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 JoVE Biology

의 재배

1, 1, 1

1Division of Biological Science and Technology, Yonsei University

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    Summary

    우리는 NGT-3D 및 NGB-3D라는 3D 선충 재배 시스템을 구축하는 간단한 방법을 제시한다. 이러한 표준 2D 실험실 C. elegans의 배양 플레이트보다 자연 예쁜 꼬마 선충 서식지에 더 유사 서식지에서 선충의 체력과 행동을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

    Date Published: 12/12/2016, Issue 118; doi: 10.3791/55048

    Cite this Article

    Lee, T. Y., Yoon, K. h., Lee, J. I. Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory. J. Vis. Exp. (118), e55048, doi:10.3791/55048 (2016).

    Protocol

    1. NGT-3D 및 NGB-3D를위한 솔루션을 준비

    1. 다음 멸균 솔루션을 준비 : 0.1454 M NaCl 용액 1 L, 1 M CaCl2를, 1 M 황산 1 L 1 L, 원성 국물 (LB), KH 2의 1 M KPO 4 버퍼 (108.3 g 1 L PO 4 및 K 2 35.6 g HPO 4, H 2 O 기입 L 1). 이러한 솔루션을 사용 NGM의 제조 이전 프로토콜 (10)에서 찾을 수있다.
    2. 121 ° C, 15 분에서 오토 클레이브 솔루션을 제공합니다.
    3. 멸균 5 ㎎ / ㎖ 콜레스테롤 용액 50 ㎖를 준비합니다. 한 50㎖ 원추형 튜브에 콜레스테롤의 0.25 g 및 99.99 % 에탄올 50ml를 혼합하고 잘 혼합한다. 오토 클레이브하지 마십시오. 0.45 μm의 주사기 필터로 50 mL를 주사기를 사용하여 콜레스테롤을 살균 용액. 이것은 또한 어떤 용해되지 않은 콜레스테롤을 제거합니다.
    4. 2'- 데 옥시 -5- fluorouridine (FUdR) 주식의 150 mM의 10 ㎖를 준비합니다 (선택 사항). 15 ml의 원추형 튜브에, 0.3693 g을 혼합FUdR 증류수 10 ㎖의. 잘 흔들어.

    2. NGT-3D 및 NGB-3D에 대한 박테리아 문화를 준비합니다

    1. 박테리아 10 ml의 LB 배지에 접종. 공급 C. elegans의 사용되는 표준 박테리아는 대장균 OP50이다.
    2. 문화 밤새 진탕 배양기에서 37 ° C에서 세균 접종.
    3. 일련의 희석에 대비, 멸균 15 ML 원뿔 튜브에 NaCl 용액의 나누어지는 9 ml의. 예를 들어, 7 개의 튜브에 분취 9 ml의 OP50 균주 E. 콜라이의 10-7 희석을한다.
    4. NaCl 용액의 9 ml의 멸균 새로운 튜브에 멸균 1,000 μL 피펫, 피펫 세균 배양 1 ml의 희석 세균 배양를 사용하여 잘 10 ml의 혼합물을 소용돌이. 원하는 박테리아 희석에 도달 할 때까지 반복합니다.
      주 : 원하는 박테리아 희석 종류 및 조건 세균뿐만 아니라 정확한 실험 조건에 의존한다.예를 들어, 10-6 - 6.5 ml의 NGT-3D 튜브 당 200 세균성 식민지 - OP50 변형 대장균의 10-8 희석는 1 생산하기에 충분했다. 웜 확실 개발 콜로니 수 × 10-6의 희석에서 발생하는 60 때 정상적으로 재생 - 10-7. NGB-3D를 들어, 10-8의 희석을 사용합니다.

    3. 만들기 NGT-3D 및 NGB-3D (200 ㎖)

    1. 박테리아 배양을 제조 한 후, 0.6 g의 NaCl 1 g의 과립 한천, 및 500 mL의 플라스크에서, 0.5 g 펩톤 섞는다. 플라스크에 자기 교반 막대를 삽입합니다.
    2. 195 ml의에게 증류수를 추가하고 알루미늄 호일로 플라스크의 입 커버.
    3. 15 분 동안 오토 클레이브에서 121 ° C.
    4. 저어 접시에 뜨거운 멸균 플라스크를 놓고, 적어도 2 시간 동안 적당한 속도로 교반한다. 40 ° C까지 플라스크를 냉각. 완성 된 한천의 흐리게 될 수 있습니다 여기에 고온에서 지속적으로 충분히 냉각해야합니다.그러나, 낮은 온도는 한천의 조기 경화의 원인이 될 수 있습니다.
      1. (선택 사항), 냉각 프로세스의 속도를 저어 접시에 배치하기 전에 40 ° C의 물 목욕 15 분에 플라스크를 배치합니다.
    5. 한천 매체의 온도가 40 ℃에 도달하면, 용액은 교반 계속되고, 200 ㎕의 1 M CaCl2를 5 ㎎ / ㎖ 콜레스테롤 용액 200 ㎕를 200 ㎕의 1 M 황산 5 mL의 1 M KPO 4 버퍼를 추가 1 mM의 염화칼슘 2, 5 μg의 / ㎖ 콜레스테롤, 1 mM의 황산, 1 mM의 KPO 4의 최종 농도.
      1. NGT-3D 수명 분석을 위해 (선택 사항) 120 μM (12)의 최종 농도 150 mM의 FUdR의 80 μl를 추가합니다.
    6. 직접 플라스크에 단계 2.4에서 박테리아 문화를 희석하여 10 ml의 6 ML을 추가합니다.
      1. , NGT-3D (선택 사항) 단계 3.6 전에 한천 미디어의 6 mL로 분리하여 따로 따뜻한 유지. 이 매체는 사용할 수없는 것이다 세균최상층.
    7. 무균 절차를 이용하여, 무균 배양 챔버에 미디어 분배. 확인 챔버의 커버가 단단히 종료합니다.
      1. (선택 사항), 한천의 표면에 형성되는 세균성 식민지를 방지 3.7 완전히 경화 단계에서 용지 전에 상단에 단계 3.6.1에서 박테리아가없는 한천 미디어의 층을 확인하십시오. 이 NGT-3D의 상단에 박테리아가없는 영역을 생성합니다.
      2. NGT-3D를 들어, 박테리아 한천 층을 조심스럽게 얇은 세균 -을 만들기 위해 반경 화 3D 미디어의 상단에있는 박테리아가없는 미디어 200 μl를 분배하는 8 ml의 투명한 플라스틱 시험관에 6.5 ml의 미디어를 부어 상단에 자유 층.
      3. NGB-3D를 들어, 25cm 2 투명한 플라스틱 세포 배양 병에 미디어 65 ml에 붓는다. 이 금액은 25cm 2 세포 배양 병의 본문을 작성해야합니다.
    8. 박테리아 콜로니가 성장하도록 일주일 수직 상온 챔버 남기기적어도 1mm 직경의 상당한 크기.
      1. NGT-3D의 수명 분석을 위해 (선택 사항), 알루미늄 호일 커버 챔버 FUdR의 빛 저하를 방지 할 수있다.

    NGT-3D (상대 브루드 크기 분석)에 대한 웜 인구의 4 측정 휘트니스

    1. 선택과 세균이없는 NGM 접시에 전송 백금 와이어를 사용하여 L4 무대 웜을 선택합니다. 웜은 자유롭게 몸에 부착 된 세균을 제거하는 몇 분 동안 이동할 수 있습니다.
    2. 단계 4.1를 반복하고 웜이 박테리아에서 무료로 있는지 확인하십시오. 일반적으로, 4.1이 반복 충분하다.
    3. 조심 백금선 픽업과 3D 매체의 표면에 깨끗한 웜 놓는다. 이 웜은 결국 3D 한천 행렬에 한천을 입력해야합니다.
    4. 커버 느슨하게 일부 공기가 튜브로 얻을 수 있지만, 한천 매체 건조 방지습니다.
    5. 20 ° C에서 96 시간 동안 품어.
    6. 사일 후 단단히 뚜껑을 닫고 두는88 ° C의 물을 욕조에 NGT-3D 문화 챔버는 한천을 녹여합니다. 열은 벌레를 죽이는 그러나 그들의 몸은 그대로 유지됩니다.
      참고 : NGT-3D에 8 ㎖의 튜브 사용은 20 - 30 분 배양은 일반적으로 충분합니다.
    7. 유리 피펫을 사용하여 9cm 플라스틱 페트리 접시에 용융 미디어 옮긴다. 벌레가 자주에 충실 수있는 플라스틱 피펫은 권장되지 않습니다.
    8. 송신 스테레오 해부 현미경을 사용하여, L3, L4에 웜 및 성체 단계의 개수를 카운트. F1을하고 F2 세대가 여기에 혼동 될 수 있으므로, L2 단계 이하이다 벌레를 계산하지 마십시오. 따라서, 이러한 분석은 상대 브루 크기 분석보다는 전체 브루 크기 분석이다.

    5. 이미지 및 기록 웜 동작 NGB-3D에

    1. 백금 와이어를 사용하여 L4 무대 웜 선택 선택하고 박테리아가없는 NGM 판에 전송하고 자유롭게 몇 분 동안 이동할 수 있도록하여 표면에 붙어있는 박테리아를 제거합니다.
    2. 단계를 반복 5.1 하시다 확인하십시오RM은 박테리아에서 무료입니다.
    3. 조심스럽게 백금 와이어 픽와 병의 목 근처 NGB-3D의 한천 표면의 중심에 클린 웜을 배치합니다. 이 웜은 결국 3D 한천 행렬에 한천을 입력해야합니다.
    4. 한천 미디어의 건조를 방지하면서 덮개가 느슨하게, 약간의 공기가 튜브에 들어갈 수 있도록 닫습니다.
    5. 이미지 또는 전송 스테레오 해부 현미경 벌레를 기록합니다. 웜은 3D 매트릭스를 통해 이동으로 초점을 조절합니다.

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    Representative Results

    NGT도 3d의 구조는 한천 (도 1a)에 걸쳐 이격 된 작은 박테리아 콜로니 한천 채워진 시험관 결과 단순하고 간단한 프로토콜이다. 웜 자유롭게 세균성 식민지를 발견하고 소비, 한천 매트릭스를 통해 이동할 수 있습니다. C. elegans의 재현과 NGT-3D 정상적으로 성장할 수 있는지 여부를 확인하기 위해, 우리는 다산과 표준 2D NGM 플레이트와 3D의 애벌레 개발을 비교 하였다. 상대 무리 크기 분석에서, 성인 C. 세균 식민지가 적어도 60 식민지 (그림 1B)와 풍부한 경우 NGT-3D로 자웅 동체 표준 2D NGM 판에있는 자웅 동체로 단지뿐만 아니라 재생 엘레 간스. 또한, NGT-3D의 애벌레 개발도 96시간 (그림 1C) 후 성인 상태에서 웜의 대부분과 세균성 식민지의 많음이있을 때 일반적으로 진행된다. 그러나, 세균성 식민지는 부족한 경우3 차원 매트릭스에 상대 무리 크기 (그림 1B, 왼쪽 막대)와 애벌레 개발 (그림 1C, 왼쪽 줄) 모두에 부정적인 영향을받습니다.

    3D에 거주 웜의 장기 생리에 어떤 영향이 있는지 여부를 테스트하기 위해, 우리는 NGT-3D 및 NGM 판을 비교하는 수명 분석을 실시했다. NGT-3D에 웜의 평균 수명은 표준 NGM 플레이트 14.8 ± 3.1 일에 비해 15.6 ± 3.6 일이었다. NGT-3D 및 NGM에 사는 벌레의 수명 곡선은 거의 동일했다. 따라서, 웜 3D 및 2D 조건에서 동일하게 생존 보인다.

    NGB-3D를 제조하는 것은 어렵지 않다 및 그림 2A에서 본 것과 같은 명확한, 한천 가득한 문화 병 발생한다. 쉽게 OP50에서 우리가 deoxyviolacein, 어두운 보라색 세균의 대사 산물 (11)를 표명 한 세균 식민지를 보려면변형 대장균 (도 2A, 2B, 요청에 사용할 주). 라이브 웜 송신 입체 해부 현미경 (도 2B, 기업 영화 1) 아래에 묘화 될 수있다.

    실온에서 NGT-3D 및 NGB-3D의 저장을 최대 1 개월이 배양 챔버의 양을 유지하기에 충분하다. 튜브 나 병에 맞는 플러그 형 또는 사형 캡이 적용되는 경우 한천의 탈수는 NGT-3D 또는 NGB-3D 중 하나에 대한 문제가되지 않습니다.

    그림 1
    그림 1 : NGT-3D에서 재배 C. elegans의 개발, 생식과 수명은 표준 2D NGM의 그것과 유사합니다. (A) 박테리아의 여러 희석에 NGT-3D의 이미지. 왼쪽과바로 5 × 10-7 희석을 포함하고, 중간은 1 × 10 -7 희석입니다. 미만 60 OP50 식민지 (N = 24)에 NGT-3D 야생 형 웜 (B) 상대 종족의 크기, 크거나 (60) 식민지 (N = 14), 또는 2D NGM 플레이트 (N = 29)에 동일. 오차 막대는 표준 오류를 나타냅니다. 보다 크거나 60 식민지 같거나 2D NGM의 접시에 적은 60 OP50 식민지와 NGT-3D의 L3, L4 또는 성인 발달 단계에 F1 세대 웜 (C) 비율. NGT-3D 또는 NGM 판에 야생형 C. elegans의의 (D) 생존 곡선. NS 크게 다른 로그 순위 테스트에 의해 계산 나타냅니다. 이 수치는 리 9에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    그림 2 그림 2 : NGB-3D를 사용하여 3 차원 이미징 C. 엘레 간스. (A, B) NGB-3D의 이미지; 어두운 보라색 안료 deoxyviolacein을 표현 OP50 변형 대장균의 식민지 근처 성인 선충의 (C) 이미지. 스케일 바는 500 μm의입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    그림 2
    보충 영화 1 : 성인 선충은 NGB-3D의 식민지에서 대장균 OP50-violace 접근. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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    Discussion

    고전 선충류 성장 미디어 판을 사용하여 선충의 실험 재배가 제공 한 C. elegans의에서 연구 중요한 발견의 수백에 매우 중요했다. 여기, 우리는 더 정확하게 자연 입체 서식지를 반영하는 환경에서 C. 엘레을 육성하기 위해 새로운 방법을 제시한다. 다른 방법 3D 13 C. 엘레을 관찰하기 위해 사용되었지만, 이는 고체 차원 매트릭스 웜의 재배를 허용하는 제 1 프로토콜이다. 여기에 표시된 두 가지 방법, NGT-3D 및 NGB-3D는 과학자 이미지도 3D 재배 피트니스, 발전과 성장의 문제 등을 요청하고 3D로 벌레를 기록 할 수 있습니다. NGT-3D 및 NGB-3D 표준 2D NGM 플레이트에 약간의 차이가 있지만, 그들은이 원래의 방법과 유사한 만 z 축에 웜 재배를 추가하도록 조정한다. 따라서, 우리는 개발, 불임 및 수명이 우리의 조건에서 정상적으로 진행 것을 찾을 수 있습니다. 그만큼목표는 실험실 연구를 위해 사용 할 수있는 프로토콜을 만드는 것이 었습니다. 이러한 방법들은 매우 낮은 비용으로 쉽게 재현 매우 간단하고, 사용자의 특정의 실험에 맞게 프로토콜의 조정을 허용한다.

    프로토콜의 모든 단계가 중요하지만, NGT-3D 및 NGB-3D를 만드는 중요한 단계는 프로토콜의 3.6 단계 3.4 오토 클레이브 후 한천의 냉각 온도이다. 온도 (40 ℃ 이하 몇도) 너무 낮은 냉각하면, 한천은 강화하기 시작하고 추가 된 솔루션은 한천에 적절하게 혼합되지 않습니다. 냉각이 불충분 (40 ° C 위 몇도) 인 경우에는, 추가 된 박테리아 죽을 수 있고, 콜레스테롤 첨가 액 실험 쓸모 한천 렌더링 한천을 흐리게 할 수있다. 또한,주의의 영역 단계 4.6입니다. 수조에서 NGT-3D 한천을 용융 할 때, 용해에 도움을 단단히 뚜껑을 닫고해야합니다. 그러나, 열이 발생할 수 있습니다모자는 위험 오프 "팝업"과 발사체가 될 수 있습니다. 안전을 위해이 물에 목욕을 커버하는 것이 가장 좋습니다. 프로토콜의 많은 부분은 사용자에게 매우 융통성이다. 예를 들어, 우리는 NGT-3D에 대한 명확한 플라스틱 테스트 튜브와 NGB-3D에 대한 25cm 2 투명 세포 배양 병 (65 ml의 총 보유) 사용하고 있습니다. 사용자가 이용할 명확 튜브 또는 병의 다른 유형도 작동한다. 또한, 박테리아의 성장을 조절할 수 있습니다. 대장균 균주 OP50는 일반적으로 실험 선호했다 적어도 1mm로 성장 주일 정도 걸립니다. 우리의 경험에 의하면, 박테리아 약간 짧고도 더 이상 성장 시간은 웜 성장 또는 생식 능력에 영향을 미칠하지 않는 것. 한천의 농도 조정은, 그러나, 웜의 움직임에 영향을 미칠 것이다. 한천의 낮은 농도는 수영 같은 움직임을 나타내는 웜 결과, 높은 농도는 전체 이동을 방지 할 수있다.

    NGB-3D에 관심의 한 영역 결로의 문제였다물 축적. 따뜻한 액체 한천 견고로서 불가피 축합 특히 병 및 한천의 계면에서 시간이 지남에 발생한다. 이 수영 액체 (14) 동작과 액체가 병에 걸쳐 확산 될 수 박테리아의 성장을 도시 웜, 문제를 제기 할 수있다. 결로 방지가 곤란하다. 두 가지 구제 수단이 존재한다. 먼저 웜이 쉽게 병의 목에서 한천 표면의 중심에 배치하여 한천을 입력 할 수 있음을 확인. 둘째, 우리는 의도적으로하여 식민지가 액체와 한천의 계면에서 성장하는 기회를 감소, NGB-3D 낮은 세균의 농도를 유지한다.

    또 다른 관심사는 NGB-3D 웜의 영상입니다. 3D 웜의 이미지의 선명도와 품질을 높이기 위해 식민지는 표면에 가까워 야하지만 완전히 한천에 포함 된 상태로 유지됩니다. 우리는 표면 처 근처 만 포함 된 식민지를 성장하는 시도표면에서 박테리아 - 함유 배지의 얇은 층을 배치하고, 나머지 매체에 의한 CE 세균 부담이었다. 그러나, 문제는 완전히이 방법으로 해결되지 않았다. 대신, 우리는 한 번에 많은 NGB-3D 병을 생산하여 웜이 표면 근처의 식민지로 이동 될 가능성을 증가, 표면에 가까운 식민지를 내장 포함 만 사람을 사용하기로 결정했다. 우리가 탐구하지 않은 하나의 옵션은 우리가 여기에 사용 과립 한천 이외의 행렬에 고체 미디어를 변화하고 있습니다. Z 축 방향으로 웜을 묘화하는 것도 어려울 수있다. 우리는 수동으로 제기하고 거친 초점을 절감하여이 작업을 수행하지만, 자동화 된 추적 프로그램이 존재하는 경우, 그것은 아주 도움이 될 수 있습니다.

    희망은 3D로 선충의 배양을 위해 여기에 제시된 기술이 널리 선충의 생물 학자에 의해 사용될 것입니다. 많은 질문을 3D로 노화와 행동을 포함하여 웜 생물학, 대한 남아, 과학자들은 것에 준수 여부2D는 3D로 웜 관련이 있습니다. 실제로 NGT-3D를 이용한 이전 연구는 3 차원 배양은 2 차원 환경 9 정상적으로 재생 관능 돌연변이에 있다고 생식 체력에 미치는 영향을 보여 주었다. 또한, 한 연구에서는 15 2D에 비해 3D에서 변경 운동 행태를 보였다. 마지막으로,이 시스템은 특정 조건 변이체 또는 조작이 네이티브 차원 환경에서 동물에게 체력 이점을 부여하는지 여부의 질문에 응답하기 위해 사용될 수있다.

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    Disclosures

    Acknowledgements

    이 작품은에 의해 지원되었다 새 탐정 그랜트 [2014R1A1A1005553] JIL에 한국 연구 재단 (NRF)에서; 와 연세대 학교 미래 리더 챌린지 그랜트 [2015-22-0133] JIL에

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    LB broth, Miller (Luria-Bertani) Difco 224620
    Sodium chloride DAEJUNG 7548-4400 58.44 MW
    Agar, Granulated Difco 214530
    Peptone Bacto 211677
    Calcium chloride, dihydrate Bio Basic CD0050 2*H2O; 147.02 MW
    Cholesterol Bio Basic CD0122 386.67 MW
    Ethyl alcohol B&J RP090-1 99.99%; 46.07 MW
    Magnesium sulfate, anhydrous Bio Basic MN1988 120.37 MW
    Potassium phosphate, monobasic, anhydrous Bio Basic PB0445 136.09 MW
    2'-Deoxy-5-fluorouridine Tokyo Chemical Industry D2235 246.19 MW
    Potassium phosphate, dibasic, anhydrous Bio Basic PB0447 174.18 MW
    Multi-Purpose Test Tubes Stockwell Scientific ST.8570 8 ml
    Test Tube Closures Stockwell Scientific ST.8575
    Cell Culture Flask SPL Lifescience 70125 25 cm2
    Research Stereo Microscope Nikon SMZ18
    High-Definition Color Camera Head Nikon DS-Fi2
    PC-Based Control Unit Nikon DS-U3
    NIS-Elements Basic Research, Microscope Imaging Software Nikon MQS32000

    References

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