Chip-exo Metode: Identifisere Protein-DNA interaksjoner med nærheten basepar Precision

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Perreault, A. A., Venters, B. J. The ChIP-exo Method: Identifying Protein-DNA Interactions with Near Base Pair Precision. J. Vis. Exp. (118), e55016, doi:10.3791/55016 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Chromatin immunoprecipitation (chip) er et uunnværlig verktøy innen epigenetikk og genregulering som isolerer spesifikke protein-DNA interaksjoner. ChIP koplet til høy gjennomstrømming sekvensering (chip seq) blir ofte brukt for å bestemme den genomiske plassering av proteiner som interagerer med kromatin. Imidlertid er chip seq hemmet av forholdsvis lav oppløsning kartlegging av flere hundre basepar og høyt bakgrunnssignal. Chip-exo-metoden er en raffinert utgave av brikke seq som vesentlig bedrer på både oppløsning og støy. Den viktigste forskjellen av chip-exo metodikk er inkorporering av lambda eksonuklease fordøyelse i biblioteket fremstilling arbeidsflyt for effektivt å fotavtrykk venstre og høyre 5 'DNA-grenser protein-DNA-kryssbindende område. Brikken-exo-biblioteker blir deretter underkastet høy gjennomstrømming sekvensering. Den resulterende data kan utnyttes til å gi unike og ultra-høy oppløsning innsikt i den funksjonelle organiseringen of genomet. Her beskriver vi chip-exo metode som vi har optimalisert og strømlinjeformet for pattedyrsystemer og neste generasjons sekvensering-by-syntese plattform.

Introduction

Chromatin immunoprecipitation (chip) er en kraftig metode for å studere mekanismer for genregulering av selektivt berikende for DNA-fragmenter som samhandler med en gitt protein i levende celler. Deteksjonsmetoder chip-beriket DNA-fragmenter har utviklet seg som teknologien forbedres, fra deteksjon av en enkelt locus (standard chip qPCR) til hybridisering på oligonukleotid mikromatriser (Chip-chip) til high-throughput sekvensering (Chip-seq) 1. Selv ChIP-seq har sett utbredt anvendelse, kromatin heterogenitet og uspesifikke DNA interaksjoner har hemmet datakvalitet fører til falske positive og upresis kartlegging. For å omgå disse begrensningene, Dr. Frank Pugh utviklet chip-exo metode 2. Det fremtredende trekk chip-exo er at det inneholder en 5 'til 3' eksonuklease, effektivt spor transkripsjonsfaktorbindende steder. Som et resultat, oppnår chip-exo metodikk høyere oppløsning, større dynamisk område på deteksjon, og lavere bakgrunnsstøy.

Selv ChIP-exo er mer teknisk utfordrende å mestre enn chip seq, er det å bli allment vedtatt som studier tar sikte på å få unike ultrahøy oppløsning innsikt ved hjelp av ulike biologiske systemer 3-8. Faktisk har ChIP-exo blitt brukt til bakterier, gjær, mus, rotte og humane cellesystemer. Som bevis på prinsippet ble chip exo opprinnelig ble brukt til å identifisere den nøyaktige bindingsmotiv for en håndfull av gjær transkripsjonsfaktorer to. Teknikken ble også brukt i gjær for å studere organiseringen av transkripsjons pre-initiering kompleks, og for å dechiffrere subnucleosomal struktur av forskjellige histoner 9,10. Flere nylig, leveraged Vi chip-exo å løse tilstøtende TFIIB og Pol II bindende hendelser på menneske arrangører, og viste at utbredt divergerende transkripsjon oppstår fra distinkt initiering komplekser 11.

Arbeidsflyten som presenteres her er optimalisert og streamlined for pattedyr ChIP-exo (figur 1). For det første er bor primære eller vevskultur-cellene behandlet med formaldehyd for å bevare in vivo protein-DNA-interaksjoner gjennom en kovalent tverrbinding. Cellene lyseres og kromatin skåret til ~ 100 - 500 basepar størrelse fragmenter. ChIP så selektivt beriker for DNA-fragmenter tverrbindes til proteinet av interesse. På dette punktet, er chip-seq biblioteker typisk fremstilt, som i seg selv begrenser deteksjonsoppløsningen til den gjennomsnittlige fragmentstørrelse på noen få hundre basepar. Men seirer ChIP-exo denne begrensningen ved å klippe venstre og høyre 5 'DNA grenser protein-DNA kryssbindingsstedet med lambda eksonuklease. Sekvense bibliotekene blir deretter konstruert fra eksonuklease fordøyd DNA som beskrevet nedenfor. De resulterende nestede 5 'grenser representerer et in vivo-fotavtrykk av protein-DNA interaksjon (Figur 1, trinn 14), og blir detektert ved høy gjennomstrømning sekvensering. altHough chip-exo metodikk er mer involvert enn chip seq, overganger mellom de fleste trinnene krever enkel perle vask, noe som minimerer prøvetap og eksperimentell variabilitet. Viktigere, siden chip exo er en raffinert utgave av chip seq, enhver prøve som er vellykket med Chip-seq bør også være vellykket med Chip-exo.

In vivo footprinting av protein-DNA interaksjoner med Chip-exo resulterer i en fundamentalt forskjellig datastruktur fra ChIP-seq. Selv om vanlige Chip-seq innringere kan brukes til å chip-exo data, for å få tak i de mest presise rushsamtaler anbefaler vi bioinformatikk spesielt utviklet med den unike strukturen chip-exo data i tankene. Disse inkluderer Gene, GEM, MACE, Peakzilla, og ExoProfiler 12-15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Merk: Double destillert H 2 O eller molekylær grad tilsvarende anbefales for alle buffere og reaksjoner mikser.

Dag 0: Material Forberedelse og Cell Harvest-

1. Buffer Klargjøring

  1. Forbered Lysis buffere 1 - 3 (tabell 1 - 3) og tilsett 100 mL komplett proteasehemmer lager (KPI) til 50 ml av hver buffer like før bruk. Forbered KPI lager ved å løse en tablett i en ml molekylær klasse H 2 O.
  2. Forbered Chip Buffere (tabell 4 - 7). Tilsett 100 ul KPI lager til 50 ml Blokkere og RIPA buffere. Ikke legg KPI til Tris og Chip elueringsbuffere.

2. annealing av Adapter Oligonukleotider

Merk: Spesifikke oligonukleotid sekvenser kan bli funnet i Tilleggsinformasjon.

  1. Forbered Adapter Annealing mikser (tabell 8 - 9). Vortex å mikse og kortspinne rør for å samle innholdet. Alikvoter 100 ul av hver blanding til 0,5 ml rør.
  2. Hybridiserte oligonukleotidene ved å kjøre programmet (tabell 10) i Thermocycler.
    Oppbevares glødet oligonukleotider ved -80 ° C.

3. I Vivo Chromatin Kryssbinding med Formaldehyd

MERK: For en typisk ChIP eksperiment, skal utgangsmaterialet inneholde cirka 50 millioner celler.

  1. Legg til en frisk 37% metanol-fritt formaldehyd stamløsning til fosfat-bufret saltløsning (PBS), vasket cellekultur til en sluttkonsentrasjon på 1% (v / v), bland godt og la stå ved romtemperatur i 10 min.
    MERK: For eksempel, vi vanligvis legger 1,4 ml 37% metanol-fritt formaldehyd til celler i 50 ml romtemperatur PBS. Også unngå formaldehyd tverrbinding i medier siden-proteiner i mediet vil slukke noe av formaldehydet.
  2. Stans tverrbindingsreaksjon ved tilsetning av 2,5 M glycine for en endelig konsentrasjon på 125 mM. Bland grundig.
  3. Overføre celler til 50 ml tube på is. Spin-celler i 5 minutter ved 1000 xg ved 4 ° C. Dekanter supernatanten.
  4. Tilsett 1 ml iskald 1 x PBS til cellepelleten og resuspender ved pipettering. Overføring til 1,5 ml tube.
  5. Spin-celler i 3 minutter ved 2000 xg ved 4 ° C. Aspirer supernatant.
  6. Umiddelbart flash fryse cellepelletene i 1,5 ml rør med flytende nitrogen. Oppbevar ved -80 ° C. Tverrbundne celler er stabile på ubestemt tid ved -80 ° C.

Dag 1: Cell Lysis, ultralydbehandling, og chip

4. Cell Lysis

MERK: Under alle cellelyse seksjoner, MÅ prøvene holdes på is eller ved 4 ° C for å minimere kryssbindings reversering.

  1. I korthet tine krysskoblet celle pellet. Grundig resuspender hver pellet i 0,5 ml Lysis Buffer 1 og kombinert med 4,5 ml lysebuffer 1 i en 15 ml polystyrenrør.
  2. Fjell rør i 10 minutter ved 4 ° Cfor på en gynge plattform. Spinn i 4 minutter ved 2000 xg ved 4 ° C. Dekanter supernatanten.
  3. Grundig resuspender hver pellet i 0,5 ml Lysis Buffer 2 og tilsett 4,5 ml Lysis Buffer 2 gang resuspendert.
  4. Gynge i 5 min ved 4 ° C på en gyngende plattform. Spinn i 5 minutter ved 2000 xg ved 4 ° C. Dekanter supernatanten og banke forsiktig overflødig på papirhåndkle.
  5. Grundig resuspender hver pellet i 0,5 ml Lysis Buffer tre og tilsett 1 ml Lysis Buffer tre gang resuspendert. Hold atomlysatene på is og umiddelbart videre til lydbehandling.

5. Ultralyd of Nuclear Lysates

MERK: Under alle ultralydseksjoner, må prøvene holdes på is for å minimere kryssbindings reversering. Den spesifikke modellen av ultralyd brukes i forbindelse med protokollen under kan finnes i tabellen for materialteknologi. Detaljer om spesifikke ultralyd bruk og retningslinjer for andre instrumenter kan bli funnet i Tilleggsinformasjon.

  1. pless resonans adaptere i 15 ml polystyren rør som inneholder atom ekstrakter (metallisk bar bør ikke berøre veggen av røret).
  2. Sonicate atomlysatene i en iskald vannbad i 2 x 15 min økter med 30 sek på / 30 sek OFF på middels effekt. Bare sonikere to 15 ml-rør på en gang. Disse innstillingene fungerer på et bredt spekter av cellelinjer og primære celletyper, men ytterligere optimalisering kan være nødvendig hvis kromatin klipping er ufullstendig.
  3. For å sjekke ultralyd resultater, overføring 2 x 10 ul prøver fra lysat til 1,5 ml rør.
    1. For å reversere tverrbindinger, kombinere den første 10 ul aliquot med 10 ul TE-RNase A og 0,2 ul av proteinase K. Inkuber ved 37 ° C i 30 minutter. Tilsett 4 mL 6x xylen DNA fargestoff.
    2. For å bevare tverrbindinger, kombinere den andre 10 pl prøve med 2 ul 6x xylen DNA fargestoff.
    3. Kjør begge prøvene på en 1,5% agarosegel ved 140 V for ca 30 - 45 min før bromophenol fargestoff i stigen jegs ¾ av veien ned gel.
  4. Dersom ultralydbehandling var vellykket (de fleste DNA-fragmenter skåret til 100-500 bp), overføre ultralydbehandlet lysater til 2 ml rør inneholdende 150 ul av 10% Triton X-100. Vortex å blande.
  5. Til pellet uløselig kromatin og rusk, spin ultralydbehandlet atom lysat i 10 min ved 20 000 xg ved 4 ° C.
  6. Overfør supernatanten til et nytt 2 ml rør. Fortsett umiddelbart til chip eller lagre prøvene ved -80 ° C på ubestemt tid. Sonikerte ekstrakt bør ikke fryses og tines flere ganger.

6. Kobling Antistoff mot Perler

MERK: Aldri vortex eller fryse / tine magnetiske kuler, siden de vil knuse og øke bakgrunnssignal.

  1. Etter grundig blanding lager, delmengde Y mL perle slurry til 1,5 ml tube, hvor Y = 1,1 x 2,5 mL x (antall chip prøver). Bindingskapasitet for 2,5 ul perle slurry er opp til 13 mikrogram IgG. Vask sammenslåtte perler 3x med 1 ml BlokkeringBuffer.
  2. For mer konsekvent aliquotting av perler etter vask, resuspender perler i 10x opprinnelige slurry volum (25 mL / chip) med blokkeringsbuffer. Alikvoter 25 ul per brikke prøve i 1,5 ml rør.
  3. Legg 5 - 10 ug antistoff til tilsvarende porsjon av resuspender perler. Ta endelig volum opp til 250 fil med blokkeringsbuffer. Inkuber prøvene i 4 timer (alternativt over natten i 16 timer) på en roterende plattform ved 4 ° C.
  4. Aspirer supernatant. For å fjerne ubundet eller overflødig antistoff, vaske perler gang med 1 ml blokkeringsbuffer.
  5. Etter å aspirere siste vask, umiddelbart legge 50 millioner celle ekvivalenter av ultralyd ekstrakter (~ 1,6 ml) til antistoff: perle konjugater. Hvis ultralyd ekstrakter er ikke klar, resuspender perler i 100 mL blokkering buffer før de er klare. Det er viktig å aldri la perlene tørr.

7. Chromatin Immunpresipitasjon (chip)

  1. For hver brikke prøve, kombinere 1,5 ml sonicated ekstrakter med antistoff: perle konjugater i 1,5 ml eller 2 ml rør.
  2. Inkuber rør på en mini-tube rotator over natten (ca. 16 timer) ved hastighetsinnstilling av 9 ved 4 ˚C. Sjekk etter noen minutter for å sikre prøvene er ikke lekker, og blander riktig.

Dag 2: Chip Vasker og On-harpiks enzymatiske reaksjoner

8. Chip Vasker

MERK: For å redusere risikoen for kryssforurensning, kort spinne rør mellom hver vask. For første aspirasjon, endre tips mellom hver prøve. Under påfølgende vasker, kan det samme tipset brukes så lenge det ikke berører perlene. Se Tilleggsinformasjon Seksjon for veiledning om riktig ChIP vask.

  1. Veldig kort spinne rør ved hjelp av en mikro (~ 3 sek ved 500 xg) for å samle væske i caps og plasser på magnetstativ i 1 min. Mens han fortsatt på magnetstativ, aspirer ekstrakt.
  2. Legg 0,75 ml RIPA-buffer til hvert rør. Fjern rør fra magnetstativog invertere flere ganger for å blande. Bytt rør på magnetstativ og aspirer supernatant. Gjenta 7x.
  3. Legg til 0,75 ml 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) til hvert rør. Fjern rør fra magnetstativ og invertere flere ganger for å blande. Bytt rør på magnetstativ og aspirer supernatant. Gjenta 2x.
  4. Etter å aspirere siste vask, fortsett til polering.
    Merk: Etter hver inkubasjon reaksjon i avsnitt 9.3, 10.3, 11.3, 12.3, 13.3, 14.3 og 15.3, spin rør kort og sted mot magnetstativ for 1 min og aspirer supernatant. Vask 2 ganger med 0,75 ml RIPA-buffer og 2 ganger med 0,75 ml Tris-HCl (pH 7,5).

9. Polering Reaction

  1. Fyll ut Polering mester mix beregningene (tabell 11). Gjør Polering miks i 1,5 ml tube på is. Pipette for å blande.
  2. Umiddelbart etter siste ChIP vask suges, tilsett 50 mL av Polering mix til hver prøve harpiks mens de fortsatt på magnetstativ. Prøvene inkuberes i 30 min ved 3 xgved 30 ˚C i en termomikser.
  3. Etter å aspirere siste vask som beskrevet i notatet etter § 8.4, gå videre til A-tailing.

10. A-tailing Reaction

  1. Fyll ut A-tailing mester mix beregningene (tabell 12). Make A-tailing mix i en 1,5 ml tube på is. Pipette for å blande.
  2. Umiddelbart etter Polering delen legger 50 mL av A-tailing mix til hver prøve harpiks mens de fortsatt på magnetstativ. Inkuber prøvene i 30 minutter ved 3 xg ved 37 ° C i et termomikser.
  3. Etter å aspirere siste vask som beskrevet i notatet etter § 8.4, går du videre til P7 Adapter hemorroider.

11. P7 Adapter ringsreaksjons

  1. Fyll ut hemorroider mester mix beregningene (tabell 13). Gjør ringsblandingen i 1,5 ml tube på is. Pipette for å blande.
  2. Umiddelbart etter A-tailing delen legger 48 mL P7 hemorroider mester mix og 2 mL av en annen adapter Index to hver prøve harpiks mens de fortsatt på magnetstativ. Inkuber prøvene for 2 timer ved tre xg ved 25 ˚C i en termomikser.
    Merk: Bruken av forskjellige indekser for hver prøve vil tillate flere prøver som skulle bli sekvensert i en enkelt strømningscelle.
  3. Etter å aspirere siste vask som beskrevet i notatet etter § 8.4, gå til Φ-29 Nick Repair.

12. Phi-29 Nick Repair Reaction

  1. Fyll ut Φ-29 mester mix beregninger (Tabell 14). Gjør Φ-29 mix i 1,5 ml tube på is. Pipette for å blande.
  2. Umiddelbart etter P7 hemorroider delen legger 50 mL av Φ-29 mix til hver prøve harpiks mens de fortsatt på magnetstativ. Inkuber prøvene i 20 min ved 3 xg ved 30 ˚C i en termomikser.
  3. Etter å aspirere siste vask som beskrevet i notatet etter § 8.4, fortsett til Kinase reaksjon.

13. Kinase Reaction

  1. Fyll ut Kinase mester mix beregninger (
  2. Umiddelbart etter Φ-29 delen legger 50 ul kinase bland til hver prøve harpiks mens de fortsatt på magnetstativ. Inkuber prøvene i 20 min ved 3 xg ved 37 ˚C i en termomikser.
  3. Etter å aspirere siste vask som beskrevet i notatet etter § 8.4, går du videre til Lambda Eksonuklease reaksjon.

14. Lambda Eksonuklease Reaction

  1. Fyll ut Lambda Eksonuklease mester mix beregningene (tabell 16). Gjør Lambda Eksonuklease blande i 1,5 ml tube på is. Pipette for å blande.
  2. Umiddelbart etter Kinase delen legger 50 mL av Lambda Eksonuklease bland til hver prøve harpiks mens de fortsatt på magnetstativ. Inkuber prøvene i 30 minutter ved 3 xg ved 37 ° C i et termomikser.
  3. Etter å aspirere siste vask som beskrevet i notatet etter § 8.4, går du videre til RecJ f reaksjon.

15. RecJ fnuclease Reaction

  1. Fyll ut RecJ f mester mix beregningene (tabell 17). Gjør RecJ f miks i 1,5 ml tube på is. Pipette for å blande.
  2. Umiddelbart etter Lambda Eksonuklease delen legger 50 ul RecJ f mix til hver prøve harpiks mens de fortsatt på magnetstativ. Inkuber prøvene i 30 minutter ved 3 xg ved 37 ° C i et termomikser.
  3. Etter å aspirere siste vask som beskrevet i notatet etter § 8.4, fortsett å chip Elution.

16. Elution og Crosslink Tilbakeføring

  1. Forbered konsentrat-blanding: antall prøver x 1.1 x (200 mL ChIP elueringsbuffer + 1 ul 20 mg / ml proteinase K) i 1,5 ml rør. Tilsett 200 ul ChIP elueringsbuffer + proteinase K mester mix til hver prøve harpiks.
  2. Inkuber prøvene over natten (ca. 16 timer) på 3 xg ved 65 ˚C i en termomikser med et oppvarmet lokk for å unngå kondens.

Dag 3: Utdrag DNAion og Adapter hemorroider

17. Elution og Crosslink Reversal (fortsatt)

  1. Etter inkubasjon over natten ved 65 ˚C, kort spinne prøver å samle kondensat. Plasser prøver på magnetstativ i 1 min.
  2. Overføre 200 ul supernatant til et nytt 1,5 ml rør inneholdende 200 ul TE-buffer (pH 7,5).

18. Fenol Kloroform isoamylalkohol (PCIAA) Extraction

  1. Tilsett 400 ul fenol-kloroform isoamylalkohol til hver prøve. Vortex til å blandes i 20 sek.
  2. Sentrifuger i 10 minutter ved 20.000 xg ved romtemperatur (RT). overføre forsiktig 325 ul av det øvre vandige lag til et nytt rør.
    Merk: Pass på å ikke overføre noen av de organiske (nederste laget) inn i det nye røret.
  3. Legg 1/10 volum av 3 M NaOAc (pH 5,5) og 1 ul 20 mg / ml glykogen til hver prøve. For flere prøver, forberede en master mix.
  4. Tilsett 3 volumer iskald 100% etanol til hver prøve. Vortexå blande. Inkuber i 15 minutter ved -80 ° C.
  5. -Sentrifuge i 15 minutter ved 20 000 x g ved 4 ° C. dekanter nøye overstående, og pass på å ikke forstyrre pelleten.
  6. Tilsett 500 mL rykende iskald 70% etanol, og pass på å ikke forstyrre pelleten. Sentrifuger i 5 min ved 20000 x g ved 4 ° C. dekanter nøye supernatant.
  7. Tørt pellet i ca. 20 minutter (eller til den er tørr) i en hastighet vakuum ved 45 ° C.
    MERK: Dette er en pause punkt i protokollen. Tørre DNA pellets kan lagres ved -20 ° C.
  8. Resuspender pellets i 10 mL DDH 2 O. Pipet gjentatte ganger over området der DNA pelletert, selv om den tørkede pellet kan ikke sees.
  9. Overfør 10 ul av hver prøve til en frisk 0,3 ml PCR-rør eller 8-stativ, avhengig av antall prøver.

19. P7 primerforlengelsesreaksjon

  1. Fyll ut P7 Primer Skjøte mester mix beregningene (tabell 18). Gjør Extension blande i 1,5 ml tube på is. Pipette for å blande.
  2. Tilsett 10 ul Forlengelse blanding (minus Φ-polymerase 29) til hver 10 pl prøve. Pipette for å blande.
  3. Kjør prøver i Thermocycler ved hjelp av programmet (tabell 19) til gløding primer til malen inntil 30 ˚C "hold" trinn.
  4. Tilsett 1 mL Φ-29 polymerase under 30 ˚C "hold" trinnet i programmet. Pipette for å blande. Gjenoppta resten av programmet (tabell 19).

20. A-tailing Reaction

  1. Fyll ut A-tailing mester mix beregningene (tabell 20). Make A-tailing mix i en 1,5 ml tube på is. Pipette for å blande.
  2. Tilsett 10 pl av A-tailing blanding til hver prøve. Pipette for å blande.
  3. I Thermocycler, inkubere prøvene i 30 minutter ved 37 ° C, og deretter varmeinaktivering i 20 minutter ved 75 ° C.

21. P5 Adapter ringsreaksjons

  1. Fill ut P5 Adapter Ligerings mester mix beregningene (tabell 21). Gjør ringsblandingen i 1,5 ml tube på is. Pipette for å blande.
  2. Tilsett 20 ul av P5 ringsblandingen til hver prøve. Pipette for å blande.
  3. I Thermocycler, inkubere prøvene i 2 timer ved 25 ° C.

22. Bead Opprydding

Merk: Vennligst se Materialer avsnitt for produsentens informasjon om perle rydde opp.

  1. Overfør hver 50 pl prøve i et nytt 1,5 ml rør.
  2. Resuspender rydde opp perler på en mini-rør rotator ved hastighetsinnstilling på 15 til 15 min ved RT. Ikke la perlene bosette før pipettering.
  3. Legg 60 mL rydde opp perlene prøve (1,2: 1 rydde opp perlene til prøve-forholdet er kritisk for å fjerne DNA som er kortere enn 200 basepar). Pipette til å blandes i 20 sek.
  4. Resuspender rydde opp perler på en mini-rør rotator ved hastighetsinnstilling på 15 i 3 minutter ved RT. I korthet spinne rør.
  5. Plasser rørene på magnetstativ i 1 min.Pipettér av og kast supernatanten.
    MERK: IKKE bruk vakuumaspirasjon i denne delen fordi det vil suge opp oppryddings perler.
  6. Legg 400 mL av rykende RT 70% etanol til hver prøve mens de er på magnetstativ. Ikke bland. Aspirer supernatant. Gjenta 2x.
  7. Tørk opprydding perler i 10 min ved RT. Fargen av kulene vil slå mørk til lys brun og meget små sprekker vil være synlig i harpiksen pelleten når perlene er tørre.
  8. For å eluere DNA, tilsett 40 mL 10 mM Tris (pH 7,5). Grundig pipettér til å blandes i 20 sek.
  9. Plassere prøvene på magnetstativet i 1 min. Sakte pipettér og overføre 36 mL eluatet direkte til 0,3 ml PCR rør.
  10. Gå direkte til PCR-reaksjons eller lagre eluatene ved -20 ° C.

Dag 4: PCR og Gel Analyse

23. PCR

  1. Fyll ut PCR mester mix beregningene (tabell 22). Gjør PCR mix. Pipet svært forsiktig for å blande for å unngåbobler.
  2. Legg 14 mL av PCR bland til hver 36 mL DNA-prøve. Pipette for å blande. Hold prøvene på is inntil de er klare til å sette i Thermocycler.
  3. For den positive PCR-kontroll, er et på forhånd fremstilt bibliotek. Til den negative kontroll PCR, omfatter vann. Kjør prøver i Thermocycler bruker PCR-programmet (tabell 23).

24. Gel Forberedelse, DNA Eksisjon, og visualisering

  1. Rengjør og skyll en passende størrelse gel boks med avionisert vann. Tilbered en 1,5% agarosegel (inneholdende 0,5 mg / ml etidiumbromid) med tykk, bred vel kam som kan holde 60 mL.
    MERK: Etidiumbromid (EtBr) er et kreftfremkallende og må behandles med forsiktighet.
  2. Spinn ned PCR prøverør kort for å samle kondens.
  3. Legg 1/5 volum på 6x xylen DNA fargestoff til kombinerte prøven. Ikke bruk bromfenolblått i DNA-fargestoff, siden det vandrer på samme sted som den prøve-DNA.
  4. Laste hele prøven into hver brønn, fortrinnsvis med tomme brønner i mellom prøver.
    Note: Biblioteker med de samme indeksene må ikke kjøres i samme gel.
  5. Belastning 7 ul 100 bp stige på begge sider av prøver. Kjør gel på 140 V i ca 30-45 min før bromophenol fargestoff i stigen er ¾ vei nedover gel.
  6. Bilde og visualisere gel på en transilluminator på en lav UV innstilling. Skjære deler av agarose som inneholder DNA-fragmenter 200-500 bp. Vær svært forsiktig for å unngå å kutte ut adapter dimer band som kjører på 125 bp.
  7. Plasser hver skåret gel skive i en 15 ml tube. Record nettovekt på hver gel skive. Skriv denne vekten direkte på tube.
  8. Bildet, lagre, og kommentere utskåret gel for å bekrefte riktig størrelse perioden.

25. Gel Rensing

  1. Rense DNA fra utskåret gel skive i henhold til produsentens instruksjoner, med følgende modifikasjoner.
  2. Oppløse gel skive av gyngeved RT på gynge plattform. Det vil ta omtrent 20 min for å oppløse.
  3. For å oppnå høyrenset DNA, vaskes kolonner med 0,5 ml buffer QG etter oppløst gel har passert gjennom kolonnen.
  4. Etter Buffer PE vask, la kolonner sitte ved RT i 2-5 min. Spinn i 1 min på 13 000 xg ved RT.
  5. For å gi rom for PCR reaksjon mester mix, elueres prøver med 40 mL EB Buffer til en frisk 1,5 ml tube.

26. DNA Kvantifisering

  1. Forbered prøvene i henhold til produsentens instruksjoner (tabell 24). Mål prøver i bestemt instrument med optiske rør.
  2. Når ChIP-exo biblioteker er kvantifisert, sende for sekvensering på en plattform som bruker sekvensering-by-syntese kjemi 16 som er kompatibel med DNA-adaptere i denne protokollen.
    MERK: Vanligvis er 2 ul av prøven er tilstrekkelig for kvantifisering, men mer kan være nødvendig hvis prøvekonsentrasjon er lavere. DNA gir typiskly området mellom 50 og 200 ng.
  3. Etter kvantifisering, lagre prøvene ved -20 ° C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figurene nedenfor representative resultater fra brikken-exo-protokoll som presenteres her. I motsetning til tradisjonelle chip-seq metoder med noen enzymatiske trinn, krever chip exo elleve sekvensielt avhengige enzymatiske reaksjoner (figur 1). Derfor må man være forsiktig ved hvert trinn for å sikre at hver reaksjonskomponent blir tilsatt til sin respektive reaksjonsmasterblanding. Vi anbefaler å generere en formalistisk regneark basert på reaksjons Tabeller å automatisk utføre reaksjon mester mix beregninger, skriver de resulterende tabellene, og deretter krysse av hvert element etter at den er lagt til master mix.

Vi benytter en rekke kvalitetskontroll tiltak gjennom protokollen for å sikre høy kvalitet sekvense resultater (figur 2). Hver brikke reaksjon består av tre grunnleggende komponenter: 1), ultralydbehandlet kromatin ekstrakt fra celler av interest, 2) et antistoff rettet mot proteinet av interesse, og 3) ProteinG (eller ProteinA) harpiks for å immobilisere de utfelte immunkompleksene. Innhenting av høy kvalitet ultralydbehandlet kromatin ekstrakter (figur 2A) kan være ganske utfordrende siden ultralyd betingelser må være optimalisert for hver celletype og ultralydinstrument. Det er verdt å bruke tid til å optimalisere dette trinnet fordi den høyeste kvalitet bibliotekene starte med et ultralyd resultat som gir DNA-fragmenter mellom 100-500 bp (Figur 2A, "+" lane). Siden formaldehyd tverrbindinger er labil og formaldehyd i seg selv har en begrenset holdbarhet, bruker vi en elektromobilitet shift-analysen (figur 2A, "-" lane) for å kontrollere at ultralyd ekstrakter inneholder intakte protein-DNA tverrbindinger, tydelig som super-shift av DNA-fragmentene. For å vurdere bakgrunnssignalet vi rutinemessig utføre en "mock" chip som utelater antistoff fra brikken reaksjon. En høy kvalitet ChIP-exo bibliotek preparat vil ha svært liten, om noen, bakgrunnssignalet i "mock" chip ( "-") i forhold til det spesifikke ChIP antistoff, i dette tilfelle rettet mot Pol II. Som vist i figur 2B, tradisjonelle Chip-seq bibliotekene har vesentlig mer bakgrunnssignal enn chip exo. Til slutt, før sekvensering, ChIP-exo bibliotek kvalitet vurderes på Bioanalyzer (Figur 2C - D). Analyse måler nøyaktig biblioteket størrelsesfordeling og oppdager forurensende adapter dimer (merket med pil) som kjører på 125 bp. Dersom adapter dimerer er til stede, vil de redusere den sekvense båndbredde. Derfor anbefaler vi en ekstra perle opprydding som effektivt fjerner DNA fragmenter mindre enn 200 bp.

ChIP-exo er en kraftig funksjonell genomikk teknikken fordi det er den eneste metoden som kan romlig løse divergerende, initiere, pause, og elongating RNA polymerase II ona genom-wide skala (figur 3) 11. Siden disse tilstøtende bindende hendelsene er titalls basepar fra hverandre, er chip seq klarer å skille disse bindende hendelser med oppløsningsevne på flere hundre basepar.

Figur 1
Figur 1: ChIP-exo Skjematisk. Etter chip, blir P7 adapter ligert til sonication grenser. Lambda eksonuklease trimmer deretter DNA 5 'til 3' for å kryssbindingspunktet, for derved å spor protein-DNA interaksjon. Etter eluering og crosslink reversering, syntetiserer primer extension duplex DNA. Til slutt, ligering av P5 adapteren markerer de venstre og høyre eksonuklease grenser, og det resulterende bibliotek underkastes high-throughput-sekvensering. Kartlegging av 5 'endene av sekvensen koder til referansegenom avgrenser eksonuklease barrieren og dermed den nøyaktige stedet av protein-DNAkryssbinding. Figur modifisert fra Rhee og Pugh 17. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: chip exo kvalitetskontroller. Paneler AC vise representative resultater fra ubeslektede eksperimenter. (A) Kvaliteten på sonikert kromatin ekstrakt (fra human HCC1806 brystkreftcellelinje) blir vurdert ved agarose gelelektroforese på ekstrakter med (+) og uten (-) tverrbindingene reversert. Intakte tverrbindinger vil føre til protein-DNA komplekser å migrere tregere. Således løper ekstrakt uten tverrbindinger reversert (-) gjør det mulig for kvaliteten på formaldehydtverrbindinger som skal vurderes, som er avgjørende for en vellykket chip. (B) Sammenligning av en mock IP (-) ennd Pol II (+) ChIP-exo og chip-seq bibliotek preparater etter 21 sykluser av PCR forsterkning. Etter PCR, DNA-fragmenter 200-500 bp skjæres ut (merket med rød hashet boks) og renset ved hjelp av en gel utvinning kit. (CD) I panel C, representerer den øverste spor en ideell spor fra en samlet bibliotek (P1), og den nederste spor viser en samlet bibliotek (P2) som inneholder adapter dimer. Panel D viser DNA tetthet tomten tilsvarer de P1-2 bibliotek spor fra felt C (pilen betegner adapter dimer band). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: ChIP-exo Romlig Løser Tydelig Toveis transkripsjonsinitieringen komplekser. (A) Glattet fordeling av tråd-separated ChIP-exo tag 5 'ender for Pol II, TFIIB, og TBP på menneske RPS12 genet i prolifererende K562 celler. (B) i gjennomsnitt ChIP-exo mønstre rundt nærmeste RefSeq TSS. Peak-pair koder ble justert til TSS gen-by-genet, binned i ikke-overlappende 10bp intervaller i forhold til TSS, og deretter gjennomsnittlig tetthet verdi topp-par på tvers av alle TFIIB-okkuperte (n = 6,511) gener ble plottet som en prosent av den totale. Den "toppene" av TBP og TFIIB er indiscernible (vertikalt forskjøvet i innfelt). (C) Modell basert på panel B data, illustrerer forskjellige transkripsjonsinitieringen komplekser løses av Chip-exo (svart kurve). Pol II okkupert to separate oppløsbare steder som sammenfaller med områder av avvikende transkripsjon innvielse ( "Divergent") og "pause" områder. Denne klare romlig separasjon av Pol II komplekser viser at avvik transkripsjoner oppstå fra forskjellige innvielses komplekser. De aller fleste Pol II krysskoblet abo UT 50 bp nedstrøms av TSS på "Pause" side, der det er ventet å ta en pause etter å initiere transkripsjon. Pol II ble mest brukt opp 20 - 60 bp oppstrøms for TSS der pre-initieringskomplekset ( "PIC") former, noe som indikerer at i gjennomsnitt det sannsynlig bruker mindre tid på det enn på de stoppede nettsteder. Dette tyder på at i de fleste (men ikke nødvendigvis alle) tilfeller, når Pol II er rekruttert, det raskt fjerner arrangøren og forutsetter et pause-state ca. 30 - 50 bp nedstrøms av TSS, i samsvar med den observasjon at Pol II pause utgivelsen er et hastighetsbegrensende trinn i transkripsjon. Disse tilstøtende innvielses komplekser er uløselig av Chip-seq (illustrert ved grå fill trace) siden oppløsningen er begrenset til noen få hundre basepar. Figur modifisert fra Pugh og Venters 11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

ontent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Opplysning Fil. 1: Tilleggsinformasjon Klikk her for å laste ned denne filen.

reagens Volum (ml) [Final]
1 M HEPES-KOH (pH 7,5) 50 50 mm
5 M NaCl 28 140 mm
0,5 M EDTA 2 1 mm
100% Glycerol 100 10%
10% NP40 50 0,50%
10% Triton X100 25 0,25%
DDH 2 O Fyll opp til en L

Tabell 1. Oppskrift for Lysis Buffer 1. Filtrer med 0,22 mikrometer filter. Oppbevares i 50 ml rør ved 4 ˚C. Tilsett 100 ul KPI lager til 50 ml buffer like før bruk.

reagens Volum (ml) [Final]
1 M Tris-HCl (pH 8) 10 10 mm
5 M NaCl 40 200 mm
0,5 M EDTA 2 1 mm
0,5 M EGTA 1 0,5 mm
DDH2 O Fyll opp til en L

Tabell 2. Oppskrift på Lysis Buffer 2. Filtrer med 0,22 mikrometer filter. Oppbevares i 50 ml rør ved 4 ˚C. Tilsett 100 ul KPI lager til 50 ml buffer like før bruk.

reagens Volum (ml) [Final]
1 M Tris-HCl (pH 8) 10 10 mm
5 M NaCl 20 100 mm
0,5 M EDTA 2 1 mm
0,5 M EGTA 1 0,5 mm
10% deoxycholate 10 0,10%
5 g 0,5% (vekt / volum)
DDH 2 O Fyll opp til en L

Tabell 3. Oppskrift på Lysis Buffer 3. Filtrer med 0,22 mikrometer filter. Oppbevares i 50 ml rør ved 4 ˚C. Tilsett 100 ul KPI lager til 50 ml buffer like før bruk.

reagens Volum (ml) [Final]
10x PBS 50 1x
Bovine Serum Albumin 2,5 g 0,50%
DDH 2 O Fyll opp til 500

Tabell 4. Oppskrift på Blokkering Buffer. Filter bruker 0,22 mikrometer filter. Oppbevares i 50 ml rør ved 4 ˚C. Tilsett 100 ul KPI lager til 50 ml buffer like før bruk.

reagens Volum (ml) [Final]
1 M HEPES (pH 7,5) 25 50 mm
0,5 M EDTA (pH 8) 1 1 mm
10% natriumdeoksycholat 35 0,70%
10% NP40 50 1%
1 M LiCl 250 500 mm
DDH 2 O Fyll opp til 500
innhold "fo: keep-together.within-page =" 1 "fo: keep-med-next.within-side =" always ">

Tabell 5. Oppskrift på RIPA buffer. Filter bruker 0,22 mikrometer filter. Oppbevares i 50 ml rør ved 4 ˚C. Tilsett 100 ul KPI lager til 50 ml buffer like før bruk.

reagens Volum (ml) [Final]
1 M Tris-Cl (pH 7,5) 2,5 50 mm
0,5 M EDTA 1 10 mm
20% SDS 2,5 1%
DDH 2 O Fyll opp til 50

Tabell 6. Oppskrift for ChIP elueringsbuffer. Filter bruker 0,22 mikrometer filter. Oppbevar ved romtemperatur.

reagens Volum (ml) [Final]
1 M Tris-Cl (pH 7,5) 0.5 10 mm
DDH 2 O Fyll opp til 50

Tabell 7. Oppskrift for TE-buffer. Filter bruker 0,22 mikrometer filter. Oppbevar ved 4 ˚C.

Volum (mL) [Final]
100 mikrometer ExA2-iX 75 15 mikrometer
100 mikrometer ExA2-33 75 15 mikrometer
1 M Tris (pH 7,5) 50 100 mm
5 M NaCl 5 50 mm
DDH 2 O 295 -
totalt volum 500

Tabell 8. P7 Adapter annealing mix.

Tabell 9. P5 Adapter annealing mix.

Volum (mL) [Final]
100 mikrometer ExA1-58 75 15 mikrometer
100 mikrometer ExA1-13 75 15 mikrometer
1 M Tris (pH 7,5) 50 100 mm
5 M NaCl 5 50 mm
DDH 2 O 295 -
totalt volum 500
Temp (C) Tid
95 5 min
72 5 min
65-60 rampe nedgang 5 min
55-50 rampe nedgang 3 min
45-40 rampe nedgang 3 min
30 3 min
20 3 min
10 3 min
4 For alltid

Tabell 10. Adapter annealing Program.

1x (mL) [Final]
DDH 2 O 39.8
10x reaksjonsbuffer 2 5 1x
100 mikrometer ATP 0.5 1 mm
3 mm dNTP 1.7 100 mikrometer
3 U / ul T4 polymerase 1 3 U
5 U / ul Klenow 1 5 U
10 U / mL T4 polynukleotidkinase 1 10 U
Totalt reaksjonsvolum 50

Tabell 11. Polering mester mix.

1x (pl) [Final]
DDH 2 O 42.3
10x reaksjonsbuffer 2 5 1x
3 mM dATP 1.7 100 mikrometer
5 U / pl Klenow-3'-5'-ekso minus 1 5 U
Totalt reaksjonsvolum 50

Tabell 12. A-tailing mester mix.

1x (pl) [Final]
DDH 2 O 41
100 mM ATP 0.5 1 mm
10x reaksjonsbuffer 2 5 1x
400 U / ul T4 DNA Ligase 1.5 600 U
Reaksjon mix volum 48
15 mM Index Adapter 2 30 picomol
Totalt reaksjonsvolum 50

Tabell 13. P7 Adapter hemorroider mester mix.

1x (pl) [Final]
DDH 2 O 41
10x Φ-29 Buffer 5 1x
3 mm dNTP 2,5 150 mikrometer
10 U / mL Φ-29 polymerase 1.5 15 U
Totalt reaksjonsvolum 50

Tabell 14. Φ-29 Nick Repair mester mix.

1x (pl) [Final]
DDH 2 O 43,5
100 mM ATP 0.5 1 mm
10x reaksjonsbuffer 2 5 1x
10 U / mL T4 polynukleotidkinase 1 10 U
Totalt reaksjonsvolum 50

Tabell 15. Kinase reaksjon mester mix.

1x (&# 956; l) [Final]
DDH 2 O 43
10x Lambda Buffer 5 1x
5 U / mL Lambda eksonuklease 2 10 U
Totalt reaksjonsvolum 50

Tabell 16. Lambda Eksonuklease reaksjon mester mix.

1x (pl) [Final]
DDH 2 O 44
10x reaksjonsbuffer 2 5 1x
30 U / mL RecJ f eksonuklease 1 30 U
Total reaksjon vKanonvolumet 50

Tabell 17. RecJ f Nuclease reaksjon mester mix.

1x (pl) [Final]
DDH 2 O 6,45
10x Φ-29 Buffer 2 1x
3 mM dNTP 1.3 200 mikrometer
20 mikrometer P7 Primer 0,25 0,25 mikrometer
Reaksjon mix volum 10
EtOH utfelt prøve 10
Totalt reaksjonsvolum 20

Tabell 18. P7Primerforlengelsesreaksjon masterblanding.

Temp (C) Tid
95 5 min
65 5 min
30 2 min
30 Hold til Φ-29 er lagt
30 20 min
65 10 min
4 For alltid

Tabell 19. P7 Primer Extension program.

1x (pl) [Final]
DDH 2 O 5
3 1x
3 mM dATP 1 0,1 mm
5 U / ul Klenow 3 'til 5' exo minus 1 5 U
Reaksjon mix volum 10
Primer utvidet prøve 20
Totalt reaksjonsvolum 30

Tabell 20. A-tailing mester mix.

1x (pl) [Final]
DDH 2 O 11.5
10x T4 Ligase Buffer 5 1x
15 mikrometer ExA1-58 /13 adapter 2 30 picomol
400 U / pl T4 DNA-ligase 1.5 600 U
Reaksjon mix volum 20
A-tailed prøven 30
Totalt reaksjonsvolum 50

Tabell 21. P5 Adapter hemorroider mester mix.

1x (pl) [Final]
5x PCR Buffer 10 1x (2 mM MgCl2)
10 mM av hver dNTP 1 200 uM hver
20 mikrometer P1.3 Primer 1,25 0,5 mikrometer
20 mikrometer P2.1 Primer 1,25 0,5 mikrometer
2 U / mL Hot Start-polymerase 0.5 1 U
Reaksjon mix volum 14
Perlene elueres prøve 36
Totalt reaksjonsvolum 50

Tabell 22. PCR.

<tr>
Temp (C) Tid Cycles
98 30 sek 1
98 10 sek 15-21 (avhengig av ChIP effektivitet)
52 30 sek
72 20 sek
72 2 min 1
4 For alltid Holde

Tabell 23. PCR-programmet.

Per DNA Standard (pl) Per Sample (pl)
1: 200 fortynnet buffer / fargestoff blanding 190 198
DNA-standarder 10
ChIP-exo-biblioteket 2
totalt volum 200 200

Tabell 24. Kvantifisering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi presenterer en funksjonell genomikk protokoll for å fastslå nøyaktig binding stedet for kromatin samspill proteiner på en objektiv, genom-wide måte på nær basepar oppløsning. Den mest kritiske trinn for å oppnå nær basepar kartlegging oppløsning er den eksonuklease behandling av chip-anrikede DNA mens immunpresipitatet forblir på den magnetiske harpiks. Tilsynelatende, kan protein komplekser potensielt blokkere in vivo footprinting av enhver underenhet (f.eks kromatin remodeling komplekser eller nucleosome kjernen partikkel). Imidlertid, som tidligere rapportert 10, ettersom formaldehyd er en ineffektiv tverrbindingsmiddel, blir det stadig usannsynlig at multiple subenheter av et kompleks vil tverrbindes til DNA og hverandre i samme celle på samme locus. Således in vivo footprinting av de enkelte underenheter av et proteinkompleks, for eksempel individuelle histon subenheter av et nucleosome, er mulig med Chip-exo.

t "> Det mest bemerkelsesverdige fordeler chip-exo er dens nær basepar oppløsning og lav bakgrunn. Den ultra-høy oppløsning tillater detaljerte strukturelle og romlige innsikt til å bli gjort på et genom-wide skala som i dag ikke er mulig med noen annen metode . på den annen side, er den primære begrensning chip-exo er at det er en teknisk krevende molekylærbiologisk metode til å mestre. i tillegg har de generelle begrensningene av brikken trinnet gjelder også til chip-exo (for eksempel kommersielt antistoff tilgjengelighet og spesifisitet , epitop tilgjengelighet og forholdsvis stort antall celler er nødvendig). Vanlige fellene er dårlig kvalitet sonikerte ekstrakt, ved hjelp av et ikke-chip klasse-antistoff, og ikke å holde prøvene på is så mye som mulig. Således må ultralydbetingelser nøye optimalisert, og hvert antistoff validert som tidligere beskrevet, 18 for å unngå de skadelige virkninger av disse parametrene kan ha på det eksperimentelle resultat.

Så langt somsekvense dybde for en transkripsjonsfaktor mål, vi vanligvis satse på omtrent 20 millioner unike justert leser. Siden Pol II og histonmodifikasjonene er mer bredt distribuert, vi satse på 30-50 millioner leser. Det er viktig å merke seg at siden chip exo har vesentlig mindre bakgrunn enn chip seq, færre leser er nødvendig for å oppnå tilsvarende sekvense dybde.

Chip-exo-teknologi blir nå allment vedtatt til tross for sine tekniske utfordringer, som robuste variasjoner på den opprinnelige protokollen fortsette å bli publisert 17,19,20. Spesielt er en variasjon som kan vise seg å være nyttig for vanskelig å brikke proteiner kalt chipbindeleddet, som bruker en enkelt ligeringstrinn for å øke effektivt av biblioteket fremstilling 20. Oppsummert er chip exo en stadig ansatt og kraftig metodikk for ultrahøy oppløsning kartlegging av kromatin samspill proteiner på en global skala. Som listen over kommersielt tilgjengelig ChIP-grade mauribodies fortsetter å vokse, vil fremtidige anvendelser av chip-exo metodikk være rettet mot å kartlegge ukjente gennettverk å forstå den molekylære krets av cellen i ultrahøy oppløsning. I tillegg vil chip-exo sannsynlig bli ytterligere raffinert og innrettet til å fotavtrykk in vivo protein-RNA-interaksjoner ved nær basepar oppløsning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
37% formaldehyde, methanol free, 10 x 10 ml ampules ThermoFisher Scientific 28908 Section 3
Complete Protease Inhibitor cocktail (CPI) Roche Life Science 11873580001 Sections 4, 8
Bioruptor sonicator Diagenode UCD200 Section 5
15 ml polystyrene tubes BD Falcon 352095 Section 5
MagSepharose Protein G Xtra beads GE Healthcare 28-9670-66 Section 6
DynaMag-1.5 ml Side Magnetic Rack Invitrogen 12321D Sections 6-17, 22
Mini-Tube Rotator Fisher Scientific 05-450-127 Sections 7, 22
T4 DNA Polymerase New England BioLabs M0203 Section 9
DNA Polymerase I, Klenow New England BioLabs M0210 Section 9
10x NEBuffer 2 (10x Reaction Buffer 2) New England BioLabs B7002 Sections 9-11, 13, 15, 20
Thermomixer C Eppendorf 5382 Sections 9-16
ATP Roche Life Science 010419979001 Sections 9, 11, 13
dNTPs New England BioLabs N0447 Sections 9, 12, 19, 23
T4 Polynucleotide Kinase New England BioLabs M0201 Sections 9, 13
dATP New England BioLabs N0440 Sections 10, 20
Klenow 3'-5' Exo Minus New England BioLabs M0212 Sections 10, 20
T4 DNA ligase  New England BioLabs M0202 Sections 11, 21
Φ-29 DNA Polymerase New England BioLabs M0269 Sections 12, 19
10x Φ-29 Buffer New England BioLabs B0269 Sections 12, 19
Lambda Exonuclease New England BioLabs M0262 Section 14
10x Lambda Buffer New England BioLabs B0262 Section 14
RecJf Exonuclease New England BioLabs M0264 Section 15
Proteinase K Roche Life Science 03115828001 Section 16
Glycogen Roche Life Science 010901393001 Section 18
10x T4 Ligase Buffer New England BioLabs B0202 Section 21
AMPure XP (clean up) beads  Beckman Coulter A63881 Section 22
Q5 Hot Start DNA Polymerase  New England BioLabs M0493 Section 23
5x Q5 Buffer (5x PCR Buffer) New England BioLabs B9027 Section 23
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704 Section 25
Qubit Fluorometer Invitrogen Q33216 Section 26
Optical Clear Qubit tubes  Invitrogen Q32856 Section 26
Qubit dsDNA High Sensitivity Assay kit Invitrogen Q32851 Section 26

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Venters, B. J., Pugh, B. F. How eukaryotic genes are transcribed. Crit Rev Biochem Mol Biol. 44, 117-141 (2009).
  2. Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147, 1408-1419 (2011).
  3. Chen, J., et al. Single-molecule dynamics of enhanceosome assembly in embryonic stem cells. Cell. 156, 1274-1285 (2014).
  4. Wales, S., Hashemi, S., Blais, A., McDermott, J. C. Global MEF2 target gene analysis in cardiac and skeletal muscle reveals novel regulation of DUSP6 by p38MAPK-MEF2 signaling. Nucleic acids research. 42, 11349-11362 (2014).
  5. Cho, S., et al. The architecture of ArgR-DNA complexes at the genome-scale in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 43, 3079-3088 (2015).
  6. Katainen, R., et al. CTCF/cohesin-binding sites are frequently mutated in cancer. Nat Genet. 47, 818-821 (2015).
  7. Murphy, M. W., et al. An ancient protein-DNA interaction underlying metazoan sex determination. Nat Struct Mol Biol. 22, 442-451 (2015).
  8. Zere, T. R., et al. Genomic Targets and Features of BarA-UvrY (-SirA) Signal Transduction Systems. PLoS One. 10, e0145035 (2015).
  9. Rhee, H. S., Pugh, B. F. Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes. Nature. 483, 295-301 (2012).
  10. Rhee, H. S., Bataille, A. R., Zhang, L., Pugh, B. F. Subnucleosomal structures and nucleosome asymmetry across a genome. Cell. 1377-1388 (2014).
  11. Pugh, B. F., Venters, B. J. Genomic Organization of Human Transcription Initiation Complexes. PLoS One. 11, e0149339 (2016).
  12. Albert, I., Wachi, S., Jiang, C., Pugh, B. F. GeneTrack--a genomic data processing and visualization framework. Bioinformatics. 24, 1305-1306 (2008).
  13. Guo, Y., Mahony, S., Gifford, D. K. High resolution genome wide binding event finding and motif discovery reveals transcription factor spatial binding constraints. PLoS computational biology. 8, e1002638 (2012).
  14. Bardet, A. F., et al. Identification of transcription factor binding sites from ChIP-seq data at high resolution. Bioinformatics. 29, 2705-2713 (2013).
  15. Wang, L., et al. MACE: model based analysis of ChIP-exo. Nucleic Acids Res. 42, e156 (2014).
  16. Bentley, D. R., et al. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature. 456, 53-59 (2008).
  17. Rhee, H. S., Pugh, B. F. ChIP-exo method for identifying genomic location of DNA-binding proteins with near-single-nucleotide accuracy. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 21, Unit 21.24 (2012).
  18. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22, 1813-1831 (2012).
  19. Serandour, A. A., Brown, G. D., Cohen, J. D., Carroll, J. S. Development of an Illumina-based ChIP-exonuclease method provides insight into FoxA1-DNA binding properties. Genome Biol. 14, R147 (2013).
  20. He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints. Nat Biotechnol. 33, 395-401 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics