해당 기준 곡선의 해당 값을 플로팅하여 ROI를 도면으로,도 1b에 도시 된 표준화 된 형광 값이 생성된다. 표준화 된 fluorescenCE 값은 다음 상이한 화합물의 상대 농도의 정확한 비교를 위해 사용될 수있다. 이러한 데이터는 정확하게 특정 조직 내로 침투에 ELP 변형의 영향뿐만 아니라, 각 화합물의 투여 경로의 효과를 모두 기술한다. 이러한 결과, IN 투여를 통해 전달 ELP는 CNS에 도달하는 가장 효과적인 조합이 있는지 바로 알 수있다.

이러한 결과는 최고의 관통 화합물 및 전달 방법을 결정하는 데 도움이 동안, 그들은 실제 농도 또는 CNS 내의 화합물의 지역 현지화를 설명하지 않습니다. 가 선택된 뇌 영역의 정량적 인 측정이 가능 정량적 조직학, 이들 화합물의 생체 분포에 대한 설명을 완료하는 것이 적합하다. 도 2a는 ELP IN 처리 동물 대표적인 슬라이스를 표시하고,도 2b는 ROI 영역이 분리 정량화 설명후각 전구, 반구와 소뇌. 이러한 데이터로부터, IN 경로에 의해 ELP 행정부가 높은 CNS 농도가 발생할 수 있지만, 그것은 주로 후각 전구 및 소뇌에서이 작업을 수행하는 것이 분명하다. 반대로, ELP는 IV가 전반적으로 낮은 농도를 가지고 있지만, 그것은 동등하게 뇌 전체에 분산되어 전달했다. 이러한 투여 화합물의 대상 및 다른 기관에서 효과에 대한 가능성에 따라, IN 또는 IV 투여 중 하나는 더 나은 선택이 될 수 있습니다. 이는 조직학 정량의 첨가없이 체결 될 수 없었다. 기술적으로, 양적 조직학는 모든 그룹의 모든 조직에서 사용되었을 수 있습니다 만, 여전히 같은 결론을 초래하면서 함께 두 가지 방법을 이용하여, 시간과 노동의 큰 거래는 저장되었습니다.

그림 1
그림 1 : 생체 외 전체 기관 형광측정. A)를 ELP 그룹의 대표 이미지. 열지도 축척은 방사 효율로 설정 하였다. B) 평균 방사 효율 값은 생체 분포의 비교를 위해 사용되는 표준화 된 형광 값을 생성하기 위해 표준 곡선 분석 하였다 개별 조직 주위의 ROI 생성 얻은. 오차 막대는 SEM을 나타냅니다. 스케일 바 = 5 mm이다. (맥고완에서 수정, 등;. 약물 설계, 개발, 및 치료; 2016) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : 양적 조직 조직학 측정. 조각 O를 장착 ELP IN- 20 μm의 두께 슬라이스 두뇌에 의해 생성 IV-처리 된 동물의 A) 대표 이미지N 슬라이드, 다음 슬라이드를 형광 스캐너를 사용하는 슬라이드 스캔. B) μg의 / ㎖ 농도의 측정치를 생성하기위한 표준 곡선의 평균 그레이 값으로 측정하고, 착용감, 후각 망울, 반구와 소뇌 주위 ROI를 생성으로부터 얻어진 평균값. 오차 막대는 SEM을 나타냅니다. 스케일 바 = 5 mm이다. (맥고완에서 수정, 등;. 약물 설계, 개발, 및 치료; 2016) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

생체 전체 기관 촬상 일반적으로 간단하지만, 기본 개념 및 기술에 부착 바이오 분포 측정의 정확도를 향상시킬 수있다. 광 경험 단파장 대부분의 조직에서의 산란과 흡수가 높은 유의 한 영향 단파장 형광체의 유용성. 이러한 형광체는 깊은 조직 연구에 응용이 제한되어 있지만, 표면 조직 또는 눈으로 보는 실험에서 효과적으로 사용되어왔다. 반대로, 빛의 긴 파장은 더 큰 침투 두꺼운 조직 (10)와보다 정확한 결과, 훨씬 적은 산란 및 흡수를 받아야. 스펙트럼의 원적외선과 근적외선 (NIR) 범위 (여기 ~ 600 ㎚)에 빠질 형광체는 일반적으로 전체 동물이나 큰 조직을 위해 선택된다. 이러한 장파장 형광체 특히, TIS의 자동 형광을 이용한 실험고소 또는 재료는 가능성이 중요한 고려 사항이다. 600 nm의 범위 - 예를 들어, 설치류의 담낭 내 담즙이 높은 자동 형광 500의 파장이다. 이 크게 간 값을 왜곡 할 수 있기 때문에, 촬영 전에 쓸개를 제거하는 것이 최선이다. 본래 간 및 담낭가 필요한 경우 또는, 스펙트럼의 가장 먼 단부에 여기 파장의 형광을 선택하면 담즙 자동 형광의 영향을 제한 할 수있다. 또한, 일반적인 설치류 chows 많은 스펙트럼의 중간과 멀리 범위에 걸쳐 높은 형광 정제되지 않은 알팔파가 포함되어 있습니다. 선택한 라벨은 그 파장에 속하고 소화 기관을 이미지화 할 경우, 다이어트의 변화 가능성이 최선의 방법입니다.

실시간 이미징 시스템이 정확하게 비 균일 특히 두꺼운 조직 두꺼운 조직 (예를 들면, 전체의 래트 간)을 측정하도록 설계되어 있지만,보다 정확한 측정을 할 수있는 자주EN은 간 로브가 가능한 한 적게 겹치도록 밖으로 조직을 분산시킴으로써 얻어진다. 또한, 경우에 조직은 조직의 여러 측면에서 매우 왜곡 된 표지 분자의 분포, 영상이 그 측정 값을 평균하여 정확도를 높일 수있는 위치. 궁극적으로 조직의 유형을 묘화하기 위해, 그 조직 및 투여 표지 분자의 전위 분포와 관련된 재료의 자동 형광 심하게 제한 적합한 여기 및 방출 파장의 형광을 선택하기 위해 고려되어야 가능한 한 간섭.

양적 조직 조직학을 수행 할 때 유의해야 할 몇 가지 중요한 세부 사항이 있습니다. 결과가 정확하기 위해서는, 조각 전체 조직 또는 지역에 걸쳐 수행해야하는 분석한다. 이것은 이러한 조직은 다른 프로세스에 사용할 수 없음을 의미합니다. 수정하고 얼룩 후하는 것이 가능할 수있다스캔 있지만 슬라이스 미래 착색에 영향을 미칠 수있는 스캐너에 넣어 약간 전에 건조되도록 전형적 최상이다. 마찬가지로, 스캔 후속 공정에서 잠재적 인 신호를 감소 사진 표백 어느 정도의 원인이됩니다. 다운 스트림 현미경 응용 프로그램의 경우, 우수한 부분은 일반적으로 조직을 고정하고 절편하기 전에 자당 용액을 평형화에 의해 달성된다. 그러나,이 프로세스는 가장 인해 고정 및 / 또는 긴 자당의 효과 상기 정량적 조직학 프로토콜에서 형광 강도에 젖은 회피된다. 주변의 빛도 낮은 수준에 노출 된 경우에도 신호 존재의 양에 따라, 조각 사진 표백가 발생할 수 있습니다. 차가운 멀리 빛 슬라이드를 유지하는 것은 상당히 얻어진 측정의 정확성을 개선 할 것이다. 전반적으로주의해서 취급과 준비는 크게 최종 결과를 향상시킬 수 있습니다.

다른 다양하다방법은 생체 분포 및 기술적 어려움, 처리량 정밀도 다양 고분자 투여의 약동학 연구를 채용하고, 기기 (11)가 필요했다. 양적 면역 및 생체 활성 분석은 모두 기술적으로 복잡하고 비용과 노동에 크게 추가 투여 분자에 특이적인 항체 시약을 필요로 할 수 있습니다. 방사성 동위 원소 표지에 따라 여러 방법의 정확도를 가변하여, 이전에 사용 되었으나, 거대 분자에 방사성 동위 원소의 통합뿐만 아니라, 데이터 자체의 수집은 크게 제조를 필요로하고 종종 더 (12)를 분석을 위해 완전히 불가능 조직을 렌더링 할 수있다. 마지막으로, 양전자 방출 단층 촬영 및 질량 분석기를 포함 효과적인 것으로 도시 다른 방법으로는, 전형적으로 요구되는 장비의 부족 단순히 배제한다. 전술 한 프로토콜을 효율적으로 일을 결정하기위한 결합하는 두 가지 방법을 사용하여때문에 필요한 장비의 정기적 인 availably에 신속하고 비용 효율적인, 정확하고 쉽게 접근 방식으로 표시 분자의 전자 바이오 분포.

이 방법은 CNS에 표지 분자의 전달을위한 최적의 벡터 및 투여 경로를 식별하는 상기 데이터를 생성하기 위해 사용되었다. 전 생체 데이터에서 ELP IN 관리 및 ELP는 IV가 양적 조직 조직학을 통해 더 특성화 확인되었다 관리. 정량적 조직 조직학은 최종 결론이 그려 질 수 있도록 상기 CNS의 특정 영역에 표시된 분자의 농도를 제공 하였다. 두 가지 방법은 복수의 특정 화합물의 생물학적 분포에 대한 상세한 검사를 수행하기위한 빠르고 효과적인 방법을 나타낸다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Maleimide derivitized fluorophors (e.g., tetramethylrhodamine-5-maleimide, AlexaFluor 633-C5-maleimide) Thermo Fisher T6027, A20342 Thiol reactive fluorescent dyes for protein labeling
Phosphate Buffered Saline Sigma 1002243569 PBS Buffer for rinsing
Optimal Cutting Temperature Compound Tissue-Tek 4585 Used for freezing and mounting
Equipment
IVIS Spectrum Perkin Elmer For ex vivo whole organ imaging
Cryomicrotome Thermo For cryosectioning
Fluorescence slide scanner Perkin Elmer For slide scanning

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References

  1. George, E. M., Liu, H., Robinson, G. G., Bidwell, G. L. A Polypeptide Drug Carrier for Maternal Delivery and Prevention of Fetal Exposure. J. Drug Target. 22, (9), 1133-1145 (2014).
  2. George, E. M., Liu, H., et al. Growth factor purification and delivery systems (PADS) for therapeutic angiogenesis. Vasc. Cell. 7, (1), 1-11 (2015).
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