Étudier mitochondrial Structure et fonction

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Parker, D. J., Moran, A., Mitra, K. Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries. J. Vis. Exp. (119), e54989, doi:10.3791/54989 (2017).

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Abstract

Introduction

Les mitochondries sont classiquement décrites comme la centrale cellulaire, car ils sont les principaux sièges de la production d'énergie dans les cellules différenciées. En outre, les mitochondries jouent un rôle essentiel dans le métabolisme, la génération de chaleur, une modification lipidique, le calcium et l' homéostasie redox, l'orchestration des processus de signalisation cellulaire, etc. 1. Les mitochondries jouent également un rôle actif dans l'induction de la mort cellulaire 2, ainsi que dans la régulation du cycle cellulaire 3. Cette multi-fonctionnalité soulève les questions fondamentales suivantes: a) comment les mitochondries remplissent toutes ces fonctions simultanément et b) sont là piscines mitochondriaux spécifiques ou sous-zones qui sont spécialisés pour des fonctions distinctes? Dans ce contexte, il est important de noter que les mitochondries multifonctionnels sont dynamiques dans leur forme, la taille et la structure au sein des cellules individuelles et que la forme à l'état stable des mitochondries peuvent varier entre les types de cellules. Des décennies de recherche de divers laboratoirepatronages suggèrent que la modification de la forme mitochondriale, la taille et la structure, la dynamique collectivement appelées mitochondries, est crucial pour le maintien de diverses fonctions mitochondriales 4,5,6. Ces résultats soulèvent la possibilité que les mitochondries peuvent accomplir leur multi-fonctionnalité en raison de leur dynamisme structurel.

Des efforts considérables sont en cours pour comprendre la relation structure-fonction mitochondriale. Le dynamisme de la structure mitochondriale est principalement maintenu par leur aptitude à subir une fission et de fusion des événements les uns avec les autres. Fission de grandes mitochondries les convertit en éléments mitochondriales plus petits, tandis que la fusion entre deux mitochondries plus petites les fusionne en un élément mitochondrial plus grande 7. En outre, la fusion transitoire de deux mitochondries peut se produire pour permettre le mélange de leur contenu. La fission et de fusion événements des membranes mitochondriales interne et externe sont soigneusement régies par les spécificationstib ensembles de protéines. Le mécanisme de base de fission se compose de protéine apparentée à la dynamine-1 (DRP1), qui est recruté dans le cytosol vers la mitochondrie par son interaction avec certains de bonne protéines mitochondriales bonne (par exemple Fis1 ou Mff1), tandis que la fonction DRP1 peut également être régulée par d' autres protéines sur la surface mitochondriale 4. Bien que DRP1 agit sur la membrane externe, ses capacités de fission impact sur la membrane interne aussi bien. L'orchestration de la fission des membranes mitochondriales externes et internes ne sont pas bien compris. D'un autre côté, la fusion de la membrane interne est régie au coeur par les activités de Opa1, tandis que mitofusins régissent la fusion de la membrane externe 5. Le solde des produits de fission et fusion contrecarrant événements de mitochondries dicter la forme mitochondriale à l'état stable dans une cellule. Par exemple, la répression de la fission mitochondriale se traduirait par une fusion complète et sans opposition, alors que la sur-activité des mitochondriesl fission se traduirait par une fragmentation des mitochondries 3.

L'étude de la relation structure-fonction mitochondriale implique principalement deux approches complémentaires: a) l'analyse des phénotypes cellulaires et organismales après la manipulation génétique des protéines fission / fusion mitochondriales et b) des évaluations directes de la structure et la fonction mitochondriale. Il est à noter que les analyses génétiques ne peuvent pas toujours révéler la fonctionnalité directe de la molécule à portée de main (dans ce cas, les protéines fission / fusion mitochondriales), que les phénotypes peuvent survenir en raison d'effets secondaires. Par conséquent, il est de la plus haute importance pour développer et utiliser des outils pour étudier la structure et la fonction mitochondriale directement. Toute évaluation de la structure mitochondriale implique divers outils de microscopie. L'utilisation de la microscopie à fluorescence de cellules vivantes a considérablement avancé les études de la dynamique mitochondriale, car le dynamisme mitochondrial peut être contrôlé à la fois qualitativement et quantitativement en utilisant les outils et techniques 8 de microscopie par fluorescence appropriés. Outils de microscopie par fluorescence ont été développées pour étudier la structure et la fonction mitochondriale dans les tissus vivants et fixes Drosophila melanogaster, élucidant l'importance du dynamisme mitochondriale in vivo 9. Ceux - ci et des procédés associés sont décrits ici, dans le but d'étudier la structure et la fonction mitochondriale dans l'ovaire chez la drosophile.

L'ovaire chez la drosophile est constituée de lignées germinales et somatiques, qui résultent de leurs cellules souches adultes respectives qui se trouvent dans le germarium 10,11. Seize cellules germinales syncytial (GCS) s'encapsulées par les cellules folliculaires somatiques (FC) pour former des chambres d'œufs individuels qui émergent de l'germarium (Figure 1). L'un des 16 glucocorticoïdes get engagé à devenir un ovocyte, et les 15 restants GCS développent dans les cellules nourricières qui soutiennent la croissance de la chambre de l'ovocyte, Ce qui facilite la maturation de l'œuf avant qu'elle ne soit déposée. La majorité des FC subissent 9 séries de divisions mitotiques avant qu'ils ne quittent le cycle cellulaire mitotique pour différencier terminale dans une couche de cellules épithéliales motif constitué par des cellules antérieure du follicule (AFC), les cellules du follicule postérieur (PFC) et principales cellules du corps (CBM) . Les chambres d'œufs consécutives sont reliées par des cellules de tige, qui sont des cellules qui sont également dérivées des FC au début du développement différenciés. Forme mitochondriale régulée par mitochondrial DRP1 protéine de fission est activement impliquée dans le processus de différenciation au cours du développement normal de la FC couche ovarienne Drosophila 9,12. Les méthodes utilisées dans ces études pour déterminer l'implication de la drosophile DRP1 développement de la couche de cellules folliculaires sont décrites ici.

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Protocol

1. Préparation de la drosophile (les outils nécessaires sont représentés sur la figure 2A)

  1. Pour toutes les expériences décrites, recueillir la drosophile (maintenue à la température ambiante, soit 25 ° C) dans les 5 jours de l' éclosion et les placer dans un flacon rempli de 5-7 ml de Drosophila alimentaire (voir tableau des matériaux), avec pas plus de 25 mouches dans chaque flacon; maintenir un sex-ratio de 2: 1.
  2. Saupoudrer une petite quantité de levure granulé pour stimuler la production d'œufs de Drosophila. Effectuez la manipulation expérimentale dans les 2 - 4 jours.

2. Dissection de Drosophila Ovaires (les outils nécessaires sont représentés sur la figure 2A)

  1. Moyen d'insectes disséquant chaud (voir tableau des matériaux) à la température ambiante, 25 ° C. Remplissez trois puits d'un plat de dissection de verre de huit puits, avec 200 pi de dans chaque milieu ainsi.
  2. Anesthetize Drosophila avec CO drosophile à un moment où effectuer la microscopie en direct.
  3. Tout en regardant à travers l'oculaire du microscope de dissection, séparer le thorax de l'abdomen en utilisant deux paires de pinces. Utilisation de la pince, transférer soigneusement les abdomens dans le deuxième puits du plat.
  4. Utilisez une paire de pinces pour maintenir l'abdomen à l'extrémité postérieure, et lentement pousser les ovaires out (ainsi que les autres contenus abdominaux) avec l'autre paire de pinces. Si cette tentative échoue, retirez avec précaution l'exosquelette abdominale en insérant la pince dans l'extrémité antérieure pour libérer les ovaires.
  5. Utilisation de la pince, tenir un ovaire individu par l'extrémité postérieure opaque (ie, les oeufs jaune-rempli, stade avancé) et déplacez - le soigneusement à la troisième puits du platpour les taquineries de la traiter pour la microscopie en direct (étape 3) ou pour la fixation d'effectuer immunocoloration (étape 7).
  6. taquiner avec précaution la gaine de protection autour des ovaires en balayant une aiguille de taquineries légèrement de la partie postérieure de l'extrémité antérieure de chaque ovaire tout en le tenant par l'extrémité postérieure avec une paire de pinces.
    REMARQUE: Pour minimiser les dommages pendant les taquineries, pliez la pointe de l' aiguille et de zoomer sur chaque ovaire en augmentant le grossissement du microscope (figure 2A). Teasing devrait être suffisant pour briser la gaine efficace, mais elle doit également être fait avec soin pour préserver l'intégrité des ovarioles.

3. Préparation de Microscopie en direct des tissus

REMARQUE: Les outils nécessaires sont représentés sur la figure 2A.

  1. Avant Drosophila dissection, préparer polyl-Lysine chambres revêtues. A cette fin, placer deux gouttes de 20 pi de polyl-Lysine (0,1 mg / ml) sur la coverglass (14 mm, n ° 0) d'une boîte de Pétri à fond de verre (35 mm) à une distance raisonnable les uns des autres afin d'éviter la fusion des gouttes. Sécher à l'air les plaques pendant 1 h à 37 ° C et marquer les bords du film polyl-Lysine blanc sur la face inférieure de la plaque avec un marqueur effaçable.
    NOTE: Le polyl-Lysine revêtu chambres peuvent être conservés à 4 ° C pendant une semaine. Si l'on utilise une chambre revêtue au préalable, amener à la température ambiante avant de commencer la dissection drosophile.
  2. Définissez les paramètres de numérisation sur le microscope confocal à faire en sorte que l'échantillon peut être reproduite immédiatement après l'achèvement de la dissection et de montage, comme ci-dessous.
  3. Placer un disséqués et taquiné ovaire (étape 2 ci-dessous et colorées, le cas échéant, après l'étape 5) sur une région polyl-Lysine revêtu marqué et la propagation de l'ovaire avec l'aiguille de teasing pour séparer les ovarioles. Déposer une goutte de 10 pi de milieu de dissection des insectes au-dessus de l'ovaire, en veillant à couvrir til zone entière polyl-Lysine-enduit. Couvrir le plat de Pétri.
  4. exécuter immédiatement la microscopie confocale de l'échantillon monté à température ambiante.
    NOTE: Une seule drosophile doit être disséqué, traité et imagée à la fois. En outre, la microscopie ne doit pas être réalisée à 37 ° C, ce qui imitent un environnement de choc thermique pour les tissus de Drosophila.

4. Fluorescence Perte Dans Photoblanchiment (FLIP) Dosage pour évaluer mitochondrial Matrice de continuité

REMARQUE: la continuité de la matrice mitochondriale dans une structure mitochondriale fusionnée est créée après la fusion complète des membranes mitochondriales interne et externe suivant une progression à travers les étapes intermédiaires. Fission des mitochondries peut suivre les mêmes étapes , mais dans le sens inverse (figure 3A). FLIP est une méthode semi-quantitative time-lapse en fonction microscopie qui peut être utilisé pour évaluer la continuité de la matrice mitochondriale dans laétat final fusionné ex vivo mitochondries (étapes 3 et 4 sur la figure 3A) dans les ovaires de Drosophila vivantes 9. Le dosage de FLIP est réalisée comme une petite région d'intérêt (ROI) des mitochondries exprimant une molécule fluorescente dans la matrice mitochondriale qui est décolorées à intervalles réguliers (FLIP ROI sur la figure 3A). En conséquence, toute région mitochondrial environnante qui est continue avec le ROI FLIP (ROI expérimentale sur la figure 3A) va perdre le signal en raison de l'échange de molécules dans la matrice mitochondriale continue. Les expériences ont démontré ici FLIP sont réalisées sur la drosophile transgénique exprimant mitoYFP, qui contient la séquence d'adressage mitochondrial de la sous - unité VIII de la cytochrome oxydase humaine marqués avec YFP pour cibler à la matrice mitochondriale sous une forme librement diffusible. Une expérience similaire peut également être réalisée avec le transgène mito-UPAEP mito-GFP, comme indiqué précédemment <sup> 9. Un protocole FLIP similaire peut être utilisé avec une sonde ciblée vers l'espace inter-membrane mitochondriale pour être en mesure de détecter la continuité résultant de la fusion de l'extérieur , mais pas la membrane mitochondriale interne (étape 2 sur la figure 3A).

  1. Ouvrez le logiciel d'acquisition d'image sur le microscope confocal et définir les paramètres de numérisation appropriés dans l'onglet "Acquisition" (tableau 1). Cochez la case "séries temporelles", "blanchissement" et "Régions" boîtes pour ouvrir les différents onglets. Mettez les valeurs des paramètres d'acquisition appropriées dans chaque onglet (tableau 1).
    NOTE: Le sténopé devrait être laissée ouverte, car cette expérience est conçue pour surveiller le signal global de l' ensemble de la population mitochondriale dans des cellules individuelles.
  2. Utilisez l'oculaire pour localiser rapidement le champ d'intérêt dans le tissu vivant monté.
    REMARQUE: Sélectionnez les ovarioles qui sont bien réparties sur le verre-bottomed plat, car la microscopie confocale ne peut pas être effectuée sur ovarioles flottantes.
  3. Cliquez sur "live" pour acquérir une image en direct du champ d'intérêt choisi. Cliquez sur "stop" pour arrêter le balayage en direct.
  4. Si nécessaire, ajuster les paramètres d'acquisition de telle sorte que le signal fluorescent détecté est en dessous des niveaux de saturation (indiquées par l'absence de pixels rouges lorsque l'option «indicateur de gamme" est cochée), avec l'arrière-plan défini comme indiqué en ajustant les valeurs de décalage.
  5. Dessinez un petit retour sur investissement en utilisant l'outil de dessin de Bézier de l'onglet «Régions» pour délimiter la zone de photoblanchiment sur l'image acquise par balayage en direct.
    NOTE: La taille du ROI devrait être d' environ 20-50% du signal mitochondrial fluorescente totale dans la cellule.
  6. Effectuer l'acquisition de l'image en cliquant sur "commencer l'expérience."
  7. Quantifier l'intensité de fluorescence en utilisant le propriétaire ou le logiciel open-source (voir MatériauxTableau). Notez le signal moyen du retour sur investissement lorsque le blanchiment répétitif est ciblé (FLIP); ROIs où le blanchiment n'a pas été effectuée dans la même cellule (expérimental); le retour sur investissement d'une autre cellule écrus dans le même champ de vision, pour l'évaluation de blanchiment globale pendant la période expérimentale (blanchissement); et le retour sur investissement sur la zone de fond (arrière-plan). Soustraire le signal d'arrière-plan moyenne obtenue à partir du signal moyen dans les autres régions d'intérêt. Normaliser le signal fluorescent avec le signal initial pré-blanchiment pour la cellule respective.
  8. Tracer les données normalisées en utilisant un logiciel de traçage standard.

5. Coloration en direct avec Fluorescent mitochondrial Colorants

NOTE: L'état d' équilibre structure et potentiel mitochondrial peuvent être évalués en utilisant des colorants qui intègrent spécifiquement dans les mitochondries dans les cellules vivantes et de tissus. Ovaires vivants Drosophila peuvent être colorées ex vivo avec mitochondrial fluorescenttaches de visualiser les mitochondries, pour évaluer les espèces réactives de l'oxygène mitochondriales (mito-ROS), et d'évaluer le potentiel mitochondrial par unité de masse. Ceci peut être accompli par co-coloration avec l'ester mitochondriale potentiométrique colorant tétraméthylrhodamine d'éthyle (TMRE) et un colorant direct mitochondriale compatible représentant la masse mitochondriale (voir le tableau des matériaux pour les colorants spécifiques).

  1. Diluer le stock des taches d'insectes chaud dissection moyen des concentrations de travail finales: tache mitochondrial, 250 nM; TMRE, 50 nM; et mito-ROS tache, 5 uM.
  2. Après dissection et taquiner les ovaires après l'étape 2, placer les ovaires dans 200 ul d'une solution de coloration particulière dans un puits d'une plaque de dissection. Incuber pendant 10 min avec le plat couvert par un emballage approprié enveloppé avec du papier d'aluminium pour le protéger de la lumière. Laver les ovaires colorés en les déplaçant soigneusement avec une pince en 3 puits consécutifs containing milieu sans tache.
  3. Pour la co-coloration avec TMRE et la tache mitochondriale globale compatible, suivre le protocole ci-dessus pour tacher d'abord avec TMRE puis immédiatement avec la tache mitochondriale globale (sans étapes de lavage entre les deux).
  4. Monter les ovaires sur un plat à fond de verre enduit polyl-Lysine suite à l' étape 3 et se préparer pour la microscopie confocale avec les paramètres de numérisation appropriés (tableau 1), en suivant les étapes 4,2-4,4.
    NOTE: Le signal des colorants incorporés n'a pas duré lors d'une tentative de monter les échantillons colorés dans un milieu de montage.
  5. Cochez la case Z-sectionnant pour ouvrir l'onglet. Tournez la molette de mise au point vers le bas de l'échantillon pendant qu'il est en direct numérisé et cliquez sur "définir d'abord» pour définir la Z-partie la plus basse. Faites la même chose tout en déplaçant la roue de mise au point vers l'autre direction pour définir la section supérieure.
  6. Effectuer l'acquisition de l'image en cliquant sur "commencer l'expérience."
  7. Quantifier l'intensité de fluorescence de fond corrigée des ROIs pour le signal d'arrière-plan et les cellules individuelles (comme dans l'étape 4.7) et tracer les données en utilisant un logiciel de traçage.

6. Génération de DRP1 Null Mosaïques

NOTE: La stratégie clonal utilisé ici introduit la protéine fluorescente verte (GFP) séronégatifs clones nuls DRP1 en arrière - plan d'un, phénotypiquement de type sauvage fond GFP-positive qui est hétérozygote génotypique pour la mutation nulle DRP1 9. Choc induite par la cible de reconnaissance de flippase-flippase (FLP-FRT) médiée mitotique recombinaison site-spécifique de chaleur crée des clones homozygotes de l'allèle drpKG03815 fonctionnellement nul. Le génotype de la drosophile portant le mutant DRP1 est drpKG03815 FRT40A / CYO, alors que le génotype portant le FLP choc thermique induite (hsFLP) et le marqueur clonal UbiGFP est hsflp; nls-GFP ubiquitine (UbiGFP) FRT 40A / CYO. Le génotype de la SEprogéniture tionné de la croix entre les génotypes ci-dessus est hsFLP / +; drpKG03815 FRT40A / UbiGFPFRT40A.

  1. Synchroniser la drosophile pour la collecte vierge en les déplaçant dans de nouveaux flacons de nourriture fraîche tous les 2 à 3 jours. Surveiller les flacons de pupariating quotidiennement afin de recueillir des nouvelles femelles vierges.
  2. Collecter, curly-aile femelles vierges rouges aux yeux du génotype mutant DRP1 chaque jour, une fois le matin et une fois le soir, et les placer dans un flacon séparé. En parallèle, la collecte des hommes Drosophila avec des yeux rouges foncés et ailes droites portant hsflp et UbiGFP dans les 5 jours de l' éclosion.
  3. Mettre en place une croix en ajoutant les mâles aux femelles vierges avec un sex-ratio de 2: 1.
  4. Saupoudrer une petite quantité de levure granulé pour stimuler la production d'œufs.
    REMARQUE: déplacer avec précaution la drosophile à un nouveau flacon de médias tous les 2 à 3 jours pour augmenter la quantité de descendants et de réduire l' encombrement du flacon.
  5. Unesthetize, trier et collecter directement à ailes, progéniture femelle aux yeux rouges dans les 5 jours de l'éclosion.
  6. Pour le choc thermique, placez le Drosophila collecté dans des flacons vides avec une petite quantité de levure granulé et un petit, doux essuyez (pour absorber l'humidité pendant le choc thermique). Placer le flacon avec la drosophile dans un bain-marie à 38 ° C pendant 1 h, pour générer des clones de cellules principalement folliculaires et à 37 ° C pendant 1 heure , deux fois par jour (permettant au moins 5 h entre les chocs 2 de la chaleur) pendant 2 jours consécutifs , pour générer à la fois de la lignée germinale et les clones de cellules des follicules.
    REMARQUE: Assurez - vous que le flacon est complètement immergé dans l'eau jusqu'au niveau du bouchon.
  7. Le choc thermique peut rendre immobile la drosophile. Laisser la drosophile de choc thermique pour récupérer pendant 1 h à température ambiante quand ils deviennent mobiles à nouveau.
  8. Ajouter les mâles vers les femelles dans la même proportion que dans la croix, et les déplacer vers des flacons frais avec medium saupoudrée avec une petite quantité de levure granulée. Maintenir la drosophile pendant au moins 5 jours.
  9. Disséquer les ovaires comme nécessaire pour une expérience en direct ou fixe.
    NOTE: Ovaires isolés de la drosophile parentale exprimant UbiGFP devraient être utilisés comme témoins négatifs pour confirmer l'induction efficace des clones GFP-négative par le choc thermique.

7. Co-immunocoloration pour la cycline E et mitochondries

NOTE: Pour détecter la drosophile cycline E (dCyclinE), nous avons utilisé un anticorps obtenu dans le commerce soulevé spécifiquement contre dCyclinE 9 (voir tableau des matériaux). En tant que marqueur mitochondrial, nous avons utilisé un anticorps dirigé contre l' ATP-B (une sous - unité du complexe ATP synthase mitochondriale) 9.

  1. Chaud 4% de paraformaldehyde (PFA) à la température ambiante, 25 ° C. Prudence! Paraformaldéhyde est toxique.
    NOTE: Après ouverturel'ampoule, PFA doit être conservé à 4 ° C et utilisée dans les 7 jours. En effet, le stockage de PFA peut permettre l'oxydation du methanol, ce qui modifie considérablement les membranes mitochondriales lors de la fixation, même si elles sont présentes en quantités infimes.
  2. Immédiatement après la dissection, fixer les ovaires disséqués en les plaçant dans 200 ul de frais PFA dans un puits d'un plat de dissection de verre (sans les taquineries). Gardez le plat dans une hotte pendant 15 min. Laver les ovaires fixes en les déplaçant soigneusement avec la pince dans 3 puits successifs, chacun contenant 200 pi de 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
    NOTE: L'expérience peut être arrêté ici et les échantillons peuvent être laissés à 4 ° C pendant 1 jour.
  3. Tease les ovaires de manière plus approfondie dans du PBS (similaire à l'étape 2.6) Retirez délicatement la gaine fibreuse de protection qui peuvent entraver l'accès de l'antigène par l'anticorps.
  4. Perméabiliser les ovaires taquiné en les plaçant dans un tube microfuge de 500 ul de 0 fraîchement préparés.5% de PBS-Triton-X100 (PBS-TX) et incuber pendant 30 min tout en l'agitant à 25 tours par minute.
    NOTE: Au cours de la bascule, placez les tubes parallèles au mouvement de bascule; les placer perpendiculairement peut permettre au tissu à coller sur le bouchon des tubes, ce qui entraîne une perte tissulaire.
  5. Pour retirer le PBS-TX, placer les tubes à centrifuger dans un rack pour permettre au tissu de s'installer au fond des tubes. Inspecter visuellement et appuyez sur les tubes, si nécessaire, d'apporter tous les tissus flottants vers le bas. Aspirer soigneusement la solution à partir du haut, en veillant à ce que le tissu au niveau du fond des tubes reste intacte.
  6. Bloquer les ovaires par addition de 200 ul de 2% de sérum-albumine bovine (BSA) à 0,5% dissous dans du PBS-TX, et laisser incuber sur la bascule à la température ambiante pendant 1 h. Retirer l'agent de blocage en suivant l'étape 7.5.
  7. Ajouter des anticorps primaires dans 200 ul d'agent de blocage frais: anti-anticorps de lapin dCyclinE (1: 100) et anti-souris de l'ATP-B anticorps(1: 100). Incuber les tissus sur le basculeur pendant 2 h à température ambiante.
  8. Laver les ovaires avec du PBS-TX 3 fois pendant 15 min chacun, après l'étape 7.5.
  9. Ajouter 200 ul d'anticorps secondaires appropriés dans du PBS frais TX: anti-souris-Cy3 (1: 1000) et anti-lapin-CY5 (1: 500). Incuber sur le basculeur pendant 1 h à température ambiante.
  10. Laver les ovaires avec du PBS-TX 3 fois pendant 15 min chacun, après l'étape 7.5.
  11. Pour colorer l'ADN, ajouter Hoechst (1: 1000 dilution) pour le lavage final PBS-TX.
  12. Enfin, laissez le tissu dans 500 ul de PBS 1x.
  13. En utilisant une micropipette de 1 ml, enlever les ovaires immunocolorées du tube microfuge dans un nouveau puits d'un plat de dissection de verre contenant 200 pi de PBS.
  14. Ajouter une goutte de milieu de montage à base de glycérol sur une lame de verre et ajouter les ovaires immunocolorée un par un au support de montage.
    REMARQUE: Assurez - vous que les ovaires sont en effet transférés vers le milieu de montage. A défaut de le faire so mènera à la perte de tissu.
  15. Tout en regardant à travers le microscope de dissection, arrache délicatement les ovarioles transparents (jeunes stades) des chambres d'oeufs matures opaques à l'aide de l'aiguille taquin tout en maintenant la partie opaque de l'ovaire avec la pince. Retirez les chambres d'oeufs matures à partir du support de montage.
  16. Placer une lamelle (22 mm, n ° 1) sur la diapositive et appuyez légèrement pour faire en sorte que le moyen de montage est répartie uniformément en dessous.
    NOTE: En appuyant sur la lamelle assure également l'alignement correct du tissu le long de la lamelle. A défaut de le faire de façon optimale peut permettre aux petites étapes de flotter dans le milieu de montage, ce qui empêche la microscopie optimale de ces tissus.
  17. Air-sécher les échantillons pendant 15 minutes et sceller les bords de la lamelle soigneusement avec du vernis à ongles.
  18. Effectuer la microscopie confocale selon le besoin expérimental (tableau 1).

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Representative Results

Les procédés décrits peuvent être utilisés pour étudier la structure et la fonction mitochondriale dans les ovaires vivants et fixes de Drosophila (figure 2B). Pourvu quelques exemples de résultats escomptés obtenus avec les méthodes décrites.

Dissection de l'ovaire chez la drosophile: Lorsque disséqué en outre, les abdomens sectionnés (figure 3B) de l'ensemble de la drosophile (figure 3A) doivent libérer le contenu abdominal, comprenant 2 ovaires de chaque individu drosophile. Les ovaires intacts apparaissent sous la forme de forme ovale, les structures blanches (flèches sur la figure 3C et D) qui devraient idéalement restent attachées les unes aux autres par l' intermédiaire de la tige oviducte. Les ovarioles dans chaque ovaire doivent être maintenus ensemble par la gaine fibreuse (# en partie agrandie de la figure 3C), qui est éliminé btaquineries attention y (épaisseur de flèche sur la figure 3D, * indique un ovaire mal taquiné avec ovarioles détachés) pour exposer les ovarioles pour la coloration et la microscopie. Les ovaires libérés avec des tiges oviducte déchirés lors de la libération du contenu abdominal peuvent également être utilisés, à condition qu'ils ne soient pas endommagés autrement. Les ovaires endommagés (* dans la figure 3C) et d' autres contenus abdominaux (pointe de flèche dans la figure 3C) doivent être jetés.

La microscopie en direct de l'ovaire chez la drosophile: Ici, nous démontrons la technique FLIP et le chargement des colorants structurelles et fonctionnelles des mitochondries dans les ovaires chez la drosophile.

La technique de FLIP, appliquée précédemment pour évaluer la continuité mitochondrial dans les cellules folliculaires drosophile 9, il a été démontré ici dans les cellules nourricières ovariens de Drosophila transgénique (figure 4A). FLIP ciblée à l' un des nuages mitochondriaux associés aux cellules nourricières conduit à une perte du signal fluorescent à partir des régions d' intérêt bleu et blanc entourant le retour sur investissement FLIP rouge à moins de 200 s (figure 4B et C) supérieure à 50%; le signal provenant de la ROI vert est utilisé pour la correction d'arrière-plan. Le signal fluorescent du ROI jaune dans les autres cellules nourricières untargeted reste constante pendant ce laps de temps, ce qui signifie blanchiment globale minimale au cours du temps de l'expérience (figure 4B, et C). Aussi, voir la vidéo 1. Ce résultat indique que les mitochondriescellules infirmière ont fusionné leurs membranes externes et internes, illustrés dans les étapes 3 et 4 (figure 4A), tandis que les mitochondries dans les étapes 1 et 2 ne sont pas censés montrer toute perte de fluorescence dans ce laps de temps.

Il a été démontré précédemment qu'une mesure semi-quantitative de potentiel mitochondrial par unité de masse mitochondriale peut être évaluée par co-coloration avec le colorant potentiométrique TMRE et le colorant mitochondrial global qui reflète la masse mitochondriale 13. Ici, la même technique a été utilisée pour démontrer l'évaluation du potentiel mitochondrial par unité de masse de tissu ovarien en direct drosophile. La microscopie confocale d'ovaires de Drosophila vivantes colorées avec TMRE démontre une diminution du signal avec la profondeur du tissu (figure 5A). On prévoit que cette perte de signal fluorescent due à l'augmentation de la dispersion dans une plus grande profondeur de tissu pour se produire avec tout type de fluorophore avec une distance de travail donnée de l'objectif utilisé. Par conséquent, il est important de discerner la profondeur maximale du tissu dans lequel le fluorophore peut être détectée lors de l'imagerie de tissus vivants. Par exemple, vivre ovaires Drosophila colorées avec la tache mitochondriale globale (Mito) peut être imagée en utilisant la configuration du microscope décrit (tableau 1) dans une plage de 20 um de la lamelle, tandis que la profondeur imageable maximale diminue avec l' augmentation de la taille de la chambre d'oeuf (Figure 5B). Les réglages du microscope optimisés pour les taches mitochondriales détectent des signaux positifs dans les canaux de détection appropriés, tandis que les paramètres pour examiner tout signal diaphonie indue ou fluorophore cross-excitation expectedly détecté peu ou pas de signal (figure 6A). La co-coloration de TMRE avec le colorant mitochondrial global peut être utilisé à la fois qualitatif (figure 6B) et quantitative (figure 6C et D </ strong>) évaluations du potentiel mitochondrial par unité de masse dans les ovaires vivants drosophile. Par exemple, a) une analyse qualitative démontre que germarium drosophile présentant un potentiel mitochondrial plus élevée par unité de masse dans 2b stade où les cellules de follicules somatiques se sont posés pour encapsuler les cellules germinales (têtes de flèches sur la figure 6B) et b) Des analyses semi-quantitatives démontrent la différence de potentiel mitochondrial par unité de masse entre (étirement) AFCs et les CBM, analysé à partir d' une chambre d'oeuf étape 9 (Figure 6C). A noter que la quantification a été réalisée à partir de 2 tranches optiques différentes pour AFCs et MBC, selon leur plan de mise au point. L'utilisation de la sonde mito-ROS qui a été utilisé avec succès chez la drosophile 14 est mise en évidence dans les couches vivantes de Drosophila épithéliaux de l' ovaire de cellules de follicules, où les clones nuls fonctionnels de la protéine mitochondriale de fission Drp1were introduits. La plupart, but pas tous, des DRP1 clones de cellules du follicule nulle GFP-négative en direct présentent une coloration élevée pour mito-ROS (Figure 7A et B). Notez que bien un signal mitochondriale distinct n'a pas pu être détecté dans ce tissu, la concentration de la tache mito-ROS n'a pu être détectée dans la région nucléaire dans les cellules de follicules post-mitotiques de pointe, qui sont nettement plus grandes que les cellules de follicules en mitose (* sur la figure 7C). Cela peut se produire en raison de l'interaction de l' ADN nucléaire et le produit d'oxydation du colorant fluorescent de mito-ROS, qui est un dérivé de 15 éthidium.

La détection de la cycline E mitochondriale dans les cellules de Drosophila de follicules ovariens fixes: Il a été récemment démontré que les mitochondries peuvent réguler la molécule du cycle cellulaire cycline E par le recrutement à la surface mitochondriale dans des cellules de mammifère et la couche de cellules de Drosophila de follicules Drosophila de follicules 12. Ici, un exemple de localisation mitochondriale de la cycline E dans les cellules de follicules de Drosophila est démontrée en utilisant le protocole de co-immunocoloration décrit. Notez les niveaux élevés de dCyclinE dans les DRP1 clones nuls GFP-négative où le signal dCyclinE chevauche avec celle du signal ATP-B mitochondrial dans le germarium (figure 8A), bien que le signal ne peut pas être résolu en éléments mitochondriaux distincts avec la résolution limitée de la microscopie confocale. En outre, dans CBM post-mitotiques, les GFP-négatives DRP1 clones nuls ont à la fois des signaux de dCyclinE nucléaires et cytosoliques, ces derniers se chevauchent de manière significative avec le signal ATP-B, alors que les cellules positives pour la GFP de type sauvage ont seulement un signal de dCyclinE nucléaire (fig 8B).


Figure 1. Développement des oeufs Chambers drosophile. Dessin représentant un ovariole Drosophila constitué par une chaîne de développement des chambres d'oeuf, composées chacune d'un ovocyte et les cellules nourricières (germinale) encapsulées par la couche de cellules folliculaires (somatique). Les chambres d'œufs se développent à partir du germarium et se développent par étapes où les cellules folliculaires mitose deviennent post-mitotique. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Plan expérimental et préparation. (A) Les outils utilisés dans les méthodes décrites: A. Fly flacon; B. Insecte disséquant moyen; C. paraformaldéhyde; brosse D. Fly; E. Dissection plat; verre F. Cover; Tube G. microcentrifugeuse. plat H. verre à fond; slide I. verre; micropipette J. 1000 pi; K. micropipette 200 uL; L. micropipette 2,5 pi; M. Teasing aiguille avec une pointe recourbée (pointe est agrandie); forceps N. épais; forceps O. minces. (B) Un flux graphique schématique représentant les méthodes décrites. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Dissection de Drosophila Ovaires. (A) anesthésiés ensemble drosophile. (B) Severed Drosophila abdomens avec ou sans (*) le contenu abdominal. (C) Sortie Drosophila contenu abdominal, y compris les ovaires (flèches et *) et d' autres contenus(têtes de flèches); agrandissement de la région encadrée sur la droite mettant en évidence la partie antérieure (Ant) et postérieur (Post) se termine de la paire d'ovaires détenus par la tige oviducte, où les ovarioles sont détenus par la gaine fibreuse (#). (D) taquiné Drosophila ovaire (marquage flèche épaisse de manière appropriée et taquiné * marquage mal taquiné) par rapport à l' ovaire unteased (flèche fine). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. direct des tissus FLIP Assay. (A) Représentation schématique représentant les étapes de la mitochondrie fission / fusion, qui peut être testée par un essai de continuité mitochondriale en utilisant la méthode appropriée FLIP; dans ce cas, une sonde mito-YFP dans la matrice mitochondriale permet l'évaluaent de la continuité de la matrice mitochondriale. (B) Time-lapse microscopie in vivo d'une chambre en direct transgénique Drosophila d'oeuf exprimant mito-YFP ex; seuls points de temps de sélection (t) sont présentés. Voir la vidéo 1 pour tous les points de temps. (C) la quantification du signal fluorescent provenant de la couleur respective dans les régions d' intérêt (B) sont exprimés après correction de fond et de la normalisation. Les têtes de flèches indiquent les points de temps de photoblanchiment réitérative, alors que l'intervalle de temps entre deux événements consécutifs de blanchiment est le temps de récupération. Barre d'échelle: 10 um. Les images ont été acquises avec les paramètres décrits dans le tableau 1. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5. mitochondries en directl Coloration et Microscopie de Drosophila ovariole. (A) tranches optiques individuelles d'un ovariole Drosophila en direct colorées avec TMRE; l'image a été acquise avec les paramètres décrits dans le tableau 1. Z désigne la distance entre la lamelle couvre-objet en um. (B) Un direct Drosophila ovariole chargé avec la tache mitochondriale globale (Mito). L'image de XZ de la ligne rouge dans l'image XY est représenté, où B est le fond et T est le haut de l'image acquise. La distance entre le fond de la ligne bleue est de 20 um. Barre d'échelle: 20 um. Les images confocales ont été acquises avec les paramètres décrits dans le tableau 1. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
Figure 6. Co-coloration de la drosophile en direct ovarioles avec TMRE et mitochondrial Stain ensemble. (A) tranche optique unique d'un ovariole Drosophila en direct co-colorées avec TMRE et la tache mitochondriale globale (Mito); * Indique un artefact expérimental décrit dans la section Discussion. (B) de projection d'intensité maximale de 3 tranches optiques consécutives germarium dans (A); les pointes de flèche indiquent la région où la fluorescence TMRE est augmentée. (C) de la tranche optique unique de post-mitotique chambre d'oeuf co-colorées avec TMRE et la tache mitochondriale globale. Les panneaux supérieur et inférieur montrent le plan de mise au point pour AFCs et CBM, respectivement. (D) Box graphique montrant l' intensité de fluorescence moyenne de TMRE et la tache mitochondriale globale quantifiée de AFCs et CBM individuels dans les régions encadrées dans (C). Les moustaches de la boîte à moustaches indiquent les valeurs maximales et minimales pour chaque groupe, à l'exclusion des valeurs aberrantes. tableau 1. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 7
Figure 7. Coloration de Live DRP1 Null Mosaic Drosophila ovarioles avec le colorant Mito-ROS. (A) tranche optique unique de ovarioles colorées avec le colorant mito-ROS. (B) de projection d'intensité maximale de 2 tranches optiques consécutives d'une chambre d'œufs individuels avec les cellules de follicules dans la mitostade tic coloré avec le colorant mito-ROS. (C) de la tranche optique unique d'une chambre d'oeuf individuelle avec des cellules du follicule au stade post-mitotique colorées avec le colorant mito-ROS; * Indique un signal nucléaire. Le manque de UbiGFP marque les clones nuls DRP1. Barre d'échelle: 20 um. Les images confocales ont été acquises avec les paramètres décrits dans le tableau 1. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 8
Figure 8. Co-immunocoloration de fixe DRP1 Null Mosaic Drosophila ovarioles avec dCyclinE et anticorps ATP-B. (A) de projection d'intensité maximale de 3 tranches optiques consécutives germarium co-immunocoloration. (B) de projection d'intensité maximum de 3 tranches optiques consécutives de co-ImmunosCONTENUES CBM post-mitotiques. Les contours délimitent les clones nuls UbiGFP négatifs DRP1. Barre d'échelle: 10 um. Les images confocales ont été acquises avec les paramètres décrits dans le tableau 1. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 9
Figure 9. Exemples de dommages potentiels et artefacts. (A) germarium de UbiGFP exprimant ovariole fixées et colorées avec le colorant d'ADN Hoechst montrant des lacunes indues (*). (B) chambre d'oeuf de UbiGFP exprimant ovariole fixées et colorées avec le colorant d'ADN Hoechst montrant des pseudos / larmes (*). (C) Live ovariole avec des clones nulles UbiGFP-négatives DRP1 colorées avec le colorant mito-ROS montrant une chambre déformée (*) et une chambre d'œufs endommagés, permettant partielle coloration de la lignée germinale (**); # Indique une tache réelle éventuellement d'une chambre d'oeuf non endommagé dans la même ovariole. (D) Live ovariole tachée avec le mito-ROS colorant montrant une chambre endommagée globale avec une intense coloration artifactual de la lignée germinale. * Indique dégâts-aplatie ovarioles avec une perte de signal UbiGFP, donnant ainsi naissance à des clones GFP-négative artefactuels. Barre d'échelle: 20 um. Les images confocales ont été acquises avec les paramètres décrits dans le tableau 1. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Vidéo 1
Vidéo 1. direct des tissus FLIP Assay. Le cours du temps complet de l'essai FLIP basée photoblanchiment-décrit à la figure 5..com / fichiers / ftp_upload / 54989 / Video1.avi "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo. (Faites un clic droit pour télécharger.)

Tableau 1: Paramètres de microscope confocal pour l'acquisition des images représentatives présentées. S'il vous plaît cliquez ici pour voir le Tableau 1. (Faites un clic droit pour télécharger.)

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Discussion

Étapes critiques dans le Protocole

Photobleaching: Prévention photoblanchiment excessive des échantillons fluorescents est absolument nécessaire à l'exécution efficace de la microscopie confocale. Par conséquent, le temps utilisé pour localiser des échantillons à travers l'oculaire ou pour définir les paramètres d'acquisition d'image à travers le mode de balayage en direct devrait être réduit au minimum afin de minimiser photoblanchiment.

Les lésions tissulaires: Puisque les mitochondries sont considérés comme les capteurs de la santé cellulaire, il est extrêmement important de veiller à ce que les données obtenues en utilisant les méthodes décrites sont physiologiquement pertinents et ne reflètent pas les dommages injustifiés causés par la dissection procédurale des ovaires chez la drosophile. La dissection doit être effectuée le plus rapidement possible, mais aussi avec une extrême précaution pour minimiser les dommages aux tissus. Le temps moyen pour la dissection et les taquineries de 5 Drosophila ovaires est de 5 à 7 min (dans notre mains). Les efforts doivent être prises pour identifier les chambres d'œufs montrant les tissus endommagés qui seront exclus des analyses. Les lésions tissulaires dues à la dissection peut comporter des lacunes indues (* dans la figure 9A, identifiés par l'absence de signaux), les entailles / larmes (* dans la figure 9B, comme identifié par l'absence de signaux), ou la déformation des chambres d'œufs (* la figure 9C). Cependant, toute déformation de la chambre significative découlant de la manipulation expérimentale doit être soigneusement évaluée. Même si aucune lamelle couvre -objet est utilisé au - dessus du tissu vivant dans le protocole décrit aplatissement des ovariole peut se produire avec une pression excessive appliquée sur le tissu pendant le montage ou taquin (* sur la figure 9D). L'aplatissement de ovarioles n'a pas été observée avec des échantillons fixes, étant donné que le protocole décrit implique la fixation des tissus immédiatement après dissection, avec les taquineries se produisant par la suite. Toute chambre d'oeuf isolé sans signatures du aforementioned dommage peut être considéré comme normal. Les dommages mécaniques potentiellement résultant de dissection peut aussi conduire à la perte de la GFP, ce qui donne des clones GFP-négatif faux 16, et peut également donner lieu à une meilleure incorporation de colorant. Étant donné que les cellules germinales résidant à l' intérieur des chambres d'oeufs ne sont pas normalement perméable aux colorants mitochondriales vivants (figures 6 et 7), la coloration mitochondriale accrue des cellules germinales chez la drosophile peut résulter d'une augmentation de la perméabilité de la / tissu mourant endommagé; un tel artefact se produit avec le colorant mito-ROS (** sur la figure 9C et la totalité ovariole sur la figure 9D), ainsi qu'avec d' autres taches mitochondriales vivantes (non représenté). La perte de UbiGFP sur la figure 9D (*) peut aussi entraîner des dommages qui a provoqué la mise à plat des chambres d'oeufs. Bien que d' autres chambres d'œufs dans le ovariole endommagé peuvent rester authentique et sans artefacts (# à la figure 9C

La sensibilité du temps: Dans le cas de direct ex vivo microscopie, les données devraient être obtenues dans les 15 minutes de montage de tissu; par ailleurs, les résultats expérimentaux peuvent être affectés par des modifications de la physiologie du fait de la mort qui s'ensuit du tissu. Parfois, en fonction de la puissance du laser et d'autres paramètres d'analyse, les 10 ul de milieu de montage peut s'évaporer plus rapidement que 15 min. La détection de la cycline E mitochondriale piscine par co-immunocoloration nécessite la minimisation du temps de dissection (probablement en raison de la nature transitoire de la mitochondrial cycline E piscine qui est maintenue par la respiration mitochondriale active 12). Une mitochondrial piscine cycline E appréciable n'a pas non plus observé avec fois moins de 30 min de perméabilisation.

FLIP: Le mouvement de toute chambre d'œuf en cours d' examen au cours du temps de FLIP peut conduire à des analyses artefactuels et doit donc être exclu. L'utilisation de tout colorants mitochondriales vivants ou TMRE est pas recommandé dans une expérience de FLIP, puisque l'incorporation du colorant étranger peut altérer la continuité mitochondriale et donc conduire à des résultats artefactuels.

Drosophila stratégie de passage: La réciproque transversale à celle décrite ici (où les mâles porteurs de l'allèle mutant DRP1 sont utilisés) ne donne pas de descendants, probablement due à un impact non identifié DRP1 répression dans les parents mâles hétérozygotes.

Interprétation des données clonale: Tous les clones de GF négatif détectés dans les ovaires de contrôleisolé de la drosophile parentale exprimant UbiGFP indiquerait clones faux négatifs artefactuels, probablement générés en raison de la perte de GFP causée par des dommages lors de la dissection 16. Néanmoins, le nombre de clones GFP-négatif dans la descendance de choc thermique de la traverse doit être significativement plus élevé que tous les clones de faux négatifs observés chez les témoins. Les clones générés dans la couche de Drosophila de cellules du follicule par la stratégie basée sur la recombinaison mitotique décrits peuvent provenir de cellules souches de follicules mitotiques (souches de clones de cellules) ou les cellules de follicules non souches mitotiques (clones transitoires). Pour les clones de cellules souches, les analyses expérimentales doivent être effectuées seulement 10 jours après le choc thermique, lorsque les chambres d'œufs avec les clones transitoires ont déjà été posées. Pour clones transitoires, les analyses doivent être effectuées dans les 6 jours après le choc thermique, avec les clones de cellules du follicule des ovarioles sans clone de cellules du follicule dans le germarium.

Modifications et dépannage

Bien que l'évaluation du potentiel mitochondrial par unité de masse en utilisant la méthode décrite, il faut être conscient des artefacts potentiels découlant de l'optique du microscope ou des combinaisons de colorants mitochondriales. Toute région montrant un signal affaibli de la tache mitochondriale globale et un signal de TMRE relativement élevée (figure 5A, *) peut survenir en raison d' un transfert d'énergie par résonance de fluorescence (FRET) entre les colorants 8 ou en raison de différentes propriétés optiques du rouge (TMRE) et vert (colorant mitochondrial global) des lampes fluorescentes, étant donné une taille sténopé fixe dans la configuration d'acquisition. L'artefact lié FRET peut être évité en réduisant les concentrations de colorants, si possible, alors que les analyses quantitatives peuvent être réalisées sur des projections de 2 - 3 tranches optiques consécutives pour éviter l'artéfact optique. En outre, si un signal fluorescent est détecté dans la diaphonie et le contre-excitationcanaux, les paramètres du laser et de détection doivent être réajustés pour minimiser le signal dans ces canaux, ce qui devrait réduire le signal fluorescent dans les canaux optimaux ainsi.

endommagé du photoblanchiment réitératif induite par laser peut provoquer la fragmentation mitochondriale et provoquer ainsi la discontinuité mitochondrial, ce qui empêche une FLIP réussie. la fragmentation suspecté de mitochondrie lors de l'exécution du protocole FLIP peut être identifié par l'acquisition d'images haute résolution avec un trou d'épingle réduite (et d'améliorer le gain du détecteur). Si la fragmentation des mitochondries est visiblement remarqué au cours de l'exécution du protocole FLIP, la puissance du laser de blanchiment doit être réduite et / ou l'intervalle entre les agents de blanchiment consécutifs doit être augmentée. S'il y a blanchiment global au cours de la durée de l'expérience FLIP (signal de la ROI jaune sur la figure 3B et C), le laser à balayage doit être réajusté à un niveauqui permet peu ou pas photoblanchiment globale.

Pour éviter l'artefact potentiel en raison de dégâts de perte de la GFP, les clones GFP-positives peuvent être introduites en utilisant la stratégie de marcm, suivant le protocole de choc thermique décrit. Ici, la drosophile appropriée à utiliser pour la croix est femelle vierge drpKG03815 FRT40A / CYO X mâle GAL80 FRT 40A / CYO; baignoire-Gal4, UAS-CD8GFP / TM6 9. La descendance droite aile doit être utilisé pour la production de clones en utilisant un choc thermique (comme décrit à l'étape 6).

Limites de la technique

A) Bien que les cellules de follicules se trouvant sur la surface des chambres vivants des œufs de Drosophila incorporer les colorants de coloration des mitochondries, les cellules germinales à l' intérieur de la chambre d'œufs ne parviennent pas à le faire; la lignée germinale des stades jeunes tache faiblement (figures 5 et 6). B) Le direct ex vivo tissuLa microscopie électronique doit être effectuée dans les 15 minutes de l' achèvement de la formation de taches sur les ovaires isolés à partir de Drosophila individuel, une à la fois. Etant donné que les groupes expérimentaux doivent être traitées et imagée sur le même jour, le temps total pris pour obtenir des données statistiquement significative par ex vivo de tissus microscopie en temps réel à partir de divers groupes expérimentaux est relativement plus longs que ceux obtenus à partir de tissus fixés. C) Nous avons constaté que la tache mito-ROS était pas très stable dans l'ex vivo des tissus Drosophila, probablement en raison de la nature transitoire de la ROS analyte détecte 17,15, ce qui peut sous - tendre l'absence de détection du signal provenant de tous les DRP1 clones nuls. Cependant, toute pertinence biologique de la variabilité des mito-ROS coloration dans les cellules nulles DRP1 / clones ne peut pas être exclu et doit être étudié plus loin. Notez que le signal positif de la tache mito-ROS peut ne pas refléter simplement superoxyde améliorée, mais aussi la mitochondrial ou Cellul amélioréenvironnement oxydatif ar 15. D) Le colorant mitochondrial global ne peut pas être utilisé pour les expériences clonales GFP-négatives ou positives à GFP, étant donné que le spectre de fluorescence de ce colorant mitochondrial et la GFP sont impossibles à distinguer. E) Le test FLIP conçu pour tester la continuité de la matrice mitochondriale nécessiterait l' acquisition d'images avec un trou d' épingle ouvert qui comprend la résolution des structures mitochondriales.

Importance de la technique par rapport aux méthodes existantes / alternatives

L'étude de la relation structure-fonction mitochondriale est cruciale pour une compréhension approfondie des mécanismes de régulation de la fonctionnalité mitochondrial. Parce que les défauts mitochondriaux contribuent de manière significative à diverses maladies, notamment le diabète, le cancer, la maladie de Parkinson, une compréhension détaillée du mode de fonctionnement mitochondrial tient la promesse de FACILITATIONng le développement de stratégies thérapeutiques mitochondries dirigée. La microscopie des cellules vivantes est un outil indispensable pour l'étude de la relation structure-fonction mitochondriale. Cependant, la plupart de ces études ont été limitées à des cellules isolées. L'étude de la structure et la fonction mitochondriale a été étendue à vivre le tissu Drosophila dans une configuration ex vivo 9. Le protocole décrit de cette et études connexes conduira à une compréhension de la structure et de la fonction mitochondriale dans les ovaires Drosophila vivants, ex vivo, ce qui permet une compréhension des mitochondries dans un contexte physiologique. Cette approche ex vivo présente des avantages significatifs par rapport à des études in vitro, étant donné que la régulation du métabolisme et les propriétés énergétiques des mitochondries dans une cellule donnée est largement tributaire de la disponibilité des éléments nutritifs et la signalisation appropriée dans le contexte physiologique des cellules.

La manipulation génétique de miStructure tochondrial en réprimant la protéine mitochondriale DRP1 de fission dérègle le modulateur du cycle cellulaire cycline E et affecte le développement des follicules ovariens couche de cellules de Drosophila 9,12. Ici, le protocole comprend une description de la façon d'introduire des clones fonctionnellement nulles de DRP1 dans les ovaires chez la drosophile pour étudier la relation structure-fonction mitochondriale. Un nouveau bassin de la cycline E mitochondriale sur des cellules de mammifère, ainsi que la couche de Drosophila de cellules de follicules 12, a été détecté avec succès, ce qui sous - tend vraisemblablement la régulation de la cycline E 18 rapporté par les mitochondries. Ici, le manuscrit illustre une méthode de détection de la nouvelle piscine mitochondriale cycline E par co-immunocoloration fixe ovaires chez la drosophile pour dCyclinE et un marqueur mitochondrial (ATP-B).

Applications futures ou les directions après la maîtrise de cette technique

t Compte tenuchapeau Drosophila melanogaster est un système génétique puissant modèle, nos méthodes décrites sont prévues pour contribuer de manière significative à la compréhension de la base génétique de la relation structure-fonction mitochondriale dans la santé et la maladie. Drosophila a été largement utilisé pour démêler les interactions génétiques conduisant à la tumorigenèse 19. La capacité de la génération de clones dans la couche cellulaire épithéliale folliculaire chez la drosophile permet l'étude de l'interaction des mitochondries et des oncogènes ou des suppresseurs de tumeurs dans les clones individuels dans tumorigène in vivo et ex vivo installation. Les méthodes décrites peuvent être utilisées pour étudier la régulation de la relation structure-fonction mitochondriale sur les ovaires isolés de mutant approprié drosophile. Les méthodes décrites peuvent être étendues à étudier l'impact direct de divers facteurs nutriments et la croissance de signalisation sur la structure et la fonction mitochondriale par la exogoutre Enous des nutriments appropriés et / ou des facteurs de croissance dans l'ex vivo support d'imagerie. Les méthodes décrites peuvent être modifiés de manière appropriée et utilisés dans d' autres tissus de Drosophila isolés, comme les disques imaginaux larvaires, qui ont été largement utilisés pour étudier les voies de transduction du signal dans les maladies comme le cancer 20,21.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Grace's Media (Insect Dissecting Medium) Fisher Scientific 30611031-2
41 Paraformaldehyde AQ Electronic Microscopy Sciences 50-259-99
Mitotracker Green (overall mitochondrial stain) Life Technologies m7514 Reconstitute and Aliquot
Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate Sigma Aldrich 87917-25MG Reconstitute and Aliquot
MitoSox (Mito-Ros stain) Life Technologies m36008 Reconstitute and Aliquot
PolyLysine MP Biomedicals ICN15017625
Fly Vials Fisher Scientific AS-515
Fly Conicals Fisher Scientific AS-355
Fly Vial Flugs Fisher Scientific AS273
Fly Conical Flugs Fisher Scientific AS 277
Jazzmix Drosophila food (Drosophila food) Fisher Scientific AS153
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A9647-50G
Cyclin E Antibody (d-300) Santa Cruz sc- 33748
ATPB antibody [3D5] - Mitochondrial Marker AbCam ab14730
Cy3 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 115-165-146
Cy5 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 111-175-144
Hoechst Fisher Scientific H3570
VectaShield Fisher Scientific H100
Azer Scientific EverMark Select Microscope Slides Fisher Scientific 22-026-252
Microscope Cover Glass Fisher Scientific 12-542-B
Mat Tek Corp Glass Bottom Mircrowell Dish Fisher Scientific P35G-0-14-C
Active Dried Yeast Fisher Scientific ICN10140001
Confocal Microscope Carl Zeiss LSM 700
Dumont #5 Forceps Fine Science Technologies 11251-20
Moria Nickel Plated Pin Holder Fine Science Technologies 26016-12
Minutien Pins Fine Science Technologies 26002-15
MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 ) Bloomington Stock Center 7194
Fly Pad Fly stuff 59-118
Blowgun Fly stuff 54-104
Blowgun needle Flystuff 54-119
Dissecting Microscope Carl Zeiss Stemi 2000
Analyses software Carl Zeiss Zen 
Analyses software Open source Image J
Research Macro Zoom Microscope Olympus MVX10
QICAM Fast 1394 Cooled Digital Camera, 12-bit, Mono  QImaging QIC-F-M-12-C
QCapture Pro 5.1 QImaging

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References

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