출생 후의 쥐의 청각 수포의 해부 : 중이의 뼈와 조직 학적 분석의 분리

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Sakamoto, A., Kuroda, Y., Kanzaki, S., Matsuo, K. Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis. J. Vis. Exp. (119), e55054, doi:10.3791/55054 (2017).

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Abstract

대부분의 포유 동물에서, 추골, 침골과 등골을 포함한 중간 귀에 청각 소골은 작은 뼈이다. 마우스에서, 뼈 구조는 청각 캡슐은 내이, 즉 달팽이관과 반원형 운하를 둘러싼 반면 청각 수포가, 이소골을 수용했다. 쥐 이소골은 이비인후과 분야의 연구자들에게 큰 관심 때문에 청각에 필수적인, 그러나 그들의 대사, 개발 및 발전은 다른 분야에 매우 적합하다. 변경된 뼈 대사는 성인 쥐에서 청각 기능에 영향을 미칠 수 있으며, 다양한 유전자가 결핍 된 마우스는 자궁에서 청각 이소골의 형태 형성의 변화를 보여줍니다. 쥐의 청각 이소골이 작은 있지만 하나가 자신의 해부학 적 방향 및 3D 구조를 이해하면, 자신의 조작이 가능하다. 여기, 우리는 청각 수포 및 출생 후의 마우스의 캡슐을 해부 한 후 수포의 일부를 제거하여 개별 이소골을 분리하는 방법에 대해 설명합니다. 우리는 또한 토론 방법을 그들에게다른 방향에서 침대 수포와 캡슐은 추골의 길이 방향 수평, 또는 정면 부분의 준비를위한 파라핀 또는 동결 절편에 적합 생성합니다. 마지막으로, 우리는 마우스와 인간의 청각 이소골 사이의 해부학 적 차이점을 열거. 이러한 방법은 청각 이소골의, 병리학 적 발달과 진화 적 측면과 생쥐의 중이 분석에 유용 할 것이다.

Introduction

중이의 세 청각 이소골, 즉 추골, 침골 및 등골은 고막 안쪽 귀에 막, 또는 달팽이관 1, 2에서 사운드를 전달하는 포유 동물의 특정 청각 체인을 형성한다. 청각 기능이 청성 뇌간 반응 (ABR) 3-6, 및 레이저 도플러 Vibrometry (LDV) 7을 사용하여 모니터링 할 수있는 고막 뒤에있는 추골의 진동을 임계 값을 측정하여 마우스에서 평가 될 수있다. ABR, LDV 및 왜곡 제품 Otoacoustic 방출 (DPOAE) 측정을 결합함으로써, 전도성 난청은 감각 신경성 장애 8 구별 할 수 있습니다.

귀 조건의 동물 모델은 모든 연령의 환자의 복지를 듣고 귀 건강의 중요성을 고려할 필요가있다. 예를 들어, 중이염은 인간의 유아와 어린이, 심한 급성 중이염에서 볼 매우 일반적인 귀 감염과 합병증은 CONDI 경우에 발생할 수 있습니다기 적절한 항균제 (9)으로 처리되지 않습니다. 중이염의 마우스 모델은 발병 기전을 이해하고 치료 10,11 개발에 유용 할 수 있습니다.

(추골의 goniale 부분 제외) 연골 골화 (12, 13)에 의해 형성된다 쥐 이소골은 뼈 대사 및 형태 형성의 연구에 매우 적합하다. 첫째, 작은 크기는 X 선 또는 형광 현미경을 이용하여 14 온전한 골막과 뼈 고해상도 분석을 허용한다. 둘째, 골 세포 중 15 과부족 뼈 흡수 또는 손상 작용 등 비정상적 골 대사, 손실 3,4,7 청각에 잠재적 참여자로 분석 될 수있다. 셋째, 이상 골편의 형태 형성은 이러한 Hoxa2 16 ~ 19, 20 ~ 22 Msx1, Prrx1 23 Goosecoid가없는 동물 등 여러 가지 유전자 결핍 마우스에보고(GSC) 24, 25, Bapx1 13 Tshz1 26 Dusp6 (Mkp3) (27)는, 소량 (노그) 28 FGFR1 (29)는 마우스에서 갑상선 호르몬 수용체 (치환술, Thrb) 5에서 Bcl2 (30)1,31은, 또는 과발현 Hoxa2 32. 마지막으로, 작은 크기에도 불구하고, 구조는 근육 (33)과 관절 (34, 35) 등의 이소골과 관련된 액세스 할 수 있습니다.

마우스 골편 인간 골편보다 작은하지만 마우스 중이는 인간 상대의 소형 버전이 아님을 주목할 필요가있다. 인간의 배아 stapedial 동맥이 임신 중에 사라 반면, 예를 들어, 마우스에, 등골의 고리를 통과하는 stapedial 동맥, 삶 (36)에 걸쳐 지속. 또한, 마우스 추골의 형태가 일의 상이즉 인간의 골 (도 6 참조). 인간은 측두골의 소주 골 이루어지는 유양동 공기 전지는 수포 37보다는 골편을 수용하는 반면 쥐에서는, 청각 (고막) 수포는 공기 충전 중이 캐비티를 둘러싼 다. 두 종으로, 청각 캡슐 (귀 캡슐, 뼈 미로)는 달팽이관 및 내이의 반원형 운하를 둘러싼 다. 중이의 비교 및 진화 생물학은 광범위 38-40을 검토하고있다.

먼저 아래의 프로토콜은 각각, 주로 중이 및 내이 구성 청각 수포 및 캡슐을 해부하는 방법에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 또한 청각 수포에서 추골, 침골과 등골을 분리하는 방법을 보여줍니다. 마지막으로, 청각 이소골의 조직 절편에 대비하여 내장의 청각 수포 및 캡슐 방향을하는 방법을 보여줍니다.

Protocol

본 연구에서 수행되는 모든 동물의 절차는 게이오 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 (IACUC - 승인 번호 : 09221) 연구에서 동물의 사용을 게이오 대학의 동물 실험에서 기관 지침을 따르십시오. 인간의 표본은 해부학, 의학의 게이오 대학의학과에 기증 사체에서 분리하고, 기관의 규정에 따라 사용되었다.

청각 수포 및 캡슐 1. 분리

  1. 호흡 환기가 분 이상 중단 될 때까지 이소 플루 란 또는 세보에 적신 종이 타월 위에 플랫폼을 포함하는 항아리에 쥐를 안락사 후 자궁 전위를 수행합니다. 불린 종이 수건 마우스의 직접 접촉하지 않도록주의하십시오.
  2. 목의 등쪽에 작은 가로 절개를하고 머리를 향해 떨어져 피부를 당겨 양손을 사용하여 꼬리는 기본 목 무 노출scle 조직.
  3. 14cm에게 날카로운 외과 가위를 사용하여 자궁 경부 영역에서 마우스 목을 벨.
  4. 완전히 코를 향해 껍질 피부. 주둥이와 앞니와 함께 모든 피부를 잘라.
  5. 입에 가위를 삽입하고 양쪽 턱 근육을 잘라.
  6. 신중하게 턱을 열고 함께 혀와 아래턱을 제거합니다.
  7. midsagittal 평면 (그림 1A, B)을 따라 두 개의 반으로 날카로운 가위, 분할 두개골과 두개골베이스를 사용.
  8. 집게를 사용하여, 대뇌와 소뇌 반구와 뇌간을 제거합니다. 청각 수포 및 캡슐은 소뇌와 뇌간에 측면에 있습니다. 청각 수포가 청각 캡슐 (그림 1C, D)에 더 좌우되어 있습니다.
  9. 주변의 두개골 뼈 (그림 1E)으로 수포 및 캡슐을 해부하다.
  10. RT에서 인산 완충 용액 (PBS) pH가 7.4을 함유하는 접시에 시료를 옮긴다.
  11. 유쌍안 해부 현미경 파인더의 수포 및 캡슐 (그림 1 층)의 주위에 느슨하게 경계를 잘라 주변의 뼈와 가위를 따로 뽑아 집게를 사용합니다. 제거 된 주위의 뼈는 basioccipital (복부 경계), exoccipital (ventro-후방 경계), supraoccipital (후방 경계), interparietal, 정수리 (지느러미 테두리)는 squamosal (배측 - 전방 경계), alisphenoid (전방 경계), 및 basisphenoid 있습니다 (안테 - 복부 테두리) 뼈. 유스타키오 관 (41)의 고막 개방을 지원하는 styliform 프로세스 (SP)가, 측두골의 경상 돌기 과정 구별되어 있습니다.

추골, 침골 등골 : 청각 이소골 2. 분리

  1. 추골
    1. 고막 볼 수 있도록 작은 가위 집게를 모두 사용하여 (도 2A, B를 고랑 tympanicus에 외이도의 외측의 일부를 제거).
    2. 복부 (점선)과 후방 (#) 벽 (그림 2C)에서 malleal이 과정이 브레비스 (공 모양의 융기, 토론 참조), 모두 근처의 고막과 고막 뼈의 일부를 제거합니다. 추골과 텐서 팀파니 근육은 이제 (그림 2D, E)에 노출되어야한다.
    3. 추골 (그림 2 층)를 들어 올려 27 G 바늘 (그림 2G)의 경 사진 가장자리로 텐서 고실 근육을 잘라. 다른 포유 동물에서 볼로 malleal 흉골 단단히, 고막에 연결합니다.
    4. 깨지기 인 흉골에서 신중하게 고막을 분리합니다. 세 청각 이소골을 나타 내기 위해 고막 뼈를 제거합니다.
    5. ossicular 공동 (그림 2H)에서 침골에서 추골를 탈구.
    6. goniale에서 전방 프로세스를 파쇄하여 추골을 분리합니다.
  2. 침골과 등골
    1. t을 격리짧은 하퇴 (그림 3A)에서 침골의 후방 인대를 절단하여 그는 침골.
    2. 27 G 바늘 (그림 3B, C)의 경 사진 가장자리 등골 근처 stapedial 동맥을 차단하여 등골을 분리합니다. 필요한 경우, 바늘 등골의 근육 과정에서 stapedial 근육의 힘줄을 잘라.
    3. 등골의 폐색 난원에 재봉 바늘 (또는 마킹 핀)를 삽입하고 등골을 올립니다. 등골을 제거한 후, 타원형 창 개방이 명확하게 보이는 (그림 3D)해야한다.

청각 수포와 캡슐의 3 퍼가기

  1. 파라핀 블록에 삽입을위한 준비
    1. 제 1과 수포 캡슐을 분리.
    2. , 가위로 떨어져 수포합니다 (styliform 과정)의 앞쪽 끝을 잘라 4 ℃에서 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)의 수포와 캡슐을 담그지C, 그리고 정착이 수포로 입력 할 수 있습니다. 공기가 수포에 갇혀 될 경우, 바늘과 주사기를 제거합니다. 튜브 회전에서 4 ° CO / N의 정착에 수포 및 캡슐을 둡니다.
      주의 : PFA는 독성이 조심스럽게 취급되어야한다.
    3. PBS로 한번 씻어.
    4. 10 % 에틸렌 디아민 테트라 아세트산이 나트륨 염 수화물 4 ° C에서 일주일 동안 석회 수포 및 캡슐 (EDTA-2Na를), 2 ㎖의 튜브에 100 mM 트리스베이스, pH가 7.0. 매일 버퍼를 변경합니다.
    5. PBS로 한번 씻어. 시료를 4 ℃의 물에 70 % 에탄올에 저장 될 수있다. 임의로, 경사 알코올 시리즈 (30 %, 50 %, 물 70 %)을 70 % 에탄올로 전송.
    6. 티슈 프로세서 (4 배, 40 ℃에서 각각 1 시간) 크실렌 맑은 에탄올 용액의 등급 시리즈 시험편 (70 %, 2 × 95 %, 3X 100 %, 각 1 시간) 탈수 및 시편 침투 녹은 파라핀 왁스 42. 선택적으로, 상업 조직 clearin와 대체 자일 렌g 용액 (예를 들어, 히스 - 지우기).
    7. 프로세서에서 표본을 언로드, 그들의 카세트에서 제거.
    8. 조직 포함 콘솔 시스템에서, 장소는 녹은 파라핀 왁스로 가득 주형에 표본. (4 절)를 포함하기로 넘어갑니다.
  2. (카와 모토의 영화 법) 냉동 블록에 삽입을위한 준비 (43)
    1. 제 1과 수포 캡슐을 분리.
    2. 가위로 떨어져 수포합니다 (styliform 과정)의 앞쪽 끝을 잘라, 4 ° C에서 (항원 성을 유지하기 위해 2 % 또는 1 % PFA보다는 PBS에 4 %) 정착액의 수포와 캡슐을 빠져들게. 공기가 수포에 갇혀 경우, 바늘과 주사기를 사용하여 제거합니다. 튜브 회전에서 4 ° CO / N의 정착에 수포 및 캡슐을 둡니다.
    3. PBS에 신속하게 수포 및 캡슐을 세척하고 즉시 4 ℃에서 액체 극저온 포함 화합물에 몰입.
    4. 중요 : 기포를 제거하면 중간에 어떤그리고 바늘에 의해, 그리고 집게로 포함 화합물을 첨가하여 흡입을 통해 외부 귀. (4 절)를 포함하기로 넘어갑니다.

4. 샘플 동향 및 포함

참고 : 전체 수포 및 캡슐은 원하는 부분을 잘라 포함하는 동안 특정 방향으로 배치해야합니다. 아래에 설명 된 절차는 절을 다양한 방향에서 추골 사용된다.

  1. 추골의 종 (시상) 절편
    1. 따뜻한 파라핀 (또는 극저온 포함 화합물)에서 아래로 수포 또는 외부 청각의 (外耳道)의 측면을 넣습니다. 추골의 목 횡단 라미가 삽입 접시 (- C도 4a)의 수평 바닥과 평행이되도록 방향을 조정합니다. 고막은 마우스 헤드 (도 4a에 수직으로 약 30 °의 각도로 경사져 유의도 59를 캄펜에서
  2. 추골의 수평 절편
    1. 따뜻한 파라핀 (또는 극저온 포함 화합물)에 수평 지느러미 무늬를 배치합니다. 추골의 목 횡 박판이 매립 접시 (- F도 4d)의 하부에 수직이되도록 수포 캡슐의 방향을 조정한다.
  3. 흉골 및 고막 5의 정면 절편 (단면)
    1. 가 포함 접시의 바닥에 수직이되도록 따뜻한 파라핀 (또는 극저온 포함 화합물)의 malleal 흉골를 놓습니다.
  4. 조직 매립 콘솔 시스템에 파라핀 왁스를 경화하는 적절한 온도로 냉각 블록 (또는, 드라이 아이스 / 헥산 욕에서 극저온 매립 화합물 사용).
  5. 프로세스 조직 블록 루틴 절차를 사용하여 절단 섹션. 헤 마톡 실린 및 에오신 (H & #와 예를 들어, 얼룩 파라핀 섹션38, E), safranin O (연골) 또는 파골 세포에 대한 주석 산염 내성 산성 포스파타제 (TRAP) 활동 () 3, 또는 면역 조직 화학에 의해. Undecalcified 저온부 뼈 형광 색소 (14)를 사용하여 라벨, 칼슘 알리자린 레드 염색 및 면역 (42)에 적합하다.

Representative Results

이 프로토콜은 마우스 청각 수포로부터 골편을 분리하는 방법을 제시한다. 첫째, 수포 및 캡슐은 두개골 (그림 1)에서 하나의 조각으로 밖으로 해부한다. 해부 수포는 다음 추골 (그림 2)과 침골과 등골 (그림 3)를 제조하는 데 사용됩니다. 청각 수포와 캡슐의 랜드 마크는 수포, 지느러미 크레스트, 전방 반원의 운하와 subarcuate 포사 (그림 1 층)의 앞쪽 끝에서 styliform 과정입니다. Microcomputed 단층 촬영 (CT) 영상은 청각 수포에서 이소골뿐만 아니라 그 이소골의 종 방향 및 수평 절편 (그림 4)에 대한 최적의 방향을 알 수있다.

추골의 길이 파라핀 절편의 경우, 수포 및 캡슐은 파에 포함, 일주일 동안 4 ° C에서 EDTA에 탈회 하였다그림 4 (A)에 표시된 방향에서 RAFFIN 블록 - C는 4 μm의에서 절단 한 다음 H & E를 사용하여 염색. 청각 수포에서 고막에 부착 된 추골은 P14 (그림 5A)에서 진행중인 연골 골화를 한 것으로 밝혀졌습니다. 새로운 뼈 형성을 가시화하기 위해, 칼 세인 (30 μg의 / g의 체중)를 복강 P20 마우스에 주입하고, 수포 및 캡슐은 P21에서 24 시간 후에 단리 하였다. 탈회없는 샘플은 냉동 포함하고 모토 (43)의 방법에 따른 접착 필름을 이용하여 6㎛의에 저온 절단되었다. DAPI로 핵 염색 (4 ', 6-diamidino -2- 페닐 인돌) 후 단면은, 형광 현미경으로 관찰 하였다. 칼 세인 신호 (녹색)는 추골 (m)의 새로운 골 형성, 수포 및 캡슐 (그림 5B)를 밝혔다. 추골의 수평 절편를 들어, 5 주령의 마우스에서 분리 청각 수포는 대한 (탈회하지 않고 냉동 내장 된방향이도 4d - 더 모토 방법을 이용하여 6㎛의 저온 절단시 F)를, 및 H & E 염색을 사용. malleal의이 과정이 브레비스 (MPB)의 수평 절편은 달팽이관 (그림 5C)를 보여줍니다.

P31 마우스에서 분리 오른쪽 청각 이소골의 내측보기 마우스 추골의 전형적인 특징을 보여줍니다, 즉, "활공 - 갈매기 날개처럼"(또는 페르시아어 칼 같은 45) 흉골, 눈에 띄는이 과정이 브레비스 (공 모양의 융기 ) (그림 6) 토론을보고, 횡단 얇은. 전방 과정 (이 과정이 앞쪽)가 goniale 주변의 해부 과정에서 골절되고 (ectotympanic)가 고막 링에서 분리합니다. incudostapedial 관절이 탈구되는 반면이 대표 샘플은 추골과 침골 사이에 그대로 incudomalleolar 관절을 나타낸다. malleal에 건의 삽입과stapedial 근육 프로세스가 검출 (도 6A, 별표)입니다.

도 6b는 동일한 배율로 마우스와 인간의 청각 이소골을 비교합니다. 크기보다 다른 종 (種)의 차이는 다음과 같습니다. malleal 흉골은 날개 같은 쥐하지만 인간의 클럽과 같은 것입니다. 해부학 적 축 (또는 회전축의 추골과 침골의 짧은 공정의 전방 과정을 통해 선)과 흉골 사이의 각도는 쥐에서 훨씬 더 작은 거의 수직 반대로 두 거의 평행 인간 6,46-48있다. 인간의 이소골에서 vibrometric 연구는 incudo-malleolar 관절이 기능적으로 49을 고정하기보다는 모바일 있음을 알 수있다. 마우스 추골 인간 47 명백하지 않는 넓은 얇은 평면 횡단 얇은 판을 나타낸다. 마우스에서,이 과정이 앞쪽은 막질 뼈, 즉 goniale와 팀파니에 퓨즈C 링, 인간에이 과정이 앞쪽 뼈 (41)의 작은 spicule로 감소된다. 마우스와 인간의 등골도 다릅니다 쥐에서, 전방의 CRU는 곡선과 후방 CRU는 더 직선 반면 인간이다, 전방의 CRU는 바로 후방의 CRU보다 더 많은입니다. 그것은 몸의 크기로 추골 헤드 상대가 다량으로 "작은"뼈 (48)의 상대 성장 관계에 상당한 변화를 보여, 같은 황금 몰 같은 종에서 확대되는 것을 주목할 필요가있다.

그림 1
그림 청각 수포 및 캡슐 1. 해부. P31 마우스 두개골 (A)의 좌우 절반으로 분할된다. A, 전방; P, 후방; L, 왼쪽; R, 맞다. (B)를 타개, 피부가 헤드의 우측 절반의 내측 표면. CX, 대뇌 피질; CB, 소뇌; 조식, 꼰 로프 코nstem. D, 지느러미; V, 복부. 집게로 뇌의 (C) 제거. (D) 오른쪽 두개골의 청각 캡슐의 내측 볼 수 있습니다. 지느러미 크레스트 (화살촉)는 중간 두개골 포사 (MCF) 및 후방 두개골 포사 (PCF) 사이에 위치 및 배측 - 전방 및 청각 캡슐의 ventro - 후방 표면을 분리한다. 스케일 바, 2mm. (E) 청각 수포 및 캡슐 (중간보기)의 높은 배율. 공동 달팽이관; VII, 안면 신경; VIII, 신경 vestibulocochlear; AC, 전방 (우수) 반원형 운하; 소뇌 paraflocculus 주택 SF, subarcuate 포사. 스케일 바, 1mm. 격리 된 청각 수포 및 캡슐 (중간보기)의 (F) 현미경 사진. SP, styliform 과정. 스케일 바, 1mm. (A - E), P31 마우스. (F), P33 마우스. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
추골 2. 해부 그림. (A) 권리 청각 수포와 캡슐의 Ventrolateral 볼 수 있습니다. 고랑의 tympanicus (ST, 점선 화살표) 고막의 부착 사이트입니다. 명세서에 뼈 측면은 외이의 일부이며, ST의 뼈 내측 중간 귀 캐비티의 바닥을 형성한다. A, 전방; P, 후방; D, 지느러미; V, 복부. 외부 청각 운하의 제거 후 (B)보기는 갈 거예요 flaccida (PF)과 tensa을 갈 거예요 (PT)을 포함하여 고막 (TM)를 공개합니다. 고실 뼈 malleal이 과정이 브레비스 (MPB) 근처 (점선 및 #)의 부분 (C) 제거. m, 추골; 밀리미터, malleal 흉골. 고막을 통해 본 중이 공동으로, 공기 방울 화살표. (D) 노출 추골. 추골 헤드가 표시됩니다. 점이 찍힌라인은 침골의 관절면을 나타냅니다. 텐서 고실 근육의 (E) 힘줄이 (TT) 추골에 연결합니다. 추골이 해제 될 때 (F) 텐서 고실이 당겨진다. * 근육 과정. (G) 텐서 고실은 바늘을 사용하여 절단한다. 세 청각 이소골 고막의 제거 후 (H). incudo-malleolar 관절 탈구된다. m, 추골; 난, 침골; 의, 등골; , goniale (추골과 고막 링, TR에 융합)으로 이동합니다. 모든 규모의 바, 0.5 mm. (A, H), P33 마우스. (B - G), P31 마우스. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 침골과 등골 3. 해부. (A) 침골추골의 제거 후 등골. stapedial 동맥 (SA)는 등골 (들)을 통과한다. 점선은 침골의 관절면을 나타냅니다. 짧은 CRU의 침골 (I)의 (ICB, 하퇴 브레 베)가 후방 인대에 의해 고정되어 있습니다 (도시하지 않음). 별표, 등골의 근육 과정. (B)는 모루 제거한 후 등골. 바늘 끝은 stapedial 동맥 (SA)를 절단하는 데 사용됩니다. 혈액 유동 방향을 화살표. 점선은 등골의 관절면을 나타냅니다. (다) stapedial 동맥은 등골에서 제거됩니다. X는 stapedial 동맥 (SA)의 절단 끝을 나타냅니다. (D) 타원형 창 (아야, FENESTRA ovalis 또는 FENESTRA vestibuli)는 등골의 제거 후 볼 수 있습니다. RW, 둥근 창 (FENESTRA 원형 홀 또는 FENESTRA cochleae). 스케일 바, 0.5 mm. 이의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오그림.

그림 4
(- C 시상, A) 및 수평 (D - E) 추골의 단면 종에 대한 임베딩하는 동안 청각 수포 및 캡슐을 정위 그림 4. (A - C) 추골의 목 횡단 라미는 접시를 삽입의 바닥에 평행하게 배치됩니다. (A) 측면보기 : 마이크로 CT 이미지 (파란색 모조 착색)이 수포의 우측 추골의 삽입을 표시합니다. 추골과 침골은 녹색 모조 착색된다. 점선, 원하는 절단 평면. 실선, 접시를 삽입의 바닥. m, 추골; 화살촉, 등의 문장. M, 중간; L, 측면; D, 지느러미; V, 복부. (B) 상위 뷰 : 마이크로 CT 이미지를. 수포 (styliform 과정)의 앞쪽 끝 제거합니다. 난, 침골. (C) 상위 뷰하십시오로 촬영 한 현미경 사진을 (컬러 필터). AC, 전방 (우수) 반원형 운하; SF, subarcuate 포사; SP, styliform 과정. A, 전방; P, 후방; D, 지느러미; V, 복부. (D - F) 추골의이 과정이 브레비스는 접시를 삽입의 바닥에 수직으로 배치됩니다. (D) 측면보기 : 마이크로 CT 이미지는 우측 추골의 삽입을 표시합니다. 점선, 원하는 절단 평면. 실선, 접시를 삽입의 바닥. (E) 상위 뷰 : 마이크로 CT 이미지를. 밀리미터, malleal 흉골. (F) 상위 뷰 (컬러 필터와 함께 찍은 사진) 현미경 사진. 스케일 바, 1mm. 이전 7 바와 같이 마이크로 CT 이미지는 5 ㎛의 복셀 해상도 얻었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
에프igure 5. 조직학. (A) H & E 염색. P14의 청각 수포 (점선)의 파라핀 포함 된 권리 추골 (m)의 종 (시상) 섹션을 참조하십시오. TM, 고막. (B) 칼 세인 뼈 라벨. P21의 청각 수포에서 냉동, undecalcified 좌측 추골 (m)의 종단면. Counterstain과, DAPI. (C) H & E 염색. 청각 수포 및 캡슐 (5 주령 마우스)에서 냉동, 왼쪽 undecalcified malleal이 과정이 브레비스 (MPB)의 수평 부. 공동 달팽이관. 스케일 바, 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6
그림 6. 청각 이소골의 내측보기. (A) P의 오른쪽 청각 이소골31 마우스입니다. A, 전방; P, 후방; D, 지느러미; V, 복부. 스케일 바, 1mm. 추골 머리 (Caput mallei, 두상화 mallei); 목 (Collum mallei); 얇은 판 (횡단 얇은 판) 밀리미터 (흉골 mallei); 검은 색 별표 (추골의 근육 과정) MPA (이 과정이 앞쪽에,이 과정이 박근); MPB (이 과정이 브레비스); 침골 본체 (코퍼스 incudis); ICB (크뤼의 브레 베, 짧은 CRU의 짧은 과정); ICL (크뤼의 longum의 긴 CRU에, 긴 과정); IPL (이 과정이의 lenticularis, 렌즈 처리, 실비의 융기); 등골 머리 (Caput가 stapedis); 흰색 별표 (등골의 근육 과정) SCA (크뤼의 anterius, 전방의 CRU); SCP (크뤼의 posterius, 후방의 CRU); 기본 (기초의 stapedis, 발판); SOF (폐색 난원, intercrural 난원). (B) 76 세의 인간 여성의 오른쪽 청각 이소골 (해부학 교실 의학의 게이오 대학의 의례). 즉 인간의 이소골을 위해 사용 된 P31 마우스의 이소골은 (오른쪽 아래) 같은 배율로 몇 군데 있습니다. CURV에드 화살표는 해부학 적 축과 흉골 (점선) 사이의 각도를 나타냅니다. 스케일 바, 2mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

여기, 우리는 출생 후의 쥐의 청각 수포 및 캡슐을 분리하는 유용한 방법을 제시한다. P12에 앞서, 조직은 연약하고 격리하는 동안 손상 될 수 있습니다. P12 후, 청각 수포 및 캡슐은 쉽게 주변 조직으로부터 분리 할 수있다. 절편 전에 머리에서 수포를 해부하는 것은 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, 출생 캐비테이션 및 청각 수포의 성장이 가장 활발 이후 P6에서 발생 P14 (50)에 의해 완료됩니다. 고막과 달팽이관 벽 사이의 중간 엽 조직은 캐비테이션 과정을 통해 공기로 대체됩니다. 중간 귀 구멍에 생성 된 공기는 고정, 탈회 및 삽입하는 동안 조직과 액체 사이의 접촉을 방해 할 수 있습니다. 앞쪽 끝 (styliform 프로세스)를 차단보다는 unisolated 수포에서 그렇게 노력에 의해 분리 된 청각 수포에서 공기를 제거하는 것이 더 쉽습니다. 둘째, 추골 (그리고 고막)의 방향이 수직 아니다머리있다. 그것은 주어진 방향으로 고립 된 청각 수포 및 캡슐을 삽입하여 원하는 평면의 추골을 섹션에 따라서 용이하다.

고립되면, 청각 수포 및 캡슐은 수많은 분석에 유용하다. 예를 들어, 고해상도 X 선 마이크로 CT는 추골 (14)의 골 형성 모세 혈관으로 뼈의 미세 구조 형태를 공개 할 수 있습니다. stereofluorescence 해부 현미경은 중간 또는 내이 (33)에 형광 단백질을 발현하는 기자 마우스를 평가하는 구조를 시각화하는 강력한 도구입니다. 또한, 생체 내 또는 생체 형광 표시 방법과 전체 마운트 면역 형광 검출의 다양한이 수행 될 수있다. 가벼운 시트 형광 현미경은 입체 분석 (51)에 유용합니다. 여기에 설명되지 않았지만, 다양한 해부학 적 구조는 말초 신경, 혈관 등의 청각 수포 및 캡슐과 연관중간 귀의 고막의이 프로토콜을 이용하여 평가 될 수있다.

그 파라핀 절편이 광물의 분석을 허용하지 않습니다 때문에 삽입하기 전에 뼈 조직의 탈회를 요구하고 있습니다. 대조적으로, 동결 절편을 제조하는 데 사용되는 막 모토 방법 43 탈회없이 수행 및 알리자린 염색 등의 생체 골 분류 기술 또는 특수 염색에 사용 광물 연구에 적합 할 수있다. 극저온 절편 조건은 마우스 연령에 따라 따라 최적화되어야한다. 예를 들어, 저온 유지 챔버 내부의 적은 시원한 온도는 부분의 손상을 최소화하기 위해 이전 마우스 표본을 권장합니다.

마우스에서, 추골의 눈에 띄는 반구형 돌기에 대한 올바른 용어는 "공 모양의 융기"입니다. 그럼에도 불구하고, 용어 "이 과정이 브레비스"는 더 널리 번째위한 공 모양의 융기를 나타내는 데 사용 된특히 마우스 발달 생물 학자 16,20,22-25들 사이에서 이십년. "이 과정이 브레비스"원래 공 모양의 융기와 다른 측면 과정 (이 과정이이 lateralis), 함. 인간에서 약간의 원추형 돌기를 닮은 측면 과정 (안 그림 6B, 중간에서 볼)에 흉골로부터 연장, 고막에 부착의 일반 라인을 형성한다. 마우스에서, 횡 프로세스는 umbo 48 반대쪽의 흉골의 투영이다. 고막의 유리체의 flaccida은 추골의 측면 과정 이상입니다. 공 모양의 융기는 인간의 추골에서 알 수 없습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tools/Equipment
Paper towel Daio Paper Corporation 703347 can be purchased from other vendors
Glass Jar Various can be purchased from other vendors
14 cm surgical scissors Fine Science Tools (F.S.T.) 91400-14 can be purchased from other vendors
Extra fine scissors-straight Fine Science Tools (F.S.T.) 14084-08 can be purchased from other vendors
Fine Forceps Angled 45° Fine Science Tools (F.S.T.) 11063-07 can be purchased from other vendors
Dissecting microscope Nikon SMZ800N for routine dissection
Dissecting microscope Nikon SMZ18 for movies 
Injection needle 27 G TERUMO NN-2719S
Syringe (1 mL) TERUMO SS-01T
Marking Pin Various
Tube rotator RT-50 TAITEC 0000165-000 can be purchased from other vendors
Cryostat Leica CM3050S http://www.leicabiosystems.com/histology-equipment/cryostats/details/product/leica-cm3050-s/
TC-65 Tungsten blade Leica 14021626379 for Kawamoto's firm method
Stainless containers Leica for Kawamoto's firm method
Cryofilm type IIC Leica for Kawamoto's firm method
Silane coated slide (New Silane II) Muto Pure Chemicals 511617 can be purchased from other vendors
Cover glass Matsunami can be purchased from other vendors
Tissue processor Sakura Finetek VIP-5 can be purchased from other vendors
Tissue Embedding Console System Sakura Finetek Tissue-Tek TEC 5  can be purchased from other vendors
Sliding microtome for paraffin Yamato Kohki Industrial REM-710 can be purchased from other vendors
Path Blade+pro for hard tissue Matsunami PB3503C for paraffin section
Micro-CT RIGAKU R_mCT2 http://www.rigaku.com/en
Fluorescence microscope KEYENCE BZ-9000
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Isoflurane Maruishi pharmaceutical Co. Ltd
NaCl wako 191-01665 for PBS
KCl wako 285-14 for PBS
Na2HPO4 12H2O wako 196-02835 for PBS
KH2PO4 wako 287-21 for PBS
Paraformaldehyde (PFA, EM Grade) TAAB P001
EDTA-2Na wako 15111-45
Trizma base Sigma T1503-1KG
Super Cryoembedding Medium Leica for Kawamoto's firm method
Dry Ice Various for Kawamoto's firm method
Hexane wako 080-03423 for Kawamoto's firm method
Super Cryomouting Medium type R2 Leica for Kawamoto's firm method
Paraffin Sakura Finetek 781001A0107
Histo-Clear NDS HS-200
Calcein DOJINDO 340-00433
Hematoxylin  wako 131-09665
Eosin wako 051-06515

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References

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