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Summary

Ex - vivo - Ganzkörper -Bildgebung Organ ist ein schnelles Verfahren zur Bestimmung der relativen Konzentrationen von fluoreszierend markierten Verbindungen in und zwischen den Geweben oder den Behandlungsgruppen. Umgekehrt Histologie quantitative Fluoreszenz, während mehr arbeitsintensiv, ermöglicht die Quantifizierung der absoluten Gewebespiegel von markierten Molekülen.

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McGowan, J. W. D., Bidwell, III, G. L. The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules. J. Vis. Exp. (118), e54987, doi:10.3791/54987 (2016).

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Abstract

Fluoreszenzmarkierung ist ein gut etabliertes Verfahren , das Schicksal der markierten Moleküle unter einer Vielzahl von experimentellen Bedingungen für die Prüfung sowohl in vitro als auch in vivo. Fluoreszenzsonden sind besonders nützlich bei der biologischen Verteilung von großen Molekülen verabreicht Bestimmung, wobei die Zugabe eines niedermolekularen fluoreszierenden Markierung unwahrscheinlich ist, die Kinetik oder bio-Verteilung der Verbindung beeinflussen. Eine Vielzahl von Methoden existieren Biodistribution zu untersuchen, die deutlich in der Aufwand variieren erforderlich ist und ob die sich ergebenden Messungen sind vollständig quantitative, sondern mehrere Methoden in Verbindung verwenden, können bio-Verteilungen ein schnelles und wirksames System für die Analyse bereitzustellen.

Ex - vivo - Ganzkörper -Bildgebung Organ ist ein Verfahren , das schnell verwendet werden kann , um die relativen Konzentrationen von fluoreszierenden Molekülen innerhalb von Geweben vergleichen und zwischen mehreren Arten von Geweben oder Behandlungsgruppen. Mit Hilfe eines Imaging-platForm für lebende Tiere oder ganze Organ Bildgebung, Fluoreszenz in intakten Geweben kann ohne weitere Verarbeitung bestimmt werden, Zeit und Arbeitsersparnis und bietet gleichzeitig ein genaues Bild von der gesamten Bio-Verteilung ausgelegt. Dieses Verfahren ist ideal in Experimenten versucht, die Gewebespezifität einer Verbindung zu bestimmen, oder für den Vergleich von mehreren verschiedenen Verbindungen. Quantitative Gewebe Histologie auf der anderen Seite erfordert umfangreiche Weiterverarbeitung der Gewebe, um ein quantitatives Maß für die markierten Verbindungen zu schaffen. Zur genauen biologischen Verteilung beurteilen, alle Gewebe von Interesse muss in Scheiben geschnitten, gescannt werden, und in Bezug auf Standardkurven analysiert, um Vergleiche zwischen den Geweben oder Gruppen zu machen. Quantitative Gewebe Histologie ist der Goldstandard für absolute Verbindungskonzentrationen im Gewebe zu bestimmen.

Hier beschreiben wir, wie beide Methoden verwendet werden können, zusammen effektiv die Fähigkeit verschiedener Verabreichungsmethoden zur Beurteilung einesnd Verbindung Modifikationen zielen und fluoreszierend markierte Moleküle an das zentrale Nervensystem 1 zu liefern.

Introduction

Fluoreszenzmarkierung ist ein leicht eingesetzt und effektives Verfahren zur biologischen Verteilung von Verbindungen zu bestimmen, die eine Reihe von Geräten verwendet, die auf vielen Laboratorien üblich ist. Fluorophore sind überall erhältlich, relativ kostengünstig und kommen eine Vielzahl von Wellenlängen in, so dass mehrere markierte Moleküle ohne Störung gleichzeitig verwendet werden können. Die meisten Fluorophore haben eine Reihe von Chemien für die Konjugation an verschiedene reaktive Gruppen an Zielverbindungen und das Verfahren der Konjugation ist für die meisten Arten von reaktiven Stellen im allgemeinen einfach. Darüber hinaus sind die Geräte für die Messungen von fluoreszenzmarkierten Verbindungen erforderlich, die in vielen Labors. Fluoreszierende Mikroskope, Imager und Diascanner können alle unter verschiedenen Umständen verwendet werden, die sehr zugänglich Verwendung von fluoreszierenden Markierung zu machen. Fluoreszenzmarkierungen verwendet werden , häufig die Biodistribution und die Kinetik der Verbindungen zu bestimmen , sowohl in vivo als auch ex vivo mit Live - Imaging - Geräte, wie zum Beispiel die IVIS Spectrum Imager und durch quantitative Gewebe Histologie 2,3.

Die Verwendung von ex vivo Voll organ Abbildungs Live-Bilderzeugungsvorrichtungen verwendet , hat im Laufe der Zeit erhöhte sich aufgrund ihrer einfachen Verwendung und Fähigkeit, schnell einen genauen Vergleich der relativen Konzentrationen von markierten Verbindungen zu erstellen , ohne die Weiterverarbeitung von tissues4 erfordern. Während jedoch ex vivo Vollorgan Bildgebung für die einfache Analyse und den Vergleich ermöglichen kann, ist es nicht eine quantitative Messung der absoluten Konzentrationen der Verbindung innerhalb eines Gewebes zu erzeugen. Dies ist auf Lichtstreuungseffekte innerhalb intakter Organe. Da die Lichtstreuung (und in einem geringeren Ausmaß, Extinktion) variiert je nach Gewebegröße und Dichte können ganze Organbildgebungsgewebespiegel in großen oder dichten Organen unterschätzen. geeignete Standards für absolute Konzentrationsmessungen Formulieren ist auch schwierig, weil man die Dicke nachahmen mussund die Dichte jedes einzelnen Organs. Auf der anderen Seite, ist ganze Organ Bildgebung ein schnelles Verfahren, die relativen Gewebespiegel eines Mittels zu erhalten, und es ist ideal für die relative biologische Verteilung mehrerer verwandter Moleküle (wie in Drug-Targeting-Studien) verglichen wird. Eine alternative Strategie ist es, quantitative Fluoreszenz Histologie zu verwenden, eine Technik , die aus dem Verfahren der quantitative Autoradiographie abgeleitet, absolute Gewebespiegel eines Testmittels 5,6 zu erhalten. Anstatt Platzierung ein ganzes Tier oder ein Organ in ein Vorstellen Gerät erfordert quantitative Gewebe Histologie, dass jedes Gewebe geschnitten werden, auf Schlitten montiert, gescannt und einzeln analysiert. Standards des Testmittels werden mit der gleichen Dicke wie die Organproben vorbereitet und in Scheiben geschnitten. Durch das Schneiden wird alle Organe und Standards auf die gleiche Dicke, die Variabilität aufgrund von Lichtstreuung oder Absorption eliminiert und Gewebefluoreszenzintensität kann mit der Standardkurve fit absolute concent zu bestimmen,Ration. Während dieses Verfahren, wenn es richtig gemacht, quantitativ ist, es ist auch arbeitsintensiv und leicht falsch behandelt. die komplexer Natur der quantitativen Histologie und der deutlich höhere Arbeitskosten im Vergleich zu den gesamten Organ Bildgebung Da wird es lohnt sich zu untersuchen, wo jeder Prozess am praktischsten ist zu verwenden, wenn die Bio-Verteilung der fluoreszenzmarkierte Verbindungen zu untersuchen. Dieses Protokoll stellt eine ausführliche Beschreibung, wie diese Verfahren zusammen verwendet werden, um effizient die biologische Verteilung von Rhodamin-markiertem Elastin-ähnliches Polypeptid (ELP), mit oder ohne den Zusatz der SynB1 oder Tat zellpenetrierenden Peptide zu vergleichen, über die intranasal (IN) und intravenösen (IV) Verabreichungswege.

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Protocol

HINWEIS: Alle verwendeten Tiere in diesem Protokoll wurde von der Institutional Animal Care und Use Committee der University of Mississippi Medical Center genehmigt.

1. Behandlung von Tieren und Gewebe

  1. Verwaltung und Opfer
    1. Anesthetize die Tiere unter Verwendung von 3% Isofluran für 5 Minuten und überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie durch das Fehlen der Zehen Prise Reflex zu beobachten. Bewerben Veterinär Salbe in die Augen Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
    2. Wiegen Sie das Tier und Pipetten eine 50 mg / kg Dosis von entweder Rhodamin-markiertes ELP, SynB1-ELP oder Tat-ELP in ein 1,5-ml-Röhrchen. Sparen Sie 100 ul der verabreichten markierten Verbindungen zur Formulierung von Standardkurven in späteren Schritten.
      Hinweis: Es ist wichtig, dass die Standards von der gleichen Charge des markierten Proteins an die Tiere verabreicht, um gemacht werden, um Unterschiede zu vermeiden aufgrund der Variabilität in Fluoreszenzmarkierungseffizienz. Um Hintergrund fluores richtig entfernenzenz aus späteren Fluoreszenzmessungen, ein unbehandeltes Tier müssen die gleichen Methoden / Reagenzien wie den behandelten Tieren unter Verwendung geopfert werden.
    3. Administrieren eine IV - Injektion , wie oben beschrieben 1 entweder die Schwanzvene oder die Oberschenkelvene unter Verwendung (der über eine 1 cm lange Inzision in der Leiste zugegriffen wird). Für Analgesie, wenn eine Leisten Einschnitt, verabreichen carprofen subkutan in einer Dosis von 5 mg / kg, und gelten sensorcaine an der Einschnittstelle vor dem Verschließen mit einer Wundklammer. Um über die intranasale (IN) Route verwalten, legen Sie das Tier in Rückenlage.
    4. Mit einem 2-ul-Pipette, erstellen eine 1-ul Tropfen markierten Verbindung. Kurz den Kopf des Tieres gleiten aus der Narkose Kragen Zugang zu den Nasenlöchern zu ermöglichen.
    5. Setzen Sie die Spitze der Pipette auf die Öffnung eines einzelnen nare und den Kolben langsam niederdrücken, so dass die Tröpfchen die Nare in die Nasenhöhle zu überfahren. Wiederholen Sie alle 1 min, nares jeden Tropfen, bis die volle Dosis ist abwechselnd AnzeigeHabe.
      Hinweis: Die maximale Lautstärke über administrierter nicht 10 überschreiten sollte - 15 & mgr; l für Mäuse.
    6. Lassen Sie die Tiere in Rückenlage unter Narkose für 10 Minuten nach der letzten Verabreichung vor ihnen jeweils in einem individuellen Käfig bewegen.
      Hinweis: Tiere nicht unbeaufsichtigt lassen, bis sie genügend Bewusstsein wiedererlangt haben Brustlage zu halten.
    7. 1 h nach der Verabreichung Wieder anästhesieren die Tiere wie zuvor und opfern diese über transcardial Perfusion mit PBS (210,0 mg / L KH 2 PO 4, 9,000.0 mg / L NaCl, 726 mg / L Na 2 HPO 4 · 7H 2 O) bei 10 mL / min für eine Gesamtmenge von 20 ml.
      Anmerkung: Die Perfusion der Tiere bei der Opferung aller Blut aus dem Gewebe zu entfernen, erforderlich, um die extravaskuläre Konzentrationen der markierten Verbindungen zu bestimmen. Perfusions-Reagenzien können zu Veränderungen der Hintergrundfluoreszenz führen und sollte konsistent gehalten werden. Das Verfahren des Opfers sollte konsistent seininnerhalb von Gruppen. Verschiedene Methoden der Opfer können in unterschiedlichen Ebenen von Blut innerhalb des Gefäßsystems zur Folge haben, die Änderung der Hintergrundfluoreszenz des Gewebes.
  2. Sammlung von Geweben
    1. Bereiten PBS wie zum Spülen der entnommenen Gewebe beschrieben.
      Anmerkung: Wenn ein anderer Puffer als der Perfusionsflüssigkeit eingesetzt wurde gründlich Gewebe in dem gleichen Puffer.
    2. Entfernen Sie das Herz, Lunge, Magen, Leber, Milz und Nieren durch einfache Präparation. Kurz in PBS spülen, bevor Labor mit wischt überschüssige Feuchtigkeit zu trocken tupfen oder Feuchtigkeit ab und das Gewebe auf die Abbildungsmatte platzieren.
    3. Enthaupten die Maus und entfernen Sie die Oberseite des Schädels mit Knochenfräser oder rongeurs. Mit einer Pinzette vorsichtig entfernen das Gehirn, halten die Riechkolben intakt. Spülen, trocken, und legen Sie es auf der Abbildungsmatte zur Verfügung gestellt.
    4. So entfernen Sie das Rückenmark über schnelle Ausstoß 7, füllen einen 10-ml - Spritze mit PBS und fügen Sie eine abgestumpfte 18-Gauge - Nadel.
      Hinweis: 18-Gauge-fitsder erwachsene Spinalkanal vieler Mauslinien. Der erforderliche Durchmesser wird mit Tiergröße variieren.
    5. Legen Sie das Tier in der Bauchlage zu gewährleisten, dass die Öffnung des Wirbelkanals an der Enthauptung Seite ist sauber geschnitten und frei von Blut.
    6. Entfernen Sie die Haut aus der ganzen Wirbelsäule. Mit scharfen Knochenschneider oder einer Schere, schneiden durch die Wirbelsäule im Lendenbereich von bis zu den Hüften direkt rostral.
    7. waschen Sie es kurz mit PBS den Spinalkanal zu visualisieren. Führen Sie vorsichtig die Nadel in den Spinalkanal.
      Hinweis: Die Nadel eng fühlen sollte und kann einige langsame Roll benötigen hin und her während des Einsetzens. Sollte die Nadel locker fühlen, ein mehr rostral Schnitt kann oder einen größeren Durchmesser Nadel hergestellt werden erforderlich sein könnten.
    8. Mit dem Daumen und Zeigefinger, Druck auf die Wirbelsäule um die Nadel eingeführt. Drücken Sie den Kolben mit moderaten und konstanten Druck. Das Rückenmark intakt aus der rostrale Öffnung im Rücken auswerfenSpalte.
      Hinweis: Die vollständige Entfernung, Spülen und Trocknen aller wichtigen Organe vernünftigerweise in 5 abgeschlossen sein - 7 min. Diese kurze Zeit verhindert, daß die Notwendigkeit einer Langzeitlagerung in PBS, die in übermäßiger Belichtung und dem Auswaschen von markierten Proteine ​​aus dem Gewebe führen kann.

2. Ganz Organ Ex vivo Fluoreszenz - Imaging

  1. Imaging-Parameter
    1. Starten Sie die Bildaufnahme-Software. In der rechten unteren Ecke des Erwerbs Control Panel, klicken Sie auf "initialisieren".
    2. Unter "Aufnahmemodus", wählen Sie die "fluoreszierend" markieren. Unter "Belichtungszeit" die Option "AUTO".
    3. Unter "Binning", wählen Sie "klein" und die F / Stop auf 2 gesetzt.
    4. Wählen Sie die 535-nm-Anregung und 580-nm-Emissionsfiltern.
      Anmerkung: Diese variiert abhängig von der verwendeten Markierung.
    5. Wählen Sie "Field of View B" und stellen Sie die target Höhe 0,3 cm.
      Anmerkung: Diese variiert auf die Gewebe je abgebildet werden.
    6. Sobald die Temperatur-Anzeige grün leuchtet (die Maschine Bedeutung ist voll initialisierten), legen Sie die Gewebe auf dem schwarzen Hintergrund Matte versehen, um sicherzustellen, dass die Gewebe vollständig voneinander getrennt sind. Legen Sie die Matte in der Imager sicherzustellen, dass sämtliche Gewebe innerhalb der gewählten Region Gitter sind. Größere und inhomogenen Geweben, wie die ganze Leber, sollte angelegt werden, um die Überlappung der Flügel zu reduzieren.
      Anmerkung: Die Gewebe können zusammen in einer einzigen Gruppe angeordnet werden, so dass ein Bild eines einzelnen Tieres oder allen Geweben einer ähnlichen Art aufzunehmen. Dies macht Analyse und Organisation später einfacher. Wenn große Unterschiede in der Fluoreszenzintensität unter verschiedenen Geweben vorhanden sind, ist es am besten Bild sie einzeln oder als Gruppen aus dem gleichen Gewebetyp, wie eine einzelne Belichtungszeit nicht für alle Gewebestärken ideal sein kann.
    7. Klicken Sie auf "Erfassen".
    8. Nach der Bebilderung, entfernen Sie die Gewebe sofort und zu speichern oder sie für die quantitative Histologie einfrieren, wie in Schritt 4 beschrieben.

3. Standards und Bildverarbeitung

  1. Standards
    1. In PBS Erstellen zweifache serielle Verdünnungen von jedem Protein in der Behandlung der Tiere verwendet, bei der ursprünglichen Konzentration beginnend, mit insgesamt 15-Verdünnungen.
      Hinweis: Der Konzentrationsbereich darauf abzielen sollte, die zu erwartenden Gewebekonzentrationen enthalten und können zusätzliche Verdünnungen der ursprünglichen Probe erfordern, abhängig von der Ausgangskonzentration.
    2. Je 100 ul jeder Standard in jede Vertiefung einer schwarzen 96-Well-Platte. Fügen Sie ein gut aus reinem PBS ein gewisses Maß an Hintergrundfluoreszenz zu erhalten.
    3. Bild die Standards mit den gleichen Parametern für die Gewebe-Bildgebung verwendet.
    4. In der Bildaufnahmesoftware "Tool-Palette" unter "ROI Tools", wählen Sie die "Region of Interest (ROI") Kreis und den ROI ziehen um ein gut. Kopieren Sie, dass ROI zu allen anderen gefüllten Brunnen und klicken Sie auf "die ROIs messen."
    5. Subtrahiert den Wert der durchschnittlichen Strahlungseffizienz des reinen PBS aus den Werten der anderen Normen; Dadurch wird die Hintergrundfluoreszenz. Zeichnen Sie die Werte gegenüber der bekannten Konzentration in einem Streudiagramm.
      Anmerkung: Die sich ergebende Gleichung der linearen Trendlinie dann verwendet werden kann, um die relative Fluoreszenzwert zu berechnen.
  2. Bildverarbeitung
    1. In der Bildaufnahme-Software, wählen Sie den Freiform-ROI-Tool und ziehen ROIs um jede der einzelnen Gewebe. Klicken Sie auf "Messen".
    2. Mit den daraus resultierenden durchschnittlichen Strahlungswirkungsgradmessungen, subtrahieren, die von der unbehandelten Tier Messwerte für jeden Gewebetyp und zeichnen Sie diese Werte auf dem zuvor erstellten Standardkurve.
      Hinweis: Die resultierenden relativen Fluoreszenzwerte bieten eine schnelle und genaue Momentaufnahme derBioverteilung des markierten Verbindung.

4. Quantitative Tissue Histologie

  1. Vorbereitung und Einfrieren von Gewebe für Slicing
    1. Erstellen oder erwerben Behälter mit ausreichender Größe, die die ausgewählten Gewebe und Kryostat zum Einfrieren verwendet werden. Verpackung Aluminiumfolie um einen entsprechend dimensionierten und geformten Gegenstand funktioniert gut.
    2. Bereiten Sie eine Mischung aus Isopropanol und Trockeneis um die Hälfte eines 500-ml-Becher mit Trockeneis füllen und das Hinzufügen von ~ 350 ml Isopropanol, damit ausreichend Flüssigkeit über dem Trockeneis ist, um teilweise den Gefrierbehälter versenken.
      Hinweis: Der flüssige Stickstoff im Bruch der optimale Schnitttemperatur Verbindung führt oft (OCT) und eingebetteten Geweben und sollte vermieden werden.
    3. Füllen Sie den Gefrierbehälter teilweise mit Oktober, um sicherzustellen, dass es keine Blasen vorhanden sind. Wenn es Blasen sind, arbeiten die Blasen aus der Lösung mit einer Pinzette oder einem ähnlichen implementieren.
    4. Entfernen Sie das Gewebevon PBS und gründlich trocknen es, entweder indem sie sie mit einem Labor und tätschelte sanft abzuwischen oder durch die Ränder der empfindlichen Gewebe in ein Labor zu berühren wischen und damit die Flüssigkeit weg Docht.
    5. Legen Sie das Gewebe sanft in den Oktober im Inneren des Gefrierbehälters, um sicherzustellen, keine Blasen unter dem Gewebe einzuführen. Sobald das Gewebe an Ort und Stelle ist, fügen Oktober, bis das Gewebe vollständig bedeckt ist.
    6. Unterzutauchen den Gefrierbehälter so weit wie möglich das Isopropanol ohne daß im Inneren des Behälters in Kontakt mit dem freiliegenden OAT kommen. Lassen Sie 30 bis 90 s (oder möglicherweise mehr für größere Gewebe) für das OCT und Gewebe vollständig einzufrieren, bevor sie für so lange wie nötig bei -80 ° C lagern.
  2. Herstellung von Standards für Slicing.
    1. Vorbereitung und entsprechend 1 ml-Einwegspritzen Label vom Ende der Trommel entfernt wird, so dass die gesamte Länge der Spritze ist ein Durchmesser. Dies ermöglicht es dem gefrorenen Zylinder später herausgeschoben werden.
    2. Unsein 15-Schritt zweifache serielle Verdünnung der verabreichten Verbindungen ing Oktober, zu erstellen, wie sie zuvor mit PBS durchgeführt wurde, aber mit einem letzten resultierende Volumen von 1 ml. Fügen Sie eine Probe von reinem OCT zur Entfernung von Hintergrundfluoreszenz Werte.
    3. Die Viskosität der OCT macht eine ausreichende Durchmischung schwierig. Drehen Sie die Rohre und ermöglichen es dem Oktober vollständig zu begleichen, bevor sie wieder zu invertieren. Wiederholen Sie diese 10 bis 20 mal um eine einheitliche Mischung zu gewährleisten. Halten Sie die Standardlösungen bei 4 ° C und vor Licht während des Mischens.
    4. Nach dem Mischen herzustellen wieder ein Gemisch aus Isopropanol und Trockeneis, wie zuvor.
      Hinweis: Flüssiger Stickstoff kann auch anstelle des Isopropanol / Trockeneis-Mischung verwendet werden, die Spritzen schnell entfernt werden, nachdem sie festgefroren sind.
    5. Zeichnen Sie die Oktober-Standard in die Spritze, wobei darauf geachtet, so wenig Blasen wie möglich einzuführen. Nach dem Ziehen des OCT-Lösung auf, tauchen sofort die Spritze direkt in die Isopropanol und lassen Sie die Lösung vollständig einzufrierenin der Spritze für 10 - 20 s. Speichern der Spritzen bei -80 ° C, so lange wie notwendig.
  3. Schneiden von Gewebe und Standards
    1. Platzieren beiden Geweben und Standards in -20 ° C und lassen genügend Zeit für alle Proben zu Temperatur kommen.
      Hinweis: Die ideale Schnitt Temperatur fällt in der Regel um die 10 ° C-Bereich für die meisten Gewebe, aber es hängt letztlich von Gewebegröße und Fettgehalt und muss empirisch verfeinert werden.
    2. Mit Hilfe eines Kryostaten geschnitten Gewebe in 20 & mgr; m dicke Scheiben schneiden und montieren sie auf Objektträger, wie zuvor 8 beschrieben. Lagern Sie die Objektträger bei -20 ° C und halten sie weg von Licht so viel wie möglich während des Schneidens und bis Scannen.
      Hinweis: Es ist wichtig, dass hier die Abschnitte in geeigneter Weise über die gesamte Dicke des Gewebes verteilt sind, gemessen werden.
    3. Um die Standards auf dem Kryostaten Bohrfutter montieren, nehmen Sie die Spritze aus dem Gefrierschrank und erwärmen die Außenseite 3 - 5 s durch holding es in der Hand. Drücken Sie den Kolben, bis ein kurzer Abschnitt (~ 1 cm) des OCT-Zylinder ist außerhalb der Spritze.
      1. Mit Hilfe einer Rasierklinge geschnitten durch den Zylinder und legen den resultierenden Zylinderabschnitt senkrecht auf das Futter, OAT es an Ort und Stelle zu halten. Diese Konfiguration sollte in gut definierte Kreise führen geschnitten.
    4. Schneiden Sie die Zylinder bei 20 & mgr; m, Platzieren einer Scheibe von jeder Verdünnung auf eine einzelne Folie, so dass eine Folie die gesamte Standardkurve darstellt. Lagern Sie die Objektträger bei -20 ° C bis zum Scannen bereit.
  4. Scannen und Quantifizierung
    1. Starten Sie den Scan-Array-Software und klicken Sie auf "543 Laser", um den Laser-Startprozedur beginnen. Warten Sie 15 min für die Laser bereit zu bekommen.
    2. Sobald der Laser bereit ist, die Folien von -20 ° C zu entfernen und sie in einem großen, lichtgeschützten Behälter auf Temperatur zu kommen, bewegen und für 3 Minuten trocknen lassen. Dadurch wird die Bildung von Feuchtigkeit im sli verhindernde-Scanner.
    3. Legen Sie die Folie in die Schieberaufnahme an der Dia-Scanner. Klicken Sie auf "Scannen" und wählen Sie "easy-Scan ausgeführt werden."
    4. Stellen Sie die Scan-Auflösung bis 50 um.
    5. Wählen Sie das erste "Use" Checkbox unter "Fluorophor" und wählen Sie "TRITC." Stellen Sie die PMT-Verstärkung auf 80%.
      Hinweis: Diese Einstellungen variiert in Abhängigkeit von dem Fluorophor und der Konzentration der markierten Moleküle.
    6. Auf der linken Seite, sicherzustellen, dass der Abtastbereich die gesamte Folie umfasst. Klicken Sie auf "Start".
    7. Nach dem Scannen, wählen Sie "Datei" und "Speichern unter" und dann als .tif das Bild zu speichern.
      Hinweis: Folien von Geweben und Standards sollten auf den gleichen Einstellungen gescannt werden.
    8. Legen Sie die resultierenden Bilder in ImageJ und wählen Sie ROIs um die Gewebe und Standards. Unter dem Reiter "analysieren", wählen "Messungen" und wählen Sie "Grauwert bedeuten." Click220; messen ".
      Anmerkung: Wie bei der vorherigen Technik, die Hintergrundfluoreszenz von allen Messwerten subtrahiert werden muß.
    9. Zeichnen Sie die mittleren Grauwertmessungen von den Standards gegen die bekannten Konzentration eine Standardkurve zu erstellen.
      Hinweis: Die resultierenden Messungen aus dem Gewebe sollte auf dieser Standardkurve in jedem Gewebe und aufgetragen gemittelt werden, um die Konzentration innerhalb des Gewebes zu bestimmen.

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Representative Results

Die Daten unten beschreiben die Lieferung von drei Verbindungen: ein Drug-Delivery - Vektor als ELP und zwei Versionen von ELP mit zellpenetrierendes Peptide (SynB1-ELP und Tat-ELP) 9 modifiziert bekannt. Alle drei Verbindungen wurden mit Tetramethylrhodamin-5-Maleinimid markiert und über zwei Verabreichungswege (IN und IV) geliefert. Das Ziel dieser Experimente war es, die Verbindung und Art der Anwendung zu bestimmen , in der besten Eindringen in das zentrale Nervensystem (ZNS) 3 führen würde.

1A zeigt repräsentative ex vivo Vollorgan Bilder der Organe von den behandelten Tieren. Die Heatmap-Overlay zeigt die Fluoreszenzwerte in Strahlungseffizienz innerhalb der Gewebe. Indem ROIs um die einzelnen Gewebe und durch diese Werte auf die entsprechenden Standardkurve, standardisierte Fluoreszenzwerte in Abbildung 1B Plotten erzeugt. Die standardisierte fluorescenFAE-Werte können dann für genaue Vergleiche der relativen Konzentrationen der verschiedenen Verbindungen verwendet werden. Diese Daten genau zu beschreiben sowohl die Wirkung von ELP Modifikation am Eindringen in spezifischen Geweben, sowie die Wirkung der Verabreichungsart auf jeder Verbindung. Mit diesen Ergebnissen ist es sofort klar, dass ELP Lieferung über in der Verwaltung ist die effektivste Kombination das ZNS zu erreichen.

Während diese Ergebnisse die beste eindringenden Verbindung und Versandmethode bestimmen helfen, sie die tatsächliche Konzentration oder regionalen Lokalisierung von Verbindungen innerhalb des ZNS nicht beschreiben. Quantitative Histologie ist daher ideal, um die Beschreibung der biologischen Verteilung dieser Verbindungen zu vervollständigen, wie es für quantitative Messungen der ausgewählten Gehirnregionen ermöglicht. 2A zeigt eine repräsentative Scheibe aus den ELP IN-behandelten Tieren und 2B beschreibt die Quantifizierung des ROIs die TrennRiechkolben, Hemisphären, und des Kleinhirns. Aus diesen Daten ist es klar, dass, während ELP Verwaltung durch die IN Route in hohen Konzentrationen ZNS führen kann, es tut dies in erster Linie in den Riechkolben und des Kleinhirns. Im Gegensatz dazu lieferte ELP IV hat eine geringere Gesamtkonzentrationen, aber es ist ebenso über das gesamte Gehirn verteilt. Je nach Ziel dieser verabreichten Verbindungen und das Potential für Effekte in anderen Organen, im oder iv-Verabreichung kann die bessere Wahl sein. Dies könnte nicht ohne die Zugabe der quantitative Histologie abgeschlossen werden. Technisch gesehen, könnte quantitative Histologie in jedem Gewebe von jeder Gruppe verwendet wurden, aber durch beide Methoden zusammen verwendet, eine Menge Zeit und Arbeit gespart wurde, während noch in der gleichen Schlussfolgerung führt.

Abbildung 1
Abbildung 1: Ex - vivo - Whole-Orgel FluoreszenzMessungen. A) Repräsentative Bilder von der ELP - Gruppe. Die Heatmap Skala wurde als Strahlungseffizienz. B) Durchschnittsstrahlungswirkungsgrade von der Schaffung von ROIs um die einzelnen Gewebe erhalten , das auf einer Standardkurve , um analysiert wurden , um die standardisierten Fluoreszenzwerte für den Vergleich von bio-Verteilungen verwendet erzeugen. Die Fehlerbalken stellen SEM. Maßstabsbalken = 5 mm. (Geändert von McGowan, et al;. Drug Design, Entwicklung und Therapie; 2016) Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: Quantitative Gewebe Histologie Messungen. A) Repräsentative Bild von ELP IN- oder IV behandelten Tiere geschaffen durch Schneiden Gehirne 20 & mgr; m dick, die Montage der Scheiben on Dias und Scannen dann diese Folien eine Fluoreszenz Dia-Scanner. B) Durchschnittswerte von der Schaffung von ROIs erhalten rund um den Bulbus olfactorius, Hemisphären, und Cerebellum, gemessen als mittlere Grauwert und Anpassung an eine Standardkurve pg / mL Konzentrationsmessungen zu erzeugen. Die Fehlerbalken stellen SEM. Maßstabsbalken = 5 mm. (Geändert von McGowan, et al;. Drug Design, Entwicklung und Therapie; 2016) Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Während ex vivo Vollorgan Bildgebung im Allgemeinen einfach ist, kann die Einhaltung einiger grundlegender Konzepte und Techniken , um die Genauigkeit der Bio-Verteilungsmessungen verbessern. Kurze Wellenlängen des Lichts Erfahrung ein hohes Maß an Streuung und Absorption in den meisten Geweben, die wesentliche Auswirkungen auf die Nützlichkeit der kurzwelligen Fluorophore. Diese Fluorophore haben eine begrenzte Anwendung in Tiefgewebeuntersuchungen, aber sie haben effektiv in Experimenten verwendet wurden an Oberflächengewebe oder in die Augen. Im Gegensatz dazu unterziehen langen Wellenlängen des Lichts deutlich weniger Streuung und Absorption, in größere Eindringtiefe und genauere Ergebnisse mit dickeren Gewebe 10. Fluorophore, die im fernen roten und nahen Infrarot (NIR) Bereich (Anregung ~ 600 nm) des Spektrums liegen, werden für ganze Tiere oder größere Gewebe häufig gewählt. Für Versuche, diese langwellige Fluorophore verwenden, die Autofluoreszenz von besonderer tisklagt oder Materialien ist wahrscheinlich ein wichtiger Aspekt. Zum Beispiel ist die Galle in der Gallenblase von Nagetieren hochAutoFluoreszenz bei Wellenlängen im 500-600 nm-Bereich. Da diese stark Leberwerte verzerren können, ist es oft am besten, um die Gallenblase vor der Bildgebung zu entfernen. Alternativ, wenn die intakten Leber und Gallenblase erforderlich sind, ganz am anderen Ende des Spektrums kann den Einfluß des Gallenautofluoreszenz begrenzen ein Fluorophor mit einer Anregungswellenlänge auszuwählen. Darüber hinaus enthalten viele der üblichen Nagetier chows ungereinigtem Luzerne, die hoch in den mittleren und fernen Bereiche des Spektrums fluoresziert. Wenn die gewählten Etiketten in diesen Wellenlängen fallen und der Verdauungstrakt abgebildet werden soll, in der Ernährung eine Änderung ist wahrscheinlich die beste Option.

Während Live - Imaging - Systeme ausgelegt sind , um genau dicke Gewebe messen, mit inhomogenen und besonders dicke Gewebe (zB ganze Rattenlebern), können genauere Messungen often durch Spreizen des Gewebes aus, so dass die Lappen der Leber überlappen, so wenig wie möglich erhalten werden. Auch in Fällen, in denen Gewebe haben eine sehr schiefe Verteilung von markierten Molekülen, Imaging von mehreren Seiten des Gewebes und diese Messungen gemittelt kann die Genauigkeit zu erhöhen. Letztlich auf die Arten von Gewebe abgebildet werden, die Autofluoreszenz der Materialien, die mit diesen Geweben verbunden sind, und die Potentialverteilung der verabreichten markierten Moleküle sorgfältig in Betracht gezogen werden, sollte ein Fluorophor mit geeigneten Anregungs- und Emissionswellenlängen zu wählen, die zu begrenzen Störungen so weit wie möglich.

Wenn quantitative Gewebe Histologie durchgeführt wird, gibt es einige wichtige Details im Auge zu behalten. Damit die Ergebnisse genau zu sein, in Scheiben wird während des gesamten Gewebes oder der Region ergriffen werden, um zu analysieren. Dies bedeutet, dass diese Gewebe nicht für andere Prozesse zur Verfügung. Es kann möglich sein, zu beheben und Flecken nachScannen, aber es ist in der Regel am besten die Scheiben zu erlauben, leicht zu trocknen, bevor sie in den Scanner setzen, die Zukunft Färbung beeinflussen könnten. Ebenso wird die Abtastung ein gewisses Maß an Photobleich verursachen, das Potentialsignal in nachfolgenden Prozessen zu verringern. Für nachgeschaltete Mikroskopieanwendungen überlegen sind Abschnitte typischerweise erreicht, indem die Gewebe Fixierung und sie in einer Zuckerlösung vor dem Schneiden Äquilibrieren. Jedoch wird dieses Verfahren am besten in der obigen quantitativen histologischen Protokoll vermieden aufgrund der Auswirkungen der Fixierung und / oder lang Saccharose tränkt auf Fluoreszenzintensität. Auch abhängig von der Menge der Signal vorhanden ist, kann Scheiben auftreten Photobleaching ausgesetzt, wenn sogar geringe Mengen an Umgebungslicht. Halten Sie die Folien kalt und weg von Licht wird die Genauigkeit der resultierenden Messungen erheblich verbessern. Insgesamt kann eine sorgfältige Handhabung und Vorbereitung drastisch das Endergebnis zu verbessern.

Es gibt eine Vielzahl andererMethoden eingesetzt , um die Bio-Verteilung und Pharmakokinetik des verabreichten Makromolekülen für das Studium , die weit in der technischen Schwierigkeit, Durchsatz, Genauigkeit und die Ausrüstung 11 erforderlich variieren. Quantitative Immunoassays und Bioaktivitätstests sowohl technisch kompliziert und erfordern Antikörper oder Reagenzien, die spezifisch für die verabreichten Moleküle, Hinzufügen erheblich zu den Kosten und Arbeit. Mehrere Verfahren , die auf Radioisotopen - Markierung wurden in der Vergangenheit verwendet wurden, mit einer Genauigkeit von unterschiedlichen, aber die Integration von Radioisotopen an Makromoleküle, wie auch die Erfassung der Daten selbst, können signifikante Vorbereitung erfordern und kann oft Gewebe machen völlig unbrauchbar für weitere 12 analysiert. Schließlich können auch andere Verfahren als wirksam erwiesen, einschließlich Positronen-Emissions-Tomographie und Massenspektrometrie, werden typischerweise einfach aufgrund des Fehlens der erforderlichen Ausrüstung ausgeschlossen. Die oben beschriebenen Protokoll verwendet zwei Methoden in Verbindung zum effizienten Bestimmen the Bio-Verteilung von markierten Molekülen in einer schnellen und kosteneffiziente, präzise und leicht zugängliche Art und Weise aufgrund der regelmäßigen availably der erforderlichen Ausrüstung.

Diese Methode wurde verwendet, um die obigen Daten zu erzeugen, um die beste Vektor und Verabreichungsart für die Bereitstellung von markierten Molekülen an das ZNS zu identifizieren. Aus den ex - vivo - Daten, ELP verabreicht IN und ELP verabreicht IV zur weiteren Charakterisierung über quantitative Gewebe Histologie identifiziert wurden. Quantitative Gewebe Histologie vorgesehen dann die Konzentrationen der markierten Moleküle in spezifischen Regionen des ZNS, so dass die endgültige Schlussfolgerungen gezogen werden. Die beiden Methoden gemeinsam für eine schnelle und effektive Weg, um eine eingehende Prüfung der biologischen Verteilung von mehreren spezifischen Verbindungen auszuführen.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Maleimide derivitized fluorophors (e.g., tetramethylrhodamine-5-maleimide, AlexaFluor 633-C5-maleimide) Thermo Fisher T6027, A20342 Thiol reactive fluorescent dyes for protein labeling
Phosphate Buffered Saline Sigma 1002243569 PBS Buffer for rinsing
Optimal Cutting Temperature Compound Tissue-Tek 4585 Used for freezing and mounting
Equipment
IVIS Spectrum Perkin Elmer For ex vivo whole organ imaging
Cryomicrotome Thermo For cryosectioning
Fluorescence slide scanner Perkin Elmer For slide scanning

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References

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