El alimentador de ensayo capilar para analizar el consumo de alimentos en

Neuroscience

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Diegelmann, S., Jansen, A., Jois, S., Kastenholz, K., Velo Escarcena, L., Strudthoff, N., Scholz, H. The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (121), e55024, doi:10.3791/55024 (2017).

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Abstract

Introduction

Comer es esencial; Sin embargo, la desregulación de la ingesta de alimentos que resulta en trastornos de la alimentación como la bulimia, la anorexia o la tendencia general a comer en exceso supone un coste para la sociedad y los individuos 1, 2, 3. El objetivo de la presente investigación es descubrir los mecanismos de regulación de la ingesta de alimentos y para proporcionar una estrategia para eludir la formación trastorno. Numerosos estudios utilizando organismos modelo de mamíferos han proporcionado nuevos conocimientos de los circuitos y el papel de los sistemas de señalización en los trastornos de 4, 5, 6 de comer. Sin embargo, nuestro conocimiento de las bases neuronales y moleculares que subyacen a estos trastornos se mantiene lejos de ser completa. En los últimos años, la mosca de la fruta Drosophila melanogaster se ha convertido en un sistema modelo valioso para desentrañar conocimientos mecánicos básicos en la regulación de metabolism 7, 8, 9. El ensayo capilar de alimentación (CAFE) de Drosophila melanogaster se estableció en el laboratorio de Seymour Benzer en 2007 inspirado en un trabajo anterior de Dethier en blowfly 10, 11. El ensayo CAFE hizo posible medir directamente la ingesta de alimentos en Drosophila melanogaster. En este sistema de análisis de comportamiento, las moscas se alimentan de alimento líquido proporcionado en capilares de vidrio graduadas colocadas dentro de un vial. El descenso del menisco capilar indica pérdida de solución de alimentación a través de la evaporación y consumo de alimentos. La determinación de la velocidad de evaporación por viales sin moscas permite la cuantificación precisa de la ingesta de alimentos.

El ensayo Café es uno de los diversos paradigmas de comportamiento utilizados para medir la alimentación en Drosophila melanogaster y los investigadores tienen que elegir el más adecuado para su específicapregunta. La decisión de utilizar un determinado ensayo deben considerar los siguientes puntos: la naturaleza de los alimentos proporcionados; la condición de alimentación; la medición de la ingesta o absorción de nutrientes y el consumo de alimentos investigación o de reacción a la alimentación.

El ensayo CAFE como se describe en este informe es ideal para después de la ingesta de alimentos de una fuente de alimento líquido bajo una condición de la alimentación en posición vertical. Como alternativa, la ingesta de alimentos se puede medir para un grupo mosca en una fuente de alimento de color en un vial o en una placa. Las moscas se mataron normalmente o anestesiados después de la alimentación y la cantidad de colorante ingerido se determina por espectrometría o inspección visual del abdomen manchado. Las moscas comienzan a excretar los alimentos ingeridos solamente 30 min después de la ingesta, por lo tanto, este enfoque es difícil de utilizar para el análisis de la alimentación ya continua comportamientos 12, 13.

En contraste moscas se mantienen intactos cuando colorante absorbibles con trazadores radioactivos se utilizan y su consumo de radioisótopo se anotó en un contador de centelleo de 14, 15. La absorción del radiofármaco por el sistema digestivo de la mosca hace posible la medición de la absorción de alimentos a largo plazo, pero podría llevar a una subestimación del consumo a causa de las moléculas no absorbidos y excretados trazadores. Otro enfoque para medir la respuesta a la alimentación en Drosophila melanogaster es la respuesta extensión proboscis (PER), que normalmente se produce por la ingesta de alimentos 16. Este método elegante mide la respuesta inicial a un estímulo comida, pero no registra la cantidad de ingesta. La ingesta de alimentos se ajusta dinámicamente durante la alimentación utilizando varias señales de retroalimentación post-digestivas que son críticos para la regulación de la alimentación 17, 18. Varios intentos se han hecho en los últimos años para la recolección de datos semi-automatizar en el ensayo PER 19, 20. El PER es detectado por una almohadilla eléctrica o una combinación de electrodos y contó a través del ordenador. Combinando el ensayo PER con la absorción de radioisótopos reveló que este ensayo está limitado por la baja sensibilidad a la detección de diferencias de alimentación cantidad 18. El ensayo manual de alimentación (MAFE) 21, en el que una mosca se alimenta manualmente con un capilar de vidrio, se ha desarrollado recientemente para determinar el consumo de alimento en una sola mosca inmovilizado. El ensayo MAFE elimina las interferencias de búsqueda de alimento y la alimentación de iniciación y tiene una resolución de tiempo de segundos, y la iniciación de POR y el consumo de alimentos puede ser controlada de forma independiente en el ensayo. Sin embargo, la forma en que la inmovilización de la mosca afecta ciertos aspectos de la conducta alimentaria (por ejemplo, la locomoción, la motivación) todavía tiene que ser investigado. Por sus excelentes exámenes comparativos de diferentes ensayos para medir el consumo de alimentos en Drosophila mílanogaster y para ayudar a los investigadores para encontrar el más adecuado, consulte los informes de Deshpande y Marx 13, 22.

El ensayo CAFE evita algunas de las desventajas de otros ensayos descritos anteriormente y combina la simplicidad de uso con la medición fiable de la ingesta de alimentos. Aquí, se proporciona una descripción detallada del ensayo CAFE y que muestran una modificación sencilla configuración para reducir la evaporación. Los resultados representativos, incluyendo un ensayo de dos manjares (a corto y largo plazo) y la absorción de sacarosa de las moscas se demuestra. En la discusión comparamos nuestro método descrito con formas alternativas de realizar el ensayo CAFE, y poner de relieve las limitaciones potenciales.

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Protocol

1. El Ensayo CAFE

NOTA: El ensayo consta de tres componentes: un vial experimental, una tapa específica y capilares micro. Una caja de plástico con tapa se utiliza para el transporte de los viales preparados y para controlar la humedad de manera más eficiente.

  1. Utilice una Drosophila melanogaster vial plástico de cultivo (opcional altura 8 cm, 3,3 cm de diámetro) como un tubo para el ensayo.
  2. Sellar el vial con una tapa de plexiglás fabricado que contiene una junta tórica (Figuras 1A, 1B). Cargar vuela tocando o con un soplete través de la abertura de la tapa central (0,9 cm de diámetro), que también permite la circulación de aire y de agua, y cerrar el agujero con un tapón de esponja. Seis aberturas cónicas de menor tamaño (0,4 cm de diámetro superior, de 0,3 cm de diámetro interno) rodean el orificio central y se ajustan a las puntas de pipeta 2 - volumen de 20 l para mantener los capilares en su lugar. (Véanse los gráficos complementarios para detalles técnicos de la tapa.)
    NOTA: El usode un tapón de esponja con aberturas para los capilares en lugar de la tapa a medida utilizado en nuestro manuscrito es posible. Nuestra tapa a medida permite una manipulación segura de los viales preparados minimizando el riesgo de capilares cayendo.
  3. Para presentar el alimento líquido, utilizar 5 Microcapilares mu L con 1 marca mu l. Coloque los capilares en las aberturas cónicas en la tapa cortando la parte superior de un 2 - l punta de pipeta 20 y la inserción de la punta en el orificio (Figura 1B, marcada con el borde rojo). Para evitar que las moscas se escape, sin cortar insertar un 2 - 20 l punta de la pipeta en la misma abertura.
  4. Para manejar con seguridad viales de múltiples preparados, colocarlos en una caja de plástico con una incrustación cuadriculada (Figura 2A).

2. Preparación de las moscas

  1. Mantener las moscas en la comida estándar a 25 ° C, 60% de humedad relativa y un ciclo de luz-oscuridad / 12 h 12 h.
  2. Para el control de las condiciones de cría, introducir 35 hembras vírgenes de unaD 15 hombres por cada grupo experimental en un vial de cultivo de plástico (altura 9,8 cm, 4,8 cm de diámetro) que contienen 50 ml vuelan alimentos. Permitir que las moscas pongan huevos durante los primeros 3 días, a continuación, transferir las moscas adultas a viales de alimentos frescos y dejar que ellos ponen sus huevos durante dos días más. Después de esto repetir la transferencia de nuevo. adulto descarte vuela después de 2 días más.
  3. Como la ingesta de alimentos depende del tamaño de la mosca, determinar el peso de un grupo de 100 moscas anestesiando de 2 a 3 días de edad, las moscas adultas usando una almohadilla mosca CO 2 y recogerlos en un tubo de plástico de 1,5 ml y midiendo con un estándar de escala de laboratorio. Determinar el peso en húmedo de al menos cuatro grupos de moscas independientes según el sexo (Tabla 1); utilizar el peso para calcular el consumo de alimentos l por mg mosca. Utilice el valor para determinar la cantidad de alimento que un solo mosca alimenta por experimento y ajustar el número de capilares llenos de alimentos en consecuencia para evitar el vaciado de los capilares por la alimentación.
    1. Para un 3 h de ensayo, el uso20 moscas y dos capilares llenos. Para un experimento a largo plazo (> 3 h y hasta 9 días), utilizar un grupo de ocho moscas con un suministro de cuatro capilares llenos (resultados fiables no se pueden obtener con menos de ocho moscas en las condiciones descritas).
  4. Moscas separados en grupos de 8 o 20 (moscas) después de la medición de peso bajo la exposición al CO 2. Transferir el grupo a un nuevo vial de alimentos (que contiene 15 ml de alimentos estándar) para permitir la recuperación de CO 2 sedación para 48 h antes del experimento. Utilice de 4 a 6 días de edad moscas para el ensayo CAFE.
  5. Como moscas de tipo salvaje no tiene hambre alimenta sólo de forma marginal 19, 21, pre-morir de hambre vuela por 3 h experimentos de alimentación. No se requiere ayuno cuando el consumo de alimento se controló a lo largo de varios días. Para el ayuno, la transferencia vuela 16 a 20 h antes del ensayo tocando suavemente en un vial que contiene sólo un diámetro de doblado de papel de filtro de 45 mm humedecido con ~ 0,5 ml ddH2 O (bidestilada agua), y se cierran con una tapa ensayo CAFE enchufado.

3. Preparación de alimentos líquidos

  1. Preparar a (% 10, w / v) 3 M solución de sacarosa rellenando 102,6 g de sacarosa (C 12 H 22 O 11) a 100 ml de ddH 2 O. Pipetear 3 l, 33 l, 333 l, 3,3 ml y 6,6 ml de la solución madre en un tubo de plástico 15 mL; Añadir 2 ml de colorante alimentario (para el rojo: La cochinilla [E124]; para el azul: índigo carmín [E132]) y rellenar hasta 10 ml con ddH 2 O. Las concentraciones resultantes son 0,001, 0,01, 0,1, 1, y 2 M de sacarosa .
    NOTA: El colorante alimenticio permite visualizar el menisco más fácilmente. Sin embargo, el tinte podría tener un impacto en la ingesta de alimentos. Para evitar un sesgo debido al colorante dispensar el colorante alimenticio o aleatorio el uso de colorantes a las muestras de alimentos durante el experimento y grupos.
  2. Para la prueba de alcohol pipeta de preferencia de 333 l de sacarosa al 3 M solución madre en un tubo de plástico de 15 ml.Añadir 1,5 ml (2,3 ml) de 100% EtOH (etanol) y se añade ddH 2 O hasta 10 ml para dar como resultado 15% (0,25 mM) y un 23% (0,39 mM) soluciones de trabajo.
  3. Mantener las soluciones madre a -20 ° C y soluciones de trabajo a 4 ° C; utilizar el plazo de 1 semana.
  4. Llenar hasta 10 capilares, al mismo tiempo con una solución de comida de color, por la fuerza capilar. Inserte los extremos de los capilares en la solución de sacarosa (que sostiene los capilares en un ángulo de 45 ° a la solución). Pare si el líquido llega a la parte superior (5 l) marca del capilar y eliminar el exceso de solución en el exterior y el interior con papel de seda.

4. Montaje y realización de las pruebas capilares Feeder

  1. Si no es necesario el ayuno, la transferencia de las moscas experimentales para el ensayo pulsando o soplete. Asegúrese de incluir tres viales de control sin moscas para cuantificar la evaporación.
  2. Retirar con cuidado una punta de pipeta (2 - volumen de 20 l) que se está cerrando una de las cierren y externags, e insertar un capilar de vidrio, el extremo inferior de lleno en primer lugar. Fije el capilar mediante la colocación de la punta de pipeta de nuevo al lado del capilar. Si hay varias soluciones de alimentos están siendo probados, repetir este procedimiento en consecuencia.
  3. Coloque el capilar termina en el interior de todos los viales en el mismo nivel para evitar el sesgo que podría ocurrir si las fuentes de alimentos se encuentran en diferentes alturas (3 - 4 cm de la tapa); mantener una distancia al papel de filtro para evitar que el capilar se fugue al tocar accidentalmente el papel de filtro o de diferentes viscosidades de las fuentes de alimentos.
  4. Etiquetar el extremo superior del líquido de color usando un rotulador (marca de inicio). Para asegurar que los diferentes capilares se pueden identificar, etiquetar de forma individual mediante un código de colores o rayas.
  5. Colocar varios ensayos CAFE preparadas dentro de una caja de plástico con incrustaciones cuadriculada y transferir la caja (Figura 2 A) a una posición segura en condiciones de laboratorio o en una con temperatura, clim luz y humedad controladascomió la cámara (parámetros: 25 ° C, 60% de humedad relativa, 12 h / 12 h ciclo de luz-oscuridad) durante el período experimental (por ejemplo, 3 horas o días).
  6. Como parte inferior de papel de filtro se seca si el ensayo se realiza durante varios días, aplicar agua fresca cada 24 h a través del tapón de esponja (100 l) para mantener constante la humedad en el interior del ensayo. Utilice cuatro viales separados (8 cm de altura, 3.3 cm de diámetro) con 30 ml de ddH2O como dispositivos de humedad y colocarlos al lado de los ensayos de café en la caja de plástico. Use una cubierta para la caja de plástico para crear un ambiente de humedad controlada durante el experimento (Figura 2A).
    NOTA: la variabilidad más amplio se produce en condiciones de laboratorio; Sin embargo, es factible realizar el ensayo CAFE a temperatura ambiente (por ejemplo., en un salón de clases). El uso de un dispositivo de humidificación (papel de filtro, con o sin un tapón de esponja mojada, frascos de agua y cubierta de llenado de la caja de plástico) es muy aconsejable para disminuir la evaporación (
  7. Reemplazar los capilares llenos con los recién para los experimentos a largo plazo cada 24 h. Tome nota de moscas muertas antes de cada intervalo de 24 horas y utilizar el número de moscas vivas para calcular el consumo per mosca para el período siguiente. Desechar los antiguos capilares después de medir la disminución del menisco (véase 5.1).
    NOTA: Durante un experimento de 3 h que casi no vimos ninguna moscas muertas. Durante un estudio de 4 días que normalmente encontramos 1 - 3 moscas muertas.
  8. Al final del ensayo o antes de cambiar el capilar, marcar el menisco inferior del capilar (extremo) marca con un rotulador mientras que el ensayo de café está todavía en la posición vertical. Descartar los datos en caso extremo marca no está por debajo de la marca inicial (marca de inicio). No quite la tapa, ya que esto podría cambiar el menisco.
  9. Retirar con cuidado los capilares a partir del ensayo y almacenarlos para la recolección de datos. Compruebe si el líquido en el interior del capilar alcanza el extremo inferior si no Discard los datos, ya que la comida no era accesible a las moscas. Recoger todos los capilares por vial como un grupo. Inserte las puntas de pipeta sin cortar en todas las aberturas para evitar que las moscas escapen. Desmantelar la instalación y lavar los frascos, tapas y tapones de esponja en un baño de jabón y secar durante la noche a temperatura ambiente para su uso posterior.
    NOTA: Las moscas pueden ser analizados después del ensayo. Confirmar la absorción de los alimentos por el ojo o con un microscopio de disección.
  10. Repetir los experimentos con los mismos genotipos en al menos tres días diferentes.

5. Recolección de datos y análisis

  1. Medir la distancia entre el comienzo y el final marca de marca en el capilar utilizando un calibrador o una regla. Para transferir datos directamente a una hoja de cálculo, utilice un puerto USB (Universal Serial Bus) calibrador digital (Figura 1E) conectado. Desechar los capilares después de la medición.
  2. Cuenta para el tamaño de capilar para calcular la absorción de alimentos o evaporación. Por ejemplo, considere un casquilloIllary que es de 73 mm de largo y contiene 5 l de solución de alimentación. Una disminución 14,6 mm en el menisco refleja la absorción de 1 l solución. Calcular la absorción de los alimentos utilizando la siguiente fórmula:
    la absorción de los alimentos (l) = distancia medida (mm) / 14,6 mm
  3. Para excluir el efecto de la evaporación en la ingesta de alimentos, calcula haciendo la media de evaporación en los viales de control de tres (como mínimo) y sin moscas. Restar este valor medio a partir del valor obtenido para el consumo de alimentos por las moscas.
  4. Utilice la siguiente fórmula para determinar el consumo total por mosca:
    El consumo de alimentos (l) = (alimentos captación de [l] - la pérdida por evaporación [l]) / número total de moscas en el vial. Para los experimentos a largo plazo utilizan el número de moscas vivas antes del inicio del intervalo de 24 h.
  5. Para dar cuenta de las diferencias en el tamaño del cuerpo, como por ejemplo entre las moscas macho y hembra, normalizar el consumo de alimentos con el peso corporal (l alimentos / mg mosca).
  6. Utilice el software estadístico para el análisis de datos. por normaaliado de datos distribuidas, T-pruebas el uso de los estudiantes para determinar las diferencias entre los dos grupos de moscas, y el uso de ANOVA (análisis de varianza) con pruebas post hoc de Tukey Cramer durante más de dos grupos. En una situación de elección, analizar las diferencias de elección al azar utilizando una prueba de los signos de una muestra no paramétrico.

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Representative Results

Las moscas del genotipo w 1118 se utilizan para demostrar cómo se realiza el ensayo. Los w 1118 mutantes se utilizan comúnmente para generar líneas transgénicas y para controlar los antecedentes genéticos de transgenes marcado con el gen blanco. Normalmente, para los experimentos de comportamiento, todas las líneas transgénicas se retrocruzaron durante cinco generaciones a la misma w 1118 de valores, que se utiliza como un control experimental. Mostramos diferentes experimentos: una comparación de la pérdida por evaporación para nuestra configuración modificada, un experimento de elección de alimentos a corto plazo, un experimento de la ingesta de alimentos a largo plazo, y un experimento en diferentes diluciones de sacarosa.

La evaporación juega un papel crítico en el rendimiento del ensayo CAFE. Se incluyeron los enfoques adicionales para nuestro ensayo para disminuir la evaporación: i) el tapón central de la esponja se vuelve a llenar con agua cada 24 h; ii) adicional agua llena viales dentro de la caja de transporte y iii) el uso de una cubierta para la caja para crear un recinto de humedad (véase 4.6). La comparación de la evaporación entre una configuración sin y con dispositivos mencionados anteriormente, se observa una reducción significativa de la evaporación. Incluso el efecto de la mayor volatilidad de una solución de etanol que contiene no es detectable mediante la nueva configuración.

En un experimento de alimentación de dos elección de un grupo de 20 moscas puede alimentar por 3 h. En ambientes naturales, moscas de la fruta se alimentan preferentemente en la fermentación de frutas con alcohol 22, y se ha demostrado, utilizando una configuración similar, que las moscas prefieren soluciones de levadura-sacarosa con etanol sobre las soluciones de levadura-sacarosa sin etanol 23. Aquí, dos opciones de alimentos se ofrecen, una solución 0,1 M de sacarosa marcada con colorante alimentario rojo y una solución 0,1 M de sacarosa con 15% EtOH marcado con color de los alimentos azul (Figura 1A, C). visual exLa aminación del abdomen indica que las moscas se alimentan de las dos soluciones (Figura 1D). El consumo de alimentos por la mosca es significativamente mayor (casi 2 veces) para la solución de sacarosa que contiene EtOH (Figura 3A).

En un siguiente experimento, un estudio a largo plazo, un grupo de ocho moscas tiene acceso a las fuentes de alimentos similares durante 4 días, y las moscas consumen más de la comida que contiene etanol en cada día (Figura 3B). El índice de preferencia para el etanol ([Suc + EtOH] - [Suc] / consumo total) se mantiene constante durante este período (media = 0,29, Tabla 4). La preferencia etanol observado es compatible con varias otras publicaciones y muestra que las moscas pueden distinguir entre diferentes fuentes de alimento 24, 25, 26. La atracción etanol observado podría ser el resultado de los diferentes contenidos calóricos delas soluciones que se ofrecen y de las propiedades de recompensa de etanol 24. El ensayo también se puede usar para medir los efectos negativos de los complementos alimenticios. Ja y sus colegas mostraron en la primera publicación de este método que la aplicación de paraquat (un fármaco oxidante) disminuye el consumo de alimentos 10.

En el siguiente experimento, se muestra la diferencia en la ingesta de alimentos entre los sexos. Requerimientos metabólicos difieren entre macho y hembra de D. melanogaster. Por ejemplo, mientras que las moscas macho prefieren comida rica en carbohidratos, durante la producción de huevos, una fase que requiere un aumento de la biosíntesis de proteínas, las hembras prefieren dietas ricas en proteínas sobre las dietas ricas en carbohidratos 27. moscas hembra Acoplado macho y se utilizaron en este experimento. Para analizar las diferencias en la ingesta de alimentos entre 20 a 20 moscas hembra dentro de un intervalo de alimentación de 3 horas y masculinos, un ensayo de CAFE se realiza utilizando una concent sacarosaserie de racionamiento. Se proporcionaron cinco capilares, con soluciones que van 10-3 a la sacarosa 2 M, y el consumo de cada solución se midió (Figura 4A). Los resultados mostraron que ambos sexos prefieren soluciones de sacarosa de alta concentración como fuente de alimento (Figura 4A). Sin embargo, las mujeres consumen significativamente más de las dos soluciones de sacarosa de concentración más baja en comparación con los hombres (P <0,05); Por otro lado, los hombres consumen significativamente más de las soluciones de mayor concentración (P <0,001). Tenga en cuenta que estos datos no explican las diferencias en el tamaño corporal. Mujer D. melanogaster son generalmente más grandes y más pesados que los hombres (Tabla 1). Cuando el consumo de alimentos se normaliza a volar en masa, las diferencias entre hombres y mujeres en el consumo de soluciones de bajo-sacarosa ya no son significativos. En resumen, los hombres consumen más solución de sacarosa que las hembras apareadas, en consonancia con los datos anteriores, refleja posibles demandas metabólicas diferentes, las preferencias de nutrientes o simples diferencias en la capacidad de alimentarse de los capilares entre los dos sexos.

Figura 1
Figura 1: La Drosophila melanogaster capilar alimentador de Ensayo. A) El ensayo de alimentación con las moscas. papel de filtro humedecido proporciona el agua en la parte inferior del vial. Cuatro capilares se proporcionan durante el experimento (alimentos rojos y de color azul en los capilares opuestos). Tenga en cuenta que los capilares están asegurados en su posición por un segundo punta de la pipeta, y las posiciones no utilizadas se cierra utilizando puntas de pipeta. Un tapón de espuma en el centro de la tapa permite el intercambio de aire. B) Vista en detalle de la tapa. puntas de pipeta de corte (2 - 20 l, bordes rojos) se insertan en las aberturas cónicas de posiciones no utilizadas, y un segundo pipette punta se inserta en la punta de corte para cerrar el agujero. Las puntas de pipeta de corte se utilizan para controlar la colocación de los Microcapilares y consejos sin cortar se utilizan para mantener los capilares estrechos. C) Una mosca D. melanogaster se alimenta de un capilar. D) Después de la alimentación, los alimentos de color es claramente visible en el abdomen de la mosca. E) Un calibrador digital se utiliza para medir la distancia entre la marca de inicio y marcar el final del menisco. Los datos se transfieren directamente a una hoja de cálculo de Excel a través de USB. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: Influencia de la evaporación en el alimentador de ensayo capilar. A) ensayo de CAFE múltiple coloca dentro deuna caja de plástico con una incrustación cuadriculada. Para el control de la humedad durante el experimento cuatro viales llenos de agua (llantas rojos) se colocan dentro de la red. Los controles de evaporación se colocan en las inmediaciones de estos viales. Una cubierta para toda la configuración se muestra en el fondo. B) Comparación de la pérdida de volumen por evaporación. Se muestra el valor medio para la evaporación más de 4 días. La humedad es controlada por (i) la aplicación de agua a la esponja tapón central (24 h de intervalo); (Ii) la adición de cuatro viales llenos de agua en la red; y (iii) el uso de una cubierta de plástico para toda la instalación. La evaporación es significativamente menor si la humedad se controla para ambas soluciones ensayadas (*** P ≤ 0,001; N = 48). No hay diferencias en la volatilidad entre EtOH que contiene y no contiene solución de sacarosa es detectable con los dispositivos de humedad utilizados. Haga clic aquí para ver una versión más grande deesta figura.

figura 3
Figura 3: La preferencia por el etanol (EtOH) con un contenido de sacarosa sobre Solución de sucrosa. Se muestra una) Consumo de alimentos para el varón 1118 w moscas. Los varones consumen significativamente más de un EtOH 15% que contiene solución de sacarosa que de una solución de sacarosa llanura. *** P ≤ 0,001; N = 27. B) Las moscas prefieren significativamente una solución de sacarosa que contiene 23% de EtOH durante un ensayo de 4 días. *** P ≤ 0,001; ** P ≤ 0,01; N = 16. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4: Consumption (l / l volar y / mg mosca) de diferentes concentraciones de sacarosa por masculino y femenino w 1118 moscas. A) El consumo de diferentes concentraciones de soluciones de sacarosa difiere significativamente entre machos y hembras. Las moscas hembras consumen más a concentraciones inferiores de sacarosa, y las moscas macho consumen más a concentraciones más altas. * P <0,05; *** P <0,001; N = 27 ensayos con 20 hombres cada una, n = 30 ensayos con 20 hembras cada uno). B) la absorción de los alimentos sobre una base de masa. Un aumento significativo en el consumo se produce entre las moscas macho y hembra para los 0,1 a 2 M soluciones de sacarosa cuando normalizado para volar en masa. *** P ≤ 0,001; N = 27 machos, n = 30 hembras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

tabla 1
Tabla 1: Peso corporal del macho y de la hembra w 1118 moscas. Se midieron cuatro a cinco grupos de 100 moscas, y se calculó el peso corporal (mg / mosca). Se muestran los valores medios (con DESVEST (desviación estándar) y STERROR (error estándar)). Los valores medios se utilizan para normalizar el consumo de alimentos de volar de masas (/ mg mosca l). Por favor, haga clic aquí para descargar la hoja de cálculo.

Tabla 2
Tabla 2: Pérdida de evaporación (l) en el ensayo CAFE. La cantidad de líquido perdido a través de la evaporación se muestra durante 4 días. La humedad se controla (+) o not (-) como se describe en la Figura 2. se muestran los datos de evaporación para dos soluciones diferentes (sacarosa y sacarosa además de EtOH). Los valores medios se presentan para cada día y durante el período (con DESVEST y STERROR). La pérdida por evaporación del experimento diluciones de sacarosa se muestra debajo separado (valores medios). Por favor, haga clic aquí para descargar la hoja de cálculo.

Tabla 3
Tabla 3: Consumo de 0,1 M de sacarosa con / sin EtOH al 15% por el Hombre 1118 w moscas alimentadas durante 3 h. El consumo de ambas soluciones por grupos de 20 moscas se midió durante 3 h en 3 días. Los valores de consumo de los grupos de moscas se dividen por el número de moscas analizadas para estimar la absorción por microlitro mosca después de restar la pérdida por evaporación. Se muestran los valores medios (con DESVEST y STERROR). Por favor, haga clic aquí para descargar la hoja de cálculo.

Tabla 4
Tabla 4: Consumo de 0,1 M de sacarosa con y sin el 23% de EtOH durante cuatro días por el Hombre w 1118 moscas. El consumo de ambas soluciones por grupos de 8 moscas se midió durante 24 h durante 4 días. índice de preferencia para el etanol se calculó utilizando la siguiente fórmula ([Suc + EtOH] - [Suc] / consumo total). Los valores de consumo de los grupos de moscas se dividen por el número de moscas analizadas para estimar la absorción de l por mosca después de restar las pérdidas por evaporación. Los valores medios (con DESVEST y STERROR) se muestran para cada día..jove.com / archivos / ftp_upload / 55024 / JoVE55024R1-Diegelmann-Tabla-4.xlsx "target =" _ blank "> Haga clic aquí para descargar la hoja de cálculo.

Tabla 5
Tabla 5: Consumo de cinco concentraciones de sacarosa por el varón y la hembra w 1118 moscas. La ingesta de cada solución, y el valor de la suma de las ingestas de sacarosa, se muestra. Los valores medios para cada concentración se dan debajo de cada columna (con DESVEST y STERROR). Para calcular el consumo basado en la masa de la mosca (captación microlitro por miligramo de mosca), el consumo de alimentos se divide por el peso medio de las moscas macho o hembra (de la Tabla 1, que se muestra a la derecha). Por favor, haga clic aquí para descargar la hoja de cálculo.

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Discussion

El informe describe el ensayo de café en una manera paso a paso, centrándose en la configuración técnica y su desempeño exitoso en el laboratorio. Debido a su simplicidad, este ensayo también se podría utilizar educativamente como un experimento de la escuela. Los ejemplos muestran que el ensayo permite la investigación de la detección de alimentos, la preferencia y el consumo en Drosophila melanogaster durante períodos de tiempo cortos y más largos (horas o días). El ensayo CAFE se ha utilizado ampliamente en el campo para investigar temas que incluyen alimentos y el consumo de drogas, las adicciones, la homeostasis de la energía y el control neuronal de alimentación 16, 18, 24, 25.

En el ensayo de CAFE, moscas experimentales deben llevar a cabo con éxito varias tareas para la obtención de alimentos, tales como búsqueda de alimento, la detección y la locomoción; incapacidad para realizar estas tareas podría resultar en una reducción del consumo. porcomportamiento de envejecimiento depende principalmente del estado de hambre de las moscas y se puede aumentar mediante el ayuno 19, 21. Sensing, y de ese modo la localización, de la fuente de alimento pueden ser influenciados por la capacidad de la mosca de oler o sabor e indirectamente pueden resultar en una tasa de consumo inferior 28. La visualización de la comida al final de un capilar obliga a la marcha para bajar y mantener de forma activa en una posición boca abajo para alimentarse. Para mantener la posición de beber en el capilar, la mosca debe coordinar su contracción muscular. Deterioro o hiperactividad de la locomoción claramente afectarían la absorción de los alimentos, al igual que las deficiencias de locomoción debido al envejecimiento. Además, la interferencia de otras moscas durante esta maniobra conduce a la terminación prematura de la ingestión de alimentos. Por lo tanto, el número de moscas que se utilice deberá ser determinada antes del experimento. Este número debe garantizar que todas las moscas pueden alimentarse adecuadamente y se debe controlar para fdensidad Ly en el vial (de 8 hasta un máximo de 20 moscas en nuestro ensayo vial melanogaster CAFE D.). La alimentación se ve influida por el valor nutricional de la comida, y las moscas ajustar dinámicamente su ingestión en consecuencia 24, 29. Se demostró que los mutantes que faltan la octopamina neurotransmisor tienen puntuaciones normales de respuesta PER, pero al mismo tiempo muestran una disminución significativa en la ingesta de alimentos 14. Por otra parte, durante la alimentación, la motivación para seguir comiendo disminuye y conduce a la terminación de la conducta.

Las anteriores consideraciones se aplican no sólo al ensayo CAFE, que influyen en el comportamiento medido en otros sistemas de prueba, así alimentar. Por lo tanto, la capacidad de las moscas para realizar el ensayo debe ser tenido en cuenta en la medición de la ingesta de alimentos. Aunque no es técnicamente difícil, el ensayo de café tiene algunos potenciales inconvenientes prácticos. El descenso del meniscoen el interior del capilar depende de la pérdida por evaporación y la ingesta de alimentos por las moscas. Alta evaporación es problemático con respecto a la relación señal a ruido y por lo tanto debe ser minimizado. Se aplicaron varios enfoques y dispositivos adicionales para controlar la humedad durante el período experimental (ver 4.6). Estos accesorios nos han ayudado a reducir la evaporación efectos significativamente e incluso eliminadas de diferente volatilidad de las fuentes de alimentos que utilizamos. Sin embargo, si no hay cámara climática está disponible el ensayo se puede realizar a temperatura ambiente (por ejemplo, en una sala de clase) con valores de evaporación superiores como un inconveniente.

Como se mencionó en el protocolo, los extremos de los capilares deben ser colocados al mismo nivel en el interior del vial para evitar sesgos en la selección de la marcha debido a las diferentes distancias a la fuente de alimento. Para lograr esto, la posición capilar se fija con una segunda punta de la pipeta. La longitud del capilar no parece ser un criterio para la alimentación en silvestreTipo vuela 10. Cualquier derrame del líquido puede socavar lectura exacta del consumo de alimentos (ver 4.3 y 4.9); un entorno libre de vibraciones evita derrames. Las partículas en el capilar bloque de solución de flujo y evitar el consumo de alimentos. La solución de alimentación, especialmente si contiene levadura, necesita ser completamente disuelto para evitar una obstrucción tal. El uso de extracto de levadura soluble en agua puede superar este problema, sino como una fuente incompleta de nutrición que puede causar costes adicionales de fitness. accesibilidad a los alimentos debe ser evaluado antes y después del experimento. Los únicos datos mosca que se debe incluir en el análisis es el obtenido cuando estuvo presente durante todo el experimento acceso a los alimentos (véase 4.9). La posición de alimentación invertida es una característica crítica del experimento. En condiciones naturales, esta posición de alimentación no es desconocido para la marcha, como frutas cuelgan de los árboles y que podría bajar por una fruta podrida. Esto es apoyado por experimentos Comparing los tamaños de las comidas de moscas que se alimentan en una posición boca abajo en el ensayo de CAFE a (i) una posición de alimentación horizontal de moscas inmovilizados en el ensayo MAFE y (ii) un lado plano posición correcta alimentación utilizando alimentos radiomarcado 13, 21 . Aunque la exposición de alimentos al revés no parece ser un problema para las moscas, que podría afectar a la composición de los alimentos en el interior del capilar. suplementos suspendidos, tales como células de levadura podría hundirse a través de la gravedad a la parte inferior del capilar y por lo tanto podría ser más concentrada en la parte inferior o podrían conectar el capilar. Esto influir en el comportamiento de la mosca y por lo tanto los resultados. Asegurarse de que los componentes de la solución de alimentación se disuelven por completo, y la introducción de frecuencia capilares fresco en experimentos a largo plazo, reduce al mínimo esta influencia sobre la ingesta de alimentos.

El uso del ensayo CAFE aquí descrito permite la medición de la ingesta de alimentos en un grupo mosca con el tiempo se extiende dehoras o días. Si se requiere un análisis más detallado (por ejemplo., El comportamiento de una sola mosca o el comportamiento en el rango de minutos), otros ensayos de alimentación, tales como el ensayo de MAFE, son más apropiados. Podría ser posible que el número de moscas que se reduce aún más mediante el uso de un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y un único capilar 30.

El número de experimentos utilizados para obtener los resultados representativos varía de 15 a 27, consistente con los experimentos descritos en la literatura 17, 24. El ensayo se puede realizar de una manera clásica ciego que descarta sesgo potencial de la experimentador, y normalmente se repite al menos cuatro a cinco veces en cada uno de varios días. Los datos obtenidos con el ensayo CAFE se pueden normalizar para el peso corporal para dar cuenta de las diferencias en el comportamiento de alimentación en relación con el tamaño del cuerpo. Los resultados obtenidos con este ensayo son robustos y reproducible, de manera quese ha introducido con éxito en cursos prácticos para estudiantes graduados.

El ensayo CAFE es ampliamente utilizado en el campo de la investigación metabólica y el gusto en Drosophila melanogaster; que tiene múltiples aplicaciones en probar el papel de los suplementos de alimentos y / o medicamentos en el comportamiento de alimentación, y que puede ser utilizado para investigar la respuesta a la dosis a una fuente de alimento específico 24. En combinación con la notable variedad de técnicas utilizadas para manipular los circuitos neuronales en el D. melanogaster, este ensayo también permite a los investigadores estudiar el papel de los sistemas de refuerzo en el comportamiento de alimentación 12, 17, 18.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vials (breeding) Greiner Bio-One 960177 www.greinerbioone.com
Vials (CAFE assay) Greiner Bio-One 217101 www.greinerbioone.com
Lid-CAFE assay Workshop
Plastic box, low wall Plastime 353 www.plastime.it
Cover for the plastic box Workshop
Capillaries BLAUBRAND  REF 7087 07 www.brand.de
Pipette tips Greiner Bio-One 771290 www.greinerbioone.com
Filter paper circles Whatman 10 311 804 www.sigmaaldrich.com
D(+)-Sucrose AppliChem 57-50-1 www.applichem.com
Ethanol absolute VWR Chemicals 20,821,330 www.vwr.com
Food color (red, E124) Backfun 10027 www.backfun.de
Food color (blue, E133) Backfun 10030 www.backfun.de
Soap solution (CVK 8) CVH 103220 www.cvh.de
Digital caliper GARANT 412,616 www.hoffmann-group.com
Vials (breeding) Height 9.8 cm, diameter 4.8 cm 
Vials (CAFE assay) Height 8 cm, diameter 3.3 cm
Lid-CAFE assay Produced in university workshop, technical drawing supplied
Please click here to download this file.
Plastic box, low wall A plastic grid inlay was custom-made for 8 x 10 vial positions 
Cover for the plastic box Dimensions (37 x 29 x 18 cm)
Capillaries DIN ISO 7550 norm,  IVD-guideline 98/79 EG, ends polished
Pipette tips Pipettes for the outer circle are cut according to the lid
Filter paper circles 45 mm diameter works nicely if folded for the vials used
D(+)-Sucrose Not harmful
Ethanol absolute Highly flammable liquid and vapor
Food color (red, E124) Not stated
Food color (blue, E133) Not stated
Soap solution (CVK 8) Odor neutral soap
Digital caliper
Standard fly food (for 20 L)
Agar 160 g
Brewer's Yeast 299.33 g
Cornmeal 1,200 g
Molasses 1.6 L
Propionic acid 57.3 mL
Nipagin 30% 160 mL

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References

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