Спектроскопии ядерного магнитного резонанса для идентификации нескольких фосфорилирований искробезопасных неупорядоченных белков

1UMR8576, CNRS, Lille University, 2UMR-S1172, INSERM CNRS, Lille University
* These authors contributed equally
Published 12/27/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biochemistry

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Danis, C., Despres, C., Bessa, L. M., Malki, I., Merzougui, H., Huvent, I., et al. Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins. J. Vis. Exp. (118), e55001, doi:10.3791/55001 (2016).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Одной из основных проблем здравоохранения в 21 - м веке являются нейродегенеративные заболевания , такие как болезнь Альцгеймера (AD). Tau представляет собой ассоциированный с микротрубочками белок, который стимулирует образование микротрубочек (МТ). Tau в равной степени участвуют в нескольких нейродегенеративных расстройств, так называемые тауопатий, из которых наиболее известным является AD. В этих расстройств, Tau автопортреты агрегатов в спаренных спиральных нитей () и пневмо - гидравлическая система подачи обнаруживается изменение многих остатков путем посттрансляционных модификаций (PTMs) , такие как фосфорилирования 1. Фосфорилирования белка тау участвует как в регуляции его физиологической функции стабилизации МП и патологической потерей функции, характеризующей нейроны AD.

Кроме того, тау - белок, когда интегрированный в пневмо - гидравлическая система подачи в пораженных нейронов, неизменно гиперфосфорилированного 2. В отличие от обычного Tau, который содержит 2-3 фосфатные группы, то гиперфосфорилированного Tau в пневмо-гидравлическая система подачи содержит от 5 до 9 Phosphatе группы 3. Гиперфосфорилированию Tau соответствует и к увеличению по сравнению со стехиометрическим на некоторых участках и к фосфорилированию дополнительных сайтов, которые называются патологические сайты фосфорилирования. Тем не менее, существует перекрытие между БА и здоровых взрослых моделей фосфорилирования, несмотря на количественные различия в уровне 4. Как специфические события фосфорилирования влияние функции и дисфункции Tau остается в значительной степени неизвестны. Мы стремимся, чтобы расшифровать регулирование Tau с помощью PTMs на молекулярном уровне.

Для того, чтобы углубить понимание молекулярных аспектов Tau, мы должны решать технические проблемы. Во-первых, Tau является внутренне неупорядоченным белком (IDP), когда выделен в растворе. Такие белки не имеют четко определенную трехмерную структуру, в физиологических условиях и требуют особого биофизических методов для изучения их функции (ы) и структурные свойства. Tau является парадигмой для растущего класса ВПЛ, часто ассоциированы спатологии, такие как нейродегенеративные заболевания, тем самым увеличивая интерес для понимания молекулярных параметров, лежащих в основе их функций. Во-вторых, характеристика тау фосфорилирования представляет собой аналитический вызов, с 80 потенциальных сайтов фосфорилирования вдоль последовательности длинного 441 аминокислотного Tau изоформы. Ряд антител были разработаны против фосфорилированных эпитопов Tau и используются для обнаружения патологического тау в нейронах или ткани головного мозга. Фосфорилирования события могут происходить по крайней мере 20 сайтов, направленных на пролина-направленного киназ, большинство из них в непосредственной близости в пределах Proline богатых региона. Качественные (какие сайты?) И количественный (что стехиометрии?) Характеристика трудно даже самых последних методов MS 5.

ЯМР-спектроскопии может быть использован для исследования неупорядоченные белки, которые являются высоко динамические системы состоят из ансамблей конформеров. Высокое разрешение ЯМР-спектроскопии была примеред исследовать как структуру и функцию белка тау. Кроме того, сложность профиля фосфорилирования Тау привела к разработке молекулярных инструментов и новых методов анализа с помощью ЯМР для идентификации сайтов фосфорилирования 6 - 8. ЯМР в качестве аналитического метода позволяет для идентификации сайтов фосфорилирования тау в глобальной манере, визуализация всех модификаций одноузельных в одном эксперименте, и количественной оценки степени фосфатного включения. Эта точка имеет важное значение, так как хотя фосфорилирования исследования по Tau изобилуют в литературе, большинство из них были выполнены с антителами, в результате чего большая степень неопределенности в течение полного профиля фосфорилирования и, таким образом, истинное влияние отдельных событий фосфорилирования. Рекомбинантные киназ, включая ПВА, гликоген-синтазы-киназы (3 & beta Gsk3β), Циклинзависимые киназы 2 / циклин A (CDK2 / СусА), циклин-зависимая киназа 5 (CDK5) / p25 актivator белок, внеклеточный-сигнал-регулируемой киназы 2 (ERK2) и микротрубочки сродства для регулирования киназы (МАРК), которые показывают активность фосфорилирования по отношению к Tau, могут быть получены в активной форме. Кроме того, мутанты Tau, которые позволяют генерировать специфические тау-белка изоформы с хорошо охарактеризованных узорами фосфорилирования используются для расшифровки фосфорилирования код Tau. ЯМР - спектроскопия затем используется для характеристики ферментативно модифицированных образцов Tau 6 - 8. Хотя в пробирке фосфорилирование тау является более сложным , чем псевдо-фосфорилирования , например, путем мутации выбранного Ser / Thr в глутаминовой кислоты (Glu) остатков, такой подход имеет свои преимущества. Действительно, ни структурные параметры воздействия, ни взаимодействия фосфорилирования всегда может быть имитируется глутаминовой кислот. Примером может служить поворот мотив наблюдается вокруг фосфосерина 202 (pSer202) / фосфотреонина 205 (pThr205), который не воспроизводится с Glu 9 мутаций.

в пробирке фосфорилирования рекомбинантной ERK2 киназы представлена. ERK2 активируется фосфорилированием митогеном активируемой протеинкиназы / ERK киназ (МЕК) 10 - 12. В дополнение к подготовке модифицированного, меченные изотопами тау-белок, стратегия ЯМР используется для идентификации PTMs описана.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Производство 15 Н, 13 С-тау (Рисунок 1)

  1. Transform pET15b-тау рекомбинантного Т7 экспрессии плазмиды 13,14 в BL21 (DE3) компетентны кишечной палочки бактериальные клетки 15.
    Примечание: кДНК , кодирующую самого длинного (441 аминокислотных остатков) Tau изоформы клонируют между сайтами рестрикции NcoI и XhoI в плазмиду pET15b.
    1. Осторожно перемешать 50 мкл компетентного штамма BL21 (DE3), образуя 1-5 х 10 7 колоний на мкг плазмидной ДНК, 100 нг плазмидной ДНК в пластиковую пробирку на 1,5 мл.
      Примечание: кодон-оптимизированной использования бактериальные штаммы для экспрессии эукариотических кДНК не являются необходимыми для производства человеческого Tau.
    2. Поместите смесь клеток на льду в течение 30 мин и затем теплового шока на 10 сек при 42 ° С. Поместите пробирку обратно на льду в течение 5 мин и прибавляют 1 мл комнатной температуры LB (Лурия-Бертани) среде. Выдержите в бактериальной суспензии при 37 ° С в течение 30 мин при осторожномагитация.
  2. Spread используя цикл инокуляции 100 мкл клеточной суспензии равномерно на агаровой пластине среды LB, содержащей 100 мкг / мл ампициллина антибиотика.
  3. Выдержите выбор пластины в течение 15 ч при 37 ° С.
  4. Хранить селектирующей пластины при 4 ° С до тех пор, как перейти к шагу культуры, в течение не более 2 недель приблизительно.
    Примечание: глицерина запас бактериальной культуры (50% глицерина), хранили при -80 ° С, может быть готов начать культуру на более позднем этапе.
  5. Добавить 1 мл 1 М MgSO 4, 1 мл 100 мМ CaCl 2, 10 мл 100x витамин МЕМ комплемента, 1 мл 100 мг / мл ампициллина до 1 л из автоклавного солей M9 (6 г Na 2 HPO 4, 3 г KH 2 PO 4 , 0,5 г NaCl).
    Примечание: Белый осадок сформируют после добавления раствора CaCl 2 к солей M9 , которые быстро рассеивается.
  6. Солюбилизации 300 мг 15 N, 13 C-полной среды, 1 г 15Раствором NH4Cl и 2 г 13 C 6 -глюкозы в 10 мл среды М9. Фильтр-стерилизовать раствор изотопом с использованием фильтра 0,2 мкм, непосредственно в среде М9.
  7. Приостановка с использованием прививке петли одну колонию pET15b-тау трансформированных бактерий из выделенной пластины в 20 мл LB-среде, дополненной 100 мкг / мл ампициллина.
  8. Выдержите Инокулированную среду при температуре 37 ° С в течение приблизительно 6 часов.
  9. Измерьте оптическую плотность при длине волны 600 нм (OD 600) на 1 мл десятикратного разведения бактериальной культуры в полиэтиленовом спектрометре кювете.
    Примечание: Мутность бактериальной культуры , соответствующей OD 600 из 3,0-4,0 указывает на то, что фаза роста насыщение достигается.
  10. Добавьте 20 мл насыщенного культуры LB до 1 л ростовой среды М9, дополненной ампициллином (100 мкг / мл конечной концентрации), в 2 л Эрленмейера пластиковом озадачены культуральный флакон.
  11. Поместите колбу культуры в программируемый инкубатор на 10 °С и 50 оборотов в минуту. Программирование инкубатор для переключения на 200 оборотов в минуту и ​​37 ° С рано утром следующего дня.
  12. Мера OD 600 на 1 мл бактериальной культуры в полиэтиленовом спектрометре кювете. Добавить 400 мкл 1 М IPTG (изопропил -D-1-тиогалактопиранозид) маточный раствор (хранили при -20 & deg ; С) при OD 600 достигает величины около 1,0 до индукции экспрессии рекомбинантного белка Tau.
  13. Продолжить инкубации при 37 ° С в течение еще 3 ч. Собирают бактериальные клетки центрифугированием при 5000 х г в течение 20 мин.
  14. Замораживание бактериальных гранул при -20 ° С. Хранить в замороженном виде до стадии очистки, в течение длительного периода времени, если это необходимо.

2. Очистка 15 Н, 13 С-тау (рисунок 2)

  1. Автоклавы катионообменной (CEX) буферы очистки при 121 ° С при 15 фунтов на квадратный дюйм в течение 20 мин. Хранить буферы при 4 ° С.
  2. Разморозить бактериальный осадок клеток и тщательно ресуспендируют в 45 млэкстракционного CEX Буфер (50 мМ Näpi буфера с рН 6,5, 1 мМ ЭДТА) свеже с добавлением ингибиторов протеаз 1х (1 таблетка) и DNAseI (2000 единиц).
  3. Разрушают бактериальные клетки с использованием гомогенизатора высокого давления при 20000 фунтов на квадратный дюйм. 3-4 пропуска необходимы. Центрифуга при 20000 х г в течение 40 мин для удаления нерастворимого материала.
  4. Нагреть экстракта бактериальной клетки в течение 15 мин при 75 ° С с использованием водяной бани.
    Примечание: белый осадок наблюдается уже через несколько минут.
  5. Центрифуга при 15000 х г в течение 20 мин и сохранить супернатант, содержащий термостойких тау-белка.
  6. Хранить при -20 ° C до следующего этапа очистки, если это необходимо.
  7. Выполнение катионообменной хроматографии на сильной CEX смолой , заполненную в колонке слоем 5 мл , с помощью быстрой жидкостной хроматографии протеинов системы (FPLC) (рисунок 3 А).
    1. Установка скорости потока 2,5 мл / мин.
    2. Равновесие колонку в CEX Буфер
    3. Загрузите 60-70 мл нагретыйэкстракт, содержащий тау с помощью пробоотборного насоса, или в качестве альтернативы насос А, в зависимости от системы. Соберите проточного для анализа, чтобы убедиться, что тау-белок эффективно связывания со смолой (см 2.8).
    4. Промыть смолу с CEX Буфер до оптической плотности при 280 нм возвращается к исходному значению.
    5. Элюировать тау из колонки, используя трехступенчатую NaCl градиент, полученный путем постепенного увеличения CEX буфера В (CEX буфер с 1 М NaCl). Программа ЖЭХБ следующим образом: первый шаг градиента до 25% буфера CEX B в 10 объемах колонки (CV), чтобы достигнуть 250 мМ NaCl, второй шаг до 50% буфера CEX B в 5 CV, чтобы достигнуть 500 мМ NaCl, и третий этап до 100% CEX B буфера в 2 CV достичь 1 М NaCl. Сбор 1,5 мл фракции в течение стадий элюции.
  8. Анализ 10 мкл фракций , собранных в ходе стадии элюирования с помощью SDS-PAGE (12% ДСН-гель - акриламид) и окрашивания Кумасси (рисунок 3 А) 16. Проверьте шаг загрузки на колонку, а также с помощью AnalyЗин 10 мкл проточные.
  9. Выбрать фракции, содержащие Tau и объединяют эти фракции на следующей стадии.
  10. Произвести замену буфера на тау-содержащих объединенных фракций (рисунок 3 В).
    1. Равновесие колонку обессоливания 53 мл смолы G25 уплотненный слой (26 х 10 см) в 50 мМ бикарбоната аммония (летучем буфере), используя FPLC систему.
    2. Скорость потока устанавливается на 5 мл / мин. Вводят образец Tau на колонке с помощью цикла инъекции 5 мл. Собирают фракции, соответствующие пику поглощения при длине волны 280 нм.
    3. Повторить инъекцию 3-4 раза, в зависимости от объема исходного CEX бассейна.
  11. Рассчитать количество очищенного белка Tau с использованием площади пика на хроматограмме при 280 нм (1 мг тау соответствует 140 MAU * мл).
    Примечание: Коэффициент экстинкции белка тау при 280 нм составляет 7550 М -1 см -1. Tau не содержит каких-либо остатков ГТО.
  12. Бассейн все фракции тау.
  13. Aliquoт образец в пробирки, содержащие эквивалент от 1 до 5 мг тау. Выберите эти трубки таким образом, чтобы объем раствора мал по сравнению с объемом трубки (например 5 мл раствора в 50 мл пробирку).
  14. Пробивать отверстия в крышках трубы с помощью иглы. Заморозить образцы Tau при -80 ° С.
  15. Лиофильной сушке Tau образцов. Лиофилизированный тау-белок можно хранить при -20 ° С в течение длительных периодов времени.

3. In Vitro Фосфорилирование 15 N-тау

  1. Растворяют 5 мг лиофилизированного Tau в 500 мкл буфера для фосфорилирования (50 мМ Hepes · KOH, рН 8,0, 12,5 мМ MgCl 2, 1 мМ ЭДТА, 50 мМ NaCl).
  2. Добавить 2,5 мМ АТФ (25 мкл 100 мМ исходного раствора хранили при -20 & deg; С), 1 мМ DTT (1 мкл 1 М раствора хранили при -20 & deg; С), 1 мМ EGTA (2 мкл 0,5 М маточного раствор), ингибитор протеазы 1x коктейль (25 мкл 40х материала, полученного путем растворения 1 таблетку в 1 мл буфера фосфорилирования) и 181; М активировал-Erk2 (250 мкл в буфере 10 мМ сохранения HEPES, рН 7,3, 1 мМ ДТТ, 5 мМ MgCl 2, 100 мМ NaCl , и 10% глицерина, хранили при -80 & deg ; С) в общем объеме пробы 1 мл.
    Примечание: Активированный His-ERK2 может быть подготовлен в доме 5,8 фосфорилированием с киназы МЕК.
  3. Выдержите 3 ч при 37 ° С.
  4. Нагрева образца при температуре 75 ° С в течение 15 мин, чтобы инактивировать ERK киназа.
  5. Центрифуга при 20000 х г в течение 15 мин. Собрать и сохранить супернатант.
  6. Обессоливания образца белка в 50 мМ бикарбоната аммония с использованием колонки 3,45 мл G25 смолы уплотненного слоя (1,3 х 2,6 см), который пригоден для 1 мл пробы.
  7. Запуск 12% SDS-PAGE 16 с 2,5 мкл образца белка , чтобы проверить как его целостность и эффективную фосфорилирования (рисунок 4).
  8. Лиофилизации фосфорилированный образец Tau. Хранить порошок при -20 ° С.

4. Получение спектров ЯМР (Fi5 цифра)

  1. Солюбилизации 4 мг лиофилизированного 15 Н, 13 С ERK-фосфорилированный-Тау в 400 мкл буфера ЯМР (50 мМ Näpi или 50 мМ дейтерированных трис- D11 .cl, рН 6,5, 30 мМ NaCl, 2,5 мМ ЭДТА и 1 мМ DTT).
  2. Добавить 5% D 2 O для полевой фиксации ЯМР спектрометра и 1 мМ ТСГУ (3- (триметилсилил) 4 натриевой соли пропионовой-2,2,3,3-d)) в качестве эталонного сигнала , внутренний ЯМР. Добавьте 10 мкл 40х раствора полного коктейля ингибитора протеазы.
  3. Переноса образца в ЯМР-трубки диаметром 5 мм с помощью электронного шприца с длинной иглой или пипеткой Пастера. Закройте трубку ЯМР, используя поршень. Удалите воздушный пузырь, остающийся между поршнем и жидкостью движениями поршня.
  4. Поместите пробирку ЯМР в блесны. Отрегулировать вертикальное положение в фильера с соответствующим датчиком для головки ЯМР зонд, используемый, таким образом, что большая часть раствора образца будет внутри катушки ЯМР.
  5. Запуск воздушного потока: нажмите подъемную Iп окно системы управления магнитом. Осторожно поместите фильера с трубкой в ​​воздушном потоке в верхней части отверстие магнита. Остановить поток воздуха (нажмите лифта) , и пусть труба спускаемся на место внутри головки зонда в магните.
  6. Заданное значение температуры до 25 ° С (298 К).
  7. Выполните полуавтоматическую настройку и согласование головки зонда для оптимизации передачи мощности. Введите atmm в командной строке.
  8. Блокировка частоты спектрометра с использованием сигнала D 2 O образца , записанного на канале дейтерий. Нажмите блокировку в окне системы управления магнитом.
  9. Запуск процедуры Шиммирование для оптимизации однородности магнитного поля в месте расположения образца. Тип topshim графического интерфейса в командной строке , чтобы открыть окно Шим. Нажмите кнопку Пуск в окне Шим. Проверьте остаточный B0 стандартное значение изменения, чтобы убедиться, что прокладки являются оптимальными (менее 2 Гц хорошо).
  10. Откалибруйте параметр p1 (длина протонаРадиочастотный импульс в мксек), который необходимо получить поворот на 90 ° протонных спинов. Цель для 360 ° импульса с использованием спектра 1D протонов воды (рисунок 6).
  11. Отрегулируйте смещение частоты с помощью параметра O1 (в Гц) на частоте протонов воды в спектре 1D (рисунок 6).
  12. Начало приобретение 1D спектра протонов (последовательности импульсов с WATERGATE последовательности для подавления сигнала от воды, например zggpw5) для проверки сигналов от образца (рисунок 7). Приспособьтесь количество сканирований относительной концентрации белка. Введите ZG в командной строке , чтобы начать сбор данных.
  13. Настройка дополнительных параметров для приобретения 2D [1 Н, 15 Н] HSQC спектр (импульсной последовательности hsqcetfpf3gpsi, цифры 8-9).
    1. Для 15 Н, 13 С меченый образец, отвязать 13 С в течение косвенной эволюции 15 N.
    2. 1 Н (F2) и 15 Н (F1) размеров.
      Примечание: Адаптировать количество точек данных , сбора в поле спектрометра , чтобы сохранить такое же количество Гц на точку и ограничить развязку раз: использовать 3072 точек на частоте 900 МГц и 2048 точек на частоте 600 МГц, в размерности 1 H.
    3. Оптимизация дополнительных параметров в импульсных последовательностей, соответствующих задержек, длительности импульса, смещения частоты, уровни мощности. Тип Ased в командной строке , чтобы отобразить все параметры , имеющие значение для эксперимента.
  14. Настройка параметров для приобретения 3D [1 Н, 15 Н, 13 С] HNCACB спектр (последовательность импульсов hncacbgpwg3d, 10А) на частоте 600 МГц.
  15. Настройка параметров для 3D [1 H, 15 N, 15 N] HNCANNH эксперимент (импульсная последовательность hncannhgpwg3d) на частоте 600 МГц. Установите количество точек до 2048 в 1 H и 64и 128 очков в двух 15 N измерений. Определить спектральные ширины , как 14, 25, 25 частей на миллион (промилле) сосредоточено на 4.7, 119, 119 частей на миллион в 1 H, 15 N и 15 N измерений. Продолжительность приобретения с 16 сканирований составляет 1 день и 22 ч.

5. Определение сайтов фосфорилирования

  1. Спектры процессов с использованием сбора и обработки ЯМР программного обеспечения.
    1. Выполните преобразование Фурье данных (рисунок 7). Тип футов для спектра 1D, XFB для 2D спектра или ft3d для 3D - спектра, в командной строке.
    2. Фаза и ссылки на все спектры (фиг.7С) с использованием интерактивных окон.
  2. Определение резонансы интереса к 2D HSQC потенциально соответствующая фосфорилированных Ser и Thr остатков (рисунок 9, красная коробка).
  3. Извлечение плоскости (т.е. 2D C спектров 1 H- 13) изС спектр 3D 1 H- 15 N- 13 , используя 15 N химические сдвиги резонансов интерес в 2D. С помощью курсора размерности 2 (w2) , чтобы выбрать частоту 15 N , соответствующей плоскости (w1-W3) для визуализации (рис 10б).
  4. Выберите резонансные частоты 'CA' и ядра "CB" 13 С "я" и остатки "I-1 '(более слабый набор сигналов по сравнению с теми остатка I) для каждого [1 Н, 15 Н] резонанса интерес к HNCACB 3D спектра, нажав на резонанс, в меню режима указателя найти / добавить пик, чтобы добавить химическое значение сдвига в файле списка пиков.
    1. Определить тип я остатка, pSer или Рпор, путем сравнения химических сдвигов в списке пика к известным значениям CA и CB химических сдвигов pSer и Рпор 17.
    2. Определить наличие Pro остатка на I + 1 позицию по характерному дополнительным +2 промилле сдвига Oе значения 18 сдвига CA химической.
    3. Сравните значения химического сдвига СА и СВ резонансов , соответствующих I-1 остатка в таблицу химических сдвигов предсказанных для Тельца аминокислотных остатков 19 , чтобы определить природу остатка в положении I-1.
  5. Выберите резонансные частоты 15 N ядер 'я' и 'I-1' остатки для каждого [1 Н, 15 Н] резонанса интерес в спектре HNCANNH.
  6. Сравнить 15 N значений химического сдвига к присвоению химического сдвига белка Tau 20 - 23.
  7. Сравните идентифицированных дипептидов с последовательностью Tau для определения последовательности конкретного задания.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

На фиг.3А показан основной пик поглощения при 280 нм , наблюдаемых в процессе градиента элюции. Этот пик соответствует очищенного белка Tau, как показано на геле акриламид выше хроматограмме. На фиг.3В показана хорошо отделенного пик поглощения при 280 нм и пиком проводимости, гарантируя , что обессоливание белка является эффективным. На рисунке 4 показан белковый гель-наблюдаемый сдвиг с помощью анализа SDS-PAGE 16 характеристике кратных фосфорилирования белка (сравните дорожки 2 и 3). На рисунке 6 показан ряд протонов (1 Н) спектры 1D с увеличением длительности импульса (в мксек). Чтобы установить длительность импульса , который будет вращаться 1 H спиновой намагниченности на 90 °, импульс , соответствующий поворот на 360 ° используется на практике, так как легче калибровать путем минимизации сигнала. Сигнал протонов воды равна нулю, когда длина 360 ° импульс адекватно определены. Значение, соответствующее 36076; Вращение затем делится на 4. p1 в этом эксперименте составляет 10,5 мкс. Увеличенная область: Частота остаточного сигнала используется для определения параметра o1p (смещение частоты для 1 H). На рисунке 7 А. показывает спад свободной индукции (FID), визуализировали с целью обеспечения того , обнаружен сигнал ЯМР. Рисунок 7B. показывает H спектр 1D 1 с неправильной фазой, как видно резонансов , появляющихся в асимметричных пиков. На фиг.7С показан спектр H 1D 1 с хорошим отношением сигнал-шум, что указывает , что основные параметры сбора были правильно установлены , и сигнал от образца белка может быть обнаружен. На рисунке 8 показан 2D - 1 Н, 15 Н HSQC спектры рекомбинантного 15 N-тау на частоте 900 МГц; с хорошей чувствительностью и разрешающей способностью и фиг.8В. с обнаружением протеолиза в образце, как это видно по появлению дополнительного реАКС в спектре (синяя коробка). На рисунке 9 показана 2D 1 Н, 15 Н HSQC спектры рекомбинантного 15 N-Tau фиг.9А на частоте 600 МГц, с хорошей чувствительностью , но меньшим разрешением по сравнению с фиг.8А. на частоте 600 МГц, показывает появление дополнительных пиков в спектре , соответствующих фосфорилированных остатков (красная коробка). Рисунок 9С на частоте 900 МГц, показывает пики в спектре соответствующих фосфорилированных остатков (красная коробка). Разрешение лучше , чем на рисунке 9Б. Рисунок 10 A показывает проекции из спектра 3D ЯМР используется для оценки успешного эксперимента. Рисунок 10B показывает 1 Н- 13 С плоскости , извлекаемая из 1 H- 15 N- 13 C 3D спектра с хорошей интенсивностью сигнала позволяет обнаружить 13 C сигналы от обоих I и I-1 остатков.


Рисунок 1: Схема основных ступеней рекомбинантного белка и изотопной метки. В нескольких шагах от трансформации бактерий к рекомбинантного белка описаны, как описано в пункте 1 протокола. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2: Схема основных стадий очистки рекомбинантного тау - белка. Ступени из бактериальных клеток лизиса для очистки рекомбинантного белка описаны, как описано в пункте 2 протокола. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенную версиюэта фигура.

Рисунок 3
Рисунок 3: Жидкие стадии хроматографии протокола. (A) катионообменной хроматографии фракционирование бактериального экстракта с подогревом. Оптическую плотность при 280 нм, 260 нм и проводимости соответствуют соответственно сплошной и штриховой черных линий и красной пунктирной линией. 12% ДСН-ПААГ собранных фракций показано выше на хроматограмме. (В) обессоливание тау - белок в буфер , подходящий для лиофилизации. Количество очищенного белка тау оценивается от площади пика (2260 MAU * мл) составляет 16 мг Tau. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4 Рисунок 4: 12% ДСН-ПААГ Tau. Дорожка 1, маркер молекулярного веса; дорожка 2, 10 мкг Tau; полоса 3, 10 мкг ЭРК-фосфорилированным тау. Тау, как и другие ВПЛ, работает в аномальном образом на SDS-PAGE, при кажущейся молекулярной массой около 60 кДа, вместо ожидаемых 46 кД. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5: Схема основных этапов для ЯМР подготовки образца, ЯМР - спектроскопии сбора данных и обработки данных. В нескольких шагах от ЯМР подготовки образца к сбора и обработки данных описаны как описано в пункте 4 протокола. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенное Versioп этой фигуры.

Рисунок 6
Рисунок 6: Настройка параметра p1 для получения данных ЯМР. Этот параметр отличается от образцов и в основном зависит от концентрации соли. Стандартный 1 H нутации кривая для 80% H 2 O в D 2 O показано. Спектры единой панели с задержкой цикла на 30 сек собирали и наносили на график по горизонтали. Импульс (p1) варьировалась от 1 мкс до 55 мкс с шагом 1 мкс. Теоретически, сигнал должен быть максимальным для импульса 90 ° и равна нулю при 180 ° импульса. Однако, на практике, излучение вызывает затухание асимметрии и фазовых искажений проблемы, которые делают его трудно определить на 90 ° или 180 ° импульсы непосредственно. Вторая точка нуль соответствует длительности 360 ° импульса. Увеличена область показывает остаточный сигнал для 360 ° импульс, который используется для определения параметра частоты o1p. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 7
Рисунок 7: обработка данных ЯМР. (А) Спад сигнала свободной индукции во временной области. Спектры 1D протонов (В) в результате преобразования Фурье FID из панели А в частотной области , но с неправильной фазой (PHC0 -206 °). (C) фазированной (PHC0 -113 °) и ссылки (ТСГУ сигнал при 0 промилле). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

"/>
Рисунок 8: 2D 1 Н, 15 Н HSQC спектры рекомбинантного 15 N-тау на частоте 900 МГц. 3072 и 416 точек данных сбора были записаны с использованием спектральных ширины 14 и 25 частей на миллион в 1 H (F2) и 15 Н (F1) размеров, соответственно. 16 сканирований были записаны на приращение F1, что приводит к продолжительности эксперимента от 4 ч 30 мин. (A) хороший образец качества Tau (B) образец Tau , показывающий деградацию как показали появлению дополнительных резонансов в той или иной области спектра (высокого поля H 1, низкое поле 15 N), здесь зажаты в синий цвет. Этот последний образец готовили без ингибиторов протеазы. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 9
Рисунок 9: 2D 1 Н, 15 Н HSQC спектры рекомбинантного 15 N-тау. (А) нефосфорилированным тау, 600 МГц спектра (В) фосфорилируется тау, 600 МГц спектра и (С) фосфорилируется спектр тау, 900 МГц. Дополнительные резонансы в определенной области спектра, здесь в красной рамке, наблюдаются в спектрах фосфорилированного тау. Эти резонансы, которые соответствуют протонной амида (1 Н- 15 N) корреляции pSer и Рпор остатков, легко визуализируется в области около 8,5 до 9,5 промилле для 1 H и 117 до 125 частей на миллион в течение 15 Н, вне основной массы 1 Н, 15 Н корреляции нефосфорилированной спектра Tau. и В) соответствуют спектрам приобретенных на частоте 600 МГц, 2,048 и 256 точек данных при спектральной шириной от 14 до 25 частей на миллион было зарегистрировано в 1 H (F2) и 15 Н (F1) размеров, соответственно.Были использованы 32 сканирования, а общая продолжительность приобретения составила 2 ч 44 мин и (C) на частоте 900 МГц, 3072 и 416 точек данных при спектральной шириной от 14 до 25 частей на миллион было зарегистрировано в 1 H (F2) и 15 N ( F1) размеры, соответственно. были использованы 48 сканирований, и общая продолжительность приобретения составляла 6 ч 37 мин. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 10
Рисунок 10: 3D 1 Н, 15 Н, 13 С - ЯМР - спектр, проекции и извлекаемые 2D плоскости. 2,048, 72 и 256 точек данных были записаны в 1 H (F3), 15 Н (F2) и 13 C (F1) размеры, соответственно. Спектральные ширины 14, 25, и 61 частей на миллион, в центре 4.7, 119, и 41 частей на миллион в 1 H,15 N и 13 размеры С соответственно. Продолжительность приобретения с использованием 16 сканирований составляет 4 дня и 6 ч. Представление (А) куб , соответствующий преобразованию Фурье 3D набор данных из HNCACB спектра ЭРК-фосфорилированным тау полученные на частоте 600 МГц. 2D 1 Н, 15 Н и 1 Н, 13 С плоскости получаются проекции 3D данных вдоль 13 C и 15 N размерности соответственно. Обработка данных и представление было сделано с помощью ЯМР и приобретение программного обеспечения для обработки. (B) 2D 1 H, 13 C плоскости , извлекаемая из 3D 1 Н, 15 Н, 13 С - ЯМР набор данных на 15 N химическом сдвиге 121,8 частей на миллион. Зум (справа) с центром на 1 H химического сдвига 9,38 промилле показывает 13 CA и CB 13 резонансы обоих остатков я (pThr153) и I-1 (Ala152). 13 КБ резонанс псевдонимами из - за ширины Spectral окно. Графическое представление и пик сбор были выполнены с использованием программного обеспечения для анализа ЯМР. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Мы использовали ЯМР-спектроскопии для характеристики ферментативно модифицированных образцов тау. Рекомбинантная экспрессия и очистка описана здесь для полноразмерного человеческого белка тау так же может быть использован для получения мутантных Tau или Tau домены. Обогащены изотопом белок необходим для ЯМР-спектроскопии, что вызывает необходимость рекомбинантной экспрессии. Определение сайтов фосфорилирования требует назначения резонанса и 15 N, 13 C двукратно меченого белка. Учитывая стоимость изотопов, хороший выход необходим в рекомбинантной стадии экспрессии. Глюкоза является ограничивающим фактором для роста бактерий в среде М9 , следовательно, количество 13 С 6 - глюкозы может быть увеличена до 4 г на литр ростовой среды для повышения урожайности. Добавление полных средних и MEM витаминов не являются обязательными, но помогают стимулировать рост и повысить урожайность. Учитывая высокую стоимость полной меченой среды, этот продукт используется только в качестве среды для роста линии Дополнит. Бактериальный рост происходит медленно в среде М9. Как правило, бактериальные культуры с использованием среды М9 с добавлением 3% полного времени средней досягаемости индукции примерно через 4 ч инкубации. OD 600 1,6-1,8 обычно получают в конце культуры. Ожидаемый выход рекомбинантного белка Tau составляет около 15 мг на литр бактериальной культуры. Использование программируемого инкубатора позволяет удобно планировать производство белка, сбор бактериальных гранул и аналитического контроля производства белка в рабочее время дня.

Концентрация образца имеет важное значение для получения хорошего качества спектра. Типичный образец Tau достаточно для 2D - спектра будет содержать 1 мг в 200 мкл (т.е. 100 мкМ) тау - белка. Для 3D-спектра, по меньшей мере, 200 мкМ в 300 мкл требуется, при условии, что используется криогенный головка зонда. Доступ к высокополевого спектрометра, такого как инструмент 900 МГц, используемых в данном исследовании, обеспечит лучший сигнал-шуми снизить ограничения на концентрацию образца (рисунок 8). Учитывая , что Tau является большой неупорядоченной белок, его спектры ЯМР характеризуются значительным перекрытием сигналов и ЯМР - спектрометр высокого поля также будет самым лучшим выбором с точки зрения разрешения (рисунок 8). Тем не менее, резонансы , соответствующие сайтов фосфорилирования находятся в отдельной области спектра и легко обнаружить даже с спектрометре 600 МГц (сопоставление показателей и 9в). Кроме того, в связи с его неупорядоченной природы, тау - белок чувствителен к протеолизу (фигуры 8В).

Стерилизация буферов рекомендуется ограничить деградацию Tau. Добавление ингибиторов протеазы в образце ЯМР помогает защитить Tau от деградации в течение периодов сбора данных, которые могут длиться от нескольких часов до нескольких дней, в зависимости от последовательности импульсов. Низкий уровень рН (т.е. рН ниже 7,0) требуется А.В.подъязычная слишком быстрый обмен между белковыми протонов и протонов воды, что приводит к уширению сигнала. Образец рН должен также быть хорошо контролируется, чтобы обеспечить воспроизводимость спектров. Действительно, так как значения рКа pSer и Рпор близки к оптимальным рН для ЯМР-спектроскопии, химические сдвиги фосфорилированных остатков очень чувствительны к изменениям рН. Регулировка рН образца ЯМР могут быть сделаны непосредственно с помощью рН-метра с рН микро электрода, адаптированную к малым объемам. Tau представляет собой растворимый белок и не агрегирует в стандартных условиях. Добавление полианионами, таких как сульфат гепарина и инкубации при 37 ° С может инициировать агрегацию в образцах тау. В этом случае, учитывая твердый характер агрегатов, большинство резонансов в соответствующем спектре ЯМР расширить пределы обнаружения. Даже фосфорилированные образцы Tau не собираются в условиях, описанных здесь, для получения данных ЯМР.

По сравнению с анализом антител, ЯМР обеспечивает Oвид verall из PTMs. Масс-спектрометрия также может быть использован для идентификации шаблона фосфорилирования образца белка. Изотопной метки не является необходимым для этой техники, и необходимые количества образца значительно меньше. Тем не менее, характеристика белка с несколькими фосфорилирований, такими как тау, остается сложной. Прилегающие фосфорилирования будет производить изобарные пептиды в восходящих стратегий идентификации. Полная идентификация затем нуждается в MS / MS секвенирование пептидов, полученных образцов протеолиза. Преимущество ЯМР состоит в собственной количественный характер техники. Интенсивность ЯМР-сигнал может быть связан с количеством химической группы, присутствующей на конкретном участке. Таким образом, мы можем определить долю химической модификации на каждом участке. Самые последние успехи в приложениях MS, однако , имеют показано , что МС анализ тау множественной фосфорилирования выполнима 24, даже в количественном выражении после надлежащей нормализации 25.

Здесь мы представили тау фосфорилирования активированным ERK2, но методика может быть использована для фосфорилирования с другими киназ, а 6,7,26 - 28. Кинетические эксперименты могут быть выполнены, которые могут помочь определить киназы специфичность по отношению к белковой подложке 28 - 31. Фосфорилирования исследования не ограничиваются рекомбинантные киназы, и активность киназы клеточных или тканевых экстрактов , можно анализировать 6,32,28. Интересным событием является использование ЯМР в ячейках для изучения в модификации 33,34 на места. С другой стороны , ЯМР также хорошо приспособлена для решения фосфатазы специфичности, как это было показано при изучении дефосфорилирование фосфорилированного тау на PP2A фосфатазы 35. ЯМР-спектроскопии может быть применен к характеристике ингибиторов киназы путем сравнения профиля фосфорилирования белкового субстрата в 2D-спектре в присутствии ингибитора соединения остроумияч спектр , полученный от контрольного эксперимента 6.

Интерес с использованием ЯМР-спектроскопии, по сравнению с более чувствительными методами MS, находится в широком диапазоне применений, эксплуатирующих протокол, описанный здесь, а не на одной только своей аналитической способности. Это доказало важно определить сайты фосфорилирования, чтобы иметь возможность выявить взаимосвязь между конкретными фосфорилирование со структурными или функциональными изменениями, которые были в основном изученных методом ЯМР-анализа. ЯМР - спектроскопия фосфорилированных образцов Тельца позволяет исследовать структурное воздействие фосфорилирования на обеих переходных локальных вторичных структур и на глобальном перестройкой динамического ансамбля модифицированного Tau 36,37. Функциональные аспекты включают в себя регулирование как взаимодействия тау с белковыми партнерами 7,38,39 и агрегации тау фосфорилирования 8. Фосфорилированную образец тау охарактеризован по данным ЯМР может быть дополнительно использован для расшифровки фосфо-зависимых взаимодействий, дляПример с 14-3-3 белками 40 и сконструированной белок-белковых взаимодействий ингибиторов 41,42. ЯМР позволяет определить сайт (ы) взаимодействия на уровне остатка, и зависимость этого взаимодействия на фосфорилирование. Кроме того, ЯМР - спектроскопия фосфорилированного тау является ключевой методологией , чтобы охарактеризовать пролина цис: транс - изомеразы Pin1, является важным фосфо-зависимый фермент , участвующий в регуляции Tau 43 - 45. Кроме того, анализ фосфорилирования с помощью ЯМР может быть применен не только к ВПЛ , но и к глобулярных белках 46. И, наконец, другие виды Tau PTMs такие как ацетилирования 22,40,41 могут быть изучены с помощью ЯМР. Описанные здесь протоколы доказали решающее значение для лучшего понимания функционального и структурного регулирования Tau в физиологических и патологических состояниях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pET15B recombinant T7 expression plasmid Novagen 69257 Keep at -20 °C
BL21(DE3) transformation competent E. coli bacteria New England Biolabs C2527I Keep at -80 °C
Autoclaved LB Broth, Lennox  DIFCO 240210 Bacterial Growth Medium
MEM vitamin complements 100x Sigma 58970C Bacterial Growth Medium Supplement
15N, 13C-ISOGRO complete medium powder Sigma 608297 Bacterial Growth Medium Supplement
15NH4Cl Sigma 299251 Isotope
13C6-Glucose Sigma 389374 Isotope
Protease inhibitor tablets  Roche 5056489001 Keep at 4 °C
1 tablet in 1 ml is 40x solution that can be kept at -20 °C
DNaseI EUROMEDEX 1307 Keep at -20 °C
Homogenizer (EmulsiFlex-C3) AVESTIN Lysis is realized at 4 °C
Pierce™ Unstained Protein MW Marker Pierce 266109
Active human MEK1 kinase, GST Tagged Sigma M8822 Keep at -80 °C
AKTÄ Pure chromatography system GE Healthcare FPLC
HiTrap SP Sepharose FF (5 ml column) GE Healthcare 17-5156-01 Cation exchange chromatography columns
HiPrep 26/10 Desalting GE Healthcare 17-5087-01 Protein Desalting column
PD MidiTrap G-25 GE Healthcare 28-9180-08 Protein Desalting column
Tris D11, 97% D Cortecnet CD4035P5 Deuterated NMR buffer
5 mm Symmetrical Microtube SHIGEMI D2O (set of 5 inner & outerpipe)  Euriso-top BMS-005B NMR Shigemi Tubes
eVol kit-electronic syringe starter kit Cortecnet 2910000 Pipetting
Bruker 900 MHz AvanceIII with a triple resonance cryogenic probehead Bruker NMR spectrometer for data acquisition
Bruker 600 MHz Avance with a triple resonance cryogenic probehead Bruker NMR spectrometer for data acquisition
TopSpin 3.1 Bruker Acquisition and Processing software for NMR experiments
Sparky 3.114 UCSF (T. D. Goddard and D. G. Kneller) NMR data Analysis software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Grundke-Iqbal, I., Iqbal, K., Tung, Y. C., Quinlan, M., Wisniewski, H. M., Binder, L. I. Abnormal phosphorylation of the microtubule-associated protein tau (tau) in Alzheimer cytoskeletal pathology. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 83, (13), 4913-4917 (1986).
  2. Hasegawa, M., Morishima-Kawashima, M., Takio, K., Suzuki, M., Titani, K., Ihara, Y. Protein sequence and mass spectrometric analyses of tau in the Alzheimer's disease brain. J. Biol. Chem. 267, (24), 17047-17054 (1992).
  3. Kopke, E., Tung, Y. C., Shaikh, S., Alonso, A. C., Iqbal, K., Grundke-Iqbal, I. Microtubule-associated protein tau. Abnormal phosphorylation of a non-paired helical filament pool in Alzheimer disease. J. Biol. Chem. 268, (32), 24374-24384 (1993).
  4. Wischik, C. M., Edwards, P. C., et al. Quantitative analysis of tau protein in paired helical filament preparations: implications for the role of tau protein phosphorylation in PHF assembly in Alzheimer's disease. Neurobiol. Aging. 16, (3), 409-417 (1995).
  5. Prabakaran, S., Everley, R. A., et al. Comparative analysis of Erk phosphorylation suggests a mixed strategy for measuring phospho-form distributions. Mol. Syst. Biol. 7, 482 (2011).
  6. Landrieu, I., Lacosse, L., et al. NMR analysis of a Tau phosphorylation pattern. J. Am. Chem. Soc. 128, (11), 3575-3583 (2006).
  7. Amniai, L., Barbier, P., et al. Alzheimer disease specific phosphoepitopes of Tau interfere with assembly of tubulin but not binding to microtubules. FASEB J. 23, (4), 1146-1152 (2009).
  8. Qi, H., Prabakaran, S., et al. Characterization of Neuronal Tau Protein as a Target of Extracellular Signal-regulated Kinase. J. Biol. Chem. 291, (14), 7742-7753 (2016).
  9. Bibow, S., Ozenne, V., Biernat, J., Blackledge, M., Mandelkow, E., Zweckstetter, M. Structural impact of proline-directed pseudophosphorylation at AT8, AT100, and PHF1 epitopes on 441-residue tau. J. Am. Chem. 133, (40), 15842-15845 (2011).
  10. Boulton, T. G., Yancopoulos, G. D., et al. An insulin-stimulated protein kinase similar to yeast kinases involved in cell cycle control. Science. 249, (4964), 64-67 (1990).
  11. Anderson, N. G., Maller, J. L., Tonks, N. K., Sturgill, T. W. Requirement for integration of signals from two distinct phosphorylation pathways for activation of MAP kinase. Nature. 343, (6259), 651-653 (1990).
  12. Seger, R., Ahn, N. G., et al. Microtubule-associated protein 2 kinases, ERK1 and ERK2, undergo autophosphorylation on both tyrosine and threonine residues: implications for their mechanism of activation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88, (14), 6142-6146 (1991).
  13. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J. Mol. Biol. 189, (1), 113-130 (1986).
  14. Rosenberg, A. H., Lade, B. N., Chui, D. S., Lin, S. W., Dunn, J. J., Studier, F. W. Vectors for selective expression of cloned DNAs by T7 RNA polymerase. Gene. 56, (1), 125-135 (1987).
  15. Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166, (4), 557-580 (1983).
  16. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, (5259), 680-685 (1970).
  17. Bienkiewicz, E. A., Lumb, K. J. Random-coil chemical shifts of phosphorylated amino acids. J. Biomol. NMR. 15, (3), 203-206 (1999).
  18. Wishart, D. S., Bigam, C. G., Holm, A., Hodges, R. S., Sykes, B. D. 1H, 13C and 15N random coil NMR chemical shifts of the common amino acids. I. Investigations of nearest-neighbor effects. J Biomol NMR. 5, (1), 67-81 (1995).
  19. Tamiola, K., Acar, B., Mulder, F. A. A. Sequence-specific random coil chemical shifts of intrinsically disordered proteins. J. Am. Chem. Soc. 132, (51), 18000-18003 (2010).
  20. Lippens, G., Wieruszeski, J. M., et al. Proline-directed random-coil chemical shift values as a tool for the NMR assignment of the tau phosphorylation sites. Chembiochem. 5, (1), 73-78 (2004).
  21. Smet, C., Leroy, A., Sillen, A., Wieruszeski, J. M., Landrieu, I., Lippens, G. Accepting its random coil nature allows a partial NMR assignment of the neuronal Tau protein. Chembiochem. 5, (12), 1639-1646 (2004).
  22. Mukrasch, M. D., Bibow, S., et al. Structural polymorphism of 441-residue tau at single residue resolution. PLoS Biol. 7, (2), e34 (2009).
  23. Harbison, N. W., Bhattacharya, S., Eliezer, D. Assigning backbone NMR resonances for full length tau isoforms: efficient compromise between manual assignments and reduced dimensionality. PloS One. 7, (4), e34679 (2012).
  24. Morris, M., Knudsen, G. M., et al. Tau post-translational modifications in wild-type and human amyloid precursor protein transgenic mice. Nat. Neurosci. 18, (8), 1183-1189 (2015).
  25. Mair, W., Muntel, J., et al. FLEXITau: Quantifying Post-translational Modifications of Tau Protein in Vitro and in Human Disease. Analytical Chemistry. 88, (7), 3704-3714 (2016).
  26. Leroy, A., Landrieu, I., et al. Spectroscopic studies of GSK3{beta} phosphorylation of the neuronal tau protein and its interaction with the N-terminal domain of apolipoprotein E. J. Biol. Chem. 285, (43), 33435-33444 (2010).
  27. Theillet, F. -X., Smet-Nocca, C., et al. Cell signaling, post-translational protein modifications and NMR spectroscopy. J. Biomol. NMR. 54, (3), 217-236 (2012).
  28. Qi, H., Cantrelle, F. -X., et al. Nuclear magnetic resonance spectroscopy characterization of interaction of Tau with DNA and its regulation by phosphorylation. Biochemistry. 54, (7), 1525-1533 (2015).
  29. Cordier, F., Chaffotte, A., Wolff, N. Quantitative and dynamic analysis of PTEN phosphorylation by NMR. Methods. 77-78, 82-91 (2015).
  30. Thongwichian, R., Kosten, J., et al. A Multiplexed NMR-Reporter Approach to Measure Cellular Kinase and Phosphatase Activities in Real-Time. J. Am. Chem. Soc. 137, (20), 6468-6471 (2015).
  31. Smith, M. J., Marshall, C. B., Theillet, F. -X., Binolfi, A., Selenko, P., Ikura, M. Real-time NMR monitoring of biological activities in complex physiological environments. Curr. Opin. Struct. Biol. 32, 39-47 (2015).
  32. Theillet, F. X., Rose, H. M., et al. Site-specific NMR mapping and time-resolved monitoring of serine and threonine phosphorylation in reconstituted kinase reactions and mammalian cell extracts. Nat. Protoc. 8, (7), 1416-1432 (2013).
  33. Bodart, J. -F., Wieruszeski, J. -M., et al. NMR observation of Tau in Xenopus oocytes. J. Magn. Reson. 192, (2), 252-257 (2008).
  34. Lippens, G., Landrieu, I., Hanoulle, X. Studying posttranslational modifications by in-cell NMR. Chem. Biol. 15, 311-312 (2008).
  35. Landrieu, I., Smet-Nocca, C., et al. Molecular implication of PP2A and Pin1 in the Alzheimer's disease specific hyperphosphorylation of Tau. PLoS One. 6, e21521 (2011).
  36. Sibille, N., Huvent, I., et al. Structural characterization by nuclear magnetic resonance of the impact of phosphorylation in the proline-rich region of the disordered Tau protein. Proteins. 80, (2), 454-462 (2012).
  37. Schwalbe, M., Kadavath, H., et al. Structural Impact of Tau Phosphorylation at Threonine 231. Structure. 23, (8), 1448-1458 (2015).
  38. Amniai, L., Lippens, G., Landrieu, I. Characterization of the AT180 epitope of phosphorylated Tau protein by a combined nuclear magnetic resonance and fluorescence spectroscopy approach. Biochem. Biophys. Res. Commun. 412, (4), 743-746 (2011).
  39. Sottejeau, Y., Bretteville, A., et al. Tau phosphorylation regulates the interaction between BIN1's SH3 domain and Tau's proline-rich domain. Acta Neuropathol. Commun. 3, (1), (2015).
  40. Joo, Y., Schumacher, B., et al. Involvement of 14-3-3 in tubulin instability and impaired axon development is mediated by Tau. FASEB J. 29, (10), 4133-4144 (2015).
  41. Smet, C., Duckert, J. F., et al. Control of protein-protein interactions: structure-based discovery of low molecular weight inhibitors of the interactions between Pin1 WW domain and phosphopeptides. J. Med. Chem. 48, (15), 4815-4823 (2005).
  42. Milroy, L. -G., Bartel, M., et al. Stabilizer-Guided Inhibition of Protein-Protein Interactions. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 54, (52), 15720-15724 (2015).
  43. Smet, C., Sambo, A. V., et al. The peptidyl prolyl cis/trans-isomerase Pin1 recognizes the phospho-Thr212-Pro213 site on Tau. Biochemistry. 43, (7), 2032-2040 (2004).
  44. Landrieu, I., Smet, C., et al. Exploring the molecular function of PIN1 by nuclear magnetic resonance. Curr Protein Pept Sci. 7, (3), 179-194 (2006).
  45. Lippens, G., Landrieu, I., Smet, C. Molecular mechanisms of the phospho-dependent prolyl cis/trans isomerase Pin1. FEBS J. 274, (20), 5211-5222 (2007).
  46. Smet-Nocca, C., Launay, H., Wieruszeski, J. M., Lippens, G., Landrieu, I. Unraveling a phosphorylation event in a folded protein by NMR spectroscopy: phosphorylation of the Pin1 WW domain by PKA. J. Biomol. NMR. 55, 323-337 (2013).
  47. Smet-Nocca, C., Wieruszeski, J. M., Melnyk, O., Benecke, A. NMR-based detection of acetylation sites in peptides. J. Pept. Sci. 16, (8), 414-423 (2010).
  48. Kamah, A., Huvent, I., et al. Nuclear magnetic resonance analysis of the acetylation pattern of the neuronal Tau protein. Biochemistry. 53, (18), 3020-3032 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats