Kernresonanzspektroskopie zur Identifizierung von Multiple Phosphorylierungen von intrinsisch ungeordneten Proteinen

1UMR8576, CNRS, Lille University, 2UMR-S1172, INSERM CNRS, Lille University
* These authors contributed equally
Published 12/27/2016
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Biochemistry

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Danis, C., Despres, C., Bessa, L. M., Malki, I., Merzougui, H., Huvent, I., et al. Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins. J. Vis. Exp. (118), e55001, doi:10.3791/55001 (2016).

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Abstract

Introduction

Eine der wichtigsten Herausforderungen der Gesundheitsversorgung im 21. Jahrhundert sind neurodegenerative Erkrankungen wie Alzheimer - Krankheit (AD). Tau ist ein Mikrotubuli-assoziiertes Protein, das Mikrotubuli (MT) Bildung stimuliert. Tau gleichmäßig in mehreren neurodegenerativen Erkrankungen beteiligt sind, sogenannte Tauopathien, von denen die bekannteste AD ist. In dieser Erkrankungen, Tau Selbst Aggregate in gepaarte helikale Filamente (PHFs) und fand bei vielen Reste durch posttranslationale Modifikationen (PTMs) wie Phosphorylierung 1 modifiziert ist. Die Phosphorylierung des Tau-Proteins ist in beiden Regulation seiner physiologischen Funktion von MT Stabilisierung und pathologische Verlust der Funktion impliziert, dass AD-Neuronen charakterisiert.

Weiterhin Tau - Protein, wenn in PHFs in erkrankten Neuronen integriert wird ausnahmslos 2 hyperphosphoryliert. Im Gegensatz zu normalen Tau, die 2-3 Phosphatgruppen enthält, enthält die hyperphosphorylated Tau in PHFs 5 bis 9 phosphate Gruppen 3. Hyperphosphorylierung von Tau entspricht sowohl zu einer Erhöhung der Stöchiometrie an einigen Standorten und zur Phosphorylierung von zusätzlichen Stellen, die pathologische Websites der Phosphorylierung genannt werden. Allerdings Überlappung besteht zwischen AD und normalen erwachsenen Muster der Phosphorylierung trotz quantitative Unterschiede in der Ebene 4. Wie spezifische Phosphorylierungsereignisse Einflussfunktion und Dysfunktion von Tau bleibt weitgehend unbekannt. Wir zielen darauf ab Tau Regulierung durch PTM auf molekularer Ebene zu entschlüsseln.

Um das Verständnis der molekularen Aspekte der Tau zu vertiefen, müssen wir technische Herausforderungen zu bewältigen. Erstens ist Tau ein intrinsisch ungeordneten Protein (IDP), wenn in der Lösung isoliert. Solche Proteine ​​fehlen wohldefinierte dreidimensionale Struktur unter physiologischen Bedingungen und insbesondere biophysikalischen Methoden benötigen, um ihre Funktion (en) und strukturellen Eigenschaften zu studieren. Tau ist ein Paradigma für die wachsende Klasse von IDPs, fand oft im Zusammenhang mitKrankheiten wie neurodegenerative Erkrankungen, die Erhöhung somit das Interesse der molekularen Parameter zugrunde liegenden ihre Funktionen zu verstehen. Zweitens Charakterisierung von Tau-Phosphorylierung ist ein analytisches Herausforderung mit 80 potentiellen Phosphorylierungsstellen entlang der Sequenz des längsten 441 Aminosäure-Tau-Isoform. Eine Anzahl von Antikörpern wurden gegen phosphorylierte Epitope von Tau entwickelt und werden für den Nachweis von pathologischen Tau in Neuronen oder Hirngewebe verwendet. Phosphorylierungsereignisse stattfinden kann auf mindestens 20 Seiten gezielt durch Prolin-gerichtete Kinasen, die meisten von ihnen in der Nähe in der Prolin-reiche Region. Die qualitative (welche Seiten?) Und quantitative (welche Stöchiometrie?) Charakterisierung ist schwierig , auch durch die jüngsten MS - Techniken 5.

NMR-Spektroskopie kann verwendet werden, ungeordnete Proteine ​​zu untersuchen, sind hochdynamische Systeme von Ensembles von Konformeren gebildet. Hochauflösende NMR-Spektroskopie war Anwened sowohl Struktur als auch Funktion des Tau-Proteins zu untersuchen. Darüber hinaus führte die Komplexität der Tau - Phosphorylierung des Profils auf die Entwicklung von molekularen Werkzeugen und neue Analyseverfahren unter Verwendung von NMR zur Identifizierung von Phosphorylierungsstellen 6 - 8. NMR als analytisches Verfahren ermöglicht die Identifizierung von Tau Phosphorylierungsstellen in einer globalen Weise Visualisierung aller Single-Site-Modifikationen in einem einzigen Experiment, und Quantifizierung des Ausmaßes der Phosphat-Inkorporation. Dieser Punkt ist wichtig, da, obwohl die Phosphorylierung Studien über Tau in der Literatur gibt es zuhauf, die meisten von ihnen wurden mit Antikörpern durchgeführt wurde, ein hohes Maß an Unsicherheit über die gesamte Profil der Phosphorylierung verlassen und damit die tatsächlichen Auswirkungen der einzelnen Phosphorylierungsereignisse. Rekombinante Kinasen einschließlich PKA, Glykogen-Synthase-Kinase-3β (GSK3 & bgr;), Cyclin-abhängige Kinase 2 / Cyclin A (CDK2 / CycA), Cyclin-abhängige Kinase 5 (CDK5) / p25 Aktivator Protein, extrazelluläre-signal-regulated kinase 2 (ERK2) und Mikrotubuli-Affinität regulierenden Kinase (MARK), die in Richtung Tau-Phosphorylierung Aktivität zeigen, können in aktiver Form hergestellt werden. Darüber hinaus Tau-Mutanten, die zur Erzeugung von spezifischen Tau-Protein-Isoformen mit gut charakterisierten Phosphorylierungsmuster ermöglichen, werden verwendet, um die Phosphorylierung Code von Tau zu entziffern. NMR - Spektroskopie wird dann Proben zu charakterisieren enzymatisch modifizierten Tau verwendet , 6 bis 8. Obwohl in vitro Phosphorylierung von Tau schwieriger als Pseudo-Phosphorylierung wie durch Mutation von ausgewählten Ser / Thr in Glutaminsäure (Glu) Resten ist, hat dieser Ansatz seine Vorzüge. Tatsächlich sind weder die strukturellen Auswirkungen noch Wechselwirkungsparameter der Phosphorylierung kann immer durch Glutaminsäure nachgeahmt werden. Ein Beispiel ist das wiederum Motiv um Phosphoserin 202 (pSer202) beobachtet / Phosphothreonin 205 (pThr205), die mit Glu Mutationen 9 nicht wiedergegeben wird.

in vitro - Phosphorylierung durch rekombinante ERK2 - Kinase vorgestellt. 12 - ERK2 durch Phosphorylierung von MAP-Kinase-Weg / ERK - Kinase (MEK) 10 aktiviert. Zusätzlich zur Herstellung von modifizierten, isotopenmarkierte Tau-Protein, die Strategie zur Identifizierung des PTMs verwendet NMR beschrieben.

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Protocol

1. Herstellung von 15 N, 13 C-Tau (Figur 1)

  1. Trans pET15b-Tau rekombinanten T7 Expressionsplasmid 13,14 in BL21 (DE3) kompetente Escherichia coli Bakterienzellen 15.
    HINWEIS: Die cDNA - Codierung für die längste (441 Aminosäurereste) Tau - Isoform zwischen NcoI und XhoI - Restriktionsstellen in den pET15b - Plasmid kloniert.
    1. Vorsichtig mischen 50 ul kompetente BL21 (DE3) -Zellen, Umformen 1-5 x 10 7 Kolonien pro ug Plasmid DNA mit 100 ng Plasmid - DNA in einem 1,5 ml Kunststoffröhrchen.
      HINWEIS: codonspezifische Nutzung optimierte Bakterienstämme für die eukaryotische cDNA-Expression sind nicht erforderlich, um menschliche Tau zu erzeugen.
    2. Legen Sie das Zellgemisch auf Eis für 30 min und dann Hitzeschock für 10 Sekunden bei 42 ° C. Das Röhrchen wieder auf Eis für 5 min und 1 ml Raumtemperatur LB (Luria-Bertani) -Medium. Inkubieren der Bakteriensuspension bei 37 ° C für 30 min unter leichtemAgitation.
  2. Verteilt auf einer Impföse 100 ul Zellsuspension gleichmäßig auf einer Agarplatte LB-Medium verwendet, das 100 ug / ml Ampicillin Antibiotikum.
  3. Inkubieren Sie die Selektionsplatte für 15 Stunden bei 37 ° C.
  4. Halten Sie die Selektionsplatte bei 4 ° C bis zur Kultur Schritt fortfahren, für ein Maximum von ca. 2 Wochen.
    HINWEIS: a Glycerolstammlösung Bakterienkultur (50% Glycerin) bei -80 ° C gelagert, kann hergestellt werden, um die Kultur zu einem späteren Zeitpunkt zu starten.
  5. 1 ml 1 M MgSO 4, 1 ml 100 mM CaCl 2, 10 ml 100x MEM Vitamin Komplement, 1 ml 100 mg / ml Ampicillin bis 1 L autoklaviertem M9 - Salze (6 g Na 2 HPO 4, 3 g KH 2 PO 4 0,5 g NaCl).
    HINWEIS: Ein weißer Niederschlag bei Zugabe des CaCl 2 Lösung für die M9 - Salze bilden, die sich schnell verflüchtigt.
  6. Solubilisieren 300 mg 15 N, 13 C-Komplettmedium, 1 g 15NH 4 Cl und 2 g 13 C 6 -Glukose in 10 ml M9 - Medium. Filter-Sterilisieren der Isotopenlösung mit einer 0,2 um-Filter direkt in dem M9-Medium.
  7. Suspend eine Impföse eine Kolonie von pET15b-Tau transformierten Bakterien von der Selektionsplatte in 20 ml LB Medium, ergänzt mit 100 & mgr; g / ml Ampicillin.
  8. Inkubieren des beimpften Mediums bei 37 ° C für etwa 6 Stunden.
  9. Die optische Dichte bei 600 nm (OD 600) von 1 ml einer zehnfachen Verdünnung der Bakterienkultur in einer Plastik Spektrometers Küvette.
    HINWEIS: Die Trübung der Bakterienkultur entsprechend 600 von 3,0-4,0 zu OD zeigt an, dass Sättigungswachstumsphase erreicht ist.
  10. 20 ml der gesättigten LB-Kultur auf 1 l M9-Nährmedium, ergänzt mit Ampicillin (100 ug / ml Endkonzentration) in 2 l Erlenmeyer-Kunststoff verwirrt Kulturflasche.
  11. Legen Sie die Kulturflasche in einem programmierbaren Inkubator auf 10 °C und 50 Umdrehungen pro Minute. Programmieren Sie den Inkubator auf 200 Umdrehungen pro Minute und 37 ° C am frühen Morgen des nächsten Tages zu wechseln.
  12. Maßnahme OD 600 von 1 ml der Bakterienkultur in einer Plastik Spektrometers Küvette. Werden 400 ul 1 M IPTG (Isopropyl - β-D-1-thiogalactopyranosid) Stammlösung (bei -20 ° C gehalten) , wenn OD 600 einen Wert von etwa 1,0 erreicht die Expression von rekombinanten Tau - Proteins zu induzieren.
  13. Weiterhin die Inkubation bei 37 ° C für weitere 3 Std. Sammeln der Bakterienzellen durch Zentrifugation bei 5.000 xg für 20 min.
  14. Frieren Sie das Bakterienpellet bei -20 ° C. Halten eingefroren, bis der Reinigungsschritt für eine längere Zeit, wenn nötig.

2. Reinigung von 15 N, 13 C-Tau (Figur 2)

  1. Autoklav Kationenaustausch (CEX) Reinigungspuffer bei 121 ° C unter 15 psi für 20 min. Speicher-Puffer bei 4 ° C.
  2. Tauen die bakterielle Zellpellet und resuspendieren gründlich in 45 mlEin Puffer Extraktions CEX (50 mM NaPi-Puffer, pH 6,5, 1 mM EDTA) frisch mit Protease-Inhibitor-Cocktail 1x (1 Tablette) und DNAseI (2.000 Einheiten) ergänzt.
  3. Stören die Bakterienzellen bei 20.000 psi einen Hochdruck-Homogenisator verwendet wird. 3-4 Pässe sind erforderlich. Zentrifuge bei 20.000 xg für 40 Minuten von unlöslichem Material zu entfernen.
  4. Erhitzen Sie das Bakterienzellextrakt für 15 min bei 75 ° C im Wasserbad verwendet wird.
    HINWEIS: ein weißer Niederschlag nach wenigen Minuten beobachtet wird.
  5. Zentrifuge bei 15.000 × g für 20 Minuten und halten Sie den Überstand des hitzestabilen Tau-Protein enthält.
  6. Lagerung bei -20 ° C bis zum nächsten Reinigungsschritt, wenn nötig.
  7. Durchführen einer Kationenaustausch - Chromatographie auf einem starken CEX Harz gepackt als eine 5 ml Bettsäule eine schnelle Protein - Flüssigchromatographie (FPLC) -System (Figur 3 A).
    1. Durchflussrate einstellen auf 2,5 ml / min.
    2. Äquilibrieren der Säule in CEX Ein Puffer
    3. Laden Sie die 60-70 ml beheizbarAuszug mit einem Tau eine Probenpumpe, oder alternativ eine Pumpe auf dem System abhängig. Sammeln Sie die Flow-Through zur Analyse, um zu überprüfen, dass Tau-Protein effizient an das Harz bindet (siehe 2.8).
    4. Das Harz wird mit CEX Ein Puffer, bis die Absorption bei 280 nm zurück zum Ausgangswert ist.
    5. Elute Tau aus der Säule unter Verwendung eines dreistufigen NaCl-Gradienten durch allmähliche Erhöhung des CEX B Puffer erhalten (CEX A-Puffer mit 1 M NaCl). Programm die FPLC wie folgt: erster Schritt des Gradienten auf 25% CEX B-Puffer in 10 Säulenvolumina (CV) in 5 CV 250 mM NaCl, zweiten Stufe auf 50% CEX B Puffer zu erreichen, 500 mM NaCl zu erreichen, und der dritte Schritt zu 100% CEX B-Puffer NaCl zu erreichen in 2 CV 1 M. Sammeln 1,5-ml-Fraktionen in den Eluierungsschritte.
  8. Analyse 10 & mgr; l der Fraktionen während der Elutionsschritt durch SDS-PAGE (12% SDS-Acrylamid - Gel) und Coomassie - Färbung (3 A) 16 gesammelt. Überprüfen Sie den Ladeschritt auf der Säule als auch von Analy10 ul der Durchfluss zing.
  9. Wählen Sie die Fraktionen, die Tau und diese Fraktionen für den nächsten Schritt bündeln.
  10. Führen Sie einen Pufferaustausch auf Tau-enthaltenden vereinigten Fraktionen (Abbildung 3 B).
    1. Äquilibrieren eine Entsalzungssäule von 53 ml G25 Harz gepackt Bett (26 x 10 cm) in 50 mM Ammoniumbicarbonat (flüchtige Puffer) mit einem FPLC-System.
    2. Set Durchflussrate von 5 ml / min. Injizieren Sie die Tau Probe auf der Säule über eine 5 ml Injektionsschleife. Sammle Fraktionen bei 280 nm auf die Absorptionsspitze entspricht.
    3. Wiederholen der Injektions 3-4 mal, abhängig von dem Volumen der anfänglichen CEX Pool.
  11. Berechne die Menge an gereinigtem Tau-Proteins durch die Peakfläche des Chromatogramms bei 280 nm unter Verwendung von (1 mg von Tau entspricht 140 mAU * ml).
    HINWEIS: Der Extinktionskoeffizient des Tau - Proteins bei 280 nm ist 7550 M -1 cm -1. Tau enthält keine Trp-Resten.
  12. Pool alle Tau Fraktionen.
  13. aliquot die Probe in Röhrchen das Äquivalent von 1 bis 5 mg Tau enthält. Wählen, um diese Rohre so dass das Volumen der Lösung kleiner dem Volumen des Rohrs verglichen wird (beispielsweise 5 ml Lösung in einem 50 ml Röhrchen).
  14. Stanzlöcher in den Rohrkappen mit einer Nadel. Gefriert Tau-Proben bei -80 ° C.
  15. Lyophilisieren Tau-Proben. Lyophilisierte Tau-Protein kann bei -20 ° C für lange Zeiträume gehalten werden.

3. In - vitro - Phosphorylierung von 15 N-Tau

  1. Man löst 5 mg lyophilisiertes Tau in 500 ul Phosphorylierung Puffer (50 mM Hepes · KOH, pH 8,0, 12,5 mM MgCl 2, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl).
  2. In 2,5 mM ATP (25 & mgr; l 100 mM Stammlösung bei -20 ° C gehalten), 1 mM DTT (1 ul 1 M Stammlösung bei -20 ° C gehalten), 1 mM EGTA (2 ul einer 0,5 M Stamm Lösung), Cocktail-1x-Protease-Inhibitor (25 ul eines 40x Lager durch Auflösen von 1 Tablette in 1 ml Phosphorylierung Puffer erhalten) und 181; M aktiviert His-ERK2 (250 & mgr; l in Erhaltungspuffer 10 mM Hepes, pH 7,3, 1 mM DTT, 5 mM MgCl 2, 100 mM NaCl und 10% Glycerin bei -80 ° C gelagert) in einem Gesamtprobenvolumen von 1 ml.
    HINWEIS: Die aktivierte His-ERK2 kann in-house 5,8 durch Phosphorylierung mit dem MEK - Kinase hergestellt werden.
  3. Inkubieren 3 h bei 37 ° C.
  4. Die Probe wird bei 75 ° C für 15 min ERK-Kinase zu inaktivieren.
  5. Zentrifuge bei 20.000 xg für 15 min. Sammeln und den Überstand zu halten.
  6. Entsalzen die Proteinprobe in 50 mM Ammoniumbicarbonat eine Säule von 3,45 ml G25-Harz gepackte Bett (1,3 x 2,6 cm) verwendet, die für eine 1 ml Probe geeignet ist.
  7. Führen Sie einen 12% SDS-PAGE 16 mit 2,5 & mgr; l der Proteinprobe sowohl seine Integrität und effiziente Phosphorylierung (Abbildung 4) zu überprüfen.
  8. Lyophilisieren das phosphorylierte Tau Probe. Lagern Sie das Pulver bei -20 ° C.

4. Akquisition von NMR-Spektren (FiAbbildung 5)

  1. Solubilisieren 4 mg lyophilisiertes 15 N, 13 C ERK-phosphorylierte Tau-in 400 & mgr; l NMR - Puffer (50 mM NaPi oder 50 mM deuteriertem Tris- d11 .Cl, pH 6,5, 30 mM NaCl, 2,5 mM EDTA und 1 mM DTT).
  2. Werden 5% D 2 O für Feld Verriegelung des NMR - Spektrometers und 1 mM TMSP (3- (Trimethylsilyl) propionsäure-2,2,3,3-d 4-Natriumsalz)) als interne NMR Signal Referenz. In 10 ul einer 40x Stammlösung von kompletten Protease-Inhibitor-Cocktail.
  3. Übertragung der Probe in ein 5 mm NMR-Röhrchen eine elektronische Spritze mit einer langen Nadel oder Pasteurpipette. Schließen Sie das NMR-Röhrchen den Kolben verwendet wird. Entfernen Sie alle Luftblasen gefangen zwischen Kolben und Flüssigkeit durch Kolbenbewegungen.
  4. Legen Sie das NMR-Röhrchen in einer Schleuder. Einstellen seine vertikale Position in dem Spinner mit entsprechendem Maß für die NMR-Probenkopf verwendet, so dass die meisten der Probenlösung innerhalb der NMR-Spule sein.
  5. Starten Sie den Luftstrom: Klicken Sie Lift in der Magnetsteuersystemfenster. Legen Sie das Spinner mit dem Schlauch in der Luftstrom an der Spitze der Magnetbohrung. Stoppen Sie den Luftstrom (klicken Lift) und lassen Sie das Rohr hinunter in Platz im Inneren des Sondenkopf im Magneten.
  6. Temperatur auf 25 ° C (298 K).
  7. Führen Sie halbautomatische Abstimmung und Anpassung der Sondenkopf über die Stromübertragung zu optimieren. Geben Sie ATMM auf der Kommandozeile.
  8. Sperren Sie die Spektrometerfrequenz unter Verwendung des D 2 O - Signal der Probe auf das Deuterium - Kanal aufgezeichnet. Klicken Sie Sperre in der Magnetsteuersystemfenster.
  9. Starten Sie die Shim-Verfahren an der Position, die Homogenität des magnetischen Feldes der Probe zu optimieren. Geben Sie topshim gui auf der Kommandozeile das Shim - Fenster zu öffnen. Klicken Sie in der Shim - Fenster starten. Überprüfen Sie die Rest B0 Standardabweichungswert, um zu überprüfen, dass Unterlegscheiben optimal sind (weniger als 2 Hz ist gut).
  10. Kalibrieren des p1-Parameter (Länge eines ProtonsHochfrequenzpuls in & mgr; sec), die eine Drehung um 90 ° von Protonenspins zu erhalten, notwendig ist. Ziel für den 360 ° -Impuls ein 1D - Spektrum Wasserprotonen (Abbildung 6) verwendet wird .
  11. Einstellung der Frequenzversatz durch die o1 Parametereinstellung (in Hz) an die Protonenwasserfrequenz in der 1D - Spektrum (Abbildung 6).
  12. Beginnen Erwerb eines 1D Protonenspektrum (Pulsfolge mit Watergate Sequenz zur Unterdrückung Wassersignal, beispielsweise zggpw5) zu verifizieren Signale von der Probe (7). Passen Sie die Anzahl der Scans auf die relative Proteinkonzentration. Geben Sie auf der Kommandozeile zg die Messung zu starten.
  13. Richten Sie zusätzliche Parameter für den Erwerb eines 2D [1 H, 15 N] HSQC - Spektrum (hsqcetfpf3gpsi Impulsfolge, Figuren 8-9).
    1. Für eine 15 N, 13 C - markierten Probe, entkoppeln 13 C während der 15 N indirekte Evolution.
    2. 1 H (F2) und 15 N (F1) Dimensionen ein.
      HINWEIS: Passen Sie die Anzahl der Erwerb Datenpunkte in das Spektrometer Feld eine ähnliche Anzahl von Hz pro Punkt zu halten und mal Entkopplung zu begrenzen: 3.072 Punkte bei 900 MHz und 2.048 Punkte bei 600 MHz, im 1 H - Dimension verwenden.
    3. Optimieren Sie zusätzliche Parameter in den Impulsfolgen, entsprechend verzögert, Pulslängen, Offset-Frequenzen, Leistungsstufen. Geben Sie auf der Kommandozeile asierend alle relevanten Parameter für das Experiment anzuzeigen.
  14. Stellen Sie die Parameter für den Erwerb eines 3D [1 H, 15 N, 13 C] HNCACB Spektrum (Pulsfolge hncacbgpwg3d, 10A) bei 600 MHz.
  15. Stellen Sie die Parameter für einen 3D - [1 H, 15 N, 15 N] HNCANNH Experiment (Impulsfolge hncannhgpwg3d) bei 600 MHz. Stellen Sie die Anzahl der Punkte auf 2048 im 1 H und 64und 128 Punkte in den zwei 15 N Dimensionen. Definieren die spektralen Breiten 14, 25, 25 Teile pro Million (ppm) zentriert auf 4,7, 119, 119 ppm in dem 1 H, 15 N und 15 N Dimensionen. Dauer des Erwerbs mit 16 Scans beträgt 1 Tag und 22 Stunden.

5. Identifizierung von Phosphorylierungsstellen

  1. Verfahren Spektren Erfassung und Verarbeitung NMR Software.
    1. Durchführen einer Fourier - Transformation der Daten (Abbildung 7). Typ ft für ein 1D - Spektrum, xfb für ein 2D - Spektrum oder ft3d für ein 3D - Spektrum, auf der Kommandozeile.
    2. Phase und Referenz alle Spektren (Abbildung 7C) mit Hilfe der interaktiven Fenster.
  2. Identifizieren Resonanzen von Interesse in der 2D - HSQC möglicherweise entsprechend phosphoryliert Ser und Thr - Resten (Abbildung 9, roter Kasten).
  3. Extract Ebenen (dh 2D - 1 H- 13 C - Spektren) vondie 3D - 1 H- 15 N - 13 C - Spektrum der 15 N chemischen Verschiebungen von Resonanzen von Interesse in der 2D verwendet. Mit dem Cursor der Dimension 2 (w2) , um die 15 N Frequenz entsprechend der Ebene (w1-w3) zu wählen zu visualisierenden (10B).
  4. Wählen Sie die Resonanzfrequenzen von "CA" und "CB" 13 C - Kerne des "i" und "i-1" Rückstände (schwächere Satz von Signalen im Vergleich zu denen des i - Rest) für jeden [1 H, 15 N] Resonanz Interesse an der HNCACB 3D-Spektrum auf die Resonanz durch Anklicken im Modus Menü Zeiger finden / add Spitze, die chemische Verschiebungswert in einer Peak-Liste-Datei hinzuzufügen.
    1. Identifizieren Sie den i - Rest - Typ, pSer oder pThr, durch die chemischen Verschiebungen Vergleich in der Peak - Liste mit bekannten Werten von CA und CB chemischen Verschiebungen von pSer und pThr 17.
    2. Identifizieren Sie die Anwesenheit eines Pro-Rest an der i + 1-Position durch eine charakteristische zusätzliche 2 ppm Verschiebung of der CA chemische Verschiebungswert 18.
    3. Vergleichen die chemischen Verschiebungswerte der CA und CB Resonanzen entsprechend dem i-1 - Rest zu einer Tabelle der chemischen Verschiebungen für Tau Aminosäurereste 19 vorhergesagt , die Natur des Rückstands zu identifizieren an der i-1 - Position.
  5. Wählen Sie die Resonanzfrequenzen von 15 N - Kerne des "i" und "i-1 'Reste für jeden [1 H, 15 N] Resonanz von Interesse in der HNCANNH Spektrum.
  6. Vergleichen Sie die 15 N Werte der chemischen Verschiebung der chemischen Verschiebung Zuordnung des Tau - Proteins 20-23.
  7. Vergleichen Sie die identifizierten Dipeptide mit der Tau-Sequenz die sequenzspezifische Zuordnung zu definieren.

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Representative Results

3A zeigt eine Hauptabsorptionspeaks bei 280 nm während des Elutionsgradienten beobachtet. Dieser Peak entspricht gereinigtes Tau-Protein über dem Chromatogramm auf dem Acrylamidgel gesehen wie. Figur 3B zeigt eine gut getrennt Absorptionsmaximum bei 280 nm und die Spitzen der Leitfähigkeit, so dass das Entsalzen des Proteins effizient ist. Figur 4 zeigt Proteingel-shift beobachtet durch SDS-PAGE - Analyse 16 charakteristisch für multiple Proteinphosphorylierung (vergleiche Spuren 2 und 3). Figur 6 zeigt eine Reihe von Protonen (1 H) 1D Spektren mit zunehmender Pulslängen (in & mgr; s). Die Länge des Impulses Setup , das um 90 °, wird ein Impuls entsprechend einer 360 ° -Drehung 1 H Spinmagnetisierung rotiert wird in der Praxis verwendet, da es leichter ist , durch Minimieren des Signals zu kalibrieren. Das Signal von Wasserprotonen ist null, wenn die 360 ​​° Pulslänge ausreichend definiert ist. Der Wert entspricht einer 36076; Drehung wird dann durch 4 p1 in diesem Experiment aufgeteilt ist 10,5 us. Vergrößertes Gebiet: Die Frequenz des Restsignals verwendet , um den O1P Parameter (Frequenz für 1 H - Offset) zu definieren. Abbildung 7 A. zeigt einen freien Induktionszerfalls (FID), sichtbar gemacht, um sicherzustellen , dass ein NMR - Signal erkannt wird. 7B. zeigt ein H - Spektrum 1D 1 mit einer falschen Phase, wie durch Resonanzen erscheinen als asymmetrische Spitzen gesehen. Figur 7C zeigt ein H - Spektrum 1D- 1 mit gutem Signal - Rausch - Verhältnis, was darauf hinweist , dass die grundlegenden Erfassungsparameter richtig eingestellt wurden , und ein Signal von der Proteinprobe detektiert werden. 8 zeigt 2D- 1 H, 15 N HSQC - Spektren von rekombinantem 15 N-Tau bei 900 MHz; 8A mit guter Empfindlichkeit und Auflösung und 8B. mit Detektion der Proteolyse in der Probe, wie durch das Auftreten von zusätzlichen pe gesehenaks im Spektrum (blauer Kasten). 9 zeigt 2D 1 H, 15 N - HSQC - Spektren von rekombinanten 15 N-Tau 9A bei 600 MHz, mit guter Empfindlichkeit , aber weniger Auflösung im Vergleich auf 8A. 9B bei 600 MHz zeigt Auftreten von zusätzlichen Peaks im Spektrum phosphorylierten Resten (rotes Feld) entspricht. 9C bei 900 MHz zeigt Peaks im Spektrum zu phosphorylierten Resten (rotes Feld) entspricht. Die Auflösung ist besser als in 9B. Figur 10 A zeigt Projektionen aus dem 3D - NMR - Spektrum verwendet , um ein erfolgreiches Experiment zu bewerten. 10B zeigt ein 1 H- 13 C - Ebene von der 1 extrahiert H- 15 N- 13 C 3D - Spektrum mit guter Signalstärke 13 C - Signale von beiden i und i-1 - Reste zu erkennen , ermöglicht.


Abbildung 1: Schema der wichtigsten Schritte der Produktion rekombinanter Proteine und Isotopenmarkierung. Nur wenige Schritte von Bakterien Transformation rekombinante Proteinproduktion beschrieben werden, wie in Absatz 1 des Protokolls beschrieben. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: Schema der wichtigsten Schritte von rekombinanten Tau Proteinreinigung. Nur wenige Schritte von Bakterienzellen Lyse rekombinante Proteinreinigung beschrieben werden, wie in Absatz 2 des Protokolls beschrieben. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version zu sehendiese Figur.

Figur 3
Abbildung 3: Die Flüssigkeitschromatographie Schritte Protokoll. (A) Eine Kationenaustauschchromatographie Fraktionierung des erwärmten Bakterienextrakt. Die Absorption bei 280 nm, 260 nm und die Leitfähigkeit entsprechen jeweils feste und schwarzen Linien und gestrichelte rote Linie gestrichelt. 12% SDS-PAGE-Analyse der gesammelten Fraktionen wird über dem Chromatogramm gezeigt. (B) Entsalzen des Tau - Proteins in einem geeigneten Puffer für die Lyophilisation. Die Menge an gereinigtem Tau-Protein aus der Peakfläche geschätzt (2.260 mAU * ml) 16 mg Tau. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4 Abbildung 4: 12% SDS-PAGE - Analyse von Tau. Spur 1: Molekulargewichtsmarker; Bahn 2, 10 ug Tau; Spur 3, 10 ug ERK-phosphoryliert Tau. Tau, wie andere IDPs, läuft in eine anomale Weise auf SDS-PAGE, bei einem scheinbaren Molekulargewicht von etwa 60 kDa anstelle der erwarteten 46 kDa. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5: Schema der wichtigsten Schritte für die NMR - Probenvorbereitung, NMR - Spektroskopie Datenerfassung und Datenverarbeitung. Nur wenige Schritte von NMR-Probenvorbereitung bis zur Datenerfassung und Verarbeitung sind wie in Absatz 4 des Protokolls beschrieben skizziert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere versio zu sehenn dieser Figur.

Figur 6
Abbildung 6: Aufbau des P1 - Parameter für die NMR - Datenerfassung. Dieser Parameter unterscheidet zwischen den Proben und ist in erster Linie abhängig von der Salzkonzentration. Ein Standard - 1 H Nutation Kurve für 80% H 2 O in D 2 O gezeigt. Single-Scan-Spektren mit einem Recycling-Verzögerung von 30 Sekunden wurden gesammelt und aufgezeichnet horizontal. Der Impuls (p1), wurde aus 1 & mgr; s bis 55 & mgr; s in Schritten von 1 & mgr; s variiert. In der Theorie sollte das Signal für einen 90 ° -Impuls und gleich Null für einen 180 ° -Impuls maximal sein. In der Praxis jedoch, Strahlungsdämpfung bewirkt Asymmetrie und Phasenverzerrungsprobleme, die es schwierig machen, die 90 ° oder 180 ° -Impulsen direkt zu bestimmen. Der zweite Nullpunkt entspricht einem 360 ° Impulsdauer. Der vergrößerte Bereich zeigt ein Restsignal für eine 360 ​​° Impuls, der die O1P Frequenzparameter zu definieren, verwendet wird. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 7: NMR Datenverarbeitung. (A) Freie Induktionssignalabfall in der Zeitdomäne. 1D Protonenspektren (B) , die aus Fourier - Transformation des FID von Feld A in den Frequenzbereich , aber mit fehlerhaften Phase (PHC0 -206 °). (C) Phased (PHC0 -113 °) und verwiesen (TMSP Signal bei 0 ppm). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 8: 2D- 1 H, 15 N HSQC - Spektren von rekombinantem 15 N-Tau bei 900 MHz. 3.072 und 416 Akquisitionsdatenpunkte wurden unter Verwendung von spektralen Breiten von 14 und 25 ppm in dem 1 H (F2) und 15 N (F1) Abmessungen aufgezeichnet. 16 Scans wurden pro F1 Inkrement aufgezeichnet, auf eine Dauer des Experiments von 4 h 30 min führt. (A) gute Qualität Tau Probe (B) Tau Probe zeigt Abbau wie durch das Auftreten von zusätzlichen Resonanzen in einem bestimmten Bereich des Spektrums (Hochfeld 1 H, niedrige Feld 15 N) ergab, hier in blau eingerahmt. Diese letzte Probe wurde ohne Protease-Inhibitoren hergestellt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 9: 2D 1 H, 15 N - HSQC - Spektren von rekombinanten 15 N-Tau. (A) unphosphoryliertem Tau, 600 - MHz - Spektrum (B) phosphoryliert Tau, 600 - MHz - Spektrum und (C) phosphoryliert Tau, 900 - MHz - Spektrum. Zusätzliche Resonanzen in einem bestimmten Bereich des Spektrums, hier in rot geschachtelt werden in phosphorylierte Tau-Spektren beobachtet. Diese Resonanzen, die Protonen Amid entsprechen (1 H- 15 N) Korrelationen von pSer und pThr Rückstände lassen sich leicht im Bereich um 8,5 bis 9,5 ppm für 1 H und 117 bis 125 ppm für 15 N, außerhalb der Masse des visualisierten 1 H, 15 N Korrelationen des nicht phosphorylierten Tau - Spektrum. (A und B) entsprechen den Spektren bei 600 MHz gewonnen, 2.048 und 256 Datenpunkte auf spektrale Breiten von 14 und 25 ppm im 1 H (F2) aufgenommen und 15 N (F1) Abmessungen, respectively.32 Scans wurden verwendet, und die Gesamtdauer der Erfassungs betrug 2 h 44 min und (C) bei 900 MHz, 3072 und 416 Datenpunkte auf spektrale Breiten von 14 und 25 ppm im 1 H (F2) aufgenommen und 15 N ( F1) Abmessungen sind. 48 Scans wurden verwendet, und Gesamtdauer der Akquisition betrug 6 h 37 min. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 10: 3D 1 H, 15 N, 13 C - NMR - Spektrum, Projektionen und extrahiert 2D - Ebenen. 2.048, 72 und 256 Datenpunkte wurden in dem 1 H (F3) aufgezeichnet, 15 N (F2) und 13 C (F1) Dimensionen, respectively. Spektrale Breiten 14, 25 und 61 ppm, zentriert auf 4,7, 119, und 41 ppm in dem 1 H,15 N und 13 C - Dimensionen sind. Dauer des Erwerbs mit 16 Scans beträgt 4 Tage und 6 Stunden. (A) Cube Darstellung der Fourier - transformierten entsprechenden 3D - Datensatz eines HNCACB Spektrum von ERK-phosphoryliert Tau bei 600 MHz erhalten. Die 2D- 1 H, 15 N und 1 H, 13 C - Ebenen werden durch die Projektion der 3D - Daten entlang der 13 C und 15 N Dimension erhalten wurden. Datenverarbeitung und Darstellung wurden mittels NMR-Erfassung und Verarbeitung von Software. (B) 2D- 1 H, 13 C - Ebene aus dem 1 H 3D extrahiert, 15 N, 13 C - NMR - Datensatz bei einer 15 N chemischen Verschiebung von 121,8 ppm. Ein Zoom (rechts) zentriert auf der 1 H - chemische Verschiebung von 9,38 ppm zeigt die 13 CA und 13 CB Resonanzen beider Rest i (pThr153) und i-1 (Ala152). Die 13 CB Resonanz ist mit der Breite der s aliased durchpectral Fenster. Grafische Darstellung und Peak-Picking wurden mittels NMR-Analyse-Software. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Wir haben NMR-Spektroskopie verwendet enzymatisch modifizierten Tau-Proben zu charakterisieren. Die rekombinante Expression und Reinigung der menschlichen Volllängen-Tau-Protein hier beschrieben sind, können in ähnlicher Weise zu erzeugen mutanten Tau oder Tau-Domänen verwendet werden. Isoto- Protein wird für die NMR-Spektroskopie benötigt, rekombinante Expression erforderlich macht. Identifizierung von Phosphorylierungsstellen erfordert Resonanzzuordnung und 15 N, 13 C doppelt markierte Protein. Angesichts der Kosten von Isotope wird eine gute Ausbeute bei der rekombinanten Expression Schritt erforderlich. Glucose ist der limitierende Faktor für das Bakterienwachstum in dem M9 - Medium , also die Menge an 13 C 6 -Glukose kann bis 4 g pro Liter Wachstumsmedium erhöht die Ausbeute zu verbessern. Der Zusatz von komplettem Medium und MEM-Vitamine sind nicht obligatorisch, aber helfen, das Wachstum zu stimulieren und die Ausbeute zu verbessern. In Anbetracht der hohen Kosten des gesamten markierten Medium ist dieses Produkt nur als Wachstumsmedium verwendet supplement. Das Bakterienwachstum ist langsam in M9-Medium. Im Allgemeinen Bakterienkulturen mit M9-Medium mit 3% Komplettmedium Reichweite Zeitpunkt der Induktion nach ca. 4 h Inkubation ergänzt. Einer OD 600 von 1,6-1,8 in der Regel am Ende der Kultur erhalten. Erwartete Ausbeute an rekombinantem Tau-Protein ist etwa 15 mg pro Liter Bakterienkultur. Die Verwendung eines programmierbaren Inkubator ermöglicht bequem während des Arbeitstages Stunden Proteinproduktion, Sammlung der Bakterienpellet und analytische Kontrolle der Proteinproduktion zu planen.

Die Probenkonzentration ist wichtig, um eine gute Qualität Spektrum zu erhalten. Eine typische Tau Probe ausreichend für ein 2D - Spektrum würde enthalten 1 mg in 200 & mgr; l (dh 100 & mgr; M) Tau - Protein. Für ein 3D-Spektrum, mindestens 200 & mgr; M in 300 & mgr; l erforderlich sind, vorausgesetzt, daß eine kryogene Sondenkopf verwendet wird. Zugang zu einem Hochfeld-Spektrometer, wie beispielsweise das 900 MHz-Gerät in dieser Studie verwendet werden besseres Signal-Rausch bereitzustellenund reduzieren Einschränkungen Probenkonzentration (Abbildung 8). Da Tau ein großes ungeordnete Protein ist, werden seine NMR - Spektren , die durch erhebliche Signalüberlappung gekennzeichnet, und ein NMR - Spektrometer Hochfeld wird auch die beste Wahl in Bezug auf die Auflösung (Abbildung 8). Dennoch sind die Resonanzen entsprechenden Phosphorylierungsstellen in einer bestimmten Bereich des Spektrums sind und einfach sogar mit einem 600 MHz - Spektrometers zu erfassen (Vergleiche Figuren 9B und 9C). Darüber hinaus aufgrund ihrer ungeordneten Natur ist das Tau - Protein empfindlich gegen Proteolyse (8B).

Die Sterilisation von Puffern wird empfohlen, Tau-Abbau zu begrenzen. Zugabe von Protease-Inhibitoren auf die NMR Probe hilft bei der Datenerfassungsperioden Tau vor dem Abbau zu schützen, die von Stunden bis Tagen, in Abhängigkeit von der Impulsfolge dauern kann. Niedriger pH - Wert (dh pH - Wert unter 7,0) ist erforderlich , um avoid zu schnell Austausch zwischen Protein und Wasserprotonen, die Verbreiterung der Signal führt. Beispiel pH-Wert muss auch gut gesteuert werden, die Reproduzierbarkeit der Spektren zu gewährleisten. Da nämlich pKa-Werte von pSer und pThr auf den optimalen pH nahe sind für die NMR-Spektroskopie, chemische Verschiebungen von phosphorylierten Reste sind sehr empfindlich gegenüber pH-Schwankungen. Einstellung des pH-Werts der NMR Probe mit einem pH Mikroelektrode mit einem pH-Meter direkt vorgenommen werden, um kleine Volumina angepasst. Tau ist ein lösliches Protein und nicht aggregiert unter Standardbedingungen. Zugabe von Polyanionen, wie Heparin Sulfat und einer Inkubation bei 37 ° C kann die Aggregation in Tau Proben initiieren. In diesem Fall ist die feste Natur der Aggregate gegeben, die meisten der Resonanzen in dem entsprechenden NMR-Spektrum jenseits Detektions verbreitern. Auch die phosphorylierten Tau Proben nicht Aggregat in den Bedingungen hier für die NMR-Datenerfassung beschrieben.

Im Vergleich zu Antikörper-Analyse liefert NMR eine oLLGEMEINE Z Ansicht von PTM. Massenspektrometrie kann auch die Phosphorylierung Muster einer Proteinprobe zu identifizieren. Isotopenmarkierung ist nicht notwendig, für diese Technik, und die erforderlichen Probenmengen sind viel kleiner. Jedoch Charakterisierung eines Proteins mit mehreren Phosphorylierungen, wie Tau, bleibt eine Herausforderung. Angrenzend Phosphorylierungen wird isobar Peptide in Bottom-up-Strategien der Identifizierung erzeugen. Vollständige Identifizierung muss dann MS / MS-Sequenzierung der Peptide, die durch Probe Proteolyse erhalten. Ein Vorteil besteht in der NMR intrinsischen quantitative Natur der Technik. Die Intensität eines NMR-Signal kann an einer spezifischen Stelle auf die Menge der chemischen Gruppe, die verbunden werden. Wir können somit den Anteil der chemischen Modifikation an jeder Stelle zu definieren. Die neuesten Fortschritte in der MS - Anwendungen haben jedoch gezeigt , dass MS - Analyse von Tau mehrere Phosphorylierung denkbar 24 ist, auch in quantitativer Weise nach entsprechender Normalisierung 25.

Hier präsentierten wir Tau - Phosphorylierung durch aktivierte ERK2, aber die Methodik kann für die Phosphorylierung mit anderen Kinasen als auch 6,7,26 verwendet werden - 28. Kinetische Experimente können durchgeführt werden, die kinase Spezifität gegenüber einem Proteinsubstrat 28 zu definieren , kann helfen - 31. Phosphorylierung Studien sind nicht auf rekombinante Kinasen beschränkt und Kinaseaktivität von Zell- oder Gewebeextrakte können 6,32,28 analysiert werden. Eine interessante Entwicklung ist die Verwendung von NMR in-Zelle in situ Modifikationen 33,34 zu studieren. Im Gegensatz dazu wird NMR auch gut angepasste Phosphatase Spezifität zu adressieren, wie durch das Studium der Dephosphorylierung von phosphoryliertem Tau durch die PP2A Phosphatase 35 gezeigt wurde. NMR-Spektroskopie kann durch Vergleichen der Phosphorylierung Profil des Proteinsubstrats in einem 2D-Spektrum in Gegenwart des Inhibitors wit Verbindung zur Charakterisierung von Kinase-Inhibitoren angewendet werdenh das Spektrum von einem Kontrollexperiment , erteilt am 6..

Das Interesse der NMR-Spektroskopie, im Vergleich zu den empfindlicheren MS-Techniken, liegt in der breiten Palette von Anwendungen, die das hier beschriebene Protokoll zu nutzen, anstatt sich auf seine analytischen Fähigkeiten allein. Es hat sich als entscheidend Phosphorylierungsstellen zu identifizieren zu können spezifische Phosphorylierungen mit strukturellen oder funktionellen Änderungen verknüpfen, die hauptsächlich untersucht wurden unter Verwendung von NMR. NMR - Spektroskopie von phosphoryliertem Tau - Proben ermöglicht die strukturellen Auswirkungen der Phosphorylierung auf beiden vorübergehende lokale Sekundärstrukturen und auf die globale Neuordnung des dynamischen Ensemble von modifizierten Tau 36,37 zu erkunden. Funktionale Aspekte umfassen die Regulation der beiden Interaktion von Tau mit Proteinpartner 7,38,39 und Aggregation von Tau - Phosphorylierung 8. Das phosphorylierte Tau Probe durch NMR charakterisiert weiter phospho-abhängige Wechselwirkungen verwendet werden zu entschlüsseln, fürBeispiel mit 14-3-3 Proteine 40 und engineered Protein-Protein - Wechselwirkung Hemmer 41,42. NMR ermöglicht Definition von Interaktionsstelle (n) auf die Höhe der Rückstände und der Abhängigkeit dieser Wechselwirkung auf die Phosphorylierung. Zusätzlich NMR - Spektroskopie von phosphoryliertem Tau ist ein Schlüssel Methodik des Prolin cis zu charakterisieren: trans - Isomerase Pin1 ein wichtiges Phospho-abhängige Enzym beteiligt in Tau Regulation 43-45. Darüber hinaus kann die Phosphorylierung Analyse durch NMR angewendet werden , nicht nur auf IDPs , sondern auch auf globuläre Proteine 46. Schließlich können andere Arten von Tau PTMs wie Acetylierungen 22,40,41 kann durch NMR untersucht werden. Die Protokolle hier beschriebenen entscheidend erwiesen, um besser auf die funktionelle und strukturelle Regulierung von Tau in physiologischen und pathologischen Bedingungen zu verstehen.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
pET15B recombinant T7 expression plasmid Novagen 69257 Keep at -20 °C
BL21(DE3) transformation competent E. coli bacteria New England Biolabs C2527I Keep at -80 °C
Autoclaved LB Broth, Lennox  DIFCO 240210 Bacterial Growth Medium
MEM vitamin complements 100x Sigma 58970C Bacterial Growth Medium Supplement
15N, 13C-ISOGRO complete medium powder Sigma 608297 Bacterial Growth Medium Supplement
15NH4Cl Sigma 299251 Isotope
13C6-Glucose Sigma 389374 Isotope
Protease inhibitor tablets  Roche 5056489001 Keep at 4 °C
1 tablet in 1 ml is 40x solution that can be kept at -20 °C
DNaseI EUROMEDEX 1307 Keep at -20 °C
Homogenizer (EmulsiFlex-C3) AVESTIN Lysis is realized at 4 °C
Pierce™ Unstained Protein MW Marker Pierce 266109
Active human MEK1 kinase, GST Tagged Sigma M8822 Keep at -80 °C
AKTÄ Pure chromatography system GE Healthcare FPLC
HiTrap SP Sepharose FF (5 ml column) GE Healthcare 17-5156-01 Cation exchange chromatography columns
HiPrep 26/10 Desalting GE Healthcare 17-5087-01 Protein Desalting column
PD MidiTrap G-25 GE Healthcare 28-9180-08 Protein Desalting column
Tris D11, 97% D Cortecnet CD4035P5 Deuterated NMR buffer
5 mm Symmetrical Microtube SHIGEMI D2O (set of 5 inner & outerpipe)  Euriso-top BMS-005B NMR Shigemi Tubes
eVol kit-electronic syringe starter kit Cortecnet 2910000 Pipetting
Bruker 900 MHz AvanceIII with a triple resonance cryogenic probehead Bruker NMR spectrometer for data acquisition
Bruker 600 MHz Avance with a triple resonance cryogenic probehead Bruker NMR spectrometer for data acquisition
TopSpin 3.1 Bruker Acquisition and Processing software for NMR experiments
Sparky 3.114 UCSF (T. D. Goddard and D. G. Kneller) NMR data Analysis software

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References

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