研究线粒体结构与功能

Biology

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Parker, D. J., Moran, A., Mitra, K. Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries. J. Vis. Exp. (119), e54989, doi:10.3791/54989 (2017).

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Abstract

Introduction

线粒体经典描述为蜂窝重地,因为它们是能源生产的在分化的细胞的主座。此外,线粒体起到代谢,发热,脂质修饰,钙和氧化还原平衡的关键作用,细胞信号传导过程的流程 1。线粒体也发挥在细胞周期调控3细胞死亡2诱导的积极作用,以及。这种多功能性提出了以下基本问题:a)如何线粒体同时执行所有这些功能和b)是否有专门的是针对不同的功能,具体的线粒体池或子区域?在此情况下,必须注意的是,多官能线粒体在它们的形状,大小和单个细胞内结构是动态的,并且线粒体的稳态形状可以细胞类型之间变化是重要的。从不同的实验室数十年的研究礼拜堂表明线粒体形状,大小和结构,统称线粒体动力学的改变,是为了保持各种线粒体功能4,5,6至关重要这些发现提出线粒体可能凭借其结构的活力完成其多功能的可能性。

广泛正在努力了解线粒体结构与功能的关系。线粒体结构的动力主要是由他们的经历裂变和聚变事件与对方保持能力。大线粒体裂变将它们转换成更小的线粒体的元素,而两个较小的线粒体之间的融合将它们合并成一个更大的线粒体元件7。此外,可以发生两种线粒体的瞬态融合,以允许其内容的混合。内和外线粒体膜的裂变和聚变事件仔细规格支配IFIC设置蛋白质。芯裂变机械由dynamin上相关蛋白1(DRP1),这是从细胞质通过其与某些善意线粒体蛋白质( 例如,FIS1或Mff1)相互作用招募到线粒体,而DRP1功能也可以通过调节的线粒体表面4上的其它蛋白质。虽然DRP1外膜上运行时,其裂变能力产生影响的内膜为好。外和内线粒体膜的裂变的编排还不是很清楚。另一方面,内膜的融合在由OPA1的活动芯部管辖,而mitofusins管辖外膜5的融合。线粒体的反作用裂变和融合事件的平衡决定在细胞稳态线粒体形状。例如,线粒体裂变的压迫会导致完全和无对抗的融合,而线粒体的过度活动升裂变将导致线粒体3的碎片。

线粒体结构 - 功能关系的研究主要涉及两个互补的方法:一)线粒体裂变/融合蛋白的基因操作后的细胞和有机体的表型分析和b)线粒体的结构和功能的直接评估。值得注意的是,遗传分析可能不总是揭示分子的手头的直接功能(在此情况下,线粒体裂变/融合蛋白)中,作为表型可能是由于次级效应引起的。因此,它是极为重要的发展和使用的工具来直接研究线粒体的结构和功能。线粒体结构的任何评估都涉及各种显微镜的工具。活细胞荧光显微镜的使用具有极大地促进线粒体动力学的研究,因为线粒体活力可以监测定性和quantitatively使用适当的荧光显微镜的工具和技术8。荧光显微镜基础的工具已经发展到线粒体的研究结构和功能的现场和固定果蝇组织,阐明体内线粒体9活力的重要意义。这些和相关的方法在这里所描述,在果蝇卵巢研究线粒体的结构和功能的目的。

果蝇卵巢由种系和体细胞谱系,从驻留在germarium 10,11各自的成体干细胞,其产生的。十六合胞生殖细胞(GCS)通过体毛囊细胞(FC)中得到包封以形成浮现出germarium( 图1)的个人卵腔室。之一的16个选区的获得致力于成为卵母细胞,和其余15选区发展成支持卵腔的生长护士细胞,促进卵成熟它铺设之前。多数的FC经过9轮有丝分裂的它们退出有丝分裂的细胞周期到最终分化成由前卵泡电池(AFC),后囊细胞(全氟化碳),和主体单元的图案的上皮细胞层之前(的MBC) 。连续蛋室由茎细胞,其分化,它们也从FC的在发展的早期的细胞连接。由线粒体分裂蛋白DRP1调节线粒体形状果蝇卵巢FC层9,12的正常发展过程中,积极参与分化过程。在这些研究中使用,以确定DRP1的果蝇卵泡细胞层发展参与方法说明如下。

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Protocol

1.制备果蝇 (在图2A中描绘所需的工具)

  1. 任何所描述的实验中,收集果蝇 (保持在室温,或25℃)内羽化的5天,将它们放置在盛有5小瓶-毫升果蝇 7食品(参见材料数据表 ),以不超过25苍蝇在每个瓶子;维护女:2男:1的比例。
  2. 洒造粒酵母少量刺激果蝇产蛋量。 4天 - 2内进行实验操作。

2.解剖果蝇卵巢的(图2A描绘所需的工具)

  1. 暖昆虫解剖培养基(见材料表 ),以室温,25℃。填充八孔玻璃解剖盘的三个孔,以在每个培养基的200微升良好。
  2. 麻醉果蝇与CO 果蝇 。
  3. 同时期待通过解剖显微镜的目镜,从断绝使用两对镊子腹部胸部。使用镊子,仔细的腹部转移到菜的第二口井。
  4. 用一对镊子的保持在后端腹部,并慢慢地与另一对钳子的推卵巢出来(与其他腹部内容一起)。如果这种尝试失败了,小心插入钳入前端释放卵巢取出腹腔外骨骼。
  5. 使用镊子,持有不透明后端个人卵巢( 蛋黄填充,后期鸡蛋),并小心将其移动到菜的第三井为挑逗处理它实时显微镜(步骤3)或用于固定到执行免疫染色(步骤7)。
  6. 通过从后轻轻扫过挑逗针对每个卵巢的前端,同时用一对镊子的保持它用的后端小心挑逗从卵巢周围保护套。
    注意:要取笑期间尽量减少损失,弯曲针尖端和通过增加显微镜( 图2A)的放大率放大各卵巢。挑逗应该足以打破鞘有效的,但它也应仔细进行保存卵巢管的完整性。

3.准备用于活组织显微镜

注意:图2A中描绘所需的工具。

  1. 果蝇解剖之前,准备多聚赖氨酸涂覆室。为此,将多聚赖氨酸(0.1毫克/毫升)的两个20微升滴上covergl驴,以防止液滴的合并在彼此合理距离玻璃底培养皿(35 mm)上的(14毫米,0号公报)。风干平板在37ºC1小时并标记在板的与可擦除标记在底部的白色多聚赖氨酸膜的边缘。
    注:多聚赖氨酸包被的腔室可以被储存在4℃下一周。如果使用预先涂覆室中,在开始果蝇解剖前使其至室温。
  2. 上设置共焦显微镜扫描参数,以确保可将样品立即解剖和安装完成后,如下成像。
  3. 放置一解剖并逗卵巢(以下的步骤2和染色,如果需要的话,在步骤5)上的标记的多聚赖氨酸包被的区域,传播卵巢与挑逗针头至卵巢管分离。将昆虫解剖介质对卵巢的前10μL下降,确保覆盖Ť他整个多聚赖氨酸包被的区域。盖培养皿。
  4. 立即执行在室温下安装的样品的共焦显微镜。
    注意:只有一个果蝇应解剖,进行处理,并在时间成像。此外,显微镜不应在37℃,这会模仿果蝇组织热休克环境中执行。

4.荧光损失在漂白(翻转)检测,以评估线粒体基质连续性

注:在熔融线粒体结构线粒体基质连续性以下通过中间步骤的进展中的线粒体内膜和外膜的完全熔化后建立的。线粒体裂变可以遵循同样的步骤,但在相反的方向( 图3A)。 FLIP是一个时间推移基于显微镜半定量方法,该方法可用于评估在线粒体基质连续性体外线粒体的最终熔融状态( 图3A中的步骤3和4)在活果蝇卵巢9。对FLIP测定法作为表示在被定期( 图3A中FLIP ROI)的光漂白线粒体基质的荧光分子的线粒体的感兴趣区域(ROI)的小区域进行。其结果是,是与对FLIP的ROI(实验ROI在图3A)连续任何周围线粒体区域将失去的信号,由于分子中的连续线粒体基质的交换。这里展示的FLIP实验转基因果蝇表达mitoYFP,其中包含标记YFP人类细胞色素氧化酶亚基第八的线粒体靶向序列,将其定位到线粒体基质中自由扩散的形式进行。类似的实验,也可以与线粒体pUASP-线粒体-GFP转基因进行的,如先前报道<SUP> 9。类似FLIP协议可以与靶向线粒体膜间空间中的探针可以用于能够检测从外部的融合所得的连续性而不是内线粒体膜(步骤2在图3A)。

  1. 在共聚焦显微镜打开图像采集软件,并在“获取”标签( 表1)设置适当的扫描参数。检查“时间序列”,“漂白”,和“区域”框以打开单个标签。出台相应的采集参数值在每个选项卡( 表1)。
    注:针孔应保持开路,因为此实验的目的是监测从单个细胞的全线粒体人口整体信号。
  2. 使用目镜快速定位在安装现场组织感兴趣的领域。
    注:选择是很好铺在玻璃bottome的卵巢管D盘,由于共焦显微镜不能浮动卵巢管进行的。
  3. 点击“活”来获取感兴趣的选定字段的实时图像。点击“停止”,停止现场扫描。
  4. 如果需要的话,调节采集参数,使得所检测到的荧光信号是低于饱和水平(由缺乏红色像素表示当“范围指示器”选项时),与所定义的背景为通过调整所述偏移值设定。
  5. 绘制使用从“区域”标签贝塞尔绘图工具来划分由现场扫描获取的图像上的光漂白区的小的投资回报。
    注:ROI的大小应在20 -在细胞内的总荧光线粒体信号的50%。
  6. 通过点击进行图像采集“开始实验”。
  7. 量化使用专有或开源软件的荧光强度(见材料表)。记录从投资回报率的平均信号,其中重复漂白是针对(FLIP);其中,漂白尚未在相同小区进行的感兴趣区(试验);从在同一视场的另一个未漂白细胞的投资回报率,为试验期间(漂白)评估整体漂白;并且在背景区域(背景)的投资回报率。减去在其他感兴趣区域的平均信号获得的平均背景信号。正常化与用于各个小区中的初始漂白前信号的荧光信号。
  8. 绘制使用任何标准绘图软件的标准化数据。

5.现场染色荧光染料线粒体

注:稳态线粒体结构和潜在的可使用特异性结合到线粒体的活细胞和组织的染料进行评估。活果蝇卵巢可体外染色荧光线粒体渍形象化线粒体,以评估线粒体活性氧(丝裂ROS)的生产,并评估每单位质量线粒体电位。这可以通过共染色与线粒体电位染料四甲乙酯(TMRE)和代表线粒体质量相容的活线粒体染色来完成(见材料表的特定染料)。

  1. 稀释在温暖的昆虫污渍解剖介质的最终工作浓度的股票:线粒体染色,250纳米; TMRE,50nM的;和线粒体-ROS染色,5微米。
  2. 解剖和戏弄卵巢以下步骤2中后,将卵巢成任何特定的染色溶液的200微升在解剖盘的好。孵育他们10分钟并通过合适的盒用铝箔包裹,以保护它免受光所覆盖的培养皿中。用钳子小心地移动它们到连续的3口井containin洗染色卵巢无污点摹网上平台。
  3. 对于共染色与TMRE和兼容整体线粒体染色,按照上述协议,立即先用TMRE,然后用染色的整体线粒体染色(不之间的任何洗涤步骤)。
  4. 安装在一个多聚赖氨酸涂覆的玻璃底培养皿下列步骤3卵巢和用于与适当的扫描参数( 表1)共聚焦显微镜制备,下列步骤4.2-4.4。
    注:从掺入染料的信号,再尝试安装该染色样品中安装介质中时并没有持续。
  5. 检查Z-切片框打开的选项卡。转动调焦环对样品的底部,而它正在实时扫描,然后单击“设置第一”来定义底层Z-部分。做相同的同时移动焦点车轮朝另一个方向以限定的最上面部分。
  6. 通过点击进行图像采集“开始实验”。
  7. 量化来自感兴趣区为背景信号和各个单元的背景校正的荧光强度(如在步骤4.7)和使用任何绘图软件绘制数据。

6.代DRP1空马赛克

注意:此处所用的克隆策略介绍一个GFP阳性,表型的野生型背景下,对于DRP1无效突变9基因型杂的背景绿色荧光蛋白(GFP)阴性DRP1空克隆。热休克诱导翻转,翻转识别目标(FLP-FRT)介导的位点特异性有丝分裂重组创建功能无效drpKG03815等位基因的纯合子克隆。 果蝇携带突变DRP1的基因型为drpKG03815 FRT40A / CYO,而基因型携带热休克诱导FLP(hsFLP)和UbiGFP克隆标记是hsflp;泛素NLS-GFP(UbiGFP)FRT 40A / CYO。的本身的基因型上述基因型之间的交叉lected后代hsFLP / +; drpKG03815 FRT40A / UbiGFPFRT40A。

  1. 通过将移动到新鲜食品的新瓶,每2〜3天同步果蝇的处女集合。日常监控pupariating瓶,以便收集新兴处女的女性。
  2. 从DRP1突变基因型每天晚上收集红眼,卷曲翼处女的女性,一旦在上午,一次,并将其放置在一个单独的小瓶内。同时,收集果蝇雄性暗红色的眼睛和内羽化5天携带hsflp和UbiGFP直翅膀。
  3. 2男女比例:通过增加男性的处女女性与女性建立一个跨1。
  4. 洒造粒酵母少量刺激产蛋量。
    注:小心地移动至果蝇到的媒体新鲜小瓶,每2至3天,以增加后代的数量,并减少小瓶拥挤。
  5. 一个esthetize,排序,并收集直翅,红眼睛的女性后代中羽化5天。
  6. 对热休克,将收集的果蝇到空的小瓶造粒酵母少量和一个小的,柔软的擦拭(热休克期间吸收水分)。放置与果蝇小瓶在水浴中在38ºC1小时,以产生主要毛囊细胞克隆,并在37ºC1小时,一天两次(允许2热冲击之间的至少5小时),用于连续2天,同时生成的种系和卵泡细胞克隆。
    注:确保将小瓶中的水至插头的水平完全淹没。
  7. 热休克可能使果蝇不动。允许热休克果蝇 ,为在室温下1小时恢复当他们再次成为移动。
  8. 以相同的比例增加男性回女性在十字架上,并将其移动到与mediu新鲜瓶米撒上颗粒酵母少量。保持果蝇至少5天。
  9. 解剖卵巢根据需要为一个活的或固定的实验。
    注意:从亲果蝇表达UbiGFP分离卵巢应该被用作阴性对照,以确认由热休克GFP阴性的克隆的有效诱导。

7.联合免疫染色细胞周期素E和线粒体

注:要检测果蝇细胞周期素E(dCyclinE),我们已经使用了专门针对dCyclinE 9募集市售获得的抗体(见材料表 )。作为线粒体标记物,我们使用针对的ATP-B的抗体(线粒体ATP合酶复合物的亚基)9。

  1. 暖4%低聚甲醛(PFA),以室温,25℃。 警告!多聚甲醛是有毒的。
    注:开场后安瓿,PFA应储存在4℃和7天内使用。这是因为,PFA的存储可允许氧化甲醇,这将在定影期间极大地改变线粒体膜,即使痕量存在。
  2. 解剖后,立即将其放入新鲜的PFA 200μL在玻璃解剖盘的井(无揶揄)修复解剖卵巢。请在通风橱中的菜15分钟。通过用钳子小心移动它们到连续的3个孔,1×磷酸盐缓冲盐水的各自含有200微升(PBS)洗涤固定的卵巢。
    注:实验可以在这里停止,并且可将样本在4ºC留1天。
  3. 在PBS更彻底逗卵巢(类似于步骤2.6),以小心地取出防护纤维鞘可能妨碍了抗体抗原访问。
  4. 通过将它们与500微升新鲜的0离心管通透戏弄卵巢。5%的PBS-的Triton-X100(PBS-TX)和孵育它为30分钟,同时在25转摆动。
    注意:在摇动,放置管平行于摇摆运动;将它们垂直地可以允许组织粘附到管的盖,从而导致组织损失。
  5. 以除去PBS-TX放置离心管在机架以允许组织在管的底部沉淀下来。目视检查他们,挖掘管,如果需要的话,给人们带来任何浮动的组织下到谷底。从顶部小心地吸出溶液,并确保在管底部的组织保持原状。
  6. 通过添加2%牛血清白蛋白的200μL的(BSA)溶解在0.5%的PBS-TX方框卵巢,并在室温下孵育它在摇臂1小时。通过以下步骤7.5移除阻断剂。
  7. 添加第一抗体在新鲜封闭剂的200微升:抗兔dCyclinE抗体(1:100)和抗小鼠的ATP-B抗体(1:100)。孵育在摇臂的组织,在室温下2小时。
  8. 用PBS-TX洗卵巢3次,每次15分钟,随后的步骤7.5。
  9. 添加200μL的在新鲜的PBS-TX的适当的二级抗体:抗小鼠CY3(1:1000)和抗 - 兔CY5(1:500)。孵育该摇杆在室温下1小时。
  10. 用PBS-TX洗卵巢3次,每次15分钟,随后的步骤7.5。
  11. 染色的DNA,加入赫斯特(1:1000稀释)最终PBS-TX洗。
  12. 最后,离开组织在1X PBS 500微升。
  13. 使用1毫升微量,请从离心管的免疫染色卵巢到含有PBS的200微升玻璃解剖盘的新鲜好。
  14. 基于甘油安装介质一滴添加到载玻片并且由一个加到安装平台的免疫染色卵巢之一。
    注:确保卵巢确实转移到安装介质。未能一切都做得那么Ø会导致组织损失。
  15. 同时期待通过解剖显微镜,轻轻掐使用戏弄针保持与镊子卵巢的不透明部分不透明成熟的卵子商会透明卵巢管(年龄阶段)。从安装介质中取出成熟的卵子商会。
  16. 将在幻灯片上,轻压一个玻璃罩(22毫米,1号),以确保安装介质传播均匀下方。
    注:按上玻璃罩也确保沿玻璃罩的组织的适当对准。未能这样最佳地做可以允许较小的阶段漂浮在所述安装平台,从而防止那些组织的最佳显微镜。
  17. 空气干燥15分钟,将样品和密封玻璃罩的边缘仔细指甲油。
  18. 执行共焦显微镜根据实验的需要( 表1)。

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Representative Results

所描述的方法可用于研究线粒体的结构和功能在现场和固定果蝇卵巢( 图2B)。提供与所描述的方法获得的预期结果的一些例子。

果蝇卵巢的解剖 :当进一步解剖,从整个果蝇图3A)被切断的腹部( 图3B)应该释放腹腔内容,包括来自每个单独的果蝇 2卵巢。完整卵巢显示为椭圆形,白结构,其理想地应保持通过输卵管秆彼此连接( 图3CD箭头)。在每个卵巢的卵巢管应该由纤维鞘(在图3C的放大部分#),其为b除去保持在一起Ÿ小心挑逗( 图3D粗箭头; *指示与分离卵巢管一个严重戏弄卵巢)揭露卵巢管染色镜检。同的腹部内容物的释放期间撕开输卵管秸秆释放卵巢也可使用,只要不损坏。任何损坏卵巢(*在图3C)和其他腹部内容( 如图3C箭头)应当被丢弃。

果蝇卵巢直播镜检查 :在这里,我们展示了FLIP技术,在果蝇卵巢线粒体的结构和功能性染料的加载。

倒装技术,以前用于评估在果蝇毛囊细胞线粒体9连续性,已经在这里证明在转基因果蝇卵巢滋养细胞图4A)的连续性。 FLIP定位到与护士细胞相关线粒体云中的一个导致从周围内200秒( 图4BC)的红色FLIP ROI内的蓝色和白色的ROI的荧光信号的大于50%的损失;从绿色的ROI信号用于背景校正。从其他不相关的滋养细胞黄色的ROI的荧光信号保持整个时间帧常数,实验( 图4B和 C)的时间过程中标志着最小整体漂白。此外,请参阅视频1.这个结果表明,线粒体在护士细胞已融合的外膜和内膜,在步骤3和4( 图4A)中列举,而在步骤1和2线粒体预计不会显示在这个时间帧荧光的任何损失。

先前已表明,每单位线粒体电位线粒体质量的半定量测量可通过共染色与电位染料TMRE和反射线粒体质量13整体线粒体染色来评估。这里,相同的技术被用于证明在活果蝇卵巢组织的每单位质量的线粒体电位的评估。与TMRE染色活果蝇卵巢共聚焦显微镜表明在信号与组织( 图5A)的深度的减少。荧光信号由于更大的组织深度增加散射这一损失有望通过任何一种fluorop的发生·霍尔与使用中的目标的给定的工作距离。因此,为了辨别在其中可以在活组织成像来检测所述荧光团的组织的最大深度是很重要的。例如,活的整体线粒体染色(三刀)染色果蝇卵巢可使用范围为20微米的由盖玻片内所描述的显微镜设置( 表1)进行成像,而最大可成像深度随蛋室尺寸减小( 图5B)。对于线粒体污渍优化显微镜设置检测在相应检测通道阳性信号,而设置,以检查任何不适当的信号串扰或荧光团交激发果然检测最小或没有信号( 图6A)。 TMRE的与整体线粒体染色共染色可以用于定性( 图6B)和定量的( 图6CD </活果蝇卵巢单位质量线粒体膜电位的STRONG>)评估。例如,a)一种定性分析表明, 果蝇 germarium呈现的每单位质量更高线粒体电位在阶段2b中,其中所述体毛囊细胞已经出现封装生殖系细胞(箭头的头在图6B)和b)半定量分析表明线粒体电位每单位质量(伸展)亚冠和MBC的,如从一个阶段9卵室( 图6C)分析之间的差异。注意,量化已从2不同的光学片进行用于汽车金融和MBC的,这取决于它们的焦点平面。已在果蝇 14已成功应用于美图-ROS探头的使用是体现在生活果蝇卵巢滤泡上皮细胞层,那里的线粒体分裂蛋白质的功能空克隆Drp1were介绍。大多数情况下,BU吨不是所有的活GFP阴性DRP1空卵泡细胞克隆表现出升高的染色丝裂的ROS( 图7AB)。注意,虽然明显的线粒体信号不能在这个组织中检测到,丝裂ROS污点的浓度可以在核区中的高级有丝分裂后毛囊细胞,它比有丝分裂毛囊细胞显著放大检测(*在图7C)。这可能是由于核DNA和线粒体-ROS染料,它是乙锭15的衍生物的荧光氧化产物之间的相互作用发生。

在固定果蝇卵泡细胞线粒体细胞周期蛋白E的检测 :近来已经证明,线粒体可以通过将其招募到哺乳动物细胞中的线粒体表面和果蝇毛囊细胞层调节细胞周期分子细胞周期蛋白E 果蝇滤泡细胞层12中的线粒体细胞周期蛋白E池。在此,在果蝇毛囊细胞细胞周期蛋白E的线粒体定位的一个例子是使用所述的共免疫染色协议证明。注意在其中dCyclinE信号与在germarium( 图8A)的线粒体ATP-B信号的重叠GFP阴性DRP1空克隆dCyclinE的水平升高,虽然该信号无法解析与有限的分辨率不同线粒体元件的共焦显微镜。另外,在有丝分裂后的MBC,所述GFP阴性DRP1空克隆有两个核和胞质dCyclinE信号,与所述的ATP-B信号后者显著重叠,而野生型GFP阳性细胞只有一个核dCyclinE信号( 图8B)。


图1. 开发果蝇 商会卡通描绘了一个果蝇卵巢管组成的链的发展蛋室,每个卵母细胞和卵泡细胞层(体)封装护士细胞(生殖细胞)组成的。鸡蛋商会从germarium制定并通过的阶段,其中有丝分裂的毛囊细胞成为有丝分裂后发育。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2.实验计划和准备。在使用方法(A)工具描述:A.飞瓶; B.昆虫解剖介质; C.多聚甲醛; D.飞刷; E.解剖盘; F.盖玻片; G.离心管。 H.玻璃底培养皿;一搏命; J. 1000μL微量; K. 200μL微量; L. 2.5微升微量; M.戏弄针头弯曲的尖端(尖端放大); N.厚钳; O.细镊子。 (B)的流程图代表示意图描述的方法。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3
图3.解剖果蝇卵巢的。 (一)全麻醉果蝇(B)的半个果蝇的腹部有或无(*)腹腔内容。 (C)的发行日期果蝇的腹部内容,包括卵巢(箭头和*)和其他内容(箭头);该对输卵管秆,其中卵巢管是由纤维鞘(#)举行举行卵巢在突出前(蚂蚁)和后(POST)右盒装区域的放大倍率结束。 (D)相比,unteased卵巢(细箭头)戏弄果蝇卵巢(粗箭头标记适当梳理和*标记严重戏弄)。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4
图4.活组织化验FLIP。 (A)的示意图表示线粒体裂变/融合,这可通过使用倒装法的适当线粒体连续性测定法测定的步骤;在这种情况下,在线粒体基质中的线粒体-YFP探针允许assessm线粒体基质连续性ENT。 (二)时间推移现场转基因果蝇卵室表达线粒体-YFP 体内显微镜;只有选择的时间点(T)所示。查看视频1所有的时间点。 (C)从相应的有色感兴趣区(B)中的荧光信号的定量背景校正后和标准化来表示。的箭头指示的反复光漂白的时间点,而两个连续褪色事件之间的时间间隔是恢复时间。比例尺:10微米。的图像与表1中描述的参数获得的。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5
图5.线粒体直播升染色和果蝇卵巢管的显微镜。 (A)和TMRE染色活果蝇卵巢管的独立的光学片;图像用表1中记载的参数获得的。 Z表示从微米盖玻片之间的距离。 (B)带电果蝇卵巢管装入整体线粒体染色(美图)。在XY图像中的红线的XZ图像被示出,其中B是底部,T是所获取的图像的顶部。从底部到蓝线的距离为20微米。比例尺:20微米。的共焦图象分别用表1中记载的参数获得的。 请点击此处查看该图的放大版本。

图6
F果蝇卵巢管与TMRE和整体线粒体染色的igure 6共染色。 (A)活果蝇卵巢管共同沾有TMRE和整体线粒体染色(美图)的单光切片; *表示在讨论部分中描述的实验神器。 (B)在(A)的germarium连续3个光片最大强度投影;箭头指示在其中TMRE荧光增加的区域。 (三)有丝分裂后卵室的单光片合作沾上TMRE和整体线粒体污点。所述顶板和底板分别显示焦点的用于AFC中和的MBC的平面。 (D)箱线图显示TMRE的平均荧光强度和(C)在盒装地区个别汽车金融公司和MBC的量化的整体线粒体污点。的箱形图的晶须表示最大值和最小值的每个组,但不包括异常值。 表1中记载的参数获得的。 请点击此处查看该图的放大版本。

图7
图7.现场DRP1空马赛克果蝇卵巢管染色用美图-ROS染料。 (一)与线粒体-ROS染料染色卵巢管的单光片。 (B)与在线粒体毛囊细胞的单个卵腔的2个连续的光学片的最大强度投影抽动阶段沾上水户-ROS染料。 (三)具有与线粒体-ROS染料染色的有丝分裂后阶段的毛囊细胞的个体卵室的单光切片; *表示核信号。缺乏UbiGFP的标志着DRP1空克隆。比例尺:20微米。的共焦图象分别用表1中记载的参数获得的。 请点击此处查看该图的放大版本。

图8
固定DRP1空马赛克果蝇卵巢管图8.联合免疫与dCyclinE和ATP-B抗体。 (A)的联合免疫染色germarium连续3次光片最大强度投影。 (B)的联合immunos连续3次光片最大强度投影tained有丝分裂后的MBC。该大纲划定UbiGFP负DRP1空克隆。比例尺:10微米。的共焦图象分别用表1中记载的参数获得的。 请点击此处查看该图的放大版本。

图9
图9.潜在损坏,文物的例子。 (A)的Germarium UbiGFP表达卵巢管固定并用该DNA染料赫斯特表示不适当的间隙(*)染色。 (B)的UbiGFP表达卵巢管固定并用该DNA染料赫斯特表示刻痕/泪(*)染色蛋室中。 (三)现场卵巢管与水户-ROS染料呈现出畸形的室(*)染色UbiGFP负DRP1空克隆和损坏的卵室,允许分批种系(**)的染色; #表示在同一卵巢管未损坏的鸡蛋室的可能真正污点。 (四)现场卵巢管与线粒体-ROS染料染色显示与种系人为的紧张染色的总体损坏室。 *表示损伤诱导扁平卵巢管与UbiGFP信号丢失,从而引起人为的GFP阴性克隆。比例尺:20微米。的共焦图象分别用表1中记载的参数获得的。 请点击此处查看该图的放大版本。

视频1
视频1. 实时组织FLIP分析。基于光漂白-FLIP试验的完整时间过程如图5所示。.COM /文件/ ftp_upload / 54989 / Video1.avi“目标=”_空白“>请点击这里观看该视频。(右键点击下载)。

表1:所提出的代表图像的采集共聚焦显微镜设置。 请点击此处查看表1(右键点击下载)。

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Discussion

该议定书中的关键步骤

漂白:防止荧光样品的过度的光漂白是绝对必要的进行高效率的共焦显微镜。因此,用于通过目镜来定位样品或通过实时扫描模式设置图像采集参数的时间应尽量减少,以减少光漂白。

的组织损伤 :由于线粒体被认为是细胞健康的传感器,这是非常重要的,以确保使用所描述的方法获得的数据是生理学相关,并不反映引起果蝇卵巢的程序夹层不适当的损害。应尽可能快地进行剥离,而且还与极端的预防措施以最小化组织损伤。 5 果蝇卵巢的解剖和戏弄的平均时间为5〜7分钟(在我们手中S)。努力必须采取鉴定蛋室表示将从分析中排除受损组织。由于解剖组织损伤可以包括不适当的间隙(*在图9A中 ,作为确定的缺乏信号),刻痕/泪(*在图9B中,作为确定的缺乏信号),或变形的蛋室(*在图9C)。不过,从实验操作所引起的任何有意义室变形应仔细评估。虽然没有盖玻片上使用中所描述的协议的活组织的顶部,卵巢管的扁平化可以与同时取笑或安装(*在图9D)施加于组织不适当的压力发生。卵巢管的扁平化并没有被观察到与固定的样品中,由于描述的方案涉及解剖后立即组织的固定,与挑逗发生之后。任何孤立的卵室没有aforementione任何签名ð损害可能被认为是正常的。从解剖可能造成机械损伤也可能导致GFP的损失,得到假GFP阴性克隆16,也可以产生增强的染料结合。鉴于驻留在蛋室内部的生殖系细胞通常不透过活线粒体染料( 图67), 果蝇的生殖系细胞的增强线粒体染色可以从增加在受损/垂死组织的渗透性结果;与线粒体-ROS染料(**在图9C图9D中的整个卵巢管)发生这样的赝象,以及与其他活线粒体污渍(未示出)。 UbiGFP在图9D(*)的损失也可能从造成的蛋室的平坦化损害导致。虽然在受损的卵巢管其他蛋室可以保持原汁原味和神器免费(# 图9C

时间灵敏度 :在活体外显微镜的情况下,数据应组织安装在15分钟内获得;否则,实验结果可以通过生理学的改变,由于组织的随后死亡的影响。有时,这取决于激光功率和其他扫描参数,安装介质的10μL的可能超过15分钟蒸发越快。通过共免疫染色线粒体细胞周期蛋白E池的检测需要的清扫时间(可能最小化由于和线粒体的瞬时性质里亚尔细胞周期蛋白E池由主动线粒体呼吸12维护)。可观的线粒体细胞周期蛋白E池也没有用透时间小于30分钟观察。

FLIP:任何蛋室的被检查FLIP时间过程中的移动会导致人为的分析,因此必须排除。在FLIP实验不建议使用任何活的线粒体染料或TMRE,因为国外染料掺入可以改变线粒体的连续性,从而导致人为的结果。

果蝇交叉策略 :横倒数到此处所描述的(其中,携带DRP1突变等位基因的男性使用)不产生许多子代,可能是由于DRP1压制在杂合父本一个不明的影响。

克隆数据的解读 :在控制卵巢检测到的任何GF-负克隆从亲果蝇表达UbiGFP将指示人为的假阴性克隆,由于夹层16中造成的损害的GFP损失可能产生分离。然而,在交叉的热休克子代GFP阴性的克隆的数量应该比对照看到任何假阴性克隆显著更高。在通过所述有丝分裂基于重组策略果蝇滤泡细胞层中产生的克隆可以从有丝分裂毛囊干细胞产生(干细胞克隆)或从有丝分裂非干毛囊细胞(瞬态克隆)。对于干细胞克隆,实验分析应在热激后10天进行,当与瞬态克隆蛋室已铺设。对于瞬态克隆的分析应在6天内的热休克后没有在任何germarium毛囊细胞克隆进行,随着卵巢管的毛囊细胞克隆。

修改和故障排除

当使用所描述的方法评估每单位质量线粒体膜电位,人们必须知道所产生的显微镜光学或线粒体染料组合潜在工件。示出了从总体线粒体染色削弱信号和相对升高的TMRE信号( 图5A,*)的任何区域可能由于染料8或由于红色的不同的光学特性之间的荧光共振能量转移(FRET)(TMRE)和绿色(整体线粒体染料)荧光灯,由于在收购设置一个固定的针孔大小。该FRET相关的构件可以通过降低染料浓度,应尽量避免使用,而定量分析可以对2预测进行 - 连续3个光片,以避免光神器。此外,如果在串扰和交叉激励被检测的荧光信号通道,激光器和检测器的设置必须重新调整,以在这些通道,从而有望降低荧光信号中的最佳信道,以及该信号最小化。

激光诱导从反复漂白损坏可能会导致线粒体的碎片,从而导致线粒体的不连续性,防止一个成功的翻转。对FLIP协议的执行期间线粒体的疑似碎片可以通过用减少针孔获取更高分辨率的图像(和增强检测器增益)进行识别。如果线粒体不成对FLIP协议的执行过程中有明显注意到,漂白激光器的功率必须减少和/或连续的漂白剂之间的间隔必须增加。如果在翻转实验(从图3BC中的黄色的ROI信号)的时间过程中整体漂白,扫描激光必须重新调整到一个水平允许很少或没有整体光漂白。

为了避免潜在的工件由于GFP的损伤引起的损耗,也可以使用MARCM策略,以下所描述的热休克协议被引入GFP阳性克隆。在这里,用于跨适当的果蝇是处女女drpKG03815 FRT40A / CYO点¯x男性GAL80 FRT 40A / CYO;浴缸-GAL4,UAS-CD8GFP / TM6 9。直翅后代应用于使用热休克克隆生成(如在步骤6中所述)。

该技术的局限性

A)中虽然驻留的活果蝇卵室的表面上的毛囊细胞掺入线粒体染色染料,蛋室内部的生殖系细胞不这样做;年轻阶段的种系染色弱( 图56)。 B)体外 Tissu酒店显微术必须在染色完成后的15分钟内从个别果蝇 ,人们隔离在一个时间卵巢进行。因为实验组应处理并成像在同一天,所用的总时间,以从不同的实验组活体外组织显微镜获得统计显著数据比从固定的组织获得的那些相当长。 c)我们注意到,丝裂的ROS污点是不是在体外果蝇组织非常稳定,可能是由于活性氧的瞬时性质分析物检测17,15,其可以从所有DRP1背后缺乏检测信号的空克隆。然而,在该DRP1空细胞丝裂ROS染色的可变性的任何生物相关/克隆不能排除,必须进一步调查。需要注意的是从线粒体-ROS染色阳性信号可以不仅反映增强的超氧化物,但也增强线粒体或cellulAR氧化环境15。 D)的总的线粒体染色不能用于GFP阴性或GFP阳性克隆实验中,由于本线粒体染色和GFP的荧光光谱是无法区分的。 E)的该倒装实验设计测定线粒体基质的连续性,需要图像采集以开放的针孔,它包括线粒体结构的分辨率。

关于到现有/替代方法的技术意义

研究线粒体结构 - 功能关系是线粒体功能的调节机制的透彻理解至关重要。由于线粒体缺陷显著各种疾病,包括糖尿病,癌症,帕金森氏病,导致线粒体手法详细了解持有facilitati的承诺纳克的线粒体导向的治疗策略的发展。活细胞显微镜是研究线粒体结构与功能的关系不可缺少的工具。然而,大多数这些研究已被限制到分离的细胞。线粒体的结构和功能的研究一直延伸到果蝇组织住在体外设置9。这个和有关的研究中所描述的协议将导致在活果蝇卵巢, 离体的线粒体的结构和功能的理解,从而允许在生理上下文中的线粒体的理解。这种离体方法具有超过体外研究显著优势,因为在给定的小区中的代谢和线粒体的能量性质的调节在很大程度上取决于营养供应和适当的信令在细胞的生理环境。

MI的遗传操作通过抑制线粒体裂变蛋白质DRP1 tochondrial结构deregulates细胞周期调节细胞周期蛋白E和影响果蝇卵泡细胞层9,12的发展。这里,协议包括如何引入DRP1的功能空克隆在果蝇卵巢研究线粒体结构-功能关系的描述。线粒体细胞周期蛋白E的哺乳动物细胞上的新型池,以及果蝇毛囊细胞层12,已被成功地检测到,这可能underlies由线粒体18所报告的细胞周期蛋白E调节。这里,原稿演示通过共免疫染色固定果蝇卵巢为dCyclinE和线粒体标志物(ATP-B)检测新颖线粒体细胞周期蛋白E池的方法。

掌握这一技术后,未来的应用方向或

鉴于ŧ帽子果蝇是一个功能强大的遗传模型系统,我们描述的方法预计到显著到在健康和疾病线粒体结构-功能关系的遗传基础的理解作出贡献。 果蝇已被广泛用于梳理出遗传相互作用导致肿瘤发生19。果蝇上皮毛囊细胞层克隆的产生的能力允许在单个致瘤克隆线粒体和癌基因或肿瘤抑制基因的相互作用的研究在体内离体设置。所描述的方法可用于研究从适当突变体果蝇分离卵巢线粒体结构-功能关系的调节所述方法可以进一步扩展通过exog研究对线粒体的结构和功能的信令的各种养分和生长因子的直接影响源性加入适当的营养物和/或生长因子在体外成像介质。所描述的方法可以适当地修改和其他孤立果蝇组织使用,如幼虫成虫盘,它已广泛用于研究癌症等20,21疾病信号转导通路。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Grace's Media (Insect Dissecting Medium) Fisher Scientific 30611031-2
41 Paraformaldehyde AQ Electronic Microscopy Sciences 50-259-99
Mitotracker Green (overall mitochondrial stain) Life Technologies m7514 Reconstitute and Aliquot
Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate Sigma Aldrich 87917-25MG Reconstitute and Aliquot
MitoSox (Mito-Ros stain) Life Technologies m36008 Reconstitute and Aliquot
PolyLysine MP Biomedicals ICN15017625
Fly Vials Fisher Scientific AS-515
Fly Conicals Fisher Scientific AS-355
Fly Vial Flugs Fisher Scientific AS273
Fly Conical Flugs Fisher Scientific AS 277
Jazzmix Drosophila food (Drosophila food) Fisher Scientific AS153
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A9647-50G
Cyclin E Antibody (d-300) Santa Cruz sc- 33748
ATPB antibody [3D5] - Mitochondrial Marker AbCam ab14730
Cy3 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 115-165-146
Cy5 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 111-175-144
Hoechst Fisher Scientific H3570
VectaShield Fisher Scientific H100
Azer Scientific EverMark Select Microscope Slides Fisher Scientific 22-026-252
Microscope Cover Glass Fisher Scientific 12-542-B
Mat Tek Corp Glass Bottom Mircrowell Dish Fisher Scientific P35G-0-14-C
Active Dried Yeast Fisher Scientific ICN10140001
Confocal Microscope Carl Zeiss LSM 700
Dumont #5 Forceps Fine Science Technologies 11251-20
Moria Nickel Plated Pin Holder Fine Science Technologies 26016-12
Minutien Pins Fine Science Technologies 26002-15
MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 ) Bloomington Stock Center 7194
Fly Pad Fly stuff 59-118
Blowgun Fly stuff 54-104
Blowgun needle Flystuff 54-119
Dissecting Microscope Carl Zeiss Stemi 2000
Analyses software Carl Zeiss Zen 
Analyses software Open source Image J
Research Macro Zoom Microscope Olympus MVX10
QICAM Fast 1394 Cooled Digital Camera, 12-bit, Mono  QImaging QIC-F-M-12-C
QCapture Pro 5.1 QImaging

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References

  1. Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148, (6), 1145-1159 (2012).
  2. Youle, R. J., van der Bliek, A. M. Mitochondrial fission, fusion, and stress. Science. 337, (6098), 1062-1065 (2012).
  3. Mitra, K. Mitochondrial fission-fusion as an emerging key regulator of cell proliferation and differentiation. Bioessays. (2013).
  4. Kageyama, Y., Zhang, Z., Sesaki, H. Mitochondrial division: molecular machinery and physiological functions. Curr Opin Cell Biol. 23, (4), 427-434 (2011).
  5. Chen, H., Chan, D. C. Physiological functions of mitochondrial fusion. Ann N Y Acad Sci. 1201, 21-25 (2010).
  6. Liesa, M., Shirihai, O. S. Mitochondrial dynamics in the regulation of nutrient utilization and energy expenditure. Cell Metab. 17, (4), 491-506 (2013).
  7. Hoppins, S. The regulation of mitochondrial dynamics. Curr Opin Cell Biol. 29, 46-52 (2014).
  8. Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. Chapter 4, Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches. Curr Protoc Cell Biol. Chapter. 21-21 (2010).
  9. Mitra, K., Rikhy, R., Lilly, M., Lippincott-Schwartz, J. DRP1-dependent mitochondrial fission initiates follicle cell differentiation during Drosophila oogenesis. J Cell Biol. 197, (4), 487-497 (2012).
  10. Klusza, S., Deng, W. M. At the crossroads of differentiation and proliferation: precise control of cell-cycle changes by multiple signaling pathways in Drosophila follicle cells. Bioessays. 33, (2), 124-134 (2011).
  11. Sahai-Hernandez, P., Castanieto, A., Nystul, T. G. Drosophila models of epithelial stem cells and their niches. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, (3), 447-457 (2012).
  12. Parker, D. J., et al. A new mitochondrial pool of cyclin E, regulated by Drp1, is linked to cell-density-dependent cell proliferation. J Cell Sci. 128, (22), 4171-4182 (2015).
  13. Mitra, K., Wunder, C., Roysam, B., Lin, G., Lippincott-Schwartz, J. A hyperfused mitochondrial state achieved at G1-S regulates cyclin E buildup and entry into S phase. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (29), 11960-11965 (2009).
  14. Shidara, Y., Hollenbeck, P. J. Defects in mitochondrial axonal transport and membrane potential without increased reactive oxygen species production in a Drosophila model of Friedreich ataxia. J Neurosci. 30, (34), 11369-11378 (2010).
  15. Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radic Biol Med. 48, (8), 983-1001 (2010).
  16. Haack, T., Bergstralh, D. T., St Johnston, D. Damage to the Drosophila follicle cell epithelium produces "false clones" with apparent polarity phenotypes. Biol Open. 2, (12), 1313-1320 (2013).
  17. Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417, (1), 1-13 (2009).
  18. Mandal, S., Guptan, P., Owusu-Ansah, E., Banerjee, U. Mitochondrial regulation of cell cycle progression during development as revealed by the tenured mutation in Drosophila. Dev Cell. 9, (6), 843-854 (2005).
  19. Tipping, M., Perrimon, N. Drosophila as a model for context-dependent tumorigenesis. J Cell Physiol. 229, (1), 27-33 (2014).
  20. Herranz, H., Eichenlaub, T., Cohen, S. M. Cancer in Drosophila: Imaginal Discs as a Model for Epithelial Tumor Formation. Curr Top Dev Biol. 116, 181-199 (2016).
  21. Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63, (2), 411-436 (2011).

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