ミトコンドリアの構造と機能の研究に

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Parker, D. J., Moran, A., Mitra, K. Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries. J. Vis. Exp. (119), e54989, doi:10.3791/54989 (2017).

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Abstract

Introduction

彼らは分化した細胞でのエネルギー産生の主な席があるので、ミトコンドリアは、古典的に、携帯大国として記載されています。また、ミトコンドリア1、代謝、発熱、脂質修飾、カルシウム及び酸化還元ホメオスタシスにおける細胞シグナル伝達プロセスのオーケストレーションに重要な役割を演じます。ミトコンドリアは、細胞死2、ならびに細胞周期調節3での誘導に積極的な役割を果たしています。このような多機能性は、以下の基本的な問題を提起する:a)どのようにミトコンドリアが同時にこれらすべての機能を実行し、異なる機能のために特化されている特定のミトコンドリアプールやサブゾーンb)はありますか?この文脈では、多官能性ミトコンドリアが、個々の細胞内での形状、大きさ、および構造に動的であること、およびミトコンドリアの定常状態の形状は、細胞型間で変化し得ることに留意することが重要です。様々な実験室からの研究の十年オラトリオは、ミトコンドリアの形状、大きさ、構造、総称ミトコンドリアのダイナミクスの変化は、様々なミトコンドリアの機能4,5,6を維持するために重要であることを示唆していますこれらの知見は、ミトコンドリアがそれらの構造的ダイナミズムのおかげで、それらの多機能化を達成することができる可能性を提起します。

大規模な努力がミトコンドリアの構造と機能の関係を理解するために進行中です。ミトコンドリアの構造のダイナミズムは、主として、互いに分裂および融合事象を受ける能力によって維持されます。 2つの小さなミトコンドリアの融合が大きくミトコンドリア素子7にそれらをマージしながら、大規模なミトコンドリアの分裂は、より小さなミトコンドリアの要素に変換します。また、2ミトコンドリアの一過性の融合は、その内容の混合を可能にするために発生することがあります。内側と外側のミトコンドリア膜の分裂と融合イベントは慎重仕様によって支配されていますタンパク質のIFICセット。コア核分裂機械はDRP1機能もによって調節することができる一方で、特定の善意のミトコンドリアタンパク質( 例えば、Fis1またはMff1)との相互作用によってミトコンドリアに細胞質ゾルから募集されたダイナミン関連タンパク質1(DRP1)、から構成されていますミトコンドリアの表面4上の他のタンパク質。 DRP1は、外膜で動作しますが、その核分裂能力は、同様に内膜に影響を与えます。外側と内側のミトコンドリア膜の分裂のオーケストレーションが十分に理解されていません。 mitofusinsは、外膜5の融合を支配しながら、一方で、内膜の融合は、OPA1の活動によりコアに支配されています。ミトコンドリアの対抗核分裂と核融合イベントのバランスは、細胞内の定常状態のミトコンドリア形状を決定します。例えば、ミトコンドリア分裂の抑制は、ミトコンドリアの過活動しながら、完全かつ無競争の融合をもたらすであろうリットルの核分裂はミトコンドリア3の断片化をもたらすであろう。

ミトコンドリアの構造と機能の関係の研究は、主に次の2つの相補的なアプローチを含む:a)は、ミトコンドリア分裂/融合タンパク質の遺伝子操作した後、細胞および生物表現型の分析およびb)ミトコンドリアの構造と機能の直接評価。表現型が原因で二次的な影響を生じる可能性があるとして、遺伝的分析はいつも、(この場合は、ミトコンドリアの分裂/融合タンパク質)手元にある分子の直接の機能を明らかにしない可能性があることに注目すべきです。したがって、直接ミトコンドリアの構造および機能を研究するためのツールを開発し、使用するために極めて重要です。ミトコンドリアの構造のいずれかの評価は、様々な顕微鏡ツールを必要とします。ミトコンドリアの活力を定性的およびquantitatモニターすることができるので、生細胞の蛍光顕微鏡法の使用は、ミトコンドリアの動力学の研究を大幅に進んでいますively適切な蛍光顕微鏡のツールとテクニック8を使用して。蛍光顕微鏡ベースのツールは、 インビボ 9 ミトコンドリアダイナミズムの意義を解明する、ライブ固定キイロショウジョウバエ組織においてミトコンドリアの構造および機能を研究するために開発されてきました。これらおよび関連する方法は、 ショウジョウバエ卵巣でミトコンドリアの構造と機能を研究することを目的に、ここで説明します。

ショウジョウバエの卵巣は、胚腺10,11内に存在し、それぞれの成体幹細胞から生じる生殖系列および体細胞系統、で構成されています。十六合胞体胚細胞(のGC)は、胚腺( 図1)から出てくる個々の卵室を形成するために体包細胞(FCS)によってカプセル化されます。 16のGCの一つは、卵母細胞になることを約束します、そして残りの15 GCは卵母細胞チャンバの成長を支援ナース細胞に発展しますそれが載置される前に、卵の成熟を促進します。これらは末端前方包細胞(AFCS)、後方包細胞(PFC類)、及び本体細胞からなるパターン化された上皮細胞層に分化する分裂細胞周期を出る前に、FCの大半は、有糸分裂の9ラウンドを受ける(MBCS) 。連続卵室が早期開発中のFCに由来する細胞を分化さ茎細胞によって接続されています。ミトコンドリア分裂タンパク質DRP1によって規制ミトコンドリアの形状は、積極的にショウジョウバエ卵巣FC層9,12の正常な発達の間、分化の過程に関与しています。 ショウジョウバエ卵胞細胞層の発達にDRP1の関与を同定するために、これらの研究で使用した方法は、ここに記載されています。

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Protocol

ショウジョウバエの調製(図2Aに示されている必要なツール)

  1. 記載された実験のいずれかの場合は、 ショウジョウバエを収集羽化の5日以内(室温、または25ºCに維持)と5を充填したバイアルの中に置いて-これ以上25以下で、7 mLのショウジョウバエの食品( 材料表を参照てください)各バイアルに飛びます。女性を維持する:1:2の男性の比率を。
  2. ショウジョウバエの卵の産生を刺激する顆粒化酵母の少量を振りかけます。 4日 - 2内の実験的操作を実行します。

ショウジョウバエ卵巣の2解剖(図2Aに示されている必要なツール)

  1. 室温、25°Cにメディアを解剖ウォーム昆虫( 材料表を参照てください)。各ウェル中の培地200μLで、皿を解剖8ウェルガラスの3つのウェルを埋めます。
  2. COとショウジョウバエの麻酔ショウジョウバエを扱います。
  3. 解剖顕微鏡の接眼レンズを覗きながら、鉗子の2ペアを使用して腹部から胸部を断ちます。鉗子を使用して、慎重に皿の第2のウェルに腹部を転送します。
  4. 後端で腹部を保持し、ゆっくりと鉗子の他のペアで(他の腹部のコンテンツと一緒に)卵巣を押し出すために鉗子のペアを1つ使用します。この試みは失敗、慎重に卵巣を解放するために前方端部に鉗子を挿入することにより、腹部の外骨格を削除する必要があります。
  5. 鉗子を使用して、不透明な後端することによって、個々の卵巣を保持する( すなわち、卵黄に満ちた、後期段階の卵)と皿の第3のウェルに慎重にそれを移動ライブ顕微鏡(ステップ3)のためにそれを処理するためからかうためまたは免疫(ステップ7)を実行するように固定します。
  6. 慎重にピンセットで後端によって、それを保持しながら、各卵巣の前端に後方から軽くからかい針を掃引することによって卵巣周囲から保護シースをいじめます。
    注:、からかい時の被害を最小限に抑える針の先端を曲げ、顕微鏡( 図2A)の倍率を増加させることにより、各卵巣にズームインするには。いじめは、シースを破壊するのに十分効果的であるが、また、慎重ovariolesの整合性を維持するために行われるべきです。

ライブ・組織の顕微鏡3.準備

注:必要なツールは、 図2Aに示されています。

  1. ショウジョウバエの解剖前に、ポリI-リジンコーティングされたチャンバーを準備します。この目的のために、coverglにポリIリジン(0.1 mg / mlで)の2つの20μLの液滴を配置しますお尻ドロップのマージを防止するために、互いから合理的な距離でガラス底ペトリ皿(35ミリメートル)の(14ミリメートル、0号)。 37ºCで1時間、プレートを空気乾燥させ、消去可能なマーカーでプレートの下に白いポリI-リジンフィルムのエッジをマーク。
    注:ポリIリジンでコーティングされたチャンバー週間4℃で保存することができます。既にコーティングされてチャンバーを用いた場合は、 ショウジョウバエの解剖を開始する前に、室温までそれを持って来ます。
  2. サンプルは以下のように、解剖および取り付けが完了した直後に画像化することができることを確認するために、共焦点顕微鏡上の走査パラメータを設定します。
  3. 解剖1を配置し、マークされたポリI-リジンでコーティングされた領域上の卵巣(手順2次および染色し、必要に応じて、次のステップ5)をからかったとovariolesを分離するためにからかい針で卵巣を広げます。トンをカバーするために確認して、卵巣の上に昆虫解剖培地の10-μLのドロップを置きます彼は、領域全体をポリI-リジンでコーティングしました。ペトリ皿をカバーしています。
  4. すぐに室温に装着されたサンプルの共焦点顕微鏡検査を行います。
    注:唯一のショウジョウバエは 、解剖処理され、一度に画像化されるべきです。また、顕微鏡は、 ショウジョウバエの組織のための熱ショック環境を模倣します、37℃で実施されるべきではありません。

光退色(FLIP)アッセイ4.蛍光損失はミトコンドリアマトリックスの連続性を評価するために、

注:融合ミトコンドリア構造におけるミトコンドリアのマトリックスの連続性は、中間段階を経て進行を次のミトコンドリア内膜と外膜の完全な融合後に確立されています。ミトコンドリアの分裂は、同じ手順に従いますが、逆の方向に( 図3A)があります。 FLIPは、ミトコンドリアマトリックスの連続性を評価するために使用することができるタイムラプス顕微鏡ベースの半定量的な方法でありますライブショウジョウバエ卵巣9ex vivoでミトコンドリアの最終的な溶融状態( 図3Aに3と4ステップ)。 FLIPアッセイは、一定の間隔( 図3AにおけるFLIPのROI)に光退色さミトコンドリアマトリックス中の蛍光分子を発現するミトコンドリアの関心領域(ROI)の小領域として実行されます。その結果、FLIPのROI( 図3Aの実験ROI)と連続している任意の周囲のミトコンドリアの領域が原因で、連続ミトコンドリアマトリックス中の分子の交換に信号を失うことになります。ここで実証FLIP実験は自由に拡散形でミトコンドリアマトリックスに標的化するためにYFPのタグが付いたヒトチトクロームオキシダーゼVIIIサブユニットのミトコンドリア標的配列を含むmitoYFPを発現するトランスジェニックショウジョウバエで実行されます。以前に報告されたように同様の実験はまた、水戸pUASP-水戸-GFP導入遺伝子を用いて行うことができます<SUP> 9。同様のFLIPプロトコルは、ミトコンドリア内膜( 図3Aのステップ2)の外側ではなく、融合に起因する連続性を検出することができるように、ミトコンドリアの膜間空間に標的プローブを使用することができます。

  1. 共焦点顕微鏡の画像取得ソフトウェアを開き、「取得」タブ( 表1)に適切なスキャンパラメータを設定します。個々のタブを開くには、「時系列」「漂白」と「地域」チェックボックスをオンにします。各タブ( 表1)に適切な取得パラメータの値を入れてください。
    注:この実験は、個々の細胞中の全ミトコンドリア集団から全体の信号を監視するように設計されているように、ピンホールは、開いたままにしておく必要があり。
  2. すぐに取り付けられて生きている組織に興味のある分野を特定するために接眼レンズを使用してください。
    注:よくガラスbottomeに広がっているovariolesを選択共焦点顕微鏡は、フローティングovariolesで実行することができないので、D皿、。
  3. 関心の選択したフィールドのライブ画像を取得する「ライブ」をクリックします。ライブスキャンを停止するには、「停止」をクリックしてください。
  4. 必要に応じて、検出した蛍光シグナルがオフセット値を調整することによって設定のように定義背景に、飽和レベル(「レンジインジケーター」オプションがチェックしたとき赤色の画素が存在しないことによって示される)未満であることを、このような収集パラメータを調整します。
  5. ライブスキャンにより取得された画像上の光退色ゾーンを区別するために「地域」タブからベジェ描画ツールを使用して、小さなROIを描画します。
    注: -セル内の全蛍光ミトコンドリアシグナルの50%ROIの大きさは約20であるべきです。
  6. クリックして画像取得を行う「実験を開始します。」
  7. 材料を参照てください(プロプライエタリまたはオープンソースソフトウェアを使用して蛍光強度を定量化表)。反復的な漂白を対象としているROI(FLIP)から平均信号を記録します。漂白は、同じセル内で行われていないのROI(実験)。実験期間(漂白)の間に、全体的な漂白を評価するためのビューの同じフィールドで別の無漂白のセルからROI;背景領域(背景)にROI。他関心領域における平均信号から得られた平均バックグラウンドシグナルを差し引きます。それぞれの細胞のための最初のプレ漂白剤信号に蛍光シグナルを正規化します。
  8. 任意の標準的な作図ソフトウェアを使用して正規化されたデータをプロットします。

蛍光ミトコンドリア色素5.ライブ染色

注:定常状態のミトコンドリアの構造および潜在的には特異的に生細胞および組織中のミトコンドリアに組み込む色素を使用して評価することができます。ライブショウジョウバエ卵巣が蛍光ミトコンドリアでex vivoで染色することができます、ミトコンドリアを視覚化するミトコンドリアの活性酸素種(ミト-ROS)の産生を評価するために、単位質量あたりのミトコンドリアのポテンシャルを評価するために汚れ。これは、ミトコンドリアの電位差色素テトラメチルローダミンエチルエステル(TMRE)とミトコンドリアの質量を表す互換生ミトコンドリア染色(特異的色素の材料表を参照)で共染色することによって達成することができます。

  1. 最終的な作業濃度に培地を解剖暖かい昆虫における汚れのストック希釈:ミトコンドリア染色、250 nMのを。 TMRE、50 nMの。水戸-ROS染色、5μM。
  2. 解剖後、ステップ2次の卵巣をからかって、解剖皿のウェル中のいずれかの特定の染色溶液の200μLに卵巣を配置します。光から保護するためにアルミニウムホイルで包まれた適切なボックスで覆われた皿で10分間、それらをインキュベートします。 containin 3回連続ウェルにピンセットで慎重にそれらを移動することによって染色された卵巣を洗います汚れのないグラム媒体。
  3. TMREと互換性の全体的なミトコンドリアの染色との共染色のために、(その間の任意の洗浄工程なし)、全体的なミトコンドリア染色ですぐに最初のTMREで、次いで染色する上記のプロトコールに従ってください。
  4. ステップ3次のポリI-リジンコーティングされたガラス底皿に卵巣をマウントし、適切な走査パラメータ( 表1)との共焦点顕微鏡の準備、手順4.2から4.4以下。
    注:メディアをマウントで染色したサンプルをマウントしようとしたときに組み込まれた染料からの信号は続きませんでした。
  5. タブを開くには、Z-切片チェックボックスをオンにします。それはライブ走査されている間、サンプルの底部に向かってフォーカスホイールを回して、一番下のZ-セクションを定義するために「最初の設定」をクリックしてください。一番上のセクションを定義するために、他方向にフォーカスホイールを移動させながら、同じ操作を行います。
  6. クリックして画像取得を行う「実験を開始します。」
  7. (ステップ4.7のように)バックグラウンド信号のためのROIと、個々の細胞からのバックグラウンド補正された蛍光強度を定量化し、任意の描画ソフトウェアを使用して、データをプロットします。

DRP1ヌルモザイクの6世代

注:ここで使用されるクローン戦略はDRP1ヌル変異9のための遺伝子型がヘテロ接合性であるGFP陽性、表現型の野生型バックグラウンドの背景に緑色蛍光タンパク質(GFP)陰性DRP1ヌルクローンを紹介します。熱ショック誘導性のフリッパーゼ-フリッパーゼ認識対象(FLP-FRT)媒介部位特異的な有糸分裂組換えは、機能的にヌルdrpKG03815対立遺伝子のホモ接合のクローンを作成します。熱ショック誘導性のFLP(hsFLP)とUbiGFPクローンマーカーを有する遺伝子型がhsflpであるのに対し、DRP1の変異を運ぶショウジョウバエの遺伝子型は、drpKG03815 FRT40A / CYOです。ユビキチンNLS-GFP(UbiGFP)FRT 40A / CYO。それ自体の遺伝子型上記の遺伝子型との間の相互の択子孫はhsFLP / +です。 drpKG03815 FRT40A / UbiGFPFRT40A。

  1. 2〜3日ごとに新鮮な食品の新しいバイアルにそれらを移動することによって、処女収集のためにショウジョウバエを同期ます。新興処女雌を収集するために、毎日pupariatingバイアルを監視します。
  2. 夕方に一度午前中に一回、毎日DRP1変異体遺伝子型から、赤目、カーリー翼処女雌を収集し、別のバイアルに入れます。並行して、羽化の5日以内にhsflpとUbiGFPを運ぶ濃い赤い目、ストレート翼で男性のショウジョウバエを収集ます。
  3. 1:2の男性比:女性で処女雌に男性を追加することで、クロスを設定します。
  4. 卵の産生を刺激する顆粒化酵母の少量を振りかけます。
    注:慎重子孫量を増加させるために2〜3日毎に培地の新鮮なバイアルにショウジョウバエを移動 、バイアル集中を低減します。
  5. アンesthetize、ソート、収集ストレート翼、羽化の5日以内に赤の目の女性の子孫。
  6. ヒートショックのため、粒状化酵母の少量と小さなと空のバイアルに収集したショウジョウバエを配置 、ソフト(ヒートショック中に水分を吸収するために)ワイプ。主に卵胞細胞クローンを生成するために、1時間38ºCの水浴中にショウジョウバエでバイアルを置き、二回1時間37ºC日で2日間連続(2ヒートショックの間に少なくとも5時間を可能にします) 、生殖細胞及び濾胞細胞クローンの両方を生成します。
    注:バイアルを完全にプラグのレベルまで水に沈めていることを確認します。
  7. 熱ショックは、 ショウジョウバエの不動を行うことができます。彼らは再びモバイルになったときに熱ショックを与えショウジョウバエを室温で1時間回復することができます。
  8. クロスと同じ比率でバック男女を追加し、mediuで新鮮なバイアルに移動しますmは、造粒酵母の少量振りかけ。少なくとも5日間、 ショウジョウバエを維持します
  9. ライブまたは固定された実験のために必要に応じて卵巣を解剖。
    注:UbiGFP熱ショックによりGFP陰性クローンの効率的な誘発を確認するために、陰性対照として使用されるべき発現親ショウジョウバエから単離された卵巣。

7.サイクリンEとミトコンドリアのための共同免疫染色

注: ショウジョウバエサイクリンE(dCyclinE)を検出するために、我々は( 材料表を参照)dCyclinE 9に対して特異的に上昇し、商業的に得られた抗体を使用しています。ミトコンドリアマーカーとして、我々は、ATP-B(ミトコンドリアATP合成酵素複合体のサブユニット)9に対する抗体を使用します。

  1. 室温、25℃にウォーム4%パラホルムアルデヒド(PFA)。 あぶない!パラホルムアルデヒドは有毒です。
    注:開封後アンプル、PFAは、4℃で保存し、7日以内に使用すべきです。 PFAの記憶が劇的定着時ミトコンドリア膜を変化させるメタノールへの酸化を可能にすることができるので、これはあっても、微量で存在します。
  2. すぐに解剖した後、(からかいなし)ガラス解剖皿のウェル内に新鮮なPFAの200μLでそれらを置くことによって解剖卵巣を修正。 15分間ヒュームフード中で料理をしてください。 3回連続井戸、1×リン酸緩衝生理食塩水をそれぞれ含有200μL(PBS)にピンセットで慎重にそれらを移動することによって、固定卵巣を洗ってください。
    注:この実験は、ここで停止することができ、試料を1日4ºCで放置することができます。
  3. 慎重抗体による抗原へのアクセスを妨げる可能性が保護線維鞘を除去するために、(同様の2.6ステップする)PBS中でより徹底的に卵巣をいじめます。
  4. たて0の500μLとマイクロチューブでそれらを置くことによってからかわ卵巣を透過性。5%PBS-トリトンX100(PBS-TX)、25 rpmで揺れながら、30分間それをインキュベートします。
    注:揺動時には、チューブが揺動運動に平行に配置します。このように組織損失で、その結果、組織がチューブのキャップに固執することを可能にする垂直に配置すること。
  5. PBS-TXを削除するには、組織は、チューブの底に落ち着くことができるようにラック内マイクロチューブを配置します。視覚的に点検し、必要に応じて、チューブをタップし、底部に任意の浮動組織をダウンさせます。チューブの底の組織は邪魔されずに残っていることを確認して、上部から慎重にソリューションを吸引します。
  6. 0.5%PBS-TXに溶解した2%ウシ血清アルブミン(BSA)の200μLを加えることによって卵巣をブロックし、1時間室温でロッカー上でインキュベートします。ステップ7.5に従うことによってブロッキング剤を除去します。
  7. 新鮮なブロッキング剤の200μLに一次抗体を追加します:抗ウサギdCyclinE抗体(1:100)および抗マウスATP-のB抗体(1:100)。室温で2時間ロッカー上で組織をインキュベートします。
  8. ステップ7.5以下、15分ごとに、PBS-TXで3回卵巣を洗ってください。
  9. 新鮮なPBS-TXで、適切な二次抗体の200μLを追加:抗マウスCY3(1:1,000)および抗ウサギ-CY5(1:500)。室温で1時間ロッカー上でインキュベートします。
  10. ステップ7.5以下、15分ごとに、PBS-TXで3回卵巣を洗ってください。
  11. 最終的なPBS-TXの洗浄に:(千希釈1)DNAを染色するには、ヘキストを追加します。
  12. 最後に、1×PBS500μLの組織を残します。
  13. 1-mLのマイクロピペットを用いて、200μlのPBSを含むガラス解剖皿の新鮮なウェルにマイクロチューブから免疫染色卵巣を除去します。
  14. スライドガラスにグリセロールベースの封入剤の一滴を追加し、封入剤に免疫染色卵巣を一つずつ追加してください。
    注:卵巣が実際に取り付け媒体に転写されていることを確認します。秒を怠りますO組織喪失につながります。
  15. 解剖顕微鏡を覗きながら、静かにピンセットで卵巣の不透明な部分を保持しながら、からかい針を使用して、不透明な成熟卵室から透明ovarioles(若い段階)を摘み取ります。マウンティング培地から成熟卵室を削除してください。
  16. 封入剤が均一に下に広がっていることを確実にするために軽くスライドとプレスにカバーガラス(22ミリメートル、1号)を配置します。
    注:また、カバーガラス上に押すと、カバーガラスに沿って組織の適切な位置合わせを保証します。最適にそうしないと、小さいステージがそれらの組織の最適な顕微鏡を防止し、マウンティング培地中に浮遊することを可能にします。
  17. 15分間のサンプルを空気乾燥し、マニキュアで慎重にカバーガラスの端をシールします。
  18. 実験の必要性表1)あたりの共焦点顕微鏡を実行します。

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Representative Results

記載の方法は、生きて固定ショウジョウバエ卵巣( 図2B)にミトコンドリアの構造および機能を研究するために使用することができます。記載された方法を用いて得られた期待結果のいくつかの例が提供されます。

ショウジョウバエ卵巣の解剖 :さらに解剖すると、全体のショウジョウバエ図3A)から切断腹部( 図3B)は、各個々のショウジョウバエから2卵巣を含め、腹部内容物を放出する必要があります。無傷の卵巣は、理想的には、卵管茎を介して相互に接続されたままべき楕円形、白構造( 図3C及びD中の矢印)として表示されます。各卵巣内ovariolesは、Bを除去して線維鞘( 図3Cの拡大部分で#)、によって一緒に保持されるべきです染色し、顕微鏡観察のためにovariolesを露出させる;(戸建ovariolesとひどくからかわ卵巣を示す* 図3Dに太い矢印)yの慎重なからかい。腹部の内容物の放出の間に引き裂か卵管茎と放出卵巣も使用、それらが他の方法で破損していない提供することができます。どれ( 図3C中*)損傷を受けた卵巣および他の腹部内容( 図3C中の矢印)が破棄されるべきです。

ショウジョウバエ卵巣のライブ顕微鏡は :ここでは、FLIP技術とショウジョウバエ卵巣におけるミトコンドリアの構造的および機能色素のロードを示しています。

以前ショウジョウバエ包細胞9におけるミトコンドリアの連続性を評価するために適用される、トランスジェニックショウジョウバエの卵巣ナース細胞ここで証明されているFLIP技術図4A)との連続である場合、FLIPのROIに反復光退色し、断続的な回復期間を含むFLIPプロトコルは、周辺地域内だけでなく、FLIPのROI内の信号の損失を可能にします。ナース細胞に関連するミトコンドリア雲の1を標的とするFLIPは200秒( 図4BおよびC)内の赤FLIPのROIを囲む青と白のROIからの蛍光シグナルの50%を超える損失につながります。緑色のROIからの信号は、バックグラウンド補正のために使用されます。他の非標的ナース細胞中の黄色のROIからの蛍光シグナルは、実験( 図4B、およびC)の時間経過の間に最小限の全体的な漂白を意味、この時間枠全体で一定のままです。また、この結果は、ミトコンドリアことを示しているビデオ1を参照してくださいステップ1および2におけるミトコンドリアは、この時間枠内の蛍光の損失を示すことが期待されていないながら、看護師の細胞は、ステップ3および4( 図4A)に例示するそれらの外側と内側の膜を、融合しています。

単位当たりのミトコンドリア電位ミトコンドリアの質量の半定量的尺度が電位差色素TMREとミトコンドリアの質量13を反映 、全体的なミトコンドリアの染色との共染色によって評価することができることが以前に実証されています。ここでは、同様の技術は、ライブショウジョウバエ卵巣組織の単位質量当たりのミトコンドリア電位の評価を実証しました。 TMREで染色したライブショウジョウバエ卵巣の共焦点顕微鏡は、組織( 図5A)の深さとシグナルの減少を示しています。大きな組織の深さで散乱を増加する蛍光シグナルのこの損失はfluoropの任意の種類で発生することが予想されます使用中の目的の与えられた作動距離とホーア。したがって、フルオロフォアは、生きている組織の画像化の間に検出することができる内の組織の最大の深さを認識することが重要です。最大画像形成可能な深さが増加卵室の大きさに伴って減少する一方で、例えば、全体的なミトコンドリアの染色(水戸)で染色したライブショウジョウバエ卵巣は、カバーガラスから20μmの範囲内に記載の顕微鏡のセットアップ( 表1)を使用して画像化することができる( 図図5(b))。設定は任意の過度の信号クロストークやフォアクロス励起予想通り、最小限の検出されないか、無信号( 図6A)を調べることながら、ミトコンドリアの汚れのために最適化された顕微鏡の設定は、適切な検出チャネルにおける正の信号を検出します。全体的なミトコンドリアの染色でTMREの共染色は、定性的( 図6B)および定量( 図6CおよびD <両方のために使用することができますライブショウジョウバエ卵巣における単位質量当たりのミトコンドリアポテンシャルの/強い>)の評価。例えば、a)の定性分析は、 ショウジョウバエの胚腺が体嚢細胞は、 図6Bの生殖系列細胞(矢頭をカプセル化するために生じているステージ2bに単位質量当たりの高いミトコンドリア電位を示す)と、b)半定量分析を実証することを示していますステージ9卵室( 図6C)から分析として(ストレッチ)AFCSとMBCS間の単位質量あたりのミトコンドリアの電位差、。定量化が焦点の彼らの平面に応じて、AFCSとMBCSで、2つの異なる光のスライスから行われていることに注意してください。正常ショウジョウバエ 14で使用されているミト-ROSプローブの使用はDrp1were導入ミトコンドリア分裂タンパク質の機能ヌルクローンライブショウジョウバエ卵巣上皮卵胞細胞層、で実証されています。ほとんど、府トンすべてではない、生きたGFP陰性DRP1ヌル卵胞細胞クローン水戸-ROS( 図7AおよびB)のための高められた染色を示します。 *個別のミトコンドリアの信号は、この組織では検出できなかったが、水戸-ROS染色の濃度は、有糸分裂包細胞よりも有意に大きい高度な有糸分裂後包細胞、(核領域で検出することができたことに注意してください図7C中)。これにより、核DNAとエチジウム15の誘導体である水戸-ROS色素、蛍光酸化生成物との相互作用に発生する可能性があります。

固定ショウジョウバエ卵胞細胞におけるミトコンドリアサイクリンEの検出 :最近、ミトコンドリアが、哺乳動物細胞及びショウジョウバエ卵胞細胞層内のミトコンドリアの表面に補充することによって、細胞周期の分子サイクリンEを制御することができることが実証されていますショウジョウバエ包細胞層12を強化ます。ここでは、 ショウジョウバエ包細胞におけるサイクリンEのミトコンドリア局在の一例について説明同時免疫染色プロトコルを用いて実証されます。信号が制限された解像度で明瞭なミトコンドリアの要素に分解することはできませんが、dCyclinE信号は、胚腺( 図8A)におけるミトコンドリアATP-B信号のそれと重なるGFP陰性DRP1ヌルクローンにおけるdCyclinEレベルの上昇に注意してください。共焦点顕微鏡の。また、有糸分裂後MBCSに、GFP陰性DRP1ヌルクローンは、(野生型GFP陽性細胞のみが核dCyclinE信号を持っているのに対し、後者は著しく、ATP-B信号と重複すると、両方の核および細胞質dCyclinE信号を持っている図8B)。


ショウジョウバエ エッグチェンバース 図1. 開発 卵室を開発鎖からなるショウジョウバエ卵巣管を描いた漫画、それぞれ、卵胞細胞層(体細胞)に封入された卵母細胞及びナース細胞(生殖細胞)からなります。卵室は、胚腺から開発し、有糸分裂包細胞が分裂後になる段階を経て発症します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2.実験計画と準備。記載の方法で使用される(A)ツール:A.フライバイアル; B.昆虫は、媒体を解剖します。 C.パラホルムアルデヒド; D.フライのブラシ。皿を解剖E.。 F.カバーガラス; G.マイクロチューブ。 H.ガラスボトムディッシュ。 I.ガラススライド。 J. 1,000μLマイクロピペット。 K. 200-μLマイクロピペット。 L. 2.5μLマイクロピペット。曲がった先端を有するM.からかう針(先端が拡大されます)。 N.太い鉗子。 O.シン鉗子。 (B)に記載した方法を表すフローチャートの概略図。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
ショウジョウバエ卵巣の図3.解剖。 (A)麻酔全体ショウジョウバエ(B)噛みつきショウジョウバエしまたは腹部の内容(*)なしで腹部。 (C)は、卵巣(矢印と*)やその他のコンテンツを含むショウジョウバエの腹部内容を、リリース(矢頭)。前方(Antの)と後部(ポスト)を強調表示し、右側の箱入りの領域の倍率はovariolesが線維鞘(#)によって保持されている卵管茎、によって保持された卵巣一対の終了します。 (D)unteased卵巣(細い矢印)と比較してからかったショウジョウバエ卵巣 (太い矢印が適切にマーキングからかわ及び*はひどくからかわマーキング)。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4
図4.ライブ組織FLIPアッセイ。 FLIPの方法を使用して適切なミトコンドリアの連続アッセイによりアッセイすることができるミトコンドリア分裂/融合の手順を示す(A)概略図。この場合には、ミトコンドリアマトリックスで水戸-YFPプローブはassessmを可能にしますミトコンドリアマトリックスの連続性のENT。 (B)タイムラプスex vivoでのmito-YFPを発現している生トランスジェニックショウジョウバエの卵室の顕微鏡。唯一の選択の時点(t)が示されています。すべての時点用のビデオ1を参照してください。 (C)(B)の各着色関心領域からの蛍光シグナルの定量化は、バックグラウンド補正および正規化後に発現されます。二つの連続漂白イベント間の時間間隔は回復時間であるのに対し、矢じりは、反復光退色時点を示しています。スケールバー:10μmです。画像は、表1に記載されたパラメータで取得しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5
図5.ライブミトコンドリアリットルの染色およびショウジョウバエ卵巣管の顕微鏡。 (A)TMREで染色したライブショウジョウバエ卵巣管の個々の光学スライス。画像は、 表1に記載したパラメータを用いて取得されました。 Zは、μm単位のカバーガラスからの距離を示します。 (B)全体的なミトコンドリアの染色(水戸)を搭載したライブショウジョウバエ卵巣管。 XY画像内の赤線のXZ像がBは底面であり、Tは、取得した画像の上部であり、示されています。ブルーラインへの底からの距離は20μmです。スケールバー:20μmです。共焦点画像は、 表1に記載したパラメータを用いて取得しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図6
FTMREと総合的なミトコンドリア染色でライブショウジョウバエ Ovariolesのigure 6.共同染色。 (A)TMREと全体的なミトコンドリアの染色(水戸)で共染色されたライブショウジョウバエ卵巣管のシングル光学スライス。 *考察の項で記載された実験アーチファクトを示します。 (B)(A)中の胚腺の3連続光学切片の最大強度の投影。矢頭はTMRE蛍光が増大している領域を示しています。 (C)有糸分裂後の卵室TMREと全体的なミトコンドリア染色で共染色のシングル光学スライス。上部と下部のパネルは、それぞれ、AFCSとMBCSのための焦点の平面を示しています。 (D)TMREの平均蛍光強度および(C)中の四角で囲まれた領域内の個々のAFCSとMBCSから定量化、全体的なミトコンドリア染色を示すボックスプロット。ボックスプロットのウィスカが外れ値を除いた、各群の最大値と最小値を示しています。 表1に記載したパラメータを用いて取得しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図7
水戸-ROS染料とライブDRP1ヌルモザイクショウジョウバエ Ovariolesの図7染色。 (A)水戸-ROS色素で染色したovariolesのシングル光学スライス。 (B)水戸で卵胞細胞と個々の卵室の2回連続光学スライスの最大強度投影チックステージは水戸ROS染料で染色しました。 (C)水戸-ROS色素で染色した有糸分裂後の段階で卵胞細胞と個々の卵室のシングル光学スライス。 *核信号を​​示しています。 UbiGFPの欠如は、DRP1ヌルクローンをマーク。スケールバー:20μmです。共焦点画像は、 表1に記載したパラメータを用いて取得しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図8
dCyclinEとATP-B抗体を修正DRP1ヌルモザイクショウジョウバエ Ovariolesの図8.共同免疫染色。 (A)共免疫染色胚腺の3連続した光のスライスの最大強度投影。 (B)共immunosの3連続した光のスライスの最大強度投影有糸分裂後MBCSをtained。アウトラインはUbiGFP陰性DRP1ヌルクローンの境界を定めます。スケールバー:10μmです。共焦点画像は、 表1に記載したパラメータを用いて取得しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図9
破損の恐れの工芸品の9例を図。 (A)胚腺卵巣管を固定し、過度の隙間(*)を示すDNA色素ヘキストで染色UbiGFPが発現します。 (B)DNA色素ヘキストはニック/涙(*)を示すで固定し、染色された卵巣管UbiGFP発現の卵室。 (C)部分的なことができ、変形室(*)および損傷した卵室を示す水戸-ROS色素で染色したUbiGFP陰性DRP1ヌルクローンと卵巣管ライブ生殖細胞系列(**)の染色; #は、同じ卵巣管で損傷していない卵室の多分本当の汚れを意味します。 (D)生殖細胞系列の強烈な人工的な染色との全体的な損傷を受けたチャンバーを示す色素ミト-ROSで染色した卵巣管ライブ。 *損傷誘導は、このように人為的GFP陰性クローンを生じさせる、UbiGFP信号の損失とovariolesを平らに示しています。スケールバー:20μmです。共焦点画像は、 表1に記載したパラメータを用いて取得しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ビデオ1
ビデオ1. ライブ・組織FLIPアッセイ。 図5で説明した光退色ベースのFLIPアッセイの完全な時間経過。.COM /ファイル/ ftp_upload / 54989 / Video1.avi "ターゲット=" _空白 ">このビデオを見るにはここをクリックして下さい。(ダウンロードして右クリックします。)

表1:提示代表画像の取得のための共焦点顕微鏡の設定。 表1を見るにはこちらをクリックしてください(ダウンロードするには、右クリックします。)

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Discussion

プロトコル内の重要なステップ

光退色:蛍光サンプルの過度の光退色を防止することは、効率的な共焦点顕微鏡を実行することに絶対に必要です。したがって、接眼レンズを介してサンプルを検索したり、ライブ走査モードを介して画像取得パラメータを設定するために使用される時間は、光退色を最小にするために最小化されるべきです。

組織の損傷 :ミトコンドリアは、細胞の健康のセンサであると考えられているので、それは記載された方法を用いて得られたデータは、生理学的に関連しており、 ショウジョウバエ卵巣の手続き切開によって引き起こされる過度の損傷を反映していないことを確実にするために極めて重要です。解剖は、組織の損傷を最小限にできる限り迅速に行われ、だけでなく、極端な予防措置とされるべきです。 5 ショウジョウバエ卵巣の解剖やからかいのための平均時間は、私たちの手に(7分に5です秒)。努力は分析から除外される損傷組織を示す卵室を識別するために注意しなければなりません。解剖による組織損傷が過度のギャップを含むこともできる(* 図9Aで、信号の欠如によって同定されるような)、ニック/涙の(* 図9B信号の欠如によって同定されるような)卵室の、または変形(* 図9Cで)。しかし、実験的操作から生じるいかなる意味のある室の変形を慎重に評価する必要があります。何のカバースリップがovariolesの平坦化、記載されたプロトコルで生きている組織の上で使用されていないが、いじめや( 図9Dに*)マウント中に組織に適用される不当な圧力で発生する可能性があります。記載されているプロトコルは、からかい、その後に発生すると、すぐに解剖した後、組織の固定を含むためovariolesの平坦化は、固定された試料で観察されていません。 aforementioneのいずれかの署名せずに任意の単離された卵室Dの損傷は正常とみなされてもよいです。潜在的に解剖に起因する機械的損傷も偽GFP陰性クローン16を得、GFPの損失につながる可能性があり、また、強化された色素の取り込みを生じさせることができます。 ;卵室の内部に存在する生殖系列細胞が生きミトコンドリア色素( 図6および7)、 ショウジョウバエの生殖系列細胞の増強ミトコンドリア染色が損傷/瀕死組織の透過性の増加に起因すると通常は透過性ではないことを考えるとこのような人工物は、(** 図9Cおよび図9D全体卵巣管で)、ならびに他のライブのミトコンドリアの汚れ(図示せず)と水戸-ROS染料で発生します。 図9D(*)でUbiGFPの損失も卵室の平坦化を生じる損傷から生じる可能性があります。損傷を受けた卵巣管における他の卵室は本物のままで、無料のアーチファクトかもしれないが( 図9Cで#

時間感度 :ライブエクスビボ顕微鏡の場合には、データは、実装組織の15分以内に得られるべきです。それ以外の場合は、実験の結果は、組織のその後の死に生理学の変化によって影響を受ける可能性があります。時には、レーザパワーと他の走査パラメータに応じて、マウンティング培地10μLを15分よりも早く蒸発します。同時免疫染色によってミトコンドリアサイクリンE・プールの検出が原因mitochondの一時的な性質に解剖時間(可能性が高いの最小化を必要としますアクティブなミトコンドリア呼吸12によって維持されているリアルサイクリンEプール)。かなりのミトコンドリアサイクリンEプールも30分未満の透過処理時間で観察されませんでした。

FLIP:FLIPの時間経過の間に、検査中の任意の卵室の移動は、人為的な分析につながる可能性があり、したがって、排除しなければなりません。外国色素の取り込みは、ミトコンドリアの連続性を変化させるため、人為的な結果を招く可能性があるため、任意の生きミトコンドリア染料やTMREの使用は、FLIPの実験では推奨されません。

ショウジョウバエの交差点戦略 :によるヘテロ接合の雄親でDRP1抑制の未確認の影響による可能性が高い多くの子孫を、得られていない(DRP1変異対立遺伝子を運ぶ男性が使用されている)、ここで説明したものとのクロス逆数。

クローンデータの解釈 :制御卵巣で検出された任意のGF-負のクローンそう解剖16時のダメージによるGFPの損失に起因して発生する人為偽陰性クローンを、示すことになるUbiGFPを発現している親のショウジョウバエから単離されました。それにもかかわらず、クロスの熱ショックを与え子孫におけるGFP陰性クローンの数は、対照で見られる任意の偽陰性のクローンよりも有意に高くすべきです。記載有糸分裂組換えベースの戦略によってショウジョウバエ濾胞細胞層で発生したクローンは、有糸分裂濾胞性幹細胞(細胞クローン幹)から、または分裂の非幹包細胞(一過性のクローン)から生じ得ます。幹細胞クローンについて、実験的な分析は、一過性のクローンと卵室が既に敷設された場合、わずか10日間熱ショック後に実行する必要があります。一過性のクローンの場合、分析は、胚腺内の任意の卵胞細胞クローンなしovariolesの卵胞細胞クローンで、熱ショック後6日以内に行われるべきです。

変更およびトラブルシューティング

記載された方法を用いて単位質量あたりのミトコンドリアの可能性を評価しながら、1は、顕微鏡光学系またはミトコンドリア染料の組み合わせから生じる潜在的なアーティファクトを知っていなければなりません。全体的なミトコンドリア染色から弱くなった信号と比較的高められたTMRE信号( 図5(a)、*)を示す任意の領域が原因で8または起因する赤の異なる光学特性への色素間の蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)に発生する可能性がある(TMRE)そして、緑の取得セットアップ中に固定ピンホールサイズ与えられた(全体的なミトコンドリア染料)蛍光灯、。光学アーチファクトを回避するために3つの連続光学切片 - 定量分析は、2の突起上で実行することができるが、FRETに関連するアーティファクトは、可能な場合、色素濃度を低減することによって回避することができます。また、蛍光信号は、クロストークおよびクロス励起で検出された場合チャネルは、レーザーおよび検出器の設定は同様に、最適なチャネルで蛍光シグナルを低減することが期待されるこれらのチャネルの信号を最小化するために再調整しなければなりません。

レーザー誘起反復光退色から、損傷は、ミトコンドリアの断片化を引き起こすため、成功したFLIPを防止し、ミトコンドリアの不連続が発生することがあります。 FLIPプロトコルの実行中にミトコンドリアの疑いのある断片化を低減するピンホールと高解像度画像を取得(検出器利得を高める)ことによって同定することができます。ミトコンドリアの断片化が目に見えてFLIPプロトコルの実行中に気づいている場合、漂白レーザーの電力を低減しなければならない、および/または連続的な漂白剤との間の間隔を大きくしなければなりません。全体的な漂白がFLIP実験( 図3B及びCの黄色いROIからの信号)の時間経過の間に存在する場合、走査レーザーレベルに再調整する必要がありますそれは、最小限または全く、全体的な光退色ができます。

GFPの損傷誘導性の損失の可能性アーチファクトを回避するために、GFP陽性クローンを記載熱ショックプロトコルに従って、MARCM戦略を使用して導入することができます。ここでは、クロスために使用されるべき適切なショウジョウバエは処女雌drpKG03815 FRT40A / CYO Xの男性GAL80 FRT 40A / CYOです。浴槽-GAL4、UAS-CD8GFP / TM6 9。 (ステップ6で説明したように)直線翼の子孫は、熱ショックを使用して、クローンの生成のために使用されるべきです。

テクニックの制限事項

ライブショウジョウバエの卵室の表面上に存在する包細胞は、ミトコンドリアの染色色素を組み込むながらA)、卵室内の生殖細胞系列細胞は、そうすることができません。若い段階の生殖細胞系列は( 図5および6)は弱く染色されます。 B)ライブex vivoで TISSU電子顕微鏡は、個々のショウジョウバエ 、一度に1から単離された卵巣に染色の完了の15分以内に行わなければなりません。実験群は、処理され、同じ日に結像されるべきであるので、種々の実験群からのライブエクスビボ組織顕微鏡から統計学的に有意なデータを得るために要する総時間が固定された組織から得られるものよりも適度に長いです。 C)私たちが原因でROSの一過性の性質のためにそうex vivoのショウジョウバエの組織は、それがすべてのDRP1からのシグナルの検出の欠如の根底にあるかもしれ17,15を 、検出した検体中のmito-ROSの汚れが非常に安定していなかったことを指摘ヌルクローン。しかし、DRP1ヌル細胞/クローンにおける水戸-ROS染色の変動の任意の生物学的関連性を除外することができず、さらに調査する必要があります。水戸-ROS汚れから正の信号がちょうど強化スーパーオキシドだけでなく、強化されたミトコンドリアまたはcellulを反映していない可能性があることに注意してくださいarの酸化環境15。このミトコンドリアの染色及びGFPの蛍光スペクトルは区別がつかないので、D)全体的なミトコンドリア染色は、GFP陰性またはGFP陽性クローンの実験のために使用することはできません。 E)ミトコンドリアマトリックスの連続性をアッセイするために設計されたFLIP実験は、ミトコンドリアの構造の解像度を含むオープンピンホールと画像取得が必要となります。

既存の/代替方法に関して技術の意義

ミトコンドリア構造と機能の関係を研究することは、ミトコンドリア機能の調節機構を完全に理解するために重要です。ミトコンドリアの欠陥が大幅に糖尿病、癌、パーキンソン病を含む様々な疾患に寄与するので、ミトコンドリアの手口の詳細な理解がfacilitatiの約束を保持していますミトコンドリア指向治療戦略の開発をngの。生細胞の顕微鏡は、ミトコンドリアの構造と機能の関係を研究するための不可欠なツールです。しかしながら、これらの研究のほとんどは、単離された細胞に限定されています。ミトコンドリアの構造と機能の研究では、ex vivoでの設定9ショウジョウバエの組織を生きるように拡張されました。これの説明されたプロトコルおよび関連研究は、生理学的文脈におけるミトコンドリアの理解を可能にする、ex vivoで 、ライブショウジョウバエ卵巣でミトコンドリアの構造と機能の理解につながります。所定の細胞内代謝とミトコンドリアのエネルギー特性の調節が、細胞の生理的な文脈における栄養利用と適切な信号に大きく依存するので、このex vivoでのアプローチは、in vitro試験に比べて大きな利点を有しています。

マイルの遺伝子操作DRP1は、細胞周期調節サイクリンEを調節解除し、 ショウジョウバエ卵胞細胞層9,12の発達に影響するミトコンドリア分裂タンパク質を抑制することによってtochondrial構造。ここでは、プロトコルは、ミトコンドリアの構造と機能の関係を研究するために、ショウジョウバエの卵巣でDRP1の機能的にヌルクローンを導入する方法の説明が含まれています。哺乳動物細胞上のミトコンドリアサイクリンEの新規プールのほか、 ショウジョウバエ包細胞層12は 、成功した可能性が高いミトコンドリア18によって報告されたサイクリンEの規制を根底れ、検出されました。ここでは、原稿がdCyclinEおよびミトコンドリアマーカー(ATP-B)のための共免疫染色固定ショウジョウバエ卵巣による新規ミトコンドリアサイクリンE・プールを検出するための方法を示しています。

このテクニックをマスターした後、将来のアプリケーションや行き方

与えられたトン帽子キイロショウジョウバエは、強力な遺伝的モデルシステムである、私たちに記載の方法は、健康と病気におけるミトコンドリアの構造と機能の関係の遺伝的基礎の理解に大きく寄与することが期待されています。 ショウジョウバエは、広く腫瘍形成19につながる遺伝的相互作用を引き出すために使用されています。 ショウジョウバエ上皮卵胞細胞層におけるクローンの世代の能力は、in vivoおよびex vivo 設定 、個々の腫瘍形成性クローンにおけるミトコンドリアおよび癌遺伝子または腫瘍抑制因子の相互作用の研究を可能にします。記載の方法は、適切な変異ショウジョウバエから単離された卵巣のミトコンドリアの構造と機能の関係の調節を研究するために使用することができます記載の方法はさらにexogを通じてミトコンドリアの構造と機能上のシグナリング様々な栄養素と成長因子の直接的な影響を研究するために拡張することができますex vivoでイメージング媒体中で適切な栄養素および/または増殖因子のenous添加。記載の方法は、適宜変更広く癌20,21のような疾患におけるシグナル伝達経路を研究するために使用されてきた幼虫成虫、同様に、他の単離されたショウジョウバエの組織で使用することができます。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Grace's Media (Insect Dissecting Medium) Fisher Scientific 30611031-2
41 Paraformaldehyde AQ Electronic Microscopy Sciences 50-259-99
Mitotracker Green (overall mitochondrial stain) Life Technologies m7514 Reconstitute and Aliquot
Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate Sigma Aldrich 87917-25MG Reconstitute and Aliquot
MitoSox (Mito-Ros stain) Life Technologies m36008 Reconstitute and Aliquot
PolyLysine MP Biomedicals ICN15017625
Fly Vials Fisher Scientific AS-515
Fly Conicals Fisher Scientific AS-355
Fly Vial Flugs Fisher Scientific AS273
Fly Conical Flugs Fisher Scientific AS 277
Jazzmix Drosophila food (Drosophila food) Fisher Scientific AS153
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A9647-50G
Cyclin E Antibody (d-300) Santa Cruz sc- 33748
ATPB antibody [3D5] - Mitochondrial Marker AbCam ab14730
Cy3 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 115-165-146
Cy5 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 111-175-144
Hoechst Fisher Scientific H3570
VectaShield Fisher Scientific H100
Azer Scientific EverMark Select Microscope Slides Fisher Scientific 22-026-252
Microscope Cover Glass Fisher Scientific 12-542-B
Mat Tek Corp Glass Bottom Mircrowell Dish Fisher Scientific P35G-0-14-C
Active Dried Yeast Fisher Scientific ICN10140001
Confocal Microscope Carl Zeiss LSM 700
Dumont #5 Forceps Fine Science Technologies 11251-20
Moria Nickel Plated Pin Holder Fine Science Technologies 26016-12
Minutien Pins Fine Science Technologies 26002-15
MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 ) Bloomington Stock Center 7194
Fly Pad Fly stuff 59-118
Blowgun Fly stuff 54-104
Blowgun needle Flystuff 54-119
Dissecting Microscope Carl Zeiss Stemi 2000
Analyses software Carl Zeiss Zen 
Analyses software Open source Image J
Research Macro Zoom Microscope Olympus MVX10
QICAM Fast 1394 Cooled Digital Camera, 12-bit, Mono  QImaging QIC-F-M-12-C
QCapture Pro 5.1 QImaging

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References

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