Studera Mitokondriell struktur och funktion i

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Parker, D. J., Moran, A., Mitra, K. Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries. J. Vis. Exp. (119), e54989, doi:10.3791/54989 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Mitokondrier är klassiskt beskrivs som den cellulära kraftpaket, eftersom de är de viktigaste platserna för energiproduktion i differentierade celler. Dessutom, mitokondrierna spela en avgörande roll i ämnesomsättningen, värmealstring, lipid modifiering, kalcium och redox homeostas, orkestreringen av cellsignalering processer, etc 1. Mitokondrier spelar också en aktiv roll i induktionen av celldöd 2, liksom i cellcykelreglering 3. En sådan multifunktionalitet lyfter följande grundläggande frågor: a) Hur mitokondrierna utföra alla dessa funktioner samtidigt och b) är det specifika mitokondriella pooler eller subzones som är specialiserade för olika funktioner? I detta sammanhang är det viktigt att notera att de multifunktionella mitokondrierna är dynamiska i sin form, storlek och struktur inom enskilda celler och att steady-state form av mitokondrier kan variera mellan olika celltyper. Årtionden av forskning från olika labboratorier tyder på att förändringen av mitokondriell form, storlek och struktur, kollektivt kallade mitokondriella dynamik, är avgörande för att upprätthålla olika mitokondriella funktioner 4,5,6. Dessa upptäckter lyfter möjligheten att mitokondrierna kan utföra sin mångsidighet genom sin strukturella dynamik.

Omfattande ansträngningar görs för att förstå den mitokondriella struktur och funktion relation. Dynamiken av mitokondriell struktur primärt upprätthålls av deras förmåga att undergå fission och fusion händelser med varandra. Fission av stora mitokondrier omvandlar dem till mindre mitokondriella element, medan fusion mellan två mindre mitokondrier övergår dem i en större mitokondriell elementet 7. Vidare kan övergående fusion av två mitokondrier inträffar för att tillåta blandning av deras innehåll. Klyvnings och fusionshändelser hos de inre och yttre mitokondriemembranen noggrant styrs av specific uppsättningar av proteiner. Kärnan fission maskiner är sammansatt av dynamin relaterat protein 1 (Drp1), som rekryteras från cytosolen till mitokondrierna genom dess interaktion med vissa bona fide mitokondriella proteiner (t.ex., Fis1 eller MSnabbsp frm1 mSnabbsp), medan Drp1 funktion även kan regleras genom andra proteiner på den mitokondriella ytan 4. Även Drp1 verkar på det yttre membranet, dess klyvnings förmågor påverkar det inre membranet också. Orkestreringen av fission av yttre och inre mitokondriska membranen är inte väl förstådd. Å andra sidan, är sammansmältning av det inre membranet styrs på kärnan av verksamheten i Opa1, medan mitofusins styr fusion av yttre membranet 5. Återstoden av de motverkande fission och fusion händelser mitokondrier diktera steady-state mitokondriell form i en cell. Till exempel, skulle repression av mitokondriell klyvning resultera i fullständig och unopposed fusion, medan överaktivitet av mitokondrierl fission skulle leda till fragmentering av mitokondrier 3.

Studiet av mitokondriell struktur och funktion relation innebär i huvudsak två gratis metoder: a) analyser av de cellulära och organism fenotyper efter genetisk manipulation av mitokondriella fission / fusionsproteiner och b) direkta bedömningar av mitokondriell struktur och funktion. Det är anmärkningsvärt att genetiska analyser inte alltid kan avslöja direkt funktion av molekylen till hands (i det här fallet, mitokondriella fission / fusionsproteiner), eftersom fenotyper kan uppstå på grund av sekundära effekter. Därför är det av yttersta vikt att utveckla och använda verktyg för att studera mitokondriell struktur och funktion direkt. En bedömning av mitokondriell struktur innebär olika mikroskopi verktyg. Användning av fluorescensmikroskopi av levande celler har i hög grad avancerade studier av mitokondriella dynamik, eftersom mitokondriell dynamik kan övervakas både kvalitativt och quantitattivt med användning av lämpliga fluorescensmikroskopi verktyg och tekniker 8. Fluorescensmikroskopi-baserade verktyg har tagits fram för att studera mitokondriell struktur och funktion i levande och fixerade Drosophila melanogaster vävnader, belysa betydelsen av mitokondriell dynamik in vivo 9. Dessa och liknande metoder beskrivs här, med målet att studera mitokondriell struktur och funktion i Drosophila äggstocken.

Drosophila äggstocken består av nedärvda och somatiska linjer, som uppstår från deras respektive adulta stamceller som finns i den germarium 10,11. Sexton syncytialkönsceller (GCS) blir inkapslad av somatiska follikelcellerna (FCS) för att bilda individuella ägg kamrar som framkommer ur den germarium (Figur 1). En av de 16 GC få åtagit sig att bli en äggcell, och de återstående 15 GC utvecklas till sjuksköterska celler som stöder tillväxten av äggcellen kammaren, Underlätta mognaden av ägget innan det läggs. Majoriteten av FC: er undergår 9 omgångar av mitotiska delningar innan de lämnar den mitotiska cellcykeln för att terminalt differentiera till ett mönstrat epitelial cellskikt bestående av främre follikelcellerna (AFCS), posterior follikelcellerna (PFC), och huvudkroppsceller (MBC) . De på varandra följande ägg kamrarna är förbundna genom stjälkceller, vilka är differentierade celler som också är härledda från de FC: er tidigt i utvecklingen. Mitokondriell form regleras av den mitokondriella fission protein Drp1 deltar aktivt i processen för differentiering under den normala utvecklingen av Drosophila äggstocks FC skiktet 9,12. De metoder som används i dessa studier för att identifiera medverkan Drp1 i follikelstimulerande cellskikt Drosophila utveckling beskrivs här.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Framställning av Drosophila (de verktyg som krävs är avbildade i figur 2A)

  1. För någon av de beskrivna experimenten, samla Drosophila (hölls vid rumstemperatur, eller 25 ° C) inom 5 dagar eclosion och placera dem i en flaska fylld med 5-7 ml Drosophila mat (se Material tabell), med högst 25 flugor i varje flaska; upprätthålla en kvinnlig: manlig förhållandet 2: 1.
  2. Strö en liten mängd granulerad jäst för att stimulera Drosophila äggproduktion. Utför experimentell manipulation inom 2 - 4 dagar.

2. Dissekering av Drosophila Äggstockar (de verktyg som krävs är avbildade i figur 2A)

  1. Varm insekt dissekera medium (se Material tabell) till rumstemperatur, 25 ° C. Fyll tre brunnar av en åtta brunnar glas dissekera skålen med 200 mikroliter medium i varje brunn.
  2. Söva Drosophila med CO Drosophila vid en tidpunkt då uppträder live mikroskopi.
  3. Medan du tittar genom okularet av dissektion mikroskop, avskilja bröstkorgen från buken med hjälp av två par pincett. Med hjälp av pincett, noggrant överföra bakkroppen till den andra brunnen i skålen.
  4. Använd en pincett för att hålla buken vid den bakre änden, och långsamt driva äggstockarna ut (tillsammans med de andra bukinnehållet) med den andra pincett. Skulle detta försök misslyckas, försiktigt bort buken exoskelett genom att föra in tången i den främre änden för att frigöra äggstockarna.
  5. Med hjälp av pincett, hålla en enskild äggstock av den opaka bakre änden (dvs gulan fylld sent skede ägg) och flytta den försiktigt till den tredje brunnen i skålenför retas att bearbeta den för levande mikroskopi (steg 3) eller för fixering för att utföra immunfärgning (steg 7).
  6. Noggrant retas det skyddande höljet från runt äggstockarna genom att sopa en retas nål lätt från den bakre till den främre änden av varje äggstock medan du håller den vid den bakre änden med en pincett.
    OBS: För att minimera skador under retas, böja nålspetsen och zooma in på varje äggstock genom att öka förstoringen av mikroskopet (Figur 2A). Retas bör vara effektiva tillräckligt för att bryta manteln, men det skall också noggrant göras för att bevara integriteten av ovarioles.

3. Förberedelse för Live-vävnad Mikroskopi

OBS: De verktyg som krävs är avbildade i figur 2A.

  1. Innan Drosophila dissektion, förbereda polyL-lysin belagda kammare. För detta ändamål placera två 20-mikroliter droppar av polyL-lysin (0,1 mg / ml) på coverglass (14 mm, nr 0) av en glasbottnad petriskål (35 mm) på ett rimligt avstånd från varandra för att förhindra en sammanslagning av dropparna. Lufttorka plattorna under 1 h vid 37 ° C och markera kanterna på den vita polyL-Lysin-film på undersidan av plattan med ett raderbart markör.
    OBS: Den polyL-lysin-belagda kamrarna kan lagras vid 4 ° C i en vecka. Om du använder en tidigare belagd kammare, föra den till rumstemperatur innan Drosophila dissektion.
  2. Ställ in inläsningsparametrarna på konfokalmikroskop för att säkerställa att provet kan avbildas direkt efter slutförandet av dissekering och montage, enligt nedan.
  3. Placera en dissekeras och retad äggstock (efter steg 2 och färgas, om så erfordras, efter steg 5) på en markerad polyL-lysin-belagda region och sprids äggstocken med retas nål för att separera ovarioles. Placera en 10-mikroliter droppe insekt dissekera mediet ovanpå äggstocken, och se till att täcka than hela polyL-lysin-belagda området. Täck petriskål.
  4. Omedelbart utföra konfokalmikroskopi av det monterade provet vid rumstemperatur.
    OBS: Endast en Drosophila bör dissekeras, bearbetas och avbildas på en gång. Dessutom bör mikroskopi inte utföras vid 37 ° C, vilket kommer att efterlikna en värmechock miljö för Drosophila vävnad.

4. Fluorescens Förlust i fotoblekning (FLIP) analys för att bedöma Mitochondrial Matrix Kontinuitet

OBS: Mitochondrial matris kontinuitet i en smält mitokondriell struktur etableras efter fullständig sammansmältning av de mitokondriella inre och yttre membranen efter en progression genom de mellansteg. Fission av mitokondrier kan följa samma steg men i den motsatta riktningen (figur 3A). FLIP är en time-lapse mikroskopi baserade semi-kvantitativ metod som kan användas för att bedöma mitokondrie matrisen kontinuitet islutlig smält tillstånd av ex vivo mitokondrier (steg 3 och 4 i figur 3A) i levande Drosophila äggstockar 9. FLIP-analysen utförs som en liten region av intresse (ROI) i mitokondrierna som uttrycker en fluorescerande molekyl i den mitokondriella matrisen som photobleached med regelbundna intervall (FLIP ROI i figur 3A). Som ett resultat kommer varje omgivande mitokondriell region som är kontinuerlig med FLIP ROI (experimentell ROI i figur 3A) förlora signalen på grund av utbyte av molekyler i den kontinuerliga mitokondriella matrisen. FLIP experiment visade här utförs på transgen Drosophila uttrycker mitoYFP, som innehåller den mitokondriella inriktning sekvensen för det humana cytokromoxidas VIII subenhet taggade med YFP att rikta det till den mitokondriella matrisen i en fritt diffunderbart formulär. Ett liknande experiment kan också utföras med mito pUASP-mito-GFP transgenen, som tidigare rapporterats <sup> 9. Ett liknande FLIP-protokoll kan användas med en prob riktad mot det mitokondriella intermembranutrymme för att kunna detektera kontinuiteten som erhålls vid smältning av det yttre men inte de inre mitokondriska membranen (steg 2 i figur 3A).

  1. Öppna bilden förvärvet programvara på konfokalmikroskop och ställa in lämpliga inläsningsparametrarna i "Förvärv" -fliken (tabell 1). Kontrollera "Tidsserier", "Blekning" och "Regioner" lådor att öppna de olika flikarna. Sätt lämpliga förvärvsparametervärden i varje flik (tabell 1).
    OBS: pinhole bör lämnas öppen, eftersom detta experiment är utformat för att övervaka den totala signalen från hela mitokondrie befolkningen i individuella celler.
  2. Använd okularet att snabbt lokalisera intresseområde i monterat levande vävnad.
    OBS: Välj ovarioles som är väl spridda på glas bottomed maträtt, eftersom konfokalmikroskopi kan inte utföras på flytande ovarioles.
  3. Klicka på "live" för att få en levande bild av den valda intresseområde. Klicka på "stopp" för att stoppa levande scanning.
  4. Vid behov, justera förvärvet parametrar såsom att den detekterade fluorescerande signal är lägre än mättnadsnivå (indikeras av frånvaron av röda pixlar när "range indikatorn" alternativet är markerat), med den definierade bakgrund som fastställts av att justera de förskjutna värdena.
  5. Rita en liten ROI med hjälp av Bezier ritverktyg från fliken "Regioner" att avgränsa fotoblekning zonen på bilden förvärvades av levande scanning.
    OBS: Storleken på ROI bör vara omkring 20 - 50% av den totala fluorescerande mitokondriell signal inom cellen.
  6. Utför bild förvärv genom att klicka på "start experiment."
  7. Kvantifiera fluorescensintensiteten med hjälp av egenutvecklade eller programvara med öppen källkod (se MaterialTabell). Anteckna medelvärdet signalen från ROI där repetitiva blekningen riktad (FLIP); den ROI där blekningen inte har utförts i samma cell (Experimental); ROI från en annan oblekt cell i samma synfält, för att bedöma den totala blekning under försöksperioden (Blekning); och avkastningen på bakgrundsområdet (Bakgrund). Subtrahera den genomsnittliga bakgrundssignalen erhållen från medelvärdessignalen i den andra ROI. Normalisera fluorescerande signal med den initiala pre-blekmedel signal för respektive cell.
  8. Plotta normaliserade data med hjälp av en vanlig plottning programvara.

5. Levande Färgning med fluorescerande Mitochondrial Färgämnen

OBS: Steady-state mitokondriell struktur och potential kan bedömas med hjälp av färgämnena som specifikt införliva i mitokondrier i levande celler och vävnader. Live Drosophila äggstockar kan färgas ex vivo med fluorescerande mitokondriefläckar att visualisera mitokondrierna, att bedöma mitokondriella reaktiva syreradikaler (mito-ROS) produktion, och bedöma mitokondrie potential per massenhet. Detta kan åstadkommas genom samtidig färgning med den mitokondriella potentiometrisk färgämnet tetrametylrodamin etylester (TMRE) och en kompatibel levande mitokondrie fläck som representerar den mitokondriemassa (se Material Tabell för de specifika färgämnen).

  1. Späd lager av fläckar i varma insekt dissekera medium till den slutliga bearbetningen koncentrationer: mitokondrie fläck, 250 nM; TMRE, 50 nM; och mito-ROS fläck, 5 | iM.
  2. Efter dissekering och retas äggstockarna efter steg 2, placera äggstockarna till 200 mikroliter av en viss färglösningen i en brunn i en dissektion maträtt. Inkubera dem under 10 minuter med skålen täcks av en lämplig låda lindade med aluminiumfolie för att skydda den mot ljus. Tvätta färgade äggstockar genom att flytta dem noga med pincett i 3 brunnar i rad containing medium utan fläck.
  3. För samtidig färgning med TMRE och kompatibel totala mitokondrie fläck, följ ovanstående protokoll att färga först med TMRE och sedan omedelbart med den totala mitokondriella fläcken (utan tvättsteg däremellan).
  4. Montera äggstockarna på en polyL-lysin belagda glasbottnad skål efter steg 3 och förbereda sig för konfokalmikroskopi med lämpliga inläsningsparametrarna (tabell 1), efter steg 4,2-4,4.
    OBS: Signalen från de inkorporerade färgämnen varade inte vid försök att montera de färgade proven i monteringsmedium.
  5. Kontrollera Z-sektionering rutan för att öppna fliken. Vrid fokushjulet mot botten av provet medan det levande skannas och klicka på "set först" för att definiera den nedersta Z-sektionen. Gör samma sak när du flyttar fokus hjulet mot den andra riktningen för att definiera den översta delen.
  6. Utför bild förvärv genom att klicka på "start experiment."
  7. Kvantifiera bakgrundskorrigerade fluorescensintensiteten från ROI för bakgrundssignalen och de enskilda cellerna (som i steg 4,7) och plotta data med hjälp av någon plottning programvara.

6. Framställning av Drp1 Null Mosaik

OBS: Den klonala strategi som används här införs grönt fluorescerande protein (GFP) -negativa Drp1 null kloner i bakgrunden av en GFP-positiva, fenotypiskt vildtyp bakgrund som är genotypiskt heterozygot för Drp1 nollmutation 9. Värmechock-inducerad flippas-flippas erkännande mål (FLP-FRT) -medierad platsspecifik mitotiska rekombination skapar homozygota kloner av funktionellt noll drpKG03815 allelen. Genotyp Drosophila bär Drp1 mutanten är drpKG03815 FRT40A / CYO, medan genotyp som bär värmechock-inducerad FLP (hsFLP) och UbiGFP klon markör är hsflp; ubiquitin nls-GFP (UbiGFP) FRT 40A / cyo. Genotypen av sigkerat avkomma av korsning mellan ovanstående genotyper är hsFLP / +; drpKG03815 FRT40A / UbiGFPFRT40A.

  1. Synkronisera Drosophila för jungfru insamling genom att flytta dem till nya flaskor av färska livsmedel var två till tre dagar. Övervaka pupariating flaskorna dagligen för att samla nya jungfru honor.
  2. Samla rödögd, curly-wing jungfru honor från Drp1 mutant genotyp varje dag, en gång på morgonen och en gång på kvällen, och placera dem i en separat flaska. Parallellt samla manliga Drosophila med mörkröda ögon och raka vingar bär hsflp och UbiGFP inom 5 dagar eclosion.
  3. Inrätta ett kors genom att lägga hanarna till Virgin honor med en kvinnlig: manlig förhållandet 2: 1.
  4. Strö en liten mängd granulerad jäst för att stimulera äggproduktion.
    OBS: Flytta försiktigt Drosophila till en färsk flaska med media var 2 till 3 dagar för att öka mängden av avkomma och för att minska injektionsflaska trängsel.
  5. Enesthetize, sortera och samla raka bevingade, rödögd hona avkomma inom 5 dagar eclosion.
  6. För värmechock, placera den insamlade Drosophila in i tomma glasflaska med en liten mängd av granulerad jäst och en liten, mjuk torka (för att absorbera fukt under värmechock). Placera flaskan med Drosophila i ett vattenbad vid 38 ° C under 1 h, för att generera huvudsakligen follikelstimulerande cellkloner, och vid 37 ° C under 1 h två gånger om dagen (som medger åtminstone 5 h mellan de två värmechocker) under 2 på varandra följande dagar att generera både nedärvda och follikelstimulerande cellkloner.
    OBS: Se till att flaskan är helt nedsänkt i vattnet upp till nivån av pluggen.
  7. Den värmechock kan göra Drosophila orörlig. Tillåta den värme chockade Drosophila att återhämta sig under 1 h vid rumstemperatur när de blir mobil igen.
  8. Lägg hanarna tillbaka till honorna i samma proportion som i korset, och flytta dem till nya flaskor med medium beströs med en liten mängd av granulerad jäst. Behåll Drosophila minst 5 dagar.
  9. Dissekera äggstockarna som är nödvändiga för en levande eller fast experiment.
    OBS: Äggstockar isolerade från den paren Drosophila som uttrycker UbiGFP bör användas som negativa kontroller för att bekräfta effektiv induktion av GFP-negativa kloner genom värmechock.

7. Co-immunfärgning för cyklin E och Mitokondrier

OBS: För att upptäcka Drosophila cyklin E (dCyclinE), har vi använt ett kommersiellt erhållen antikropp riktad specifikt mot dCyclinE 9 (se Material tabell). Som en mitokondriell markör använde vi en antikropp mot ATP-B (en subenhet av den mitokondriella ATP-syntas komplex) 9.

  1. Varm 4% paraformaldehyd (PFA) till rumstemperatur, 25 ° C. Försiktighet! Paraformaldehyd är giftigt.
    OBS: Efter öppnandeampullen bör PFA förvaras vid 4 ° C och användes inom 7 dagar. Detta beror på att lagring av PFA kan tillåta oxidation till metanol, vilket dramatiskt skulle ändra mitokondriemembranen under fixeringen, även om de är närvarande i spårmängder.
  2. Omedelbart efter dissektion, fastställa dissekerade äggstockar genom att placera dem i 200 mikroliter av färsk PFA i en brunn på en glas dissekera skålen (utan retas). Håll skålen i ett dragskåp i 15 min. Tvätta de fasta äggstockar genom att flytta dem noga med pincetten i 3 brunnar i följd, var och en innehållande 200 mikroliter av 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
    OBS: Experimentet kan stoppas här och proverna kan lämnas vid 4 ° C i 1 dag.
  3. Retas äggstockarna mer noggrant i PBS (liknande steg 2,6) för att försiktigt ta bort skydds fibrösa slida som kan hindra antigen tillgång av antikroppen.
  4. Permeabilisera retad äggstockar genom att placera dem i ett mikrofugrör med 500 mikroliter av nybakade 0.5% PBS-Triton-X100 (PBS-TX) och inkubera det i 30 min medan gunga vid 25 rpm.
    OBS: Under gungning, placera rören parallellt med gungande rörelse; placera dem i rät vinkel kan tillåta vävnaden att hålla sig till locket av rören, vilket resulterar i vävnadsförlust.
  5. För att ta bort PBS-TX, placera mikrofugrör i ett ställ för att tillåta vävnaden att slå sig ner på botten av rören. Inspektera dem visuellt och peka på rören, om nödvändigt, för att få eventuella flytande vävnader ner till botten. Aspirera lösningen försiktigt från toppen, och se till att vävnaden vid botten av rören förblir ostört.
  6. Blockera äggstockarna genom tillsats av 200 mikroliter av 2% bovint serumalbumin (BSA) upplöst i 0,5% PBS-TX, och inkubera den på vipparmen vid rumstemperatur under 1 h. Avlägsna blockeringsmedel genom att följa steg 7,5.
  7. Lägga primära antikroppar i 200 mikroliter av färskt blockeringsmedel: anti-kanin dCyclinE antikropp (1: 100) och anti-mus-ATP-B-antikroppar(1: 100). Inkubera vävnaderna på rocker under 2 h vid rumstemperatur.
  8. Tvätta äggstockarna med PBS-TX 3 gånger under 15 min vardera, efter steg 7,5.
  9. Tillsätt 200 | il av de lämpliga sekundära antikroppar i färsk PBS-TX: anti-mus-CY3 (1: 1000) och anti-kanin-CY5 (1: 500). Inkubera på vipparmen under 1 h vid rumstemperatur.
  10. Tvätta äggstockarna med PBS-TX 3 gånger under 15 min vardera, efter steg 7,5.
  11. För att färga DNA: t, till Hoechst (1: 1000 spädning) till det slutliga PBS-TX tvätt.
  12. Slutligen, lämna vävnaden i 500 mikroliter av 1x PBS.
  13. Med hjälp av en 1 ml mikropipett, ta bort immun äggstockar från mikrofugrör till en ny brunn i en glas dissekera skål innehållande 200 mikroliter PBS.
  14. Tillsätt en droppe av glycerolbaserat monteringsmedium till en glasskiva och tillsätt immunfärgat äggstockar en efter en till monteringsmedium.
    OBS: Se till att äggstockarna faktiskt överförs till monteringsmedium. Om du inte gör ero kommer att leda till vävnadsförlust.
  15. Medan du tittar genom dissektion mikroskop, försiktigt plocka transparenta ovarioles (yngre stadier) från opaka mogna ägg kammare med hjälp av retas nål medan du håller den opaka delen av äggstocken med pincett. Ta bort de mogna ägg kamrarna från monteringsmedium.
  16. Placera en coverglass (22 mm, nr 1) på bilden och tryck lätt för att se till att monteringsmedium sprids jämnt under.
    OBS: Om du trycker på coverglass säkerställer också korrekt inriktning av vävnaden längs coverglass. Om du inte gör så optimalt kan tillåta mindre steg för att flyta i monteringsmedium, vilket förhindrar optimal mikroskopi av dessa vävnader.
  17. Lufttorka proverna för 15 min och försegla kanterna på täckglas försiktigt med nagellack.
  18. Utför konfokalmikroskopi enligt experimentell behov (tabell 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De beskrivna metoderna kan användas för att studera mitokondriell struktur och funktion i levande och fixerade Drosophila-äggstockar (figur 2b). Förutsatt är några exempel på förväntade resultat som erhållits med de beskrivna metoderna.

Dissekering av Drosophila äggstocken: När dissekeras ytterligare bör avhuggna bakkroppen (Figur 3B) från hela Drosophila (figur 3A) frigöra bukinnehållet, inklusive 2 äggstockar från varje enskild Drosophila. De intakta äggstockar visas som ovala, vita strukturer (pilar i figur 3C och D) som helst bör förbli knutna till varandra genom oviductal stjälken. De ovarioles i varje äggstock bör hållas samman av den fibrösa slida (# i förstorad del av fig 3C), vilken avlägsnas by försiktig retas (tjock pil i figur 3D, * indikerar en dåligt retad äggstock med fristående ovarioles) att exponera ovarioles för färgning och mikroskopi. De frigjorda äggstockar med oviductal stjälkar bryts vid lanseringen av buken innehållet kan också användas, förutsatt att de inte skadade på annat sätt. Eventuella skadade äggstockar (* i figur 3C) och andra bukinnehållet (pilspets i figur 3C) ska kasseras.

Live mikroskopi av Drosophila äggstocken: Här visar vi FLIP teknik och lastning av mitokondriella strukturella och funktionella färgämnen i Drosophila äggstockar.

FLIP tekniken tillämpas tidigare att bedöma mitokondrie kontinuitet i Drosophila follikelcellerna 9 har visats här i äggstocks sjuksköterska cellerna i transgena Drosophila (Figur 4A). FLIP riktad till en av de mitokondriella moln associerade med sjuksköterskan celler leder till en förlust som är större än 50% av den fluorescerande signalen från de blå och vita ROI omger den röda FLIP ROI inom 200 s (figur 4B och C); signalen från den gröna ROI används för bakgrundskorrigering. Den fluorescerande signalen från den gula ROI i de andra oriktade sjuksköterska celler förblir konstant under denna tidsram, vilket innebär minimal total blekning under tidsförloppet av experimentet (Figur 4B och C). Se även Video 1. Detta resultat indikerar att mitokondrieri sjuksköterska celler har smält sina yttre och inre membran, som exemplifieras i steg 3 och 4 (figur 4A), medan mitokondrier i steg 1 och 2 inte förväntas visa någon förlust av fluorescens i denna tidsram.

Det har tidigare visats att en semi-kvantitativt mått på mitokondriell potential per enhet mitokondriemassa kan bedömas genom samtidig färgning med den potentiometriska färgämnet TMRE och den totala mitokondriella fläcken som återspeglar mitokondriemassa 13. Här användes samma teknik som används för att demonstrera bedömningen av mitokondriell potential per massenhet i levande Drosophila äggstocksvävnad. Konfokalmikroskopi av levande Drosophila äggstockar färgade med TMRE demonstrerar en minskning i signal med djupet av vävnaden (figur 5A). förväntas denna förlust av fluorescerande signal på grund av ökad spridning i större djup i vävnaden för att inträffa med någon form av fluorophore med en viss arbetsavstånd av det objektiv som används. Därför är det viktigt att urskilja det maximala djupet av vävnaden inom vilken fluoroforen kan detekteras under levande vävnad avbildning. Till exempel, levande Drosophila äggstockar färgade med den totala mitokondriella fläcken (Mito) kan avbildas med den beskrivna mikroskop setup (tabell 1) inom ett område av 20 | j, m från täckglas, medan den maximala avbildbar djupet minskar med ökande ägg kammarstorlek (figur 5B). Optimerade mikroskop inställningar för mitokondriella fläckar upptäcka positiva signaler i lämpliga kanaler upptäckt, medan inställningarna för att undersöka eventuella otillbörliga signal överhörning eller fluoroforen tvär excitation oväntat upptäckt minimal eller ingen signal (figur 6A). Co-färgning av TMRE med den totala mitokondrie fläck kan användas för både kvalitativa (figur 6B) och kvantitativa (Figur 6C och D </ strong>) bedömningar av mitokondriell potential per massenhet i levande Drosophila äggstockar. Till exempel, a) en kvalitativ analys visar att Drosophila germarium uppvisar högre mitokondriell potential per massenhet i steg 2b där de somatiska follikelcellerna har uppstått att inkapsla nedärvda celler (pilspetsar i figur 6B) och b) halv kvantitativa analyser visar skillnaden i mitokondriell potential per viktenhet mellan (stretch) AFCS och MBC, som analyseras ur ett steg 9 ägg kammare (Figur 6C). Observera att kvantifieringen har utförts från 2 olika optiska skivor för AFCS och MBC, beroende på deras plan fokus. Användningen av den mito-ROS sond som har använts med framgång i Drosophila 14 demonstreras i levande Drosophila-ovariala epiteliala follikel cellager, där funktionella null kloner av den mitokondriella klyvningsproteinet Drp1were införts. De flesta, but inte alla, av de levande GFP-negativa Drp1 null follikel cellkloner uppvisar förhöjd färgning för mito-ROS (figur 7A och B). Notera att även om en distinkt mitokondriell signalen inte kunde detekteras i denna vävnad, kunde koncentrationen av den mito-ROS fläck detekteras i den nukleära regionen i de avancerade post-mitotiska follikelcellerna, som är betydligt större än de mitotiska follikelcellerna (* i figur 7C). Detta kan inträffa på grund av interaktionen av nukleärt DNA och den fluorescerande oxidationsprodukt av den mito-ROS färgämne, som är ett derivat av etidium 15.

Detektering av mitokondrie-cyklin E i fasta Drosophila äggstocks follikelcellerna: Det har nyligen visats att mitokondrier kan reglera cellcykeln molekylen cyklin E genom att rekrytera det till den mitokondriella ytan på däggdjursceller och Drosophila follikeln cellskiktet Drosophila follikelstimulerande cellskiktet 12. Här, är ett exempel på mitokondriell lokalisering av cyklin E i Drosophila follikelcellerna visas med användning av sam-immunfärgning protokoll som beskrivits. Notera förhöjda nivåer av dCyclinE i GFP-negativa Drp1 null kloner där dCyclinE signalen överlappar med den för den mitokondriella ATP-B-signalen i germarium (Figur 8A), även om signalen inte kan lösas i olika mitokondriella element med begränsad upplösning av konfokalmikroskopi. Också, i post-mitotiska MBC, de GFP-negativa Drp1 null kloner har både nukleära och cytosoliska dCyclinE signaler, där de senare avsevärt överlappar den ATP-B-signalen, under det att vildtyp-GFP-positiva celler har endast en nukleär dCyclinE signal (Figur 8B).


Figur 1. Utvecklingen av Drosophila Egg Chambers. Tecknad film som visar en Drosophila ovariole bestående av en kedja av utvecklings ägg kammare, var och en består av en äggcell och sjuksköterskan cellerna (nedärvda) inkapslade av follikeln cellskiktet (somatisk). Ägget kammare utvecklas från germarium och utvecklas genom olika stadier där de mitotiska follikelcellerna blir efter mitotiska. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2. Experimentell plan och förberedelse. (A) Verktyg som används i förfarandena beskrivna: A. Fly ampull; B. Insect dissekera medium; C. Paraformaldehyd; D. Fly borste; E. Dissecting skålen; F. Cover glas; G. mikrofugrör. H. glasbottnad skål; I. glasskiva; J. 1000-il mikropipett; K. 200-mikroliter mikropipett; L. 2,5-mikroliter mikropipett; M. Teasing nål med en böjd spets (spetsen förstoras); N. Tjocka pincett; O. Tunna pincett. (B) Ett flödesschema schematiskt representerar de beskrivna metoderna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Dissektion av Drosophila äggstockar. (A) bedövad hela Drosophila. (B) Severed Drosophila bakkroppen med eller utan (*) buken innehållet. (C) Släppt Drosophila bukinnehållet, inklusive äggstockarna (pilar och *) och annat innehåll(pilhuvuden); förstoring av den inramade regionen till höger belysa den främre (Ant) och posterior (Post) ändar av paret av äggstockarna som innehas av det oviductal stjälk, där ovarioles innehas av den fibrösa slida (#). (D) Teased Drosophila äggstocken (tjock pil märkning lämpligt retad och * märkning dåligt retad) i jämförelse med unteased äggstock (tunn pil). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4. Live-vävnads FLIP-analys. (A) Schematisk som representerar stegen att mitokondriell fission / fusion, som kan analyseras genom en lämplig mitokondriell kontinuitet analys med användning av FLIP-metoden; i detta fall, ett mito-YFP sonden i den mitokondriella matrisen gör det möjligt att assessment av mitokondriens matrix kontinuitet. (B) Time-lapse ex vivo mikroskopi av en levande transgen Drosophila ägg kammare uttrycker mito-YFP; endast utvalda tidpunkter (t) visas. Se Video 1 för alla tidpunkter. (C) Kvantifiering av den fluorescerande signalen från den respektive färgade ROI i (B) uttrycks efter bakgrundskorrigering och normalisering. Pilarna visar de UPPREPANDE fotoblekning tidpunkter, under det att tidsintervallet mellan två blekningshändelser i följd är den återhämtningstid. Skala bar: 10 pm. Bilderna förvärvades med de parametrar som beskrivs i tabell 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 5
Figur 5. Live Mitokondrierl Färgning och mikroskopi av Drosophila Ovariole. (A) Enskilda optiska skivor av en levande Drosophila ovariole färgas med TMRE; bilden förvärvades med de parametrar som beskrivs i tabell 1. Z betecknar avståndet från täckglaset i ^ m. (B) En live Drosophila ovariole laddad med den totala mitokondriella fläcken (Mito). XZ bilden av den röda linjen i XY bilden visas, där B är botten och T är toppen av den förvärvade bilden. Avståndet från botten till den blå linjen är 20 nm. Skala bar: 20 pm. De konfokala bilder förvärvades med de parametrar som beskrivs i tabell 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 6
Figure 6. Co-färgning av levande Drosophila Ovarioles med TMRE och den övergripande Mitochondrial Stain. (A) Single optisk skiva av en levande Drosophila ovariole co-färgades med TMRE och den totala mitokondriella fläcken (Mito); * Indikerar en experimentell artefakt som beskrivs i diskussionsavsnittet. (B) Maximal intensitet projektion av 3 på varandra följande optiska skivor av den germarium i (A); pilarna visar det område där TMRE fluorescensen ökar. (C) Single optisk skiva av post-mitotiska ägg kammaren co-färgades med TMRE och den totala mitokondriella fläcken. De övre och nedre fälten visar fokalplanet för AFCS och MBC, respektive. (D) Box diagram som visar medelfluorescensintensiteten hos TMRE och den totala mitokondriella fläcken kvantifieras från enskilda AFCS och MBC i de inramade regionerna i (C). Morrhåren i boxdiagram ange högsta och lägsta värden för varje grupp, med undantag av extremvärden. tabell 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 7
Figur 7. Färgning av Live Drp1 Null Mosaic Drosophila Ovarioles med Mito-ROS färgämne. (A) Single optisk skiva ovarioles färgade med Mito-ROS färgämne. (B) Högsta intensitet projektion av 2 konsekutiva optiska skivor en enskild ägg kammare med follikelstimulerande celler i Mitotic steget färgas med mito-ROS färgämne. (C) Single optisk skiva av en enskild ägg kammare med follikelstimulerande celler i efter mitotiska stadiet färgades med mito-ROS färgämne; * Anger en nukleär signal. Bristen på UbiGFP markerar Drp1 null kloner. Skala bar: 20 pm. De konfokala bilder förvärvades med de parametrar som beskrivs i tabell 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 8
Figur 8. Co-immunfärgning av fast Drp1 Null Mosaic Drosophila Ovarioles med dCyclinE och ATP-B-antikroppar. (A) Högsta intensitet projektion av 3 konsekutiva optiska skivor samtidigt immun germarium. (B) Högsta intensitet projektion av 3 konsekutiva optiska skivor co-Immunoshålls post-mitotiska MBC. Konturerna avgränsa UbiGFP negativa Drp1 null kloner. Skala bar: 10 pm. De konfokala bilder förvärvades med de parametrar som beskrivs i tabell 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 9
Figur 9. Exempel på risk för skador och artefakter. (A) Germarium av UbiGFP-uttryck ovariole fixerades och färgades med DNA-färgämnet Hoechst visar otillbörlig luckor (*). (B) Egg kammare UbiGFP-uttryck ovariole fixeras och färgas med DNA-färgämnet Hoechst visar hack / tårar (*). (C) Live ovariole med UbiGFP negativa Drp1 null kloner färgade med Mito-ROS färgämne visar en deformerad kammare (*) och en skadad ägg kammare, vilket delvis färgning av arvslinje (**); # Betecknar en eventuellt verklig fläck av ett oskadat ägg kammare i samma ovariole. (D) Levande ovariole färgades med mito-ROS färga visar en övergripande skadade kammare med intensiv artefaktuella färgning av nedärvda. * Indikerar skada-inducerad tillplattad ovarioles med en förlust på UbiGFP signal, vilket ger upphov till artefaktuella GFP-negativa kloner. Skala bar: 20 pm. De konfokala bilder förvärvades med de parametrar som beskrivs i tabell 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

video 1
Video 1. Live-vävnads FLIP analys. Den fullständiga tidsförlopp för den fotoblekning baserade FLIP analysen beskriven i figur 5..com / filer / ftp_upload / 54.989 / Video1.avi "target =" _ blank "> Klicka här för att se filmen. (Högerklicka för att ladda ner.)

Tabell 1: konfokalmikroskop Inställningar för förvärvet av de presenterade representativa bilder. Klicka här för att se tabell 1. (Högerklicka för att ladda ner.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritiska steg i protokollet

Fotoblekning: Förhindra otillbörlig fotoblekning av fluorescerande prover är absolut nödvändigt att utföra en effektiv konfokalmikroskopi. Därför bör den tid som används för att lokalisera prover genom okularet eller för att ställa bildupptagning parametrar genom live scanning minimeras för att minimera fotoblekning.

Vävnadsskador: Eftersom mitokondrier anses vara sensorerna av cellulär hälsa, är det oerhört viktigt att se till att de data som erhållits med hjälp av de beskrivna metoderna är fysiologiskt relevant och inte återspeglar den onödiga skador som orsakats av procedur dissekering av Drosophila äggstockarna. Dissektion bör utföras så snabbt som möjligt, men också med extrem försiktighet att minimera vävnadsskada. Den genomsnittliga tiden för dissekering och retas av 5 Drosophila äggstockarna är 5-7 minuter (i vår hands). Ansträngning måste vidtas för att identifiera ägg kammare visar skadad vävnad som kommer att uteslutas från analyserna. Vävnadsskada på grund av dissektion kan omfatta otillbörlig luckor (* i figur 9A, som identifierats av bristen på signal), hack / tårar (* i figur 9B, som identifierats av bristen på signal), eller deformering av ägg kamrarna (* i figur 9C). Dock bör någon meningsfull kammar deformation som härrör från den experimentella manipulation noggrant utvärderas. Även om ingen täck används ovanpå den levande vävnaden i det protokoll som beskrivs, tillplattning av ovarioles kan inträffa med otillbörliga påtryckningar appliceras på vävnaden medan retas eller montering (* i figur 9D). Flackare ovarioles har inte observerats med fasta prover, eftersom det protokoll som beskrivs innebär fastställandet av vävnader omedelbart efter dissektion, med retas inträffar därefter. Alla isolerade ägg kammare utan underskrifter av aforementioned skador kan anses normalt. Mekaniska skador kan resultera från dissekering kan också leda till förlust av GFP, vilket ger falska GFP-negativa kloner 16, och kan också ge upphov till ökad färgämne inkorporering. Med tanke på att de nedärvda celler som bor inuti ägget kamrarna är normalt inte permeabla för de levande mitokondriella färgämnen (figur 6 och 7), kan den förbättrade mitokondrie färgning av Drosophila nedärvda celler resulterar från en ökning i permeabiliteten hos den skadade / döende vävnad; en sådan artefakt inträffar med mito-ROS färgämne (** i fig 9C och hela ovariole i Figur 9D), såväl som med andra levande mitokondriella fläckar (ej visad). Förlusten av UbiGFP i figur 9D (*) kan också vara resultatet av skador som orsakats en flackare ägg kamrarna. Även om andra ägg kamrarna i den skadade ovariole kan förbli giltiga och artefakt fri (# i figur 9C

Tid känslighet: När det gäller levande ex vivo mikroskopi, bör uppgifterna erhållas inom 15 minuter av vävnad montering; I annat fall kan de experimentella resultaten att påverkas av förändringar av fysiologi på grund av den efterföljande död av vävnaden. Ibland, beroende på lasereffekt och andra inläsningsparametrarna, 10 mikroliter av monteringsmedium kan avdunsta snabbare än 15 minuter. Detekteringen av den mitokondriella cyklin E pool genom sam-immunfärgning kräver minimeringen av dissekering tid (sannolikt på grund av den transienta naturen hos mitochondRial cyklin E pool som upprätthålls av aktiv mitokondrie andning 12). En märkbar mitokondriell cyklin E poolen var också inte observerats med Permeabilization gånger mindre än 30 minuter.

FLIP: Rörelsen hos varje ägg kammaren under granskning under FLIP tidsförloppet kan leda till artefaktuella analyser och därmed måste uteslutas. Användningen av varje levande mitokondriella färgämnen eller TMRE rekommenderas inte i en FLIP experiment eftersom inkorporering av främmande färgämnet kan förändra den mitokondriella kontinuitet och därmed leda till artefaktuella resultat.

Drosophila crossing strategi: Tvär reciproka till den som beskrivs här (där hanar bär Drp1 mutanta allelen används) ger inte många avkommor, sannolikt på grund av en oidentifierad inverkan Drp1 förtryck i de heterozygota manliga föräldrar.

Tolkning av klon data: Alla GF-negativa kloner detekteras i kontrolläggstockarnaisolerad från föräldra Drosophila uttrycka UbiGFP skulle tyda artefaktuella falskt negativa kloner, sannolikt genereras på grund av GFP skada som orsakats av skador under dissektionen 16. Dock bör antalet GFP-negativa kloner i värme chockade avkomma av korset vara betydligt högre än någon falskt negativa kloner ses i kontrollerna. Klonerna genererade i Drosophila follikelstimulerande cellskiktet av den beskrivna mitotisk rekombination baserad strategi kan uppstå från de mitotiska follikelstimulerande stamceller (stamcellskloner) eller från de mitotiska icke-stamceller follikelstimulerande celler (transienta kloner). För stamcellskloner, bör de experimentella analyser utföras endast 10 dagar efter värmechock, när ägget kammare med gående kloner har redan lagts. För transienta kloner, bör analyserna göras inom 6 dagar efter värmechock, med follikel-cellkloner av ovarioles utan någon follikel-cellklon i germarium.

Ändringar och felsökning

Samtidigt som man bedömer mitokondriell potential per viktenhet med hjälp av den beskrivna metoden, måste man vara medveten om potentiella artefakter som följer av mikroskop optik eller mitokondriella färgämneskombinationer. Varje region som visar en försvagad signal från den totala mitokondriella fläcken och en jämförelsevis förhöjd TMRE signalen (figur 5A, *) kan uppstå på grund av fluorescensresonansenergiöverföring (FRET) mellan färgämnena 8 eller på grund av olika optiska egenskaper hos den röda (TMRE) och grönt (total mitokondriell färgämne) lysrör, med tanke på en fast hål storlek i förvärvs installationen. FRET relaterade artefakt skulle kunna undvikas genom att minska färgämneskoncentrationer, om möjligt, medan kvantitativa analyser kan utföras på projektioner av 2 - 3 konsekutiva optiska skivor för att undvika den optiska artefakt. Dessutom, om en fluorescerande signal detekteras i överhörning och tvär excitationkanaler, måste lasern och detektor inställningarna justeras för att minimera signalen i dessa kanaler, vilket förväntas minska den fluorescerande signalen i de optimala kanaler.

Laserinducerad skadade från UPPREPANDE fotoblekning kan orsaka mitokondriella fragmentering och därmed orsaka mitokondrie diskontinuitet förhindrar en framgångsrik FLIP. Misstänkt fragmentering av mitokondrier under utförandet av FLIP protokollet kan identifieras genom att förvärva högre upplösning med en reducerad hål (och öka detektorförstärkning). Om fragmentering av mitokondrier är synligt märkt under utförandet av FLIP protokollet måste kraften i bleknings laser sänkas och / eller intervallet mellan konsekutiva blekmedel måste ökas. Om det finns övergripande blekning under tidsförloppet för FLIP experimentet (signal från den gula ROI i figur 3B och C), måste avsökningslaser justeras till en nivåsom gör att minimal eller ingen övergripande fotoblekning.

För att undvika den potentiella artefakt på grund av skada-inducerad förlust av GFP, kan GFP-positiva kloner införas med användning av den MARCM strategi, efter den beskrivna värmechocksprotokoll. Här, den lämpliga Drosophila som skall användas för korset är jungfru kvinnliga drpKG03815 FRT40A / CYO X male GAL80 FRT 40A / cyo; tub-Gal4, UAS-CD8GFP / TM6 9. Den raka vingar avkomma bör användas för klon generation med hjälp av värmechock (som beskrivs i steg 6).

Begränsningar av tekniken

A) Medan follikelcellerna bor på ytan av levande Drosophila ägg kammare infoga mitokondriella färgnings färgämnen, de könsceller celler inuti ägget kammaren inte gör det; germline av de yngre stadierna färgas svagt (figur 5 och 6). B) Den levande ex vivo tissue mikroskopi måste utföras inom 15 minuter av slutförandet av färgning på äggstockarna som isolerats från individ Drosophila, en i taget. Eftersom experimentella grupper ska behandlas och avbildas på samma dag, den totala tid det tar att erhålla statistiskt signifikant data från levande ex vivo vävnads mikroskopi från olika experimentella grupper är rimligt längre än de som erhålls från fasta vävnader. C) Vi noterade att den mito-ROS fläcken inte var mycket stabila i ex vivo Drosophila vävnad, sannolikt på grund av den transienta naturen hos ROS analyt den detekterar 17,15, vilket kan ligga bakom den bristande detektering av signalen från all Drp1 null kloner. Men någon biologisk relevans variationen i Mito-ROS färgning i Drp1 null celler / kloner kan inte uteslutas och måste undersökas ytterligare. Observera att den positiva signalen från Mito-ROS fläcken inte bara kan återspegla förbättrad superoxid, men också den förbättrade mitochondrial eller cellular oxidativ miljö 15. D) Den totala mitokondriella fläcken kan inte användas för GFP-negativa eller GFP-positiva klon experiment, eftersom det fluorescerande spektrat av denna mitokondriella fläcken och GFP är oskiljbara. E) Den FLIP experiment som syftar till att analysera mitokondrie matrisen kontinuitet skulle kräva bildtagning med ett öppet hål som omfattar upplösning av mitokondriestrukturer.

Betydelsen av tekniken med avseende på befintliga / alternativa metoder

Studera den mitokondriella struktur och funktion relation är avgörande för en grundlig förståelse av de regulatoriska mekanismerna för mitokondriell funktion. Eftersom mitokondriella defekter i hög grad bidra till olika sjukdomar, bland annat diabetes, cancer, Parkinsons sjukdom, en detaljerad förståelse av den mitokondriella modus operandi håller löftet om facilitating utvecklingen mitokondrier riktade terapeutiska strategier. Live-cell mikroskopi är ett oumbärligt verktyg för att studera den mitokondriella struktur och funktion relation. De flesta av dessa studier har begränsats till isolerade celler. Studiet av mitokondriell struktur och funktion har utökats till att leva Drosophila vävnad i ett ex vivo inställning 9. Den beskrivna protokollet av detta och relaterade studier kommer att leda till en förståelse av mitokondriell struktur och funktion i levande Drosophila äggstockar, ex vivo, så att en förståelse av mitokondrier i en fysiologiskt sammanhang. Detta ex vivo tillvägagångssätt har betydande fördelar jämfört med in vitro-studier, eftersom regleringen av metabola och energiska egenskaperna hos mitokondrier i en given cell är till stor del beroende av näringstillgång och lämplig signalering i fysiologiskt sammanhang av cellerna.

Genetisk manipulation av mitochondrial struktur genom att undertrycka den mitokondriella fission protein Drp1 avreglerar cellcykeln modulatorn cyklin E och påverkar utvecklingen av Drosophila äggblåsa cellagret 9,12. Här ingår protokollet en beskrivning av hur man introducerar funktionellt null kloner av Drp1 i Drosophila äggstockarna att studera mitokondriella struktur och funktion relation. En ny pool av mitokondriell cyklin E på däggdjursceller, liksom Drosophila follikelstimulerande cellskiktet 12, har framgångsrikt upptäckt, vilket sannolikt ligger bakom den rapporterade cyklin E reglering av mitokondrier 18. Här demonstrerar manuskriptet en metod för att detektera den nya mitokondriella cyklin E pool genom sam-immunfärgning fast Drosophila äggstockar för dCyclinE och en mitokondriell markör (ATP-B).

Framtida tillämpningar eller riktningar efter behärska denna teknik

given thatt Drosophila melanogaster är en kraftfull genetisk modellsystem, våra beskrivna metoder förväntas avsevärt bidra till förståelsen av den genetiska grunden för mitokondriell struktur och funktion relation i hälsa och sjukdom. Drosophila har använts i stor utsträckning för att locka fram de genetiska interaktioner som leder till tumörbildning 19. Förmågan hos generering av kloner i Drosophila epitelceller follikelstimulerande cellskiktet tillåter att studera interaktionen mellan mitokondrier och onkogener eller tumörsuppressorer i enskilda tumörframkallande kloner i en in vivo och ex vivo installationen. De beskrivna metoderna kan användas för att studera regleringen av mitokondriell struktur och funktion relation på äggstockarna som isolerats från lämplig mutant Drosophila. De beskrivna metoderna kan förlängas ytterligare för att studera de direkta effekterna av olika näringsämnen och tillväxtfaktor signalering på mitokondriell struktur och funktion genom exogenous tillsats av lämpliga näringsämnen och / eller tillväxtfaktorer i ex vivo bildalstringsmediumet. De beskrivna metoderna kan på lämpligt sätt modifieras och utnyttjas i andra isolerade Drosophila vävnader, liksom larv imaginal skivor, som har använts i stor utsträckning för att studera signaltransduktionsvägar i sjukdomar som cancer 20,21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Grace's Media (Insect Dissecting Medium) Fisher Scientific 30611031-2
41 Paraformaldehyde AQ Electronic Microscopy Sciences 50-259-99
Mitotracker Green (overall mitochondrial stain) Life Technologies m7514 Reconstitute and Aliquot
Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate Sigma Aldrich 87917-25MG Reconstitute and Aliquot
MitoSox (Mito-Ros stain) Life Technologies m36008 Reconstitute and Aliquot
PolyLysine MP Biomedicals ICN15017625
Fly Vials Fisher Scientific AS-515
Fly Conicals Fisher Scientific AS-355
Fly Vial Flugs Fisher Scientific AS273
Fly Conical Flugs Fisher Scientific AS 277
Jazzmix Drosophila food (Drosophila food) Fisher Scientific AS153
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A9647-50G
Cyclin E Antibody (d-300) Santa Cruz sc- 33748
ATPB antibody [3D5] - Mitochondrial Marker AbCam ab14730
Cy3 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 115-165-146
Cy5 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 111-175-144
Hoechst Fisher Scientific H3570
VectaShield Fisher Scientific H100
Azer Scientific EverMark Select Microscope Slides Fisher Scientific 22-026-252
Microscope Cover Glass Fisher Scientific 12-542-B
Mat Tek Corp Glass Bottom Mircrowell Dish Fisher Scientific P35G-0-14-C
Active Dried Yeast Fisher Scientific ICN10140001
Confocal Microscope Carl Zeiss LSM 700
Dumont #5 Forceps Fine Science Technologies 11251-20
Moria Nickel Plated Pin Holder Fine Science Technologies 26016-12
Minutien Pins Fine Science Technologies 26002-15
MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 ) Bloomington Stock Center 7194
Fly Pad Fly stuff 59-118
Blowgun Fly stuff 54-104
Blowgun needle Flystuff 54-119
Dissecting Microscope Carl Zeiss Stemi 2000
Analyses software Carl Zeiss Zen 
Analyses software Open source Image J
Research Macro Zoom Microscope Olympus MVX10
QICAM Fast 1394 Cooled Digital Camera, 12-bit, Mono  QImaging QIC-F-M-12-C
QCapture Pro 5.1 QImaging

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148, (6), 1145-1159 (2012).
  2. Youle, R. J., van der Bliek, A. M. Mitochondrial fission, fusion, and stress. Science. 337, (6098), 1062-1065 (2012).
  3. Mitra, K. Mitochondrial fission-fusion as an emerging key regulator of cell proliferation and differentiation. Bioessays. (2013).
  4. Kageyama, Y., Zhang, Z., Sesaki, H. Mitochondrial division: molecular machinery and physiological functions. Curr Opin Cell Biol. 23, (4), 427-434 (2011).
  5. Chen, H., Chan, D. C. Physiological functions of mitochondrial fusion. Ann N Y Acad Sci. 1201, 21-25 (2010).
  6. Liesa, M., Shirihai, O. S. Mitochondrial dynamics in the regulation of nutrient utilization and energy expenditure. Cell Metab. 17, (4), 491-506 (2013).
  7. Hoppins, S. The regulation of mitochondrial dynamics. Curr Opin Cell Biol. 29, 46-52 (2014).
  8. Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. Chapter 4, Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches. Curr Protoc Cell Biol. Chapter. 21-21 (2010).
  9. Mitra, K., Rikhy, R., Lilly, M., Lippincott-Schwartz, J. DRP1-dependent mitochondrial fission initiates follicle cell differentiation during Drosophila oogenesis. J Cell Biol. 197, (4), 487-497 (2012).
  10. Klusza, S., Deng, W. M. At the crossroads of differentiation and proliferation: precise control of cell-cycle changes by multiple signaling pathways in Drosophila follicle cells. Bioessays. 33, (2), 124-134 (2011).
  11. Sahai-Hernandez, P., Castanieto, A., Nystul, T. G. Drosophila models of epithelial stem cells and their niches. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, (3), 447-457 (2012).
  12. Parker, D. J., et al. A new mitochondrial pool of cyclin E, regulated by Drp1, is linked to cell-density-dependent cell proliferation. J Cell Sci. 128, (22), 4171-4182 (2015).
  13. Mitra, K., Wunder, C., Roysam, B., Lin, G., Lippincott-Schwartz, J. A hyperfused mitochondrial state achieved at G1-S regulates cyclin E buildup and entry into S phase. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (29), 11960-11965 (2009).
  14. Shidara, Y., Hollenbeck, P. J. Defects in mitochondrial axonal transport and membrane potential without increased reactive oxygen species production in a Drosophila model of Friedreich ataxia. J Neurosci. 30, (34), 11369-11378 (2010).
  15. Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radic Biol Med. 48, (8), 983-1001 (2010).
  16. Haack, T., Bergstralh, D. T., St Johnston, D. Damage to the Drosophila follicle cell epithelium produces "false clones" with apparent polarity phenotypes. Biol Open. 2, (12), 1313-1320 (2013).
  17. Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417, (1), 1-13 (2009).
  18. Mandal, S., Guptan, P., Owusu-Ansah, E., Banerjee, U. Mitochondrial regulation of cell cycle progression during development as revealed by the tenured mutation in Drosophila. Dev Cell. 9, (6), 843-854 (2005).
  19. Tipping, M., Perrimon, N. Drosophila as a model for context-dependent tumorigenesis. J Cell Physiol. 229, (1), 27-33 (2014).
  20. Herranz, H., Eichenlaub, T., Cohen, S. M. Cancer in Drosophila: Imaginal Discs as a Model for Epithelial Tumor Formation. Curr Top Dev Biol. 116, 181-199 (2016).
  21. Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63, (2), 411-436 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics