Het bestuderen van mitochondriale structuur en functie in

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Parker, D. J., Moran, A., Mitra, K. Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries. J. Vis. Exp. (119), e54989, doi:10.3791/54989 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Mitochondriën zijn klassiek beschreven als de cellulaire powerhouse, omdat zij de belangrijkste zetels van de energieproductie in gedifferentieerde cellen. Bovendien mitochondria spelen een cruciale rol in de stofwisseling, warmteontwikkeling, lipide modificatie, calcium en redox homeostase, de orkestratie van cell signaling processen, etc 1. Mitochondriën ook een actieve rol bij de inductie van celdood 2, evenals regulering van de celcyclus 3 spelen. Dergelijke multifunctionaliteit roept de volgende fundamentele vragen: a) hoe mitochondriën presteren al deze functies gelijktijdig en b) zijn er specifieke mitochondriale zwembaden of subzones die gespecialiseerd zijn voor verschillende functies? In dit verband is het belangrijk op te merken dat de multifunctionele mitochondriën dynamisch van vorm, afmeting en structuur die afzonderlijke cellen en dat de steady-state vorm mitochondriën variëren tussen celtypen. Tientallen jaren van onderzoek uit verschillende labretorica suggereren dat de wijziging van de mitochondriale vorm, grootte en structuur, collectief genoemd mitochondriale dynamiek, is cruciaal voor het handhaven van verschillende mitochondriale functies 4,5,6. Deze bevindingen opmerkingen de mogelijkheid mitochondriën hun multifunctionaliteit kan bereiken vanwege de structurele dynamiek.

Uitgebreide inspanningen worden gedaan om de mitochondriale structuur-functie relatie te begrijpen. De dynamiek van mitochondriale structuur wordt voornamelijk onderhouden door hun vermogen om splitsing en fusie gebeurtenissen ondergaan met elkaar. Splijting van grote mitochondria omzet in kleinere mitochondriale elementen, terwijl fusie tussen twee kleinere mitochondria ze over in een grotere mitochondriale element 7. Bovendien kan voorbijgaande fusie van twee mitochondria opkomen bij het mengen van de inhoud mogelijk. De splitsing en fusie gebeurtenissen van de binnenste en buitenste membranen worden zorgvuldig geregeld door specific sets van eiwitten. De kern splijting machine is samengesteld uit dynamin gerelateerd eiwit 1 (Drp1), die wordt gerekruteerd uit het cytosol naar de mitochondria van de interactie met bepaalde bonafide mitochondriale eiwitten (bijvoorbeeld Fis1 of Mff1), terwijl Drp1 functie ook kan worden geregeld andere eiwitten op het oppervlak mitochondriale 4. Hoewel Drp1 werkt op de buitenste membraan, de splitsing vaardigheden invloed hebben op de binnenste membraan ook. De orkestratie van de splitsing van de buitenste en binnenste mitochondriële membranen is niet goed begrepen. Anderzijds is fusie van het binnenste membraan beheerst de kern door de activiteiten van Opa1, terwijl mitofusins regelen de fusie van het buitenste membraan 5. Het saldo van het tegengaan van kernsplijting en kernfusie gebeurtenissen van mitochondria dicteren de steady-state mitochondriale vorm in een cel. Bijvoorbeeld, onderdrukking van mitochondriale splitsing leiden tot volledig en ongehinderd fusie, terwijl de overactiviteit van mitochondriënl splitsing zou leiden tot fragmentatie van mitochondria 3.

De studie van de mitochondriale structuur-functie relatie omvat voornamelijk twee elkaar aanvullende benaderingen: a) analyses van de cellulaire en organismaal fenotypes na genetische manipulatie van mitochondriale splitsing / fusie-eiwitten en b) directe beoordeling van mitochondriale structuur en functie. Het is opmerkelijk dat genetische analyses de directe werking van het molecuul op de hand (in dit geval mitochondriale splitsing / fusie-eiwitten) niet altijd kan blijken, aangezien de fenotypes kunnen worden veroorzaakt door secundaire effecten. Het is daarom van het grootste belang te ontwikkelen en te gebruiken hulpmiddelen om mitochondriale structuur en functie direct bestuderen. Elke beoordeling van de mitochondriale structuur omvat verschillende microscopie gereedschappen. Het gebruik van fluorescentie microscopie van levende cellen is sterk gevorderd de studies van mitochondriale dynamiek, omdat mitochondriale dynamiek kan worden gecontroleerd, zowel kwalitatief als quantitattend met de juiste fluorescentiemicroscopie en -technieken 8. Fluorescentie-microscopie instrumenten ontwikkeld om mitochondriale structuur en functie te bestuderen in levende en vaste Drosophila melanogaster weefsels ophelderen van het belang van mitochondriale dynamiek in vivo 9. Deze en verwante werkwijzen worden beschreven, met als doel het bestuderen mitochondriale structuur en functie in de Drosophila eierstok.

De Drosophila eierstok bestaat uit kiemlijn en somatische lijnen, die voortvloeien uit hun volwassen stamcellen die in de germarium 10,11 bevinden. Zestien syncytieel kiemcellen (GC) krijgen ingekapseld door somatische follikel cellen (FCS) aan individuele ei kamers die naar voren komen uit de germarium (figuur 1) te vormen. Eén van de 16 GC gecommit om een ​​eicel te worden, en de resterende 15 GC ontwikkelen tot verpleegkundige cellen die de groei van de eicel kamerhouderVergemakkelijking van de rijping van de eicel voordat het wordt gelegd. De meerderheid van de FC's ondergaan 9 ronden van mitotische delingen voordat ze de mitotische celcyclus verlaten terminaal differentiëren in een patroon epitheliale cellaag bestaande uit anterior follikelcellen (AFCs), posterior follikelcellen (PFK's) en hoofdlichaam cellen (MBCS) . De opeenvolgende ei kamers zijn verbonden door steel cellen die gedifferentieerd cellen die ook zijn afgeleid van het FK vroeg in de ontwikkeling. Mitochondriale vorm gereguleerd door de mitochondriale kernsplijting eiwit Drp1 is actief betrokken bij het proces van differentiatie tijdens de normale ontwikkeling van de Drosophila eierstokkanker FC laag 9,12. De in deze studies de betrokkenheid van Drp1 in Drosophila follikel cellaag ontwikkeling identificeren werkwijzen worden hier beschreven.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Bereiding van Drosophila (het gereedschap zijn weergegeven in figuur 2A)

  1. Voor elk van de beschreven experimenten, verzamelen Drosophila (gehandhaafd bij kamertemperatuur of 25 ° C) binnen 5 dagen na verpopping en plaats ze in een flesje gevuld met 5-7 ml Drosophila voedsel (zie Materialen tabel), met niet meer dan 25 vliegt in elk flesje; onderhouden van een vrouwelijk: mannelijk verhouding van 2: 1.
  2. Strooi een kleine hoeveelheid gegranuleerde gist Drosophila eieren stimuleren. Voer experimentele manipulatie binnen 2-4 dagen.

2. Dissectie van Drosophila Eierstokken (de instrumenten die nodig zijn weergegeven in figuur 2A)

  1. Warm insect ontleden medium (zie Materialen Table) op kamertemperatuur, 25 ° C. Vul drie putjes van een acht-putjes ontleden glazen schaal met 200 ul medium in elk putje.
  2. Verdoven Drosophila met CO Drosophila op een moment dat het uitvoeren van live-microscopie.
  3. Terwijl u door het oculair van de dissectie microscoop, scheiden de thorax van de buik met behulp van twee paar tang. Behulp van de tang voorzichtig de buik dragen aan de tweede put van de schotel.
  4. Met een pincet aan de buik aan het achtereinde houden en langzaam duw de eierstokken uit (samen met de andere abdominale inhoud) met het andere paar pincetten. Mocht deze poging mislukt, verwijder voorzichtig de buik exoskelet door het invoegen van de tang in de voorste einde aan de eierstokken vrij te geven.
  5. Met behulp van de tang, houdt een individuele eierstok door de ondoorzichtige achterste einde (dat wil zeggen, de dooier gevuld, laat stadium eieren) en verplaats het goed naar de derde bron van de schotelom plagen te verwerken voor levende microscopie (stap 3) of voor bevestiging aan immunokleuring (stap 7) voeren.
  6. plagen zorgvuldig de beschermhuls van rond de eierstokken door vegen een plagen naald licht van het achterste naar het voorste uiteinde van elke eierstok bij het vasthouden van het achterste uiteinde van een pincet.
    OPMERKING: Om schade te minimaliseren tijdens de plagen, buig de naaldtip en zoom in op elk eierstok door het verhogen van de vergroting van de microscoop (Figuur 2A). Plagen moeten effectief genoeg om het omhulsel te breken, maar moet zorgvuldig worden uitgevoerd om de integriteit van de ovarioles behouden.

3. Voorbereiding voor Live-weefsel Microscopie

Opmerking: Het gereedschap is weergegeven in figuur 2A.

  1. Voordat Drosophila dissectie, bereiden polyL-lysine gecoate kamers. Hiertoe plaatst twee 20-pl druppels polyL-lysine (0,1 mg / ml) op de coverglass (14 mm, No. 0) van een glazen bodem petrischaal (35 mm) op een redelijke afstand van elkaar teneinde het samenvoegen van de druppels voorkomen. Lucht Droog de platen gedurende 1 uur bij 37 ° C en markeren de randen van de witte polyL-Lysine film op de onderzijde van de plaat met een wisbare marker.
    OPMERKING: De polyL-lysine-gecoate kamers kan een week bewaard bij 4 ° C. Bij gebruik van een eerder beklede kamer, breng het op kamertemperatuur voordat u de Drosophila dissectie.
  2. Stel de scanparameters voor de confocale microscoop om ervoor te zorgen dat het monster onmiddellijk hieronder worden afgebeeld na voltooiing van de dissectie en montage.
  3. Plaats een ontleed en geplaagd ovarium (na stap 2 en gekleurd, eventueel na stap 5) op vetgedrukte polyL-lysine-gecoate gebied en spreid het ovarium van de plagen naald om de ovarioles scheiden. Plaats een 10-ul druppel insect dissectie medium op de top van de eierstok, en zorg ervoor dat t dekkenHij gehele polyL-lysine-gecoate gebied. Dek de petrischaal.
  4. Onmiddellijk uitvoeren confocale microscopie van de gemonteerde monster bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Slechts één Drosophila worden ontleed, verwerkt en afgebeeld op een moment. Ook moet microscopie niet worden uitgevoerd bij 37 ° C, die een hitteschok omgeving voor Drosophila weefsel nabootsen.

4. Fluorescentie Verlies In Fotobleken (FLIP) Assay te beoordelen mitochondriaal Matrix Continuity

OPMERKING: Mitochondriale matrix continuïteit van een gefuseerde mitochondriale structuur komt tot stand nadat de volledige versmelting van de mitochondriale binnenste en buitenste membranen na een voortgang door de tussenstappen. Deling van mitochondrien kunnen dezelfde stappen in omgekeerde richting (figuur 3A). FLIP is een time-lapse microscopie semikwantitatieve methode die kan worden gebruikt om de mitochondriale matrix continuïteit in het beoordelenuiteindelijke gesmolten toestand van de ex vivo mitochondria (stap 3 en 4 in figuur 3A) in levende Drosophila eierstokken 9. De FLIP test wordt uitgevoerd als een klein gebied van belang (ROI) van de mitochondriën expressie brengen van een fluorescerend molecuul in de mitochondriale matrix die photobleached regelmatig (FLIP ROI in figuur 3A). Hierdoor zullen alle omringende mitochondriale regio die doorloopt in de FLIP ROI (experimentele ROI in figuur 3A) signaal verliezen als gevolg van de uitwisseling van moleculen in de continue mitochondriale matrix. De FLIP experimenten hier gedemonstreerd worden uitgevoerd op transgene Drosophila uitdrukken mitoYFP, die het mitochondriale targeting-sequentie van het menselijk cytochroom oxidase VIII subunit gelabeld met YFP bevat om het te richten op de mitochondriale matrix in een vrij diffundeerbare vorm. Een soortgelijk experiment kan worden uitgevoerd met mito pUASP-mito-GFP-transgen, zoals eerder gemeld <sup> 9. Een soortgelijk FLIP protocol kan worden gebruikt met een probe gericht op het mitochondriale inter-membraan ruimte kunnen de continuïteit als gevolg van de fusie van de buitenste sporen, maar niet het binnenste mitochondriale membranen (stap 2 in figuur 3A).

  1. Open de afbeelding acquisitie software op de confocale microscoop en stel de juiste scanparameters in het tabblad "Acquisition" (tabel 1). Controleer de "Time series", "Bleaching" en "regio" dozen om de individuele tabs te openen. Zorgen dat de verwerving parameterwaarden in elke lip (tabel 1).
    OPMERKING: De pinhole moet worden gelaten, aangezien dit experiment is ontworpen om de algemene signaal van de gehele mitochondriale populatie in afzonderlijke vakken volgen.
  2. Gebruik het oculair op het gebied van belang snel te vinden in de gemonteerde levend weefsel.
    OPMERKING: Selecteer de ovarioles die goed verspreid over de glas-bottomed schotel Aangezien confocale microscopie kan niet worden uitgevoerd op drijvende ovarioles.
  3. Klik op "live" naar een live-beeld van het geselecteerde gebied van belang te verwerven. Klik op "stop" om live het scannen te stoppen.
  4. Indien nodig de verwervingsparameters zodanig dat het gedetecteerde fluorescentiesignaal onder het verzadigingsniveau (aangegeven door de afwezigheid van rode pixels wanneer de optie "bereik indicator" is aangevinkt), de gedefinieerde achtergrond als ingesteld door instellen van de correctiewaarden.
  5. Teken een kleine ROI met behulp van de Bezier tekengereedschap uit het tabblad "Regio's" aan de fotobleken zone over de ervaringen van live-scanning afbeelding af te bakenen.
    OPMERKING: De grootte van de ROI moet ongeveer 20 zijn - 50% van de totale fluorescerende mitochondriale signaal binnen de cel.
  6. Voer de afbeelding overname door te klikken op "start experiment."
  7. Kwantificeren van de fluorescentie-intensiteit met behulp van de eigen of de open-source software (zie MaterialsTabel). Neem het gemiddelde signaal van de ROI waar de repetitieve bleking wordt gericht (FLIP); de ROI, waar bleken niet is uitgevoerd in dezelfde cel (experimenteel); de ROI van een andere ongebleekte cel in hetzelfde gezichtsveld, ter beoordeling totale bleken tijdens de experimentele periode (bleken); en het ROI op het achtergrondgebied (achtergrond). Trek de gemiddelde achtergrondsignaal verkregen uit het gemiddelde signaal in de andere ROI. Normaliseren het fluorescentiesignaal met de eerste pre-bleach signaal voor de betreffende cel.
  8. Plot de genormaliseerde data met behulp van een standaard plotten software.

5. live kleuring met fluorescerende mitochondriale kleurstoffen

OPMERKING: Steady-state mitochondriale structuur en potentieel kunnen beoordeeld worden met kleurstoffen die specifiek in mitochondria nemen in levende cellen en weefsels. Live Drosophila eierstokken kan worden gekleurd ex vivo met fluorescerende mitochondrialevlekken op de mitochondria visualiseren, om mitochondriale reactive oxygen species beoordelen (Mito-ROS) productie, en mitochondriale potentiële per massa-eenheid te bepalen. Dit kan worden bewerkstelligd door co-kleuring met het mitochondriale potentiometrische kleurstof tetramethylrhodamine ethylester (TMRE) en een compatibele levende mitochondriale vlek die de mitochondriale massa (zie Materialen voor de specifieke kleurstoffen).

  1. Verdun de voorraad van de vlekken in warm insect ontleden medium tot de uiteindelijke werkende concentraties: mitochondriale vlek, 250 nm; TMRE, 50 nm; en Mito-ROS vlek, 5 uM.
  2. Na dissectie en plagen de eierstokken volgende stap 2, zet de eierstokken in 200 pi van een bepaalde kleuring oplossing in een putje van een dissectie schotel. Incubeer ze gedurende 10 min met de schotel onder een geschikte doos omwikkeld met aluminiumfolie om deze te beschermen tegen licht. Was de eierstokken gekleurd door ze voorzichtig te bewegen met een pincet in 3 opeenvolgende putten met dag medium zonder vlek.
  3. Voor co-kleuring met TMRE en de compatibele totale mitochondriale vlek, volgt u de bovenstaande protocol om eerst met TMRE en direct daarna vlekken met de algemene mitochondriale vlek (zonder wasstappen daartussen).
  4. Monteer de eierstokken op een polyL-lysine beklede glazen bodem schotel volgende stap 3 en voor te bereiden op confocale microscopie met de juiste scanparameters (tabel 1), naar aanleiding van de stappen 4,2-4,4.
    LET OP: Het signaal van de opgenomen kleurstoffen duurde niet bij een poging om de gekleurde monsters in montage medium te monteren.
  5. Controleer de-Z snijden in om het tabblad te openen. Draai de focus wiel naar de onderkant van het monster terwijl het wordt live gescand en klik op "eerst" naar de onderste Z-sectie te definiëren. Doe hetzelfde tijdens het verplaatsen van het brandpunt wiel naar de andere richting naar het bovenste gedeelte definiëren.
  6. Voer de afbeelding overname door te klikken op "start experiment."
  7. Kwantificeren-achtergrond gecorrigeerde fluorescentie-intensiteit van de ROI voor de achtergrond signaal en de afzonderlijke cellen (zoals in stap 4.7) en plot van de gegevens met behulp van een plotten software.

6. Genereren van Drp1 Null Mozaïeken

OPMERKING: De klonale strategie hier gebruikt introduceert green fluorescent protein (GFP) -negatieve Drp1 null klonen in de achtergrond van een GFP-positieve, fenotypisch wildtype achtergrond die genotypisch heterozygoot voor de Drp1 nulmutatie 9. Heat-shock-geïnduceerde flippase-flippase herkenning target (FLP-FRT) gemedieerde site-specific mitotische recombinatie creëert homozygote klonen van de functioneel null drpKG03815 allel. Het genotype van Drosophila het dragen van de Drp1 mutant is drpKG03815 FRT40A / CYO, terwijl de genotype dragen van de heat shock-geïnduceerde FLP (hsFLP) en UbiGFP klonale marker is hsflp; ubiquitine NLS-GFP (UbiGFP) FRT 40A / Cyo. Het genotype van de SEteerd nageslacht van de kruising tussen de bovengenoemde genotypen is hsFLP / +; drpKG03815 FRT40A / UbiGFPFRT40A.

  1. Synchroniseer de Drosophila voor Virgin verzamelen door ze in nieuwe flesjes van vers voedsel elke 2 tot 3 dagen. Bewaken van de pupariating flacons dagelijks in om de opkomende maagdelijke vrouwtjes verzamelen.
  2. Verzamel rode ogen, krullend-wing maagdelijke vrouwtjes uit de Drp1 mutant genotype elke dag, een keer in de ochtend en een keer in de avond, en plaats ze in een apart flesje. Daarnaast verzamelen mannelijke Drosophila met donker rode ogen en rechte vleugels dragen hsflp en UbiGFP binnen 5 dagen na verpopping.
  3. Het opzetten van een kruis door het toevoegen van de mannetjes aan de Maagd vrouwtjes met een vrouwelijke: mannelijk verhouding van 2: 1.
  4. Strooi een kleine hoeveelheid gegranuleerde gist eiproductie stimuleren.
    OPMERKING: beweeg voorzichtig Drosophila een nieuwe flacon medium elke 2 tot 3 dagen om de hoeveelheid nakomelingen vergroten en flesje verdringing te verminderen.
  5. Eenesthetize, sorteren, en het verzamelen van straight-winged, red-eyed vrouwelijke nakomelingen binnen 5 dagen na verpopping.
  6. Voor de heat shock, plaatst de verzamelde Drosophila in lege flesjes met een kleine hoeveelheid gegranuleerde gist en een kleine, zachte doek (om het vocht absorberen tijdens de heat shock). Plaats het flesje met de Drosophila in een waterbad bij 38 * C gedurende 1 uur, hoofdzakelijk follikel celklonen genereren, en bij 37 ° C gedurende 1 uur tweemaal per dag (waarbij ten minste 5 uur tussen de 2 warmte schokken) gedurende 2 opeenvolgende dagen , zowel kiemlijn en follikel celklonen genereren.
    LET OP: Zorg ervoor dat de flacon volledig wordt ondergedompeld in het water tot aan het niveau van de plug.
  7. De heat shock kan de Drosophila immobiel te maken. Laat de warmte geschokt Drosophila te herstellen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur wanneer ze weer mobiel te worden.
  8. Voeg de mannetjes terug naar de vrouwtjes in dezelfde verhouding als in het kruis, en verplaats ze naar verse flesjes met medium bestrooid met een kleine hoeveelheid gegranuleerde gist. Handhaaf de Drosophila gedurende ten minste 5 dagen.
  9. Ontleden de eierstokken als nodig is voor een live of vaste experiment.
    OPMERKING: Eierstokken geïsoleerd van de ouderlijke Drosophila expressie UbiGFP worden als negatieve controles om de efficiënte inductie van GFP-negatieve klonen door hitteschok bevestigen.

7. Co-immunokleuring voor Cycline E en Mitochondriën

LET OP: om te detecteren Drosophila Cycline E (dCyclinE), hebben we een commercieel verkrijgbaar antilichaam opgewekt specifiek tegen dCyclinE 9 gebruikt (zie Materials tabel). Als mitochondriale marker, gebruikten we een antilichaam tegen ATP-B (a subeenheid van het mitochondriale ATP synthase complex) 9.

  1. Warm 4% paraformaldehyde (PFA) op kamertemperatuur, 25 ° C. Voorzichtigheid! Paraformaldehyde is giftig.
    LET OP: Na het openende ampul moet PFA worden bewaard bij 4 ° C en binnen 7 dagen. Dit komt omdat de opslag van PFA oxidatie tot methanol, die dramatisch membranen zou veranderen tijdens fixatie kan toestaan, zelfs indien aanwezig in zeer kleine hoeveelheden.
  2. Onmiddellijk na de dissectie, bevestig de eierstokken ontleed door ze in 200 pl vers PFA in een putje van een glazen ontleden schaal (zonder plagen). Houd het gerecht in een zuurkast voor 15 min. Was de vaste eierstokken door ze voorzichtig bewegen met de tang in 3 opeenvolgende putjes, elk 200 ui 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
    LET OP: Het experiment kan hier worden gestopt en de monsters kunnen bij 4 ºC worden gelaten voor 1 dag.
  3. Plagen de eierstokken grondiger in PBS (vergelijkbaar met stap 2.6) naar verwijder voorzichtig de beschermende vezelachtige omhulsel dat antigeen toegang van het antilichaam kan belemmeren.
  4. Permeabilize de eierstokken geplaagd door ze in een microfugebuis met 500 pi vers gemaakte 0.5% PBS-Triton-X100 (PBS-TX) en incubeer gedurende 30 minuten onder schommelen bij 25 rpm.
    LET OP: Tijdens het schommelen, plaatst de buizen parallel aan de schommelbeweging; ze te plaatsen loodrecht kunnen toestaan ​​dat het weefsel te houden aan de kap van de buizen, hetgeen resulteert in weefsel verlies.
  5. De PBS-TX verwijderen, plaatst de microfuge buizen in een rek om het weefsel te vestigen op de bodem van de buizen. Inspecteer ze visueel en tik op de buizen, indien nodig, een drijvend weefsels naar beneden te brengen. Zuig de oplossing voorzichtig uit de bovenkant en zorg ervoor dat het weefsel aan de onderkant van de pijpen ongestoord blijft.
  6. Blokkeer de eierstokken door toevoeging van 200 gl 2% runderserumalbumine (BSA), opgelost in 0,5% PBS-TX en incubeer het op de rocker bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Verwijder de blokkerende middel door stap 7.5.
  7. Voeg primaire antilichamen in 200 pl vers blokkeermiddel: anti-konijn dCyclinE antilichaam (1: 100) en anti-muis antilichaam ATP-B(1: 100). Incubeer de weefsels op wip voor 2 uur bij kamertemperatuur geroerd.
  8. Was de eierstokken met PBS-TX 3 keer voor 15 minuten elk, volgende stap 7.5.
  9. Voeg 200 ul van de geschikte secundaire antilichamen in verse PBS-TX: anti-muis-CY3 (1: 1000) en anti-konijnen-CY5 (1: 500). Incubeer op wip voor 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
  10. Was de eierstokken met PBS-TX 3 keer voor 15 minuten elk, volgende stap 7.5.
  11. Om het DNA te kleuren, voeg Hoechst (1: 1000 verdunning) de laatste PBS-wassing TX.
  12. Tenslotte laat het weefsel in 500 pi 1X PBS.
  13. Met behulp van een 1 ml micropipet, verwijder de immuun-eierstokken van de microfugebuis in een frisse putje van een glazen dissectie schotel met 200 pi PBS.
  14. Één druppel glycerol-based fixeermiddel een glasplaatje en voeg de immunogekleurde eierstokken een voor een naar het fixeermiddel.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de eierstokken inderdaad worden overgedragen aan de montage medium. Niet om s te doeno zal leiden tot verlies van weefsel.
  15. Kijk door de dissectie microscoop, voorzichtig plukken de transparante ovarioles (jongere stadia) van de ondoorzichtige rijpe eicel kamers met behulp van de plagen naald terwijl de ondoorzichtige deel van de eierstok met de tang. Verwijder de rijpe eicel kamers van de montage medium.
  16. Plaats een dekglaasje (22 mm, nr 1) op de glijbaan en druk licht om ervoor te zorgen dat de montage medium uniform daaronder wordt verspreid.
    LET OP: Door op de dekglaasje zorgt ook voor een goede afstemming van het weefsel langs de dekglaasje. Als u dit niet optimaal te doen kunnen toestaan ​​dat de kleinere podia te zweven in de montage medium, waardoor een optimale microscopie van deze weefsels.
  17. Air-droog de monsters gedurende 15 minuten en sluit de randen van het dekglaasje voorzichtig met nagellak.
  18. Voeren confocale microscopie per experimentele behoefte (tabel 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De beschreven werkwijzen kunnen worden gebruikt om de mitochondriale structuur en functie te bestuderen in levende en vaste Drosophila eierstokken (Figuur 2B). Verschaft zijn enkele voorbeelden van verwachte resultaten verkregen met de beschreven werkwijzen.

Dissectie van de Drosophila eierstok: Wanneer verder ontleed moeten de gescheiden buik (figuur 3B) vanaf het gehele Drosophila (figuur 3A) de abdominale inhoud ontwijkt, waaronder 2 eierstokken uit elke afzonderlijke Drosophila. Het intacte eierstokken verschijnen als ovaalvormig, wit structuren (pijlen in figuur 3C en D) die ideaal elkaar via de oviductal steel moet vast blijven zitten. De ovarioles in elke eierstok moeten bij elkaar worden gehouden door de vezelige schede (# in vergroot gedeelte van figuur 3C), waarin B wordt verwijderdy voorzichtig plagen (dikke pijl in figuur 3D; * wijst op een slecht geplaagd eierstok met vrijstaande ovarioles) aan de ovarioles bloot te leggen voor het kleuren en microscopie. De vrijgekomen eierstokken met oviductal stelen gescheurd tijdens de release van de abdominale inhoud kan ook worden gebruikt, mits deze niet anderszins beschadigd zijn. Beschadigde eierstokken (* in figuur 3C) en andere buikinhoud (pijlpunt in figuur 3C) moet worden weggegooid.

Live-microscopie van de Drosophila eierstok: Hier tonen we de FLIP techniek en het laden van mitochondriale structurele en functionele kleurstoffen in Drosophila eierstokken.

De FLIP techniek, die eerder toegepast op mitochondriale continuïteit beoordelen in het Drosophila follikel cellen 9, hier heeft aangetoond in de ovariële verpleegkundige cellen van transgene Drosophila (Figuur 4A). FLIP gericht op een van de mitochondriale wolken verbonden met de verpleegkundige cellen leidt tot een verlies van het fluorescentiesignaal van de blauwe en witte ROI rond de rode FLIP ROI binnen 200 s (Figuur 4B en C) hoger dan 50%; het signaal van de groene ROI wordt gebruikt voor achtergrondcorrectie. Het fluorescentiesignaal van de gele ROI in de andere irrelevante verpleegkundige cellen blijft constant gedurende deze periode, betekent minimale totale bleken in het tijdsverloop van het experiment (Figuur 4B en C). Zie ook de video 1. Dit resultaat geeft aan dat de mitochondriënin verpleegkundige cellen hebben hun buitenste en binnenste membranen, geïllustreerd in de stappen 3 en 4 (Figuur 4A) gesmolten, terwijl de mitochondria in de stappen 1 en 2 niet wordt verwacht dat het verlies van fluorescentie in deze periode te laten zien.

Eerder is aangetoond dat een semi-kwantitatieve maat mitochondriale potentiaal per eenheid mitochondriale massa kan worden beoordeeld door co-kleuring met potentiometrische kleurstof TMRE en de totale mitochondriale vlek die mitochondriale massa 13 weerspiegelt. Hier werd dezelfde techniek die gebruikt wordt voor de beoordeling van de mitochondriale potentiële per massa-eenheid te tonen in levende Drosophila eierstokweefsel. Confocale microscopie van levende Drosophila eierstokken gekleurd met TMRE demonstreert een afname in signaal met de diepte van het weefsel (Figuur 5A). Dit verlies van fluorescerend signaal als gevolg van toenemende spreiding in grotere weefsel diepte wordt verwacht met enige vorm van fluorophore met een gegeven werkafstand van de doelstelling in gebruik is. Daarom is het belangrijk om de maximale diepte van het weefsel waarin het fluorofoor in levend weefsel beeldvorming kan worden gedetecteerd onderscheiden. Leven bijvoorbeeld Drosophila eierstokken gekleurd met de algemene mitochondriale vlek (Mito) kunnen worden afgebeeld met behulp van de beschreven microscoop setup (Tabel 1) binnen een bereik van 20 urn van het dekglaasje, met een maximale afbeeldingsgebied diepte afneemt bij toenemende ei kamer grootte (fig 5B). De geoptimaliseerde microscoop instellingen voor de mitochondriale vlekken op te sporen positieve signalen in de juiste detectie-kanalen, terwijl de instellingen om onnodige signaal cross-talk of fluorofoor cross-excitatie zoals verwacht gedetecteerd minimale of geen signaal (figuur 6A) te onderzoeken. Co-kleuring van TMRE met de algemene mitochondriale vlek kan worden gebruikt voor zowel kwalitatieve (figuur 6B) en kwantitatieve (Figuur 6C en D </ strong>) evaluaties van mitochondriale potentiële per massa-eenheid in levende Drosophila eierstokken. Bijvoorbeeld, a) een kwalitatieve analyse blijkt dat de Drosophila germarium vertoont hogere mitochondriale potentiaal per eenheid massa in fase 2b waarin de somatische follikel cellen ontstaan de kiemlijn cellen (pijlpunten in figuur 6B kapselen) en b) semi-kwantitatieve analyses tonen het verschil in mitochondriale potentiaal per eenheid van massa tussen (stretch) AFCs en de MBCS, zoals geanalyseerd vanuit een podium 9 ei kamer (figuur 6C). Merk op dat de kwantificering wordt uitgevoerd uit 2 verschillende optische schijven voor AFCs en MBCS, afhankelijk van hun focalevlak. Het gebruik van de mito-ROS probe die met succes is toegepast in Drosophila 14 blijkt in levende Drosophila eierstokepitheliaalcellen follikel cellagen, waarbij functionele null klonen van het mitochondriale eiwit splijting Drp1were geïntroduceerd. Most, but niet alle, van de levende GFP-negatieve Drp1 null follikel celklonen vertonen verhoogde kleuring voor mito-ROS (Figuur 7A en B). Merk op dat hoewel een afzonderlijke mitochondriale signaal in dit weefsel kon worden gedetecteerd, de concentratie van de mito-ROS kleuring kon worden gedetecteerd in de nucleaire regio in de geavanceerde post-mitotische follikel cellen, die aanzienlijk groter is dan de mitotische follikel cellen (* figuur 7C). Dit kan optreden als gevolg van de interactie van nucleaire DNA en het fluorescerende oxidatieproduct van de ROS mito-kleurstof, die een derivaat van ethidium 15.

Detectie van mitochondriale cycline E in vaste Drosophila follikel cellen: Er is onlangs aangetoond dat mitochondriën de celcyclus molecuul Cycline E kan reguleren door het aantrekken naar de mitochondriale oppervlak in zoogdiercellen en de Drosophila follikel cellaag Drosophila follikel cellaag 12. Hier wordt een voorbeeld van mitochondriale lokalisatie van cycline E in de Drosophila follikelcellen aangetoond door middel van co-immunokleuring protocol beschreven. Let op de verhoogde niveaus van dCyclinE in het GFP-negatieve Drp1 nul klonen waarbij het dCyclinE signaal overlapt met dat van het mitochondriale ATP-B-signaal in de germarium (figuur 8A), hoewel het signaal niet kan worden opgelost in afzonderlijke mitochondrial elementen met de beperkte resolutie van confocale microscopie. Ook in post-mitotische MBCS, het GFP-negatieve Drp1 null klonen hebben zowel nucleaire als cytosolische dCyclinE signalen, waarbij de laatste een aanzienlijke overlapping met de ATP-B-signaal, terwijl de wild-type GFP-positieve cellen hebben slechts een nucleaire dCyclinE signaal (Figuur 8B).


Figuur 1. De ontwikkeling van de Drosophila Egg Chambers. Spotprent een Drosophila ovariole bestaat uit een keten ontwikkelen ei kamers, elk bestaande uit een oöcyt en de verpleegkundige cellen (kiembaan) ingekapseld door de follikel cellaag (somatische). Het ei kamers ontwikkelen van het germarium en ontwikkelen door middel van podia waar de mitotische follikel cellen post-mitotische. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Experimentele Plan en voorbereiding. (A) Instrumenten die gebruikt worden bij de werkwijzen beschreven: A. Fly vial; B. Insect ontleden medium; C. paraformaldehyde; D. Fly borstel; E. Opheldering gerecht; F. Cover glas; G. microfugebuis. H. Glas bodem schotel; I. glasplaatje; J. 1000-ul micropipet; K. 200-pl micropipet; L. 2,5-pl micropipet; M. Plagen naald met een gebogen tip (tip wordt vergroot); N. Dikke tang; O. Thin tang. (B) een schematisch stroomdiagram die de beschreven werkwijzen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3. Dissectie van Drosophila eierstokken. (A) verdoofde hele Drosophila. (B) Severed Drosophila buikjes met of zonder (*) de buik inhoud. (C) vrijgegeven Drosophila buikinhoud, waaronder de eierstokken (pijlen en *) en andere inhoud(Pijlpunten); vergroting van de boxed regio verder te benadrukken de voorste (vo) en achterste (Post) uiteinden van het paar eierstokken bezit van het oviductal steel, waarbij de ovarioles worden gehouden door de vezelige huls (#). (D) Geplaagd Drosophila eierstok (dikke pijl markering op de juiste wijze geplaagd en * markering slecht gepest) in vergelijking met unteased ovarium (dunne pijl). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 4
Figuur 4. live-weefsel FLIP Assay. (A) Schematische die de stappen omvat van mitochondriale splitsing / fusie, die kan worden bepaald door een geschikte mitochondriale continuïteit assay De uitklapbare methode; in dit geval, een mito-YFP probe in de mitochondriale matrix maakt de assessment van mitochondriale matrix continuïteit. (B) Time-lapse ex vivo microscopie van een live-transgene Drosophila ei kamer uitdrukken Mito-YFP; alleen select tijdstippen (t) getoond. Zie Video 1 voor alle tijd punten. (C) Kwantificering van het fluorescentiesignaal van de respectieve gekleurde ROI in (B) tot expressie na achtergrondcorrectie en normalisatie. De pijlpunten geven de herhalende fotobleken tijd punten, terwijl de tijdsinterval tussen twee opeenvolgende bleken gebeurtenissen is de hersteltijd. Schaal bar: 10 pm. De beelden werden verkregen met de in tabel 1 beschreven parameters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 5
Figuur 5. Levende Mitochondriënl kleuring en microscopie van de Drosophila Ovariole. (A) individuele optische schijfjes van een live Drosophila ovariole gekleurd met TMRE; het beeld is opgedaan met de in tabel 1 beschreven parameters. Z geeft de afstand van het dekglaasje in urn. (B) Een live Drosophila ovariole geladen met de totale mitochondriale vlek (Mito). De XZ beeld van de rode lijn beeld XY in wordt getoond, waarbij B is de bodem en T is de top van de verworven afbeelding. De afstand van de bodem naar de blauwe lijn is 20 urn. Schaal bar: 20 pm. De confocale beelden werden verkregen met de in tabel 1 beschreven parameters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 6
FIGUUR 6. Co-kleuring van levende Drosophila Ovarioles met TMRE en de Overall Mitochondriale Stain. (A) Single optische schijfje een live Drosophila ovariole co-gekleurd met TMRE en de algemene mitochondriale vlek (Mito); * Geeft een experimenteel artefact in de discussie sectie worden beschreven. (B) maximale intensiteit projectie van 3 opeenvolgende optische plakjes germarium de in (A); pijlpunten geven de regio waar de TMRE fluorescentie toeneemt. (C) Enkelvoudige optische schijfje post-mitotische ei kamer co-gekleurd met TMRE en de algehele mitochondriale vlek. De bovenste en onderste panelen tonen het focalevlak voor AFCs en MBCS respectievelijk. (D) Box grafiek die gemiddelde fluorescentie-intensiteit van TMRE en de totale mitochondriale vlek gekwantificeerd individueel AFCs en MBCS in de omkaderde gebieden in (C). De snorharen van de boxplot geven de maximale en minimale waarden voor elke groep, met uitzondering van de uitschieters. tabel 1 beschreven parameters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 7
Figuur 7. kleuring van Levende Drp1 Null Mozaïek Drosophila Ovarioles met de Mito-ROS kleurstof. (A) Single optische schijfje ovarioles gekleurd met de Mito-ROS kleurstof. (B) Maximale intensiteit projectie van 2 opeenvolgende optische schijfjes van een ei kamer met follikel cellen in de Mitotic podium gekleurd met de Mito-ROS kleurstof. (C) Enkelvoudige optische segment van een ei kamer met follikelcellen in de post-mitotische fase gekleurd met de kleurstof Mito-ROS; * Geeft een nucleair signaal. Het gebrek aan UbiGFP markeert de Drp1 null klonen. Schaal bar: 20 pm. De confocale beelden werden verkregen met de in tabel 1 beschreven parameters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8
Figuur 8. Co-immunokleuring van Fixed Drp1 Null Mozaïek Drosophila Ovarioles met dCyclinE en ATP-B-antistoffen. (A) Maximale intensiteit projectie van 3 opeenvolgende optische schijfjes-co immunostained germarium. (B) Maximale intensiteit projectie van 3 opeenvolgende optische schijfjes co-Immunosgehandhaafd post-mitotische MBCS. De contouren af ​​te bakenen de UbiGFP-negatieve Drp1 null klonen. Schaal bar: 10 pm. De confocale beelden werden verkregen met de in tabel 1 beschreven parameters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 9
Figuur 9. Voorbeelden van mogelijke schade en artefacten. (A) Germarium van UbiGFP-expressie ovariole gefixeerd en gekleurd met de kleurstof Hoechst DNA ongegronde gaten (*). (B) van het ei kamer van UbiGFP expressie ovariole gefixeerd en gekleurd met de DNA-kleurstof Hoechst toont nicks / tranen (*). (C) Leef ovariole met UbiGFP-negatieve Drp1 null klonen gekleurd met de Mito-ROS kleurstof met een misvormde kamer (*) en een beschadigde ei kamer, waardoor een gedeeltelijke kleuring van de kiemlijn (**); # Geeft een mogelijk echte smet van een onbeschadigd ei kamer in dezelfde ovariole. (D) Levend ovariole gekleurd met de Mito-ROS kleurstof die een algehele beschadigde kamer met intense kunstmatig kleuring van de kiembaan. * Geeft beschadiging geïnduceerd afgeplatte ovarioles met een verlies van UbiGFP signaal dat aldus artefactuele GFP-negatieve klonen geven. Schaal bar: 20 pm. De confocale beelden werden verkregen met de in tabel 1 beschreven parameters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

video 1
Video 1. Live weefsel FLIP Assay. De volledige tijdsverloop van de fotobleken gebaseerde FLIP assay beschreven in figuur 5..com / files / ftp_upload / 54989 / Video1.avi "target =" _ blank "> Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)

Tabel 1: confocale microscoop instellingen voor de acquisitie van de gepresenteerde Vertegenwoordiger Images. Klik hier om te bekijken Tabel 1 (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritische stappen in het protocol

Photobleaching: Het voorkomen van onnodige fotobleken van TL-monsters absoluut noodzakelijk is om het uitvoeren van efficiënte confocale microscopie. Daarom moet de tijd gebruikt om monsters te lokaliseren door het oculair of beeldopname parameters via levende scanmodus worden geminimaliseerd om fotobleken te minimaliseren.

Weefselbeschadiging: Aangezien mitochondria worden beschouwd als de sensoren van cellulaire gezondheid, is het uitermate belangrijk dat de verkregen volgens de beschreven werkwijzen gegevens fysiologisch relevante en geven niet de overmatige schade door procedurele dissectie van Drosophila eierstokken. De dissectie moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd, maar ook met extreme voorzorg minimaliseren weefselschade. De gemiddelde tijd voor de dissectie en plagen van 5 Drosophila eierstokken is 5 tot 7 minuten (in de hands). Werk moet worden genomen ei kamers waaruit beschadigd weefsel dat in de analyse wordt uitgesloten identificeren. Weefsel schade door dissectie kunnen onnodige gaten (* in figuur 9A, zoals aangegeven door het ontbreken van signaal), inkepingen / scheuren (* in figuur 9B, zoals aangegeven door het ontbreken van signaal) of vervorming van het ei kamers (* figuur 9C). Toch moet een zinvolle kamer vervorming ten gevolge van de experimentele manipulatie zorgvuldig worden geëvalueerd. Hoewel er geen dekglaasje wordt toegepast bovenop het levende weefsel in de beschreven protocol afvlakking van de ovarioles kunnen bij overmatige druk waarbij de weefsel terwijl plagen of bevestiging (* figuur 9D). De afvlakking van ovarioles is niet waargenomen met vaste monsters, aangezien de beschreven protocol heeft betrekking op de vaststelling van weefsels onmiddellijk na dissectie, met plagen die zich daarna voordoet. Elke geïsoleerd ei kamer zonder handtekeningen van de aforementioned schade kan worden beschouwd als normaal. Mechanische beschadiging mogelijk gevolg van ontleding kan ook leiden tot verlies van GFP, waardoor vals GFP-negatieve klonen 16 en kan ook leiden tot verhoogde kleurstof incorporatie geven. Aangezien de kiemlijn cellen aanwezig zijn in het ei kamers gewoonlijk niet doorlaatbaar voor de levende mitochondriale kleurstoffen (figuren 6 en 7), kan de verhoogde mitochondriale kleuring van de Drosophila kiemlijncellen gevolg van een verhoging van de permeabiliteit van de beschadigde / dood weefsel; dergelijk artefact optreedt bij de mito-ROS kleurstof (** in figuur 9C en het geheel ovariole in figuur 9D), en met andere levende mitochondriale vlekken (niet getoond). Het verlies van UbiGFP in figuur 9D (*) kan ook resulteren uit schade die de afvlakking van het ei kamers veroorzaakte. Hoewel andere ei kamers in het beschadigde ovariole authentieke kunnen blijven en artefact vrij (# in figuur 9C

Tijd gevoeligheid: In het geval van levende ex vivo microscopie, moeten de gegevens worden verkregen binnen 15 minuten van het weefsel montage; anders kan de experimentele resultaten worden beïnvloed door veranderingen in de fysiologie door de daaropvolgende dood van het weefsel. Soms, afhankelijk van het laservermogen en andere scanparameters, de 10 ul fixeermiddel kan sneller verdampt dan 15 min. De detectie van de mitochondriale Cycline E pool door co-immunokleuring vereist het minimaliseren van dissectie tijd (waarschijnlijk door de voorbijgaande aard van de mitochondrial Cycline E zwembad dat wordt onderhouden door actieve mitochondriale ademhaling 12). Merkbare mitochondriale Cycline E zwembad was ook niet waargenomen met permeabilisatie keer minder dan 30 min.

FLIP: De beweging van elk ei kamer onder Examen in de FLIP tijdsverloop kan leiden tot artefactuele analyses en dus moet worden uitgesloten. Het gebruik van een live-mitochondriale kleurstoffen of TMRE wordt niet aanbevolen in een FLIP experiment, sinds de oprichting van de buitenlandse kleurstof het mitochondriale continuïteit kunnen veranderen en dus leiden tot artefactuele resultaten.

Drosophila kruising strategie: Het kruis van wederkerigheid aan de hier beschreven (waar de mannetjes die het Drp1 mutant allel worden gebruikt) heeft niet veel nakomelingen, waarschijnlijk opbrengst als gevolg van een onbekende impact van Drp1 repressie in de heterozygote mannelijke ouders.

Interpretatie van klonale data: Elke GF-negatieve klonen gedetecteerd in de controlegroep eierstokkengeïsoleerd van de ouderlijke Drosophila uitdrukken UbiGFP zou kunstmatig vals-negatieve klonen, waarschijnlijk geproduceerd als gevolg van GFP verlies veroorzaakt door schade tijdens de dissectie 16 aan te geven. Niettemin moet het aantal GFP-negatieve klonen in de warmte geschokt nageslacht van de kruising aanzienlijk hoger dan elk vals-negatieve klonen gezien in de bedieningsorganen. De klonen gegenereerd in de Drosophila follikel cellaag van de beschreven mitotische recombinatie gebaseerde strategie kunnen voortvloeien uit de mitotische follikel stamcellen (stamcel klonen) of de mitotische niet-stamcellen follikelcellen (transient klonen). Voor stamceltransplantatie klonen, dient de experimentele analyses worden uitgevoerd 10 dagen na hitteschok bij het ei kamers met voorbijgaande klonen al gelegd. Voor kortstondige klonen, dienen de analyses worden uitgevoerd binnen 6 dagen na hitteschok, de follikel celklonen van de ovarioles zonder follikel celkloon in germarium.

Wijzigingen en problemen oplossen

Terwijl de beoordeling van mitochondriale potentieel per massa-eenheid met behulp van de beschreven methode, moet men zich bewust zijn van mogelijke artefacten die voortkomen uit de microscoop optica of mitochondriale kleurstof combinaties. Een regio die een verzwakt signaal van de totale mitochondriale vlek en een relatief hoge TMRE signaal (figuur 5A *) kunnen worden veroorzaakt door fluorescentie-energieoverdracht (FRET) tussen de kleurstoffen 8 of door verschillende optische eigenschappen van de rode (TMRE) en groene (overall mitochondriale kleurstof) TL-lampen, gegeven een vaste pinhole grootte in de overname setup. De FRET-gerelateerde artefact kan worden voorkomen door het verminderen van de kleurstofconcentraties, indien mogelijk, terwijl kwantitatieve analyses kunnen worden uitgevoerd op projecties van 2-3 opeenvolgende optische schijven om de optische artefact te vermijden. Ook als een fluorescent signaal wordt gedetecteerd in de overspraak en cross-excitatiekanalen, moet de laser en detectorinstellingen worden aangepast aan het signaal in deze kanalen, die naar verwachting het fluorescentiesignaal verminderen optimale kanalen en minimaliseren.

Laser-geïnduceerde beschadigde uit de herhalende fotobleken kan mitochondriale fragmentatie veroorzaken en dus leiden tot mitochondriale discontinuïteit, het voorkomen van een succesvolle FLIP. Verdacht fragmentatie van mitochondria tijdens de uitvoering van de FLIP protocol kan worden geïdentificeerd door het verwerven hogere resolutiebeelden met een gereduceerde pinhole (en verhoging van de detector gain). Als fragmentatie van mitochondria zichtbaar is opgemerkt tijdens de uitvoering van de FLIP protocol, moet de kracht van de laser bleken verlaagd en / of het interval tussen opeenvolgende bleekmiddelen worden verhoogd. Als er algemeen bleken in het tijdsverloop van de FLIP experiment (signaal van de gele ROI in figuur 3B en C), moet de scanning laser bijgeregeld tot een niveaudie het mogelijk maakt minimale of geen algehele fotobleken.

Om het potentieel artefact als gevolg van schade-geïnduceerd verlies van GFP te voorkomen, kan GFP-positieve klonen worden ingevoerd met behulp van de MARCM strategie, naar aanleiding van de beschreven heat-shock-protocol. Hier, de nodige Drosophila moet worden gebruikt voor het kruis maagdelijke vrouwelijke drpKG03815 FRT40A / CYO X male GAL80 FRT 40A / Cyo; tub-Gal4, UAS-CD8GFP / TM6 9. De vlakke vleugel nakomelingen worden gebruikt voor het genereren van klonen middels hitteschok (zoals beschreven in stap 6).

Beperkingen van de Techniek

A) Terwijl de follikel cellen die zich op het oppervlak van de live Drosophila ei kamers voorzien van de mitochondriale kleuring kleurstoffen, de kiembaan cellen in het ei kamer niet doen; de kiemlijn van de jonge stadia vlekken zwak (figuren 5 en 6). B) De live ex vivo tissue microscopie moet binnen 15 minuten na voltooiing van de vlekken op eierstokken geïsoleerd uit Drosophila individu, één tegelijk. Aangezien experimentele groepen moeten worden verwerkt en afgebeeld op dezelfde dag, de totale tijd genomen om statistisch significante gegevens te verkrijgen van levende ex vivo weefsel microscopie van verschillende experimentele groepen redelijkerwijs langer dan die verkregen uit gefixeerde weefsels. C) We merkten dat de mito-ROS vlek niet erg stabiel in de ex vivo Drosophila weefsels, waarschijnlijk door de voorbijgaande aard van de ROS analyt detecteert 17,15, die het gebrek aan detectie van signaal ten grondslag liggen van alle Drp1 null klonen. Echter, elke biologische relevantie van de variabiliteit in Mito-ROS kleuring in de Drp1 null cellen / klonen kan niet worden uitgesloten en moet nader worden onderzocht. Merk op dat de positieve signaal van de Mito-ROS vlek kan niet alleen weerspiegelen verbeterde superoxide maar ook de verbeterde mitochondriale of cellular oxidatieve milieu 15. D) De totale mitochondriale vlek kan niet worden gebruikt voor het GFP-negatieve of GFP-positieve klonen experimenten, aangezien het fluorescentiespectrum van deze mitochondriale vlek en GFP zijn onderscheiden. E) De FLIP experiment ontworpen om te testen mitochondriale matrix continuïteit zou beeldacquisitie met een open pinhole dat de resolutie van de mitochondriale structuren omvat vereisen.

Betekenis van de techniek met betrekking tot bestaande / Alternative Methods

Het bestuderen van de mitochondriale structuur-functie relatie van cruciaal belang voor een goed begrip van de regulerende mechanismen van mitochondriale functie. Omdat mitochondriale aandoeningen aanzienlijk bijdragen aan diverse ziekten, waaronder diabetes, kanker, ziekte van Parkinson, een gedetailleerd begrip van de mitochondriale werkwijze belooft facilitating van de ontwikkeling van op mitochondriën gerichte therapeutische strategieën. Live-cell microscopie is een onmisbaar hulpmiddel voor het bestuderen van de mitochondriale structuur-functie relatie. De meeste van deze studies beperkt tot geïsoleerde cellen. De studie van de mitochondriale structuur en functie is uitgebreid tot Drosophila weefsel leven in een ex vivo setup 9. De beschreven protocol van deze en verwante studies zullen leiden tot een begrip van mitochondriale structuur en functie in levende Drosophila eierstokken, ex vivo, die inzicht mitochondria in een fysiologische omgeving. Dit ex vivo benadering heeft belangrijke voordelen boven in vitro studies, aangezien de regulering van de metabole en energetische eigenschappen van mitochondria in een bepaalde cel is grotendeels afhankelijk van de beschikbaarheid van voedingsstoffen en passende signalering in de fysiologische omgeving van de cellen.

Genetische manipulatie van mitochondrial structuur door het onderdrukken het mitochondriale eiwit splijting Drp1 ontregelt de celcyclus modulator Cycline E en beïnvloedt de ontwikkeling van de follikel Drosophila cellaag 9,12. Hier, het protocol bevat een beschrijving van hoe functioneel null klonen van Drp1 introduceren in de Drosophila eierstokken van de mitochondriale structuur-functie relatie te bestuderen. Een nieuwe pool van mitochondriale Cycline E op zoogdiercellen, en de Drosophila follikel cellaag 12, met succes gedetecteerd, die waarschijnlijk ten grondslag aan de gerapporteerde Cycline E regulering mitochondria 18. Hier, het manuscript wordt een methode voor het detecteren van de nieuwe mitochondriale Cycline E pool door co-immunokleuring vaste Drosophila eierstokken voor dCyclinE en mitochondriale marker (ATP-B).

Toekomstige toepassingen of richtingen na Mastering deze techniek

gezien tpet Drosophila melanogaster is een krachtig genetisch modelsysteem worden onze beschreven werkwijzen verwachte bijdragen tot het begrip van de genetische basis van de mitochondriale structuur-functie relatie in gezondheid en ziekte. Drosophila is op grote schaal gebruikt om plagen uit de genetische interacties die leiden tot het ontstaan van tumoren 19. Het vermogen van de productie van klonen in de Drosophila follikel epitheliale cellaag maakt het onderzoek mogelijk van de interactie van mitochondria en oncogenen of tumor suppressors tumorigene individuele klonen in een in vivo en ex vivo opstelling. De beschreven werkwijzen kunnen worden gebruikt om de regulering van de mitochondriale structuur-functie relatie op eierstokken geïsoleerd uit geschikte Drosophila mutant bestuderen. De beschreven werkwijzen kunnen verder worden uitgebreid tot het directe effect van verschillende voedingsstoffen en groeifactor signalering op mitochondriale structuur en functie te bestuderen door de exogEnous toevoeging van de geschikte voedingsstoffen en / of groeifactoren in de ex vivo beeldmedium. De beschreven werkwijzen kunnen op geschikte wijze worden gemodificeerd en toegepast in andere geïsoleerde Drosophila weefsels, zoals de larvale denkbeeldige schijven, die op grote schaal gebruikt om signaaltransductieroutes in ziekten zoals kanker 20,21 bestuderen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Grace's Media (Insect Dissecting Medium) Fisher Scientific 30611031-2
41 Paraformaldehyde AQ Electronic Microscopy Sciences 50-259-99
Mitotracker Green (overall mitochondrial stain) Life Technologies m7514 Reconstitute and Aliquot
Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate Sigma Aldrich 87917-25MG Reconstitute and Aliquot
MitoSox (Mito-Ros stain) Life Technologies m36008 Reconstitute and Aliquot
PolyLysine MP Biomedicals ICN15017625
Fly Vials Fisher Scientific AS-515
Fly Conicals Fisher Scientific AS-355
Fly Vial Flugs Fisher Scientific AS273
Fly Conical Flugs Fisher Scientific AS 277
Jazzmix Drosophila food (Drosophila food) Fisher Scientific AS153
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A9647-50G
Cyclin E Antibody (d-300) Santa Cruz sc- 33748
ATPB antibody [3D5] - Mitochondrial Marker AbCam ab14730
Cy3 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 115-165-146
Cy5 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 111-175-144
Hoechst Fisher Scientific H3570
VectaShield Fisher Scientific H100
Azer Scientific EverMark Select Microscope Slides Fisher Scientific 22-026-252
Microscope Cover Glass Fisher Scientific 12-542-B
Mat Tek Corp Glass Bottom Mircrowell Dish Fisher Scientific P35G-0-14-C
Active Dried Yeast Fisher Scientific ICN10140001
Confocal Microscope Carl Zeiss LSM 700
Dumont #5 Forceps Fine Science Technologies 11251-20
Moria Nickel Plated Pin Holder Fine Science Technologies 26016-12
Minutien Pins Fine Science Technologies 26002-15
MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 ) Bloomington Stock Center 7194
Fly Pad Fly stuff 59-118
Blowgun Fly stuff 54-104
Blowgun needle Flystuff 54-119
Dissecting Microscope Carl Zeiss Stemi 2000
Analyses software Carl Zeiss Zen 
Analyses software Open source Image J
Research Macro Zoom Microscope Olympus MVX10
QICAM Fast 1394 Cooled Digital Camera, 12-bit, Mono  QImaging QIC-F-M-12-C
QCapture Pro 5.1 QImaging

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148, (6), 1145-1159 (2012).
  2. Youle, R. J., van der Bliek, A. M. Mitochondrial fission, fusion, and stress. Science. 337, (6098), 1062-1065 (2012).
  3. Mitra, K. Mitochondrial fission-fusion as an emerging key regulator of cell proliferation and differentiation. Bioessays. (2013).
  4. Kageyama, Y., Zhang, Z., Sesaki, H. Mitochondrial division: molecular machinery and physiological functions. Curr Opin Cell Biol. 23, (4), 427-434 (2011).
  5. Chen, H., Chan, D. C. Physiological functions of mitochondrial fusion. Ann N Y Acad Sci. 1201, 21-25 (2010).
  6. Liesa, M., Shirihai, O. S. Mitochondrial dynamics in the regulation of nutrient utilization and energy expenditure. Cell Metab. 17, (4), 491-506 (2013).
  7. Hoppins, S. The regulation of mitochondrial dynamics. Curr Opin Cell Biol. 29, 46-52 (2014).
  8. Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. Chapter 4, Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches. Curr Protoc Cell Biol. Chapter. 21-21 (2010).
  9. Mitra, K., Rikhy, R., Lilly, M., Lippincott-Schwartz, J. DRP1-dependent mitochondrial fission initiates follicle cell differentiation during Drosophila oogenesis. J Cell Biol. 197, (4), 487-497 (2012).
  10. Klusza, S., Deng, W. M. At the crossroads of differentiation and proliferation: precise control of cell-cycle changes by multiple signaling pathways in Drosophila follicle cells. Bioessays. 33, (2), 124-134 (2011).
  11. Sahai-Hernandez, P., Castanieto, A., Nystul, T. G. Drosophila models of epithelial stem cells and their niches. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, (3), 447-457 (2012).
  12. Parker, D. J., et al. A new mitochondrial pool of cyclin E, regulated by Drp1, is linked to cell-density-dependent cell proliferation. J Cell Sci. 128, (22), 4171-4182 (2015).
  13. Mitra, K., Wunder, C., Roysam, B., Lin, G., Lippincott-Schwartz, J. A hyperfused mitochondrial state achieved at G1-S regulates cyclin E buildup and entry into S phase. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (29), 11960-11965 (2009).
  14. Shidara, Y., Hollenbeck, P. J. Defects in mitochondrial axonal transport and membrane potential without increased reactive oxygen species production in a Drosophila model of Friedreich ataxia. J Neurosci. 30, (34), 11369-11378 (2010).
  15. Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radic Biol Med. 48, (8), 983-1001 (2010).
  16. Haack, T., Bergstralh, D. T., St Johnston, D. Damage to the Drosophila follicle cell epithelium produces "false clones" with apparent polarity phenotypes. Biol Open. 2, (12), 1313-1320 (2013).
  17. Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417, (1), 1-13 (2009).
  18. Mandal, S., Guptan, P., Owusu-Ansah, E., Banerjee, U. Mitochondrial regulation of cell cycle progression during development as revealed by the tenured mutation in Drosophila. Dev Cell. 9, (6), 843-854 (2005).
  19. Tipping, M., Perrimon, N. Drosophila as a model for context-dependent tumorigenesis. J Cell Physiol. 229, (1), 27-33 (2014).
  20. Herranz, H., Eichenlaub, T., Cohen, S. M. Cancer in Drosophila: Imaginal Discs as a Model for Epithelial Tumor Formation. Curr Top Dev Biol. 116, 181-199 (2016).
  21. Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63, (2), 411-436 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics