प्रसव के बाद चूहों में श्रवण बुल्ला की विच्छेदन: मध्यम कान हड्डियों और histological विश्लेषण के अलगाव

1Laboratory of Cell and Tissue Biology, Keio University School of Medicine, 2Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery, Keio University School of Medicine
Published 1/04/2017
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Biology
 

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Sakamoto, A., Kuroda, Y., Kanzaki, S., Matsuo, K. Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis. J. Vis. Exp. (119), e55054, doi:10.3791/55054 (2017).

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Abstract

सबसे स्तनधारियों में, मध्य कान में श्रवण ossicles, कान में की हड्डी, इन्कस और स्टेपीज़ सहित, छोटी हड्डियों कर रहे हैं। चूहों में, एक बोनी संरचना बुलाया श्रवण बुल्ला ossicles घरों, जबकि श्रवण कैप्सूल भीतरी कान, अर्थात् कोक्लीअ और semicircular नहरों encloses। Murine ossicles ओटोलर्यनोलोजी के क्षेत्र में शोधकर्ताओं के लिए महान ब्याज की सुनवाई और इस प्रकार के लिए आवश्यक हैं, लेकिन उनके चयापचय, विकास और विकास के अन्य क्षेत्रों के लिए प्रासंगिक हैं। बदल हड्डी चयापचय वयस्क चूहों में सुनवाई समारोह को प्रभावित कर सकते हैं, और विभिन्न जीन की कमी चूहों गर्भाशय में श्रवण ossicles के morphogenesis में परिवर्तन दिखा। हालांकि murine श्रवण ossicles छोटे हैं, उनके हेरफेर संभव है, तो अपने संरचनात्मक अभिविन्यास और 3 डी संरचना को समझता है। यहाँ, हम श्रवण बुल्ला और प्रसव के बाद चूहों के कैप्सूल काटना और फिर कैसे बुल्ला के हिस्से को हटाने के द्वारा अलग-अलग ossicles को अलग वर्णन है। हम यह भी चर्चा है कि कैसे उन्हें करने के लिएबिस्तर बुल्ला और विभिन्न झुकाव में कैप्सूल आयल या फ्रोजन वर्गों कान में की हड्डी की, अनुदैर्ध्य क्षैतिज, या ललाट वर्गों की तैयारी के लिए उपयुक्त उत्पन्न करते हैं। अंत में, हम माउस और मानव श्रवण ossicles के बीच शारीरिक मतभेद की गणना करें। इन विधियों श्रवण ossicles की, रोग विकास और विकासवादी पहलुओं और चूहों में मध्य कान का विश्लेषण करने में उपयोगी होगा।

Introduction

मध्य कान के तीन श्रवण ossicles, अर्थात् कान में की हड्डी, इन्कस, और स्टेपीज़, एक स्तनधारी-विशिष्ट श्रवण श्रृंखला है कि भीतरी कान के लिए कान की झिल्ली, या कोक्लीअ 1,2 से ध्वनि पहुंचाता के रूप में। समारोह सुनकर चूहों में श्रवण brainstem रिस्पांस (ABR) थ्रेसहोल्ड 3-6, और कान की झिल्ली लेजर डॉपलर Vibrometry (LDV) 7 का उपयोग कर नजर रखी जा सकती पीछे कान में की हड्डी के कंपन को मापने के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है। ABR, LDV, और विरूपण उत्पाद Otoacoustic उत्सर्जन (DPOAE) माप के संयोजन से, प्रवाहकीय सुनवाई हानि sensorineural हानि 8 से भेदभाव किया जा सकता है।

कान की स्थिति के पशु मॉडल की जरूरत है, सुनने और सभी उम्र के रोगियों की भलाई के लिए कान स्वास्थ्य के महत्व को देखते हुए। उदाहरण के लिए, ओटिटिस मीडिया एक बेहद आम कान मानव शिशुओं और बच्चों, और गंभीर, तीव्र ओटिटिस मीडिया में देखा संक्रमण है और इसकी जटिलताओं कब्जा करता है, तो हो सकता हैtion उचित antimicrobials 9 के साथ इलाज नहीं है। ओटिटिस मीडिया के माउस मॉडल रोगजनन को समझने में और उपचार 10,11 विकसित करने में उपयोगी साबित हो सकता है।

Murine ossicles है, जो (कान में की हड्डी की goniale भाग के लिए छोड़कर) endochondral हड्डी बन जाना 12,13 से बनते हैं, हड्डी चयापचय और morphogenesis के अध्ययन के लिए प्रासंगिक हैं। पहला, उनके छोटे आकार के एक अक्षुण्ण periosteum एक्स-रे या प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी 14 उपयोग करने के साथ हड्डियों के उच्च संकल्प विश्लेषण की अनुमति देता है। दूसरा, इस तरह के अत्यधिक या कमी हड्डी अवशोषण, या अस्थि कोशिकाओं के बीच 15 बिगड़ा बातचीत के रूप में न्यायपालिका हड्डी चयापचय, नुकसान 3,4,7 की सुनवाई के लिए एक संभावित योगदानकर्ता के रूप में विश्लेषण किया जा सकता है। तीसरा, असामान्य हड्डी morphogenesis ऐसे Hoxa2 16-19, 20-22 Msx1, Prrx1 23, Goosecoid कमी जानवरों के रूप में कई जीन की कमी चूहों, में सूचना दी है(GSC) 24,25, 13 Bapx1, Tshz1 26, Dusp6 (Mkp3) 27, नोगिन (खूंटी), 28, 29 Fgfr1, थायराइड हार्मोन रिसेप्टर्स (Thra, Thrb) 5, Bcl2 30 और दूसरों को 1,31, या चूहों में overexpressing Hoxa2 32। अंत में, अपने छोटे आकार के बावजूद, संरचनाओं इस तरह की मांसपेशियों और जोड़ों 33 34,35 के रूप में ossicles के साथ जुड़े पहुंच रहे हैं।

माउस ossicles मानव ossicles से छोटे हैं, लेकिन यह उल्लेखनीय है कि माउस मध्य कान अपने मानव समकक्ष का एक लघु संस्करण नहीं है। उदाहरण के लिए, चूहों में, stapedial धमनी, जो स्टेपीज़ की अंगूठी के माध्यम से गुजरता है, जीवन भर 36, बनी रहती है, जबकि मानव में, भ्रूण stapedial धमनी गर्भ के दौरान गायब हो जाता है। इसके अलावा, माउस कान में की हड्डी की आकृति विज्ञान वीं के उस से अलगई मानव हड्डी (चित्रा 6 देखें)। चूहों में, श्रवण (मध्य कर्ण) बुल्ला, हवा से भरा मध्य कान गुहा encloses जबकि मानव में, कर्णमूल हवा लौकिक हड्डी में घरनदार हड्डी से बना कोशिकाओं को एक बुल्ला 37 से ossicles घरों बल्कि। दोनों प्रजातियों में, श्रवण कैप्सूल (कान का कैप्सूल, बोनी भूलभुलैया) कोक्लीअ और भीतरी कान की semicircular नहरों encloses। मध्य कान की तुलनात्मक और विकासवादी जीव विज्ञान में बड़े पैमाने पर 38-40 समीक्षा की गई है।

पहले नीचे प्रदान प्रोटोकॉल का वर्णन श्रवण बुल्ला और कैप्सूल है, जो मध्य कान और भीतरी कान की मुख्य रूप से मिलकर काटना करने के लिए कैसे, क्रमशः। इस प्रोटोकॉल भी दर्शाता है कि कान में की हड्डी, इन्कस और श्रवण बुल्ला से स्टेपीज़ को अलग-थलग करने के लिए कैसे। अंत में, यह श्रवण ossicles के ऊतक सेक्शनिंग के लिए तैयार करने में एम्बेड करने के लिए श्रवण बुल्ला और कैप्सूल उन्मुख करने के लिए कैसे पता चलता है।

Protocol

इस अध्ययन में प्रदर्शन सभी पशु प्रक्रियाओं कीयो विश्वविद्यालय संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित कर रहे हैं (IACUC - स्वीकृति संख्या: 09221) और अनुसंधान के क्षेत्र में जानवरों के इस्तेमाल के लिए कीयो विश्वविद्यालय में पशु प्रयोग पर संस्थागत दिशा निर्देशों का पालन करें। मानव नमूनों एक शव एनाटॉमी, मेडिसिन के कीयो विश्वविद्यालय के स्कूल विभाग के लिए दान से अलग थे, और संस्थागत नियमों के अनुसार इस्तेमाल किया गया।

1. श्रवण बुल्ला और कैप्सूल का अलगाव

  1. एक जार isoflurane या sevoflurane में भिगो जब तक सांस वेंटिलेशन एक मिनट से अधिक के लिए रहता है कागज तौलिए से ऊपर एक मंच युक्त चूहों euthanize और फिर गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था प्रदर्शन करते हैं। लथपथ कागज तौलिये के साथ चूहों के सीधे संपर्क से बचने के लिए सावधान रहें।
  2. गर्दन के पृष्ठीय पक्ष पर एक छोटे से अनुप्रस्थ चीरा और सिर की ओर अलावा त्वचा खींचने के लिए और दोनों हाथों का उपयोग पूंछ अंतर्निहित गर्दन म्यू बेनकाब करने के लिएscle ऊतक।
  3. ग्रीवा क्षेत्र 14 सेमी तेज शल्य कैंची का उपयोग करने पर चूहों सिर काटना।
  4. पूरी तरह से नाक की ओर पील त्वचा। एक साथ सभी त्वचा कट थूथन और कृन्तक के साथ।
  5. मुंह में कैंची डालें और दोनों पक्षों पर masseter मांसपेशियों को काट दिया।
  6. जबड़े ध्यान से खोलें और एक साथ जीभ और निचले जबड़े को हटा दें।
  7. Midsagittal विमान (चित्रा 1 ए, बी) के साथ दो हिस्सों में तेज कैंची, विभाजन खोपड़ी और खोपड़ी आधार का उपयोग करना।
  8. संदंश का प्रयोग, मस्तिष्क और अनुमस्तिष्क गोलार्द्धों और मस्तिष्क को हटा दें। श्रवण बुल्ला और कैप्सूल सेरिबैलम और मस्तिष्क के लिए पार्श्व में स्थित हैं। ध्यान दें कि श्रवण बुल्ला आगे श्रवण कैप्सूल (चित्रा 1 सी, डी) के लिए पार्श्व है।
  9. बुल्ला और आसपास खोपड़ी की हड्डी (चित्रा 1E) के साथ कैप्सूल काटना।
  10. आरटी पर फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) 7.4 पीएच युक्त एक डिश के लिए नमूना स्थानांतरण।
  11. यूnder एक दूरबीन विदारक माइक्रोस्कोप, आसपास के हड्डियों और कैंची के अलावा खींचने के लिए चारों ओर बुल्ला और कैप्सूल (चित्रा 1F) ढीला सीमा में कटौती करने के लिए संदंश का उपयोग करें। आसपास हटा हड्डियों basioccipital (उदर सीमा), exoccipital (ventro पीछे सीमा), supraoccipital (पीछे सीमा), interparietal, पार्श्विका (पृष्ठीय सीमा), squamosal (dorso-पूर्वकाल सीमा), alisphenoid (पूर्वकाल सीमा), और basisphenoid हैं (Antero-उदर सीमा) हड्डियों। ध्यान दें कि styliform प्रक्रिया (सपा), जो Eustachian ट्यूब 41 के मध्य कर्ण खोलने का समर्थन करता है, लौकिक हड्डी के styloid प्रक्रिया से अलग है।

कान में की हड्डी, इन्कस और स्टेपीज़: 2. श्रवण ossicles का अलगाव

  1. कान में की हड्डी
    1. दोनों छोटे कैंची और संदंश का प्रयोग, परिखा tympanicus के लिए बाहरी श्रवण नहर पार्श्व का हिस्सा चित्रा 2A, बी को दूर इतना है कि कान की झिल्ली दिखाई देता है ()।
    2. उदर (डॉटेड) और पीछे (#) की दीवारों (चित्रा -2) में कान की झिल्ली और malleal प्रक्रिया ब्रेविस (गोलाकार एपोफ़ाइसिस, चर्चा देखें), दोनों के पास मध्य कर्ण की हड्डी का हिस्सा निकालें। कान में की हड्डी और मांसपेशियों tensor tympani अब उजागर किया जाना चाहिए (चित्रा 2 डी, ई)।
    3. कान में की हड्डी (चित्रा 2 एफ) लिफ्ट और एक 27 जी सुई (चित्रा 2 जी) के beveled बढ़त के साथ tensor tympani पेशी काटा। ध्यान दें कि malleal manubrium मजबूती, कान की झिल्ली के लिए देता है के रूप में अन्य स्तनधारियों में देखा जाता है।
    4. manubrium है, जो कमजोर है से ध्यान से कान की झिल्ली को अलग करें। मध्य कर्ण हड्डी हटाये तीन श्रवण ossicles प्रकट करते हैं।
    5. Ossicular संयुक्त (चित्रा 2H) पर इन्कस से कान में की हड्डी भंग।
    6. goniale पर पूर्वकाल प्रक्रिया fracturing द्वारा कान में की हड्डी अलग।
  2. इन्कस और स्टेपीज़
    1. टी पृथकवह कम टांग (चित्रा 3 ए) में इन्कस के पीछे बंध काटने से इन्कस।
    2. एक 27 जी सुई (चित्रा 3 बी, सी) के beveled बढ़त के साथ स्टेपीज़ के पास stapedial धमनी काटने से स्टेपीज़ अलग। यदि आवश्यक हो, सुई के साथ स्टेपीज़ के पहलवान प्रक्रिया पर stapedial पेशी के कण्डरा काटा।
    3. स्टेपीज़ के गवाक्ष रंध्र में एक सिलाई सुई (या एक अंकन पिन) डालें और स्टेपीज़ ऊपर उठा। स्टेपीज़ हटाने के बाद, अंडाकार खिड़की खोलने स्पष्ट रूप से दिखाई (चित्रा 3 डी) होना चाहिए।

3. श्रवण बुल्ला और कैप्सूल के embedding

  1. पैराफिन ब्लॉकों में embedding के लिए तैयारी
    1. धारा 1 में वर्णित के रूप में बुल्ला और कैप्सूल अलग।
    2. , बुल्ला (styliform प्रक्रिया) कैंची के साथ बंद के पूर्वकाल अंत कट 4 डिग्री पर बुल्ला और पीबीएस में 4% paraformaldehyde (पीएफए) में कैप्सूल विसर्जितसी, और लगानेवाला बुल्ला में प्रवेश करने की अनुमति है। हवा बुल्ला में फंस जाता है, तो एक सुई और सिरिंज के साथ इसे हटा दें। एक ट्यूब रोटेटर पर 4 डिग्री सीओ / एन पर बुल्ला और लगानेवाला में कैप्सूल छोड़ दें।
      सावधानी: पीएफए ​​विषैला होता है और ध्यान से संभाला जाना चाहिए।
    3. पीबीएस के साथ एक बार धो लें।
    4. 10% ethylenediaminetetraacetic एसिड disodium नमक dihydrate में 4 डिग्री सेल्सियस पर decalcify बुल्ला और कैप्सूल एक सप्ताह के लिए (EDTA-2NA), 100 मिमी Tris आधार, पीएच 7.0, एक 2 एमएल ट्यूब में। हर दूसरे दिन बफर बदलें।
    5. पीबीएस के साथ एक बार धो लें। नमूने 4 डिग्री सेल्सियस पर पानी में 70% इथेनॉल में संग्रहित किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, एक वर्गीकृत शराब श्रृंखला (30%, 50%, पानी में 70%) के माध्यम से 70% इथेनॉल के लिए स्थानांतरण।
    6. एक ऊतक प्रोसेसर पर, xylene में इथेनॉल समाधान की एक वर्गीकृत श्रृंखला में नमूनों (70%, 2x 95%, 3x 100%, प्रत्येक 1 घंटे), स्पष्ट निर्जलीकरण (4x, 40 डिग्री सेल्सियस पर प्रत्येक 1 घंटे), और साथ नमूनों में घुसपैठ पिघला हुआ पैराफिन मोम 42। वैकल्पिक रूप से, वाणिज्यिक ऊतक clearin साथ स्थानापन्न xyleneजी समाधान (जैसे, histo-साफ़)।
    7. प्रोसेसर से नमूनों उतारना, और उन्हें अपने कैसेट से हटा दें।
    8. एक ऊतक embedding सांत्वना सिस्टम पर, जगह पिघला हुआ पैराफिन मोम के साथ भरा सांचों में नमूनों। (धारा 4) एम्बेड करने के लिए आगे बढ़ें।
  2. जमे हुए ब्लॉक में embedding के लिए (कावामोटो की फिल्म विधि) तैयारी 43
    1. धारा 1 में वर्णित के रूप में बुल्ला और कैप्सूल अलग।
    2. बुल्ला (styliform प्रक्रिया) कैंची के साथ बंद के पूर्वकाल अंत कट, 4 डिग्री सेल्सियस पर (प्रतिजनकता संरक्षित करने के लिए 2% या 1% पीएफए ​​के बजाय पीबीएस में 4%) बुल्ला और लगानेवाला में कैप्सूल विसर्जित कर दिया। हवा बुल्ला में फंस जाता है, एक सुई और सिरिंज का उपयोग कर इसे हटा दें। एक ट्यूब रोटेटर पर 4 डिग्री सीओ / एन पर बुल्ला और लगानेवाला में कैप्सूल छोड़ दें।
    3. पीबीएस में जल्दी बुल्ला और कैप्सूल को धो लें और तुरंत 4 डिग्री सेल्सियस पर तरल क्रायो embedding परिसर में विसर्जित कर दिया।
    4. महत्वपूर्ण: हवाई बुलबुले निकालें, तो बीच में किसी भीऔर आकांक्षा के माध्यम से बाहरी कान एक सुई द्वारा, और संदंश के साथ embedding यौगिक जोड़कर। (धारा 4) एम्बेड करने के लिए आगे बढ़ें।

4. नमूना अभिविन्यास और एम्बेडिंग

नोट: पूरे बुल्ला और कैप्सूल वांछित वर्गों में कटौती करने के लिए embedding के दौरान एक विशेष उन्मुखीकरण में व्यवस्थित किया जाना चाहिए। प्रक्रियाओं नीचे उल्लिखित खंड के विभिन्न झुकाव में कान में की हड्डी का इस्तेमाल किया जाता है।

  1. कान में की हड्डी के अनुदैर्ध्य (parasagittal) सेक्शनिंग
    1. बुल्ला या बाहरी कर्णद्वार के पार्श्व पक्ष गर्म आयल (या क्रायो embedding यौगिक) में नीचे डाल दिया। उन्मुखीकरण समायोजित इतना है कि कान में की हड्डी की गर्दन और आड़ा पटल एम्बेडिंग पकवान (चित्रा -4 ए - सी) की क्षैतिज नीचे करने के लिए समानांतर हैं। ध्यान दें कि कान की झिल्ली माउस सिर (चित्रा -4 ए में खड़ी करने के लिए लगभग 30 डिग्री के कोण पर झुका है, चित्रा 59 Kampen में
  2. कान में की हड्डी की क्षैतिज सेक्शनिंग
    1. गर्म आयल (या क्रायो embedding यौगिक) में क्षैतिज पृष्ठीय शिखा रखें। बुल्ला और कैप्सूल के उन्मुखीकरण को समायोजित इतना है कि कान में की हड्डी की गर्दन और आड़ा पटल एम्बेडिंग पकवान (चित्रा 4D - एफ) की तह तक सीधा कर रहे हैं।
  3. Manubrium और कान की झिल्ली 5 के ललाट सेक्शनिंग (पार वर्गों)
    1. गर्म आयल (या क्रायो embedding यौगिक) में malleal manubrium जगह ऐसी है कि यह embedding डिश के नीचे करने के लिए खड़ा है।
  4. एक ऊतक embedding सांत्वना सिस्टम पर पैराफिन मोम कड़ा करने के लिए उचित तापमान के लिए ब्लॉक शांत हो जाओ (वैकल्पिक रूप से, एक सूखी बर्फ / हेक्सेन स्नान में क्रायो embedding यौगिक का उपयोग करें)।
  5. प्रक्रिया ऊतक ब्लॉक और वर्गों में कटौती नियमित प्रक्रिया का उपयोग कर। उदाहरण के लिए, hematoxylin और eosin (एच & # के साथ दाग आयल वर्गों38; ई), सैफरैनीन हे (उपास्थि के लिए), या Tartrate प्रतिरोधी एसिड फॉस्फेट (जाल) गतिविधि (अस्थिशोषकों के लिए) 3 के लिए, या immunohistochemistry द्वारा। Undecalcified cryosections fluorochromes 14 का उपयोग हड्डी लेबलिंग, कैल्शियम के लिए Alizarin लाल धुंधला, और immunofluorescence 42 के लिए उपयुक्त हैं।

Representative Results

इस प्रोटोकॉल माउस श्रवण बुल्ला से ossicles को अलग-थलग करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है। सबसे पहले, बुल्ला और कैप्सूल खोपड़ी (चित्रा 1) से एक टुकड़ा के रूप में बाहर विच्छेदित कर रहे हैं। विच्छेदित बुल्ला तो कान में की हड्डी (चित्रा 2) और इन्कस और स्टेपीज़ (चित्रा 3) तैयार करने के लिए प्रयोग किया जाता है। श्रवण बुल्ला और कैप्सूल के स्थलों बुल्ला, पृष्ठीय शिखा, पूर्वकाल semicircular नहर, और subarcuate खात (चित्रा 1F) के पूर्वकाल अंत में styliform प्रक्रिया कर रहे हैं। Microcomputed टोमोग्राफी (सीटी) इमेजिंग श्रवण बुल्ला में ossicles साथ ही उन ossicles के अनुदैर्ध्य और क्षैतिज सेक्शनिंग (चित्रा 4) के लिए इष्टतम झुकाव का पता चलता है।

कान में की हड्डी के अनुदैर्ध्य आयल सेक्शनिंग के लिए, बुल्ला और कैप्सूल एक सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर EDTA में decalcified रहे थे, एक देहात में एम्बेडेडउन्मुखीकरण चित्रा 4 ए में दिखाया गया है पर raffin ब्लॉक - सी, 4 माइक्रोन पर sectioned, और उसके बाद एच ई का उपयोग दाग। कान में की हड्डी श्रवण बुल्ला में कान की झिल्ली से जुड़ी P14 (चित्रा 5 ए) में चल रहे endochondral हड्डी बन जाना पता चला। नई हड्डी गठन कल्पना, calcein (30 माइक्रोग्राम / जी bodyweight) peritoneally एक P20 माउस में इंजेक्ट किया गया था, और बुल्ला और कैप्सूल 24 घंटे बाद P21 पर अलग थे। विकैल्सीकरण बिना नमूना जमे हुए एम्बेडेड था और फिर एक चिपकने वाला कावामोटो 43 की विधि पर आधारित फिल्म का उपयोग कर 6 माइक्रोन पर cryosectioned। DAPI के साथ परमाणु धुंधला (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) के बाद, खंड एक प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे मनाया गया। Calcein संकेतों (हरा) कान में की हड्डी (एम) में नई हड्डी गठन, बुल्ला और कैप्सूल (चित्रा 5 ब) का पता चला। कान में की हड्डी की क्षैतिज सेक्शनिंग के लिए, श्रवण एक 5 सप्ताह पुराने माउस से अलग बुल्ला (विकैल्सीकरण बिना जमे हुए एम्बेडेड था के लिएउन्मुखीकरण देखें चित्र 4D - एफ), कावामोटो पद्धति से 6 माइक्रोन पर cryosectioned, और एच एंड ई का उपयोग दाग। Malleal प्रक्रिया ब्रेविस (MPB) की क्षैतिज सेक्शनिंग भी कोक्लीअ (चित्रा 5C) से पता चलता है।

एक P31 माउस से अलग सही श्रवण ossicles के एक औसत दर्जे का दृश्य माउस कान में की हड्डी के विशिष्ट सुविधाओं से पता चलता है, अर्थात्, "ग्लाइडिंग-सीगल दक्षिणपंथी की तरह" (या फारसी तलवार की तरह 45) manubrium, एक प्रमुख प्रक्रिया ब्रेविस (गोलाकार एपोफ़ाइसिस , चित्रा 6 चर्चा देखें), और आड़ा पटल ()। ध्यान दें कि पूर्वकाल प्रक्रिया (प्रक्रिया पूर्वकाल) goniale आसपास विच्छेदन प्रक्रिया में खंडित किया गया था और मध्य कर्ण की अंगूठी (ectotympanic) से अलग हो गया था। इस प्रतिनिधि नमूने कान में की हड्डी और इन्कस के बीच एक अक्षुण्ण incudomalleolar संयुक्त दर्शाती है, जबकि incudostapedial संयुक्त हड्डी उखड़ गई है। malleal में मांसल सम्मिलन औरstapedial पहलवान प्रक्रियाओं detectable (चित्रा 6A, तारक) कर रहे हैं।

चित्रा 6B ही बढ़ाई माउस और मानव श्रवण ossicles तुलना करती है। प्रजातियों मतभेद, आकार के अलावा, निम्नलिखित शामिल हैं। malleal manubrium विंग की तरह चूहों में है, लेकिन मानव में क्लब की तरह है। संरचनात्मक अक्ष (या रोटेशन की धुरी, कान में की हड्डी और इन्कस की छोटी प्रक्रिया के पूर्वकाल प्रक्रिया के माध्यम से लाइन) और manubrium के बीच कोण चूहों में बहुत छोटा होता है और के रूप में लगभग सीधा करने का विरोध दो लगभग समानांतर हैं, मनुष्य 6,46-48 में। मानव ossicles में, vibrometric अध्ययन बताते हैं कि incudo-malleolar संयुक्त मोबाइल है बजाय कार्यात्मक तय 49। माउस कान में की हड्डी एक व्यापक, पतली, और फ्लैट आड़ा पटल मनुष्यों 47 में स्पष्ट नहीं दर्शाती है। चूहों में, प्रक्रिया पूर्वकाल झिल्लीदार हड्डियों, अर्थात् goniale और tympani को फ़्यूज़सी अंगूठी, जबकि मानव में प्रक्रिया पूर्वकाल हड्डी 41 के एक छोटे से spicule के लिए कम है। चूहों और इंसानों की स्टेपीज़ भी अलग है: चूहों में, पूर्वकाल टांग घुमावदार है और पीछे टांग अधिक सीधे मानव में जबकि है, पूर्वकाल टांग सीधे पीछे टांग से अधिक है। यह ध्यान देने योग्य है कि शरीर के आकार के कान में की हड्डी सिर रिश्तेदार बड़े पैमाने पर इस तरह के स्वर्ण तिल के रूप में प्रजातियों में बढ़ा है, "छोटी" हड्डियों 48 की allometric रिश्तों में महत्वपूर्ण परिवर्तनशीलता का प्रदर्शन लायक है।

आकृति 1
चित्रा 1. श्रवण बुल्ला और कैप्सूल के विच्छेदन। (ए) एक P31 माउस की खोपड़ी सही और बाएँ हिस्सों में विभाजित है। एक, पूर्वकाल; पी, पीछे; एल, छोड़ दिया; आर, सही है। (बी) bisected, चमड़ी सिर के ठीक आधे की औसत दर्जे की सतह। CX, सेरेब्रल कॉर्टेक्स; सीबी, सेरिबैलम; बी एस, brainstem। डी, पृष्ठीय; वी, उदर। (सी) संदंश के साथ मस्तिष्क का हटाया। (डी) सही खोपड़ी में श्रवण कैप्सूल की औसत दर्जे का दृश्य। पृष्ठीय शिखा (तीर) मध्य कपाल खात (एमसीएफ) और पीछे कपाल खात (पीसीएफ) के बीच स्थित है और dorso-पूर्वकाल और श्रवण कैप्सूल के ventro पीछे सतहों अलग करती है। स्केल बार, 2 मिमी। (ई) श्रवण बुल्ला और कैप्सूल (औसत दर्जे का दृश्य) के उच्च बढ़ाई। सह, कोक्लीअ; सातवीं, चेहरे तंत्रिका; आठवीं, तंत्रिका vestibulocochlear; एसी, पूर्वकाल (बेहतर) semicircular नहर; एस एफ, subarcuate खात है, जो अनुमस्तिष्क paraflocculus घरों। स्केल बार, 1 मिमी। (एफ) पृथक श्रवण बुल्ला और कैप्सूल (औसत दर्जे का दृश्य) की सूक्ष्मछवि। सपा, styliform प्रक्रिया। स्केल बार, 1 मिमी। (ए - ई), P31 माउस। (एफ), P33 माउस। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2 कान में की हड्डी के विच्छेदन। (ए) एक सही श्रवण बुल्ला और कैप्सूल के ventrolateral देखें। परिखा tympanicus (अनुसूचित जनजाति, धराशायी तीर) कान की झिल्ली की कुर्की साइट है। अनुसूचित जनजाति के लिए हड्डी पार्श्व बाहरी कान का हिस्सा है, और अनुसूचित जनजाति के लिए हड्डी औसत दर्जे का मध्य कान गुहा की मंजिल रूपों। एक, पूर्वकाल; पी, पीछे; डी, पृष्ठीय; वी, उदर। (बी) के बाहरी श्रवण नहर को हटाने के बाद देखें कान की झिल्ली (टीएम) Pars flaccida (पीएफ) और Tensa pars (पं) सहित प्रकट करते हैं। (सी) मध्य कर्ण की हड्डी (बिंदीदार रेखा और #) malleal प्रक्रिया ब्रेविस (MPB) के पास के कुछ हिस्सों को हटाया। मी, कान में की हड्डी; मिमी, malleal manubrium। कान की झिल्ली के माध्यम से देखा मध्य कान गुहा में तीर, एयर बबल। (डी) उजागर कान में की हड्डी। कान में की हड्डी सिर संकेत दिया है। छितराया हुआलाइन इन्कस का जोड़ सतह इंगित करता है। (ई) tensor tympani पेशी के कण्डरा (टीटी) कान में की हड्डी से जुड़ी। (एफ) tensor tympani जब कान में की हड्डी उठाया है खींच लिया है। *, मांसपेशियों की प्रक्रिया। (G) Tensor tympani एक सुई का उपयोग कट जाता है। (एच) तीन श्रवण ossicles कान की झिल्ली को हटाने के बाद। incudo-malleolar संयुक्त हड्डी उखड़ गई है। मी, कान में की हड्डी; मैं, इन्कस; एस, स्टेपीज़; , Goniale (कान में की हड्डी और मध्य कर्ण की अंगूठी, टी.आर. के लिए जुड़े हुए) जाओ। सभी पैमाने सलाखों, 0.5 मिमी। (ए, एच), P33 माउस। (बी - जी), P31 माउस। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. इन्कस और स्टेपीज़ के विच्छेदन। (ए) और इन्कसकान में की हड्डी को हटाने के बाद स्टेपीज़। stapedial धमनी (एसए) स्टेपीज़ (एस) से होकर गुजरता है। बिंदीदार रेखा इन्कस का जोड़ सतह इंगित करता है। ध्यान दें कि कम टांग इन्कस (i) (आईसीबी, टांग ब्रीव) पीछे बंध द्वारा तय हो गई है (नहीं दिखाया गया है)। Asterisk, स्टेपीज़ की मांसपेशियों की प्रक्रिया। (बी) इन्कस को हटाने के बाद स्टेपीज़। सुई की नोक stapedial धमनी (एसए) में कटौती करने के लिए प्रयोग किया जाता है। तीर, रक्त प्रवाह की दिशा। बिंदीदार रेखा स्टेपीज़ के जोड़ सतह इंगित करता है। (सी) stapedial धमनी स्टेपीज़ से निकाल दिया जाता है। एक्स stapedial धमनी (एसए) की कटौती अंत का संकेत है। (डी) अंडाकार खिड़की (आउ, विंडोज ovalis या विंडोज vestibuli) स्टेपीज़ को हटाने के बाद दिखाई देता है। आरडब्ल्यू, गोल खिड़की (विंडोज रोटोंडा या विंडोज cochleae)। स्केल सलाखों, 0.5 मिमी। इस का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंचित्रा।

चित्रा 4
चित्रा 4. अनुदैर्ध्य के लिए एम्बेड दौरान श्रवण बुल्ला और कैप्सूल Orienting (parasagittal, एक - सी) और क्षैतिज (डी - ई) कान में की हड्डी की सेक्शनिंग। (ए - सी) गर्दन और कान में की हड्डी आड़ा के पटल पकवान embedding के नीचे करने के लिए समानांतर रखा जाता है। (ए) साइड देखें: सूक्ष्म सीटी की छवि बुल्ला (नीला pseudocolored) में सही कान में की हड्डी के embedding दिखाने के लिए। कान में की हड्डी और इन्कस हरी pseudocolored रहे हैं। धराशायी लाइन, वांछित काटने विमान। ठोस लाइन, पकवान embedding के नीचे। मी, कान में की हड्डी; तीर, पृष्ठीय शिखा। एम, औसत दर्जे का; एल, पार्श्व; डी, पृष्ठीय; वी, उदर। (बी) के शीर्ष दृश्य: सूक्ष्म सीटी छवि। ध्यान दें कि बुल्ला (styliform प्रक्रिया) के पूर्वकाल अंत हटा दिया गया था। मैं, इन्कस। (सी) शीर्ष दृश्य: माइक्रोग्राफ (एक साथ लियारंग फिल्टर)। एसी, पूर्वकाल (बेहतर) semicircular नहर; एस एफ, subarcuate खात; सपा, styliform प्रक्रिया। एक, पूर्वकाल; पी, पीछे; डी, पृष्ठीय; वी, उदर। (डी - एफ) कान में की हड्डी की प्रक्रिया ब्रेविस पकवान embedding के नीचे करने के लिए खड़ा रखा गया है। (डी) साइड देखें: सूक्ष्म सीटी छवि सही कान में की हड्डी के embedding दिखाने के लिए। धराशायी लाइन, वांछित काटने विमान। ठोस लाइन, पकवान embedding के नीचे। (ई) शीर्ष दृश्य: सूक्ष्म सीटी छवि। मिमी, malleal manubrium। (एफ) शीर्ष दृश्य: माइक्रोग्राफ (एक रंग फिल्टर के साथ लिया)। स्केल सलाखों, 1 मिमी। सूक्ष्म सीटी छवियों, 5 माइक्रोन की एक voxel संकल्प पर प्राप्त किया गया, जैसा कि पहले 7 में वर्णित है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
एफigure 5. प्रोटोकॉल। (ए) एच एंड ई धुंधला। अनुदैर्ध्य (parasagittal) P14 पर श्रवण बुल्ला (बिंदीदार रेखा) में आयल एम्बेडेड सही कान में की हड्डी (एम) की धारा। टीएम, कान की झिल्ली। (बी) Calcein हड्डी लेबलिंग। P21 पर श्रवण बुल्ला में जमे हुए, undecalcified बाएं कान में की हड्डी (एम) के अनुदैर्ध्य अनुभाग। Counterstain, DAPI। (सी) एच एंड ई धुंधला। श्रवण बुल्ला और कैप्सूल (5 सप्ताह पुराने माउस) में जमे हुए है, छोड़ दिया undecalcified malleal प्रक्रिया ब्रेविस (MPB) की क्षैतिज खंड। सह, कोक्लीअ। स्केल सलाखों, 1 मिमी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6 श्रवण ossicles की औसत दर्जे का दृश्य। (ए) पी के अधिकार श्रवण ossicles31 माउस। एक, पूर्वकाल; पी, पीछे; डी, पृष्ठीय; वी, उदर। स्केल बार, 1 मिमी। कान में की हड्डी सिर (कैपट mallei, Capitulum mallei); गर्दन (ग्रीवा mallei); पटल (आड़ा पटल); मिमी (manubrium mallei); काले तारांकित (कान में की हड्डी की मांसपेशियों प्रक्रिया); एमपीए (प्रक्रिया पूर्वकाल, प्रक्रिया gracilis); MPB (प्रक्रिया ब्रेविस); इन्कस शरीर (कोर्पस incudis); आईसीबी (Crus ब्रीव, लघु टांग, छोटी प्रक्रिया); आईसीएल (Crus longum, लंबी टांग, लंबी प्रक्रिया); आईपीएल (प्रक्रिया lenticularis, lenticular प्रक्रिया, Sylvian एपोफ़ाइसिस); स्टेपीज़ सिर (कैपट stapedis); सफेद तारे (स्टेपीज़ के पहलवान प्रक्रिया); एससीए (Crus anterius, पूर्वकाल टांग); एससीपी (Crus posterius, पीछे टांग); बेस (आधार stapedis, footplate); SOF (गवाक्ष रंध्र, intercrural रंध्र)। (बी) के एक 76 वर्षीय मानव महिला का अधिकार श्रवण ossicles (एनाटॉमी विभाग मेडिसिन, कीयो विश्वविद्यालय के स्कूल के सौजन्य से)। P31 माउस के ossicles (सही) कम ही बढ़ाई imaged हैं के रूप में है कि मानव ossicles के लिए इस्तेमाल किया। curvएड तीर संरचनात्मक अक्ष और manubrium (बिंदीदार रेखा) के बीच के कोण से संकेत मिलता है। स्केल बार, 2 मिमी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

यहाँ, हम एक विधि श्रवण बुल्ला और प्रसव के बाद चूहों में कैप्सूल को अलग-थलग करने के लिए उपयोगी प्रस्तुत करते हैं। P12 के लिए पहले, ऊतकों कमजोर कर रहे हैं और अलगाव के दौरान क्षतिग्रस्त हो सकता है। P12 के बाद, श्रवण बुल्ला और कैप्सूल आसानी से आसपास के ऊतकों से अलग किया जा सकता है। सेक्शनिंग से पहले सिर से बुल्ला विदारक कई फायदे हैं। सबसे पहले, प्रसव के बाद cavitation और श्रवण बुल्ला के विकास के सबसे सक्रिय रूप से पी 6 के बाद से पाए जाते हैं और P14 50 से पूरा कर रहे हैं। कान की झिल्ली और कर्णावत दीवार के बीच mesenchymal ऊतक cavitation प्रक्रिया के माध्यम से हवा की जगह है। मध्य कान गुहा में परिणामी हवा निर्धारण, विकैल्सीकरण और embedding के दौरान ऊतकों और तरल पदार्थ के बीच संपर्क बाधित कर सकते हैं। यह पूर्वकाल अंत (styliform प्रक्रिया) को काटने के बजाय unisolated बुल्ला में ऐसा करने की कोशिश कर रहा द्वारा पृथक श्रवण बुल्ला से हवा निकालने के लिए आसान है। दूसरा, कान में की हड्डी (और कान की झिल्ली) के उन्मुखीकरण खड़ी नहीं हैसिर में। इसलिए यह एक दिया अभिविन्यास में पृथक श्रवण बुल्ला और कैप्सूल embedding द्वारा खंड के लिए आसान वांछित विमानों में कान में की हड्डी है।

एक बार अलग, श्रवण बुल्ला और कैप्सूल कई विश्लेषण के लिए उपयोगी होते हैं। उदाहरण के लिए, उच्च संकल्प एक्स-रे सूक्ष्म सीटी इस तरह के कान में की हड्डी 14 में osteogenic केशिकाओं के रूप में हड्डी microstructure आकृति विज्ञान प्रकट कर सकते हैं। Stereofluorescence विदारक माइक्रोस्कोप मध्य या भीतरी कान 33 में फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त संवाददाता चूहों के मूल्यांकन में संरचनाओं कल्पना करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। इसके अलावा, विवो या पूर्व vivo प्रतिदीप्ति लेबलिंग तरीकों और पूरे माउंट immunofluorescence का पता लगाने में विभिन्न कार्य शुरू किया जा सकता है। हल्की चादर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी भी तीन आयामी विश्लेषण 51 के लिए उपयोगी है। हालांकि यहाँ वर्णित नहीं है, विविध शारीरिक संरचनाओं श्रवण बुल्ला और इस तरह परिधीय नसों, रक्त वाहिकाओं के रूप में कैप्सूल के साथ जुड़े हैं, औरमध्य कान में कान की झिल्ली भी इस प्रोटोकॉल का उपयोग का मूल्यांकन किया जा सकता है।

ध्यान दें कि आयल सेक्शनिंग और embedding से पहले हड्डी के ऊतकों के विकैल्सीकरण की आवश्यकता है इसलिए खनिज के विश्लेषण की अनुमति नहीं है। इसके विपरीत, कावामोटो फिल्म विधि 43 जमे हुए वर्गों तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया विकैल्सीकरण बिना किया जा सकता है और इन विवो अस्थि-लेबलिंग तकनीक या इस तरह के Alizarin धुंधला के रूप में विशेष धुंधला में उपयोग करते हुए खनिज के अध्ययन के लिए उपयुक्त है। क्रायो सेक्शनिंग की स्थिति माउस उम्र के आधार पर अनुसार अनुकूलित किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, cryostat कक्ष के अंदर एक कम ठंडे तापमान पुराने माउस नमूनों के लिए सिफारिश की है वर्गों को नुकसान को कम करने के लिए।

माउस में, कान में की हड्डी के प्रमुख अर्द्ध गोलाकार फलाव के लिए सही शब्द "गोलाकार एपोफ़ाइसिस" है। फिर भी, शब्द "प्रक्रिया ब्रेविस" व्यापक रूप से अधिक वीं के लिए गोलाकार एपोफ़ाइसिस इंगित करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैएक दो दशकों में, विशेष रूप से माउस विकासात्मक जीव 16,20,22-25 के बीच में। "प्रक्रिया ब्रेविस" मूल रूप से पार्श्व प्रक्रिया (प्रक्रिया lateralis), जो गोलाकार एपोफ़ाइसिस से अलग करने के लिए भेजा। मनुष्यों में, एक पार्श्व प्रक्रिया एक मामूली शंक्वाकार प्रक्षेपण जैसी manubrium (न चित्रा 6B, औसत दर्जे का ध्यान में रखते हुए देखा है) से देने कान की झिल्ली को कुर्की के सामान्य लाइन रूपों। चूहों में, पार्श्व प्रक्रिया भी umbo से 48 विपरीत अंत में manubrium के एक प्रक्षेपण है। कान की झिल्ली की पार्स flaccida कान में की हड्डी के पार्श्व प्रक्रिया से ऊपर है। गोलाकार एपोफ़ाइसिस मानव कान में की हड्डी में स्पष्ट नहीं है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tools/Equipment
Paper towel Daio Paper Corporation 703347 can be purchased from other vendors
Glass Jar Various can be purchased from other vendors
14 cm surgical scissors Fine Science Tools (F.S.T.) 91400-14 can be purchased from other vendors
Extra fine scissors-straight Fine Science Tools (F.S.T.) 14084-08 can be purchased from other vendors
Fine Forceps Angled 45° Fine Science Tools (F.S.T.) 11063-07 can be purchased from other vendors
Dissecting microscope Nikon SMZ800N for routine dissection
Dissecting microscope Nikon SMZ18 for movies 
Injection needle 27 G TERUMO NN-2719S
Syringe (1 mL) TERUMO SS-01T
Marking Pin Various
Tube rotator RT-50 TAITEC 0000165-000 can be purchased from other vendors
Cryostat Leica CM3050S http://www.leicabiosystems.com/histology-equipment/cryostats/details/product/leica-cm3050-s/
TC-65 Tungsten blade Leica 14021626379 for Kawamoto's firm method
Stainless containers Leica for Kawamoto's firm method
Cryofilm type IIC Leica for Kawamoto's firm method
Silane coated slide (New Silane II) Muto Pure Chemicals 511617 can be purchased from other vendors
Cover glass Matsunami can be purchased from other vendors
Tissue processor Sakura Finetek VIP-5 can be purchased from other vendors
Tissue Embedding Console System Sakura Finetek Tissue-Tek TEC 5  can be purchased from other vendors
Sliding microtome for paraffin Yamato Kohki Industrial REM-710 can be purchased from other vendors
Path Blade+pro for hard tissue Matsunami PB3503C for paraffin section
Micro-CT RIGAKU R_mCT2 http://www.rigaku.com/en
Fluorescence microscope KEYENCE BZ-9000
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Isoflurane Maruishi pharmaceutical Co. Ltd
NaCl wako 191-01665 for PBS
KCl wako 285-14 for PBS
Na2HPO4 12H2O wako 196-02835 for PBS
KH2PO4 wako 287-21 for PBS
Paraformaldehyde (PFA, EM Grade) TAAB P001
EDTA-2Na wako 15111-45
Trizma base Sigma T1503-1KG
Super Cryoembedding Medium Leica for Kawamoto's firm method
Dry Ice Various for Kawamoto's firm method
Hexane wako 080-03423 for Kawamoto's firm method
Super Cryomouting Medium type R2 Leica for Kawamoto's firm method
Paraffin Sakura Finetek 781001A0107
Histo-Clear NDS HS-200
Calcein DOJINDO 340-00433
Hematoxylin  wako 131-09665
Eosin wako 051-06515

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