Dissektion av Auditory Bulla i Postnatal Möss: Isolering av mellanörat Skelett och histologisk analys

Biology
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Sakamoto, A., Kuroda, Y., Kanzaki, S., Matsuo, K. Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis. J. Vis. Exp. (119), e55054, doi:10.3791/55054 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

I de flesta däggdjur, hörselbenen i mellanörat, inklusive hammaren, städet och stigbygeln, är de minsta benen. I möss, som kallas en benig struktur hörsel bulla inrymmer hörselbenen, medan hörsel kapseln omsluter innerörat, nämligen snäckan och båggångarna. Murina ossicles är en förutsättning för att höra och därmed av stort intresse för forskare inom området otolaryngologi, men deras ämnesomsättning, utveckling, och utveckling är mycket relevanta för andra områden. Förändrad benmetabolismen kan påverka hörselfunktion hos vuxna möss, och olika gen-brist möss visar förändringar i morfogenes av hörselbenen i livmodern. Även murina hörselbenen är liten, är deras manipulation möjlig om man förstår deras anatomiska orientering och 3D-struktur. Här beskriver vi hur att dissekera hörsel bulla och kapsel av postnatal möss och sedan isolera enskilda hörselbenen genom att ta bort en del av bulla. Vi diskuterar också hur man emsäng bulla och kapsel i olika riktningar för att generera paraffin eller frysta snitt lämpliga för framställning av längsgående, horisontella eller frontal delar av hammaren. Slutligen, vi räkna anatomiska skillnader mellan mus och mänskliga hörselhörselbenen. Dessa metoder skulle vara användbart vid analys av patologiska, utvecklingsmässiga och evolutionära aspekter av hörselhörselbenen och mellanörat hos möss.

Introduction

De tre auditiva hörselbenen i mellanörat, nämligen de malleus, incus och stapes, bildar en däggdjursspecifika auditiv kedja som överför ljud från trumhinnan till innerörat, eller cochlea 1,2. Hörselfunktion kan utvärderas i möss genom att mäta Auditory Brainstem svar (ABR) trösklar 3-6, och vibration av malleus bakom trumhinnan kan övervakas med användning av Laser Doppler Vibrometry (LDV) 7. Genom att kombinera ABR, LDV och Distortion produkt otoakustiska emissioner (DPOAE) mätningar, kan konduktiv hörselnedsättning kan särskiljas från sensorineural försämring 8.

Det behövs djurmodeller av örat villkor, med tanke på betydelsen av att höra och öra hälsa välbefinnande av patienter i alla åldrar. Till exempel, är inflammation i mellanörat en oerhört gemensam öroninfektion ses i humana spädbarn och barn, och allvarliga, akut otitis media och dess komplikationer kan inträffa om condining är inte behandlas med lämpliga antimikrobiella 9. Musmodeller av öroninflammation kan visa sig användbart för att förstå patogenesen och utveckla behandlingar 10,11.

Murina hörselbenen, som (med undantag för goniale del av hammaren) bildas av endokondral benbildning 12,13, är av stor betydelse för studiet av benmetabolism och morfogenes. För det första medger deras lilla storlek med hög upplösning analys av ben med en intakt benhinna med användning av röntgen eller fluorescensmikroskopi 14. För det andra, avvikande benmetabolism, såsom överdriven eller bristfällig benresorption, eller nedsatt interaktioner mellan benceller 15, kan analyseras som en potentiell bidragande orsak till hörselnedsättning 3,4,7. Tredje, onormal LITET BEN morfogenes rapporteras i flera gen-defekta möss, såsom djur som saknar Hoxa2 16-19, Msx1 20-22, Prrx1 23, gsc(GSC) 24,25, Bapx1 13, Tshz1 26, Dusp6 (Mkp3) 27 Noggin (Nog) 28, FGFR1 29 sköldkörtelhormonreceptorer (Thra, Thrb) 5, BCL2 30 och andra 1,31, eller i möss som överuttrycker Hoxa2 32. Slutligen, trots sin ringa storlek, strukturer i samband med hörselbenen såsom muskler 33 och leder 34,35 är tillgängliga.

Mus ossicles är mindre än mänskliga hörselbenen, men det är anmärkningsvärt att musen mellanörat är inte en miniatyr av dess mänskliga motsvarighet. Till exempel, i möss, den stapedial artär, som passerar genom ringen av stigbygeln, kvarstår under hela livet 36, medan i människor, försvinner den embryonala stapedial artären under dräktigheten. Dessutom morfologin hos mus malleus skiljer sig från den hos the humant ben (se figur 6). Hos möss, omsluter den auditiva (tympanic) bulla den luftfyllda mellanörats hålrum, medan hos människor, mastoideus luftceller sammansatta av trabekulärt ben i tinningbenet inrymmer hörselbenen i stället för en bulla 37. I båda arterna, hörsel kapseln (öron kapsel, benlabyrinten) omsluter snäckan och båggångarna i innerörat. Jämförande och evolutionsbiologi i mellanörat har i stor utsträckning över 38-40.

Protokollet nedan först beskriver hur man dissekera ut hörsel bulla och kapsel, som består i huvudsak av mellanörat och innerörat, respektive. Detta protokoll visar också hur man isolera hammaren, städet och stigbygeln från hörsel bulla. Slutligen visar det sig att orientera hörsel bulla och kapsel för inbäddning i förberedelse för vävnadssnittning av hörselbenen.

Protocol

Alla djurförsök utförs i denna studie är godkända av Keio University Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC - godkännandenummer: 09.221) och följ institutionella riktlinjer för djurförsöks vid Keio University för användning av djur i forskning. Prover från människa isolerades från ett kadaver doneras till institutionen för anatomi, Keio University School of Medicine, och användes i enlighet med institutionella regler.

1. Isolering av Audi Bulla och Capsule

  1. Euthanize möss i en burk innehållande en plattform ovanför pappershanddukar indränkt i isofluran eller sevofluran tills ventilation andnings upphör under mer än en min och sedan utföra cervikal dislokation. Var noga med att undvika direktkontakt av möss med de blötlagda pappershanddukar.
  2. Gör en liten tvärgående snitt på ryggsidan av halsen och dra huden isär mot huvud och svans med båda händerna för att exponera den underliggande hals muscle vävnad.
  3. Halshugga möss vid halsregionen med hjälp av 14 cm vassa kirurgiska saxar.
  4. Peel huden helt mot näsan. Klipp av alla hud tillsammans med nosen och framtänder.
  5. Sätt sax i munnen och skär tuggmuskler på båda sidor.
  6. Öppna käken noggrant och avlägsna tungan och underkäken tillsammans.
  7. Med vassa saxar, split skalle och skallbasen i två halvor längs mittsagittalplan (Figur 1A, B).
  8. Använd pincett, ta bort de cerebrala och cerebellära halvorna och hjärnstammen. Hörsel bulla och kapsel är placerade i sidled till lillhjärnan och hjärnstammen. Notera att den auditiva bulla är vidare i sidled till hörselkapsel (Figur 1C, D).
  9. Dissekera ut bulla och kapseln med det omgivande benet (Figur 1E).
  10. Överför provexemplaret till en skål innehållande fosfatbuffrad saltlösning (PBS), pH 7,4 vid RT.
  11. Under en kikare dissektionsmikroskop, använder pincett för att dra isär de omgivande ben och sax för att klippa lossade gränsen runt bulla och kapseln (figur 1F). De omgivande ben borttagna är basioccipital (ventrala gränsen), exoccipital (ventro-posterior gränsen), supraoccipital (bakre gränsen), interparietal, parietal (rygg gränsen), squamosal (Dorso-främre kant), alisphenoid (främre kant), och basisphenoid (antero-ventrala gräns) ben. Notera att styliform processen (Sp), vilket stödjer trum öppningen av örontrumpeten 41, skiljer sig från styloid processen för tinningbenet.

2. Isolering av Auditory benen: Malleus, Incus och stigbygeln

  1. Hammare
    1. Med hjälp av både en liten sax och pincett, ta bort den del av den yttre hörselgången lateralt till sulcus tympanicus så att trumhinnan är synlig (Figur 2A, B).
    2. Avlägsna en del av trumhinnan och trum ben nära malleal processus brevis (orbicular apophysis, se diskussion), både på den ventrala (streckad) och bakre (#) väggar (figur 2C). Hammaren och tensor tympani muskeln ska nu utsättas (figur 2D, E).
    3. Lyft hammaren (Figur 2F) och skär tensor tympani muskeln med den fasade kanten av en 27 G nål (figur 2G). Notera att malleal manubrium fäster stadigt vid trumhinnan, såsom framgår av andra däggdjur.
    4. Lösgöra trumhinnan försiktigt från manubrium, som är bräcklig. Ta bort trum ben att avslöja de tre hörselhörselbenen.
    5. Rubba malleus från städet vid ossikulära leden (fig 2H).
    6. Isolera hammaren genom sprickbildning i främre processen vid goniale.
  2. Incus och stigbygeln
    1. isolera than incus genom att skära av den bakre ligament av städet vid kort crus (figur 3A).
    2. Isolera stigbygeln genom att skära av stapedial artär nära stigbygeln med den avfasade kanten av en 27 G nål (figur 3B, C). Om det behövs, skär senan av stapedial muskeln vid muskel processen av stigbygeln med nålen.
    3. Sätt i en synål (eller en markering stift) i obturatom foramen i stigbygeln och lyft upp stigbygeln. Efter avlägsnande av stigbygeln, bör den ovala fönsteröppningen vara tydligt (Figur 3D).

3. inbäddning av Audi Bulla och Capsule

  1. Förberedelse för inbäddning i paraffinblock
    1. Isolera bulla och kapseln som beskrivs i avsnitt 1.
    2. Skär den främre änden av bulla (den styliform processen) av med sax, sänk den bulla och kapsel i 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS vid 4 °C, och tillåta fixativ för att komma in i bulla. Om luft fångas i bulla, ta bort den med en nål och spruta. Lämnar bulla och kapsel på fixativ vid 4 ° CO / N på ett rör rotator.
      Varning: PFA är giftig och bör hanteras varsamt.
    3. Tvätta en gång med PBS.
    4. Avkalka bulla och kapsel för en vecka vid 4 ° C i 10% etylendiamintetraättiksyra-dinatriumsalt-dihydrat (EDTA-2Na), 100 mM Tris-bas, pH 7,0, i en 2 ml rör. Ändra bufferten varannan dag.
    5. Tvätta en gång med PBS. Prover kan lagras i 70% etanol i vatten vid 4 ° C. Valfritt, överföring till 70% etanol genom en graderad alkoholserie (30%, 50%, 70% i vatten).
    6. På en vävnadsprocessor, torka prover i en graderad serie av etanollösningar (70%, 2 x 95%, 3x 100%, var 1 timme), tydliga i xylen (4x, var en timme vid 40 ° C), och infiltrera prover med smält paraffin 42. Eventuellt ersätta xylen med kommersiell vävnads clearing lösning (t.ex. Histo-Clear).
    7. Lasta prover från processorn, och ta bort dem från sina kassetter.
    8. På en vävnad bädda konsol, plats exemplar i formar fyllda med smält paraffin. Fortsätt att bädda (§ 4).
  2. Förberedelse för ingjutning i frysta block (Kawamoto film metod) 43
    1. Isolera bulla och kapseln som beskrivs i avsnitt 1.
    2. Skär den främre änden av bulla (den styliform processen) av med sax, sänk den bulla och kapsel i fixativ (2% eller 1% PFA i stället för 4% i PBS för att bevara antigenicitet) vid 4 ° C. Om luft fångas i bulla, ta bort den med hjälp av en nål och spruta. Lämnar bulla och kapsel på fixativ vid 4 ° CO / N på ett rör rotator.
    3. Tvätta bulla och kapseln snabbt i PBS och omedelbart doppa i vätske Cryo-inbäddning föreningen vid 4 ° C.
    4. Viktigt: Ta bort luftbubblor om någon i mittenoch ytterörat genom aspiration genom en nål, och genom att tillsätta inbäddning föreningen med pincett. Fortsätt att bädda (§ 4).

4. Prov Orientering and Embedding

OBS: Hela bulla och kapseln måste ordnas i en viss orientering under inbäddning skära önskade sektioner. De förfaranden som beskrivs nedan används till avsnittet hammaren i olika riktningar.

  1. Längsgående (parasagittal) sektionering av malleus
    1. Sätta den laterala sidan av bulla eller yttre hörselgången ner i varmt paraffin (eller Cryo-inbäddning förening). Justera orienteringen så att halsen och tvärgående lamell av malleus är parallella med den horisontella botten av inbäddning skålen (Figur 4A - C). Observera att trumhinnan lutas i en vinkel på ungefär 30 ° mot vertikalplanet i musen huvudet (Figur 4A, Figur 59 i Kampen
  2. Horisontell sektionering av malleus
    1. Placera rygg krönet horisontellt i varmt paraffin (eller Cryo-inbäddning förening). Justera orienteringen av bulla och kapseln, så att halsen och tvärgående lamell av malleus är vinkelräta mot botten av inbäddning skålen (Figur 4D - F).
  3. Frontal sektionering (tvärsektioner) av manubrium och trumhinnan 5
    1. Placera malleal manubrium i varmt paraffin (eller Cryo-inbäddning förening) så att den är vinkelrät mot botten av inbäddning skålen.
  4. Kyla ner blocket till temperaturer lämpliga för att härda paraffinvax på en vävnad bädda konsol (alternativt använda Cryo-inbäddning föreningen i ett torris / hexan bad).
  5. Processvävnadsblock och skurna sektioner med hjälp av rutinprocedurer. Exempelvis sektioner fläck paraffin med hematoxylin och eosin (H & #38; E), safranin O (för brosk) eller för tartratresistent surt fosfatas (TRAP) aktivitet (för osteoklaster) 3, eller genom immunhistokemi. Undecalcified kryosnitt är lämpliga för ben märkning använder fluorokromer 14, alizarin röd färgning för kalcium, och immunofluorescens 42.

Representative Results

Detta protokoll presenterar en metod för att isolera hörselbenen från mus hörsel bulla. Först bulla och kapsel dissekeras ut som ett enda stycke från skallen (Figur 1). Dissekerade bulla används sedan för att framställa hammaren (Figur 2) och städet och stigbygeln (Figur 3). Landmärken i hörsel bulla och kapsel är styliform processen vid den främre änden av bulla, rygg vapen, främre halvcirkelformad kanal, och subarcuate fossa (figur 1F). Microcomputed tomografi (CT) avbildning avslöjar ossicles i hörsel bulla samt optimala riktlinjer för längsgående och horisontell sektionering av dessa ossicles (Figur 4).

För längd paraffin sektionering av hammaren var den bulla och kapseln avkalkas i EDTA vid 4 ° C under en vecka, inbäddad i en paRaffin blocket vid den orientering som visas i Figur 4 A - C, snittades vid 4 ^ m, och färgades sedan med användning av H & E. Malleus fäst vid trumhinnan i hörsel bulla avslöjade pågående endokondral benbildning vid P14 (figur 5A). Att visualisera ny benbildning, kalcein (30 mikrogram / g kroppsvikt) peritonealt injiceras i en P20 mus och bulla och kapsel isolerades 24 timmar senare vid P21. Provet utan urkalkning var inbäddad fryst och sedan cryosectioned vid 6 pm med hjälp av en klisterfilm baserad på metoden av Kawamoto 43. Efter nukleär färgning med DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol), fram sektionen observerades under ett fluorescensmikroskop. Calcein signaler (grön) avslöjade ny benbildning i malleus (m), bulla och kapsel (figur 5B). För horisontell sektionering av hammaren var hörsel bulla isolerad från en 5 veckor gammal mus inbäddade fryst utan urkalkning (förorientering se figur 4D - F), cryosectioned vid 6 pm med hjälp av Kawamoto metoden och färgas med H & E. Horisontell sektionering av malleal processus brevis (MPB) visar också snäckan (figur 5C).

En medial vy av de rätta auditiva hörselbenen isolerade från en P31 mus visar typiska egenskaper hos mus malleus, nämligen den "glidande-mås-vingliknande" (eller persisk svärd liknande 45) manubrium, en framstående processus brevis (orbicular apophysis , se diskussion), och tvärgående lamina (Figur 6). Notera att den främre process (processus anterior) till frakturer i dissektion förfarande runt goniale och separerades från trumringen (ectotympanic). Denna representativa provet uppvisar en intakt incudomalleolar leden mellan malleus och städet, under det att incudostapedial fogen ur led. Tendinöst infogningar in i malleal ochstapedial muskel processer kan detekteras (figur 6A, asterisker).

Figur 6B jämför mus och mänskliga auditiva hörselbenen med samma förstoring. Artskillnader, andra än storlek, innefattar följande. Den malleal manubrium är vingliknande hos möss men klubbliknande hos människor. Vinkeln mellan den anatomiska axeln (eller rotationsaxeln, linjen genom den främre processen med malleus och den korta processen för städet) och manubrium är mycket mindre i möss och de två är nästan parallella, i motsats till nästan vinkelrät hos människor 6,46-48. I mänskliga hörselbenen, vibrometric studier visar att incudo-malleolar leden är mobil snarare än funktionellt fast 49. Musen malleus uppvisar ett brett, tunt, och platt tvärgående lamellen inte framgår i människor 47. Hos möss, smälter processus anterior till membran ben, nämligen goniale och tympanic ringen, medan i människor den processus anterior reduceras till en liten spikler av ben 41. Stigbygeln hos möss och människor skiljer sig också: i möss, är den främre crus krökt och den bakre crus är mer rakt medan i människor, är den främre crus rakare än den bakre crus. Det är värt att notera att hammaren huvudet i förhållande till kroppsstorleken kraftigt förstorad i arter som guldmullvadar, visar betydande variation i allometriska relationer "de minsta" ben 48.

Figur 1
Figur 1. Dissektion av Audi Bulla och Capsule. (A) skalle av en P31 mus är uppdelad i höger och vänster halvor. A, anterior; P, posterior; L, vänster; R, höger. (B) mediala ytan av den högra halvan av den bisected, flådda huvud. Cx, cerebral cortex; Cb, cerebellum; Bs, brainstem. D, rygg; V, ventrala. (C) Borttagning av hjärnan med pincett. (D) Medial vy av den auditiva kapseln i rätt skallen. Rygg krön (pilspetsar) ligger mellan mitten hjärn fossa (mcf) och bakre hjärn fossa (PCF) och separerar dorso-främre och ventro-posterior ytor av hörsel kapseln. Skala bar, 2 mm. (E) Högre förstoring av hörsel bulla och kapsel (medial vy). Co, cochlea; VII, ansiktsnerven; VIII, vestibulocochlear nerv; AC, främre (superior) halvcirkelformad kanal; Sf, subarcuate fossa, som inrymmer lillhjärnan paraflocculus. Skala bar, en mm. (F) Micrograph av isolerade hörsel bulla och kapsel (medial vy). Sp, styliform processen. Skala bar, en mm. (A - E), P31 mus. (F), P33 mus. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2. Dissekering av Malleus. (A) ventrolaterala av en rätt hörsel bulla och kapsel. Sulcus tympanicus (ST, streckad pil) är vidhäftningsstället trumhinnans. Benet lateralt till ST är en del av ytterörat, och benet mediala till ST bildar golvet i mellanörats hålrum. A, anterior; P, posterior; D, rygg; V, ventrala. (B) Vy efter avlägsnande av den yttre hörselgången för att avslöja den trumhinnan (TM) innefattande pars flaccida (Pf) och pars Tensa (Pt). (C) Borttagning av delar av trum ben (streckade linjer och #) nära malleal processus brevis (MPB). m, malleus; mM, malleal manubrium. Pil, luftbubbla i mellanörat kaviteten sedd genom trumhinnan. (D) Exponerad hammaren. Malleus huvudet indikeras. Prickadlinjen indikerar ledytan av städet. (E) Tendon av tensor tympani muskeln (TT) fäst till malleus. (F) Den tensor tympani dras när hammaren lyfts. *, Muskel process. (G) Tensor tympani skärs med hjälp av en nål. (H) Tre auditiva hörselbenen efter avlägsnande av trumhinnan. Den incudo-malleolar förbandet ur led. m, malleus; Jag, städet; s, stigbygel; Gå, goniale (sammansmält med hammaren och trumring, TR). Alla skal barer, 0,5 mm. (A, H), P33 mus. (B - G), P31 mus. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Dissekering av Incus och stigbygeln. (A) Incus ochstigbygel efter avlägsnande av hammaren. Den stapedial artär (SA) passerar genom stigbygeln (s). Streckade linjen anger den artikulära ytan av städet. Notera att den korta crus (ICB, crus breve) av städet (i) är fäst med den bakre ligament (ej visat). Asterisk, muskel process av stigbygeln. (B) stigbygeln efter avlägsnande av städet. Nålspets används för att skära den stapedial artär (SA). Pil, riktning blodflödet. Streckade linjen anger artikulära ytan av stigbygeln. (C) Den stapedial artär avlägsnas från stigbygeln. X anger den skurna änden av den stapedial artär (SA). (D) Den ovala fönstret (Aj, ovala fönstret eller Fenestra vestibuli) är synlig efter avlägsnande av stigbygeln. Rw, runda fönster (fenestra rotunda eller Fenestra hörselsnäckor). Skalstrecken, 0,5 mm. Klicka här för att se en större version av dennafigur.

figur 4
Figur 4. Orientering hörsel Bulla och Capsule under Bädda för longitudinella (parasagittal, A - C) och horisontell (D - E) sektionering av Malleus. (A - C) Halsen och tvärgående lamell av malleus är placerade parallellt till botten av inbäddning skålen. (A) Sidovy: mikro-CT bilden för att visa inbäddning av rätten malleus i bulla (pseudocolored blå). Hammaren och städet är pseudocolored grönt. Streckad linje, den önskade skärplanet. Heldragen linje, botten av inbäddning skålen. m, malleus; pilspetsar, rygg Crest. M, medial; L, lateral; D, rygg; V, ventrala. (B) Uppifrån: Micro-CT bilden. Observera att den främre änden av den bulla (styliform process) avlägsnades. Jag, städet. (C) Ovanifrån: mikrofotografi (tagna med enfärgfilter). AC, främre (superior) halvcirkelformad kanal; Sf, subarcuate fossa; Sp, styliform processen. A, anterior; P, posterior; D, rygg; V, ventrala. (D - F) Den processus brevis av malleus placeras vinkelrätt mot botten av inbäddning skålen. (D) Sidovy: Micro-CT bilden för att visa inbäddning av rätt hammaren. Streckad linje, den önskade skärplanet. Heldragen linje, botten av inbäddning skålen. (E) Uppifrån: Micro-CT bilden. mM, malleal manubrium. (F) Ovanifrån: mikrofotografi (tagen med ett färgfilter). Skalstrecken, 1 mm. Mikro-CT-bilder erhölls vid en voxel upplösning på 5 | j, m, som tidigare beskrivits 7. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 5
Figure 5. Histologi. (A) H & E-färgning. Längsgående (parasagittal) delen av paraffininbäddade rätt hammaren (m) i hörsel bulla (streckad linje) vid P14. TM, trumhinnan. (B) Calcein ben märkning. Längdsnitt av den frusna, undecalcified vänster hammaren (m) i hörsel bulla på P21. Motfärg, DAPI. (C) H & E-färgning. Horisontalsektion av frysta, undecalcified vänster malleal processus brevis (MPB) i hörsel bulla och kapsel (5 veckor gammal mus). Co, snäckan. Skalstrecken, 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 6
Figur 6. Medial Vy över Auditory benen. (A) höger hörsel ossicles av P31 mus. A, anterior; P, posterior; D, rygg; V, ventrala. Skala bar, en mm. malleus huvud (Caput mallei, capitulum mallei); hals (Collum mallei); lamina (tvär lamina); mM (manubrium mallei); svart asterisk (muskel process av hammaren); mPa (Processus anterior, Processus gracilis); MPB (processus brevis); incus kropp (Corpus incudis); ICB (Crus breve, kort crus, kort process); ICL (Crus longum, lång crus, lång process); IPL (Processus lenticularis, linsformad process, Sylvian apophysis); stapes huvud (Caput stapedis); vit asterisk (muskel process av stigbygeln); SCA (Crus anterius, främre CRU); SCP (Crus posterius, bakre CRU); bas (Basis stapedis, fotplatta); Sof (obturator foramen, intercrural foramen). (B) Höger hörsel ossicles av en 76-årig människa kvinna (tillstånd av Institutionen för anatomi, Keio University School of Medicine). Ossicles av P31 mus (nere till höger) avbildas på samma förstoring som används för mänskliga hörselbenen. curved pilar indikerar vinkeln mellan den anatomiska axeln och manubrium (streckade linjer). Skala bar, 2 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Här presenterar vi en metod som är användbar för att isolera hörsel bulla och kapsel i postnatal möss. Före P12, vävnader är ömtåliga och kan skadas under isolering. Efter P12, kan den auditiva bulla och kapseln lätt isoleras från omgivande vävnader. Dissekera bulla från huvudet innan snitt har flera fördelar. Först, postnatal kavitation och tillväxt av hörsel bulla uppträder mest aktivt från P6 och framåt och är komplett med P14 50. Den mesenkymala vävnaden mellan trumhinnan och cochlea vägg ersätts med luft genom kavitation processen. Den resulterande luft i mellanörat kaviteten kan hindra kontakt mellan vävnader och vätskor under fixeringen, avkalkning och inbäddning. Det är lättare att ta bort luft från den isolerade hörsel bulla genom att skära av den främre änden (styliform process) snarare än att försöka göra det i oisolerade bulla. För det andra, inte är vertikal orientering av malleus (med trumhinnan)i huvudet. Det är därför lättare att avsnittet hammaren i önskade plan genom att bädda in den isolerade hörsel bulla och kapsel i en viss riktning.

När isolerade, hörsel bulla och kapslar är användbara för många analyser. Till exempel, kan hög upplösning röntgenmikro CT avslöjar ben mikrostruktur morfologi såsom osteogena kapillärer i malleus 14. Den stereofluorescence dissekera mikroskop är ett kraftfullt verktyg för att visualisera strukturer utvärdera reporter möss som uttrycker fluorescerande proteiner i mitten eller innerörat 33. Dessutom, olika in vivo eller ex vivo fluorescensmärkningsmetoder och hela montera immunofluorescens detektion skulle kunna genomföras. Ljus ark fluorescensmikroskopi är också användbart för tredimensionell analys 51. Även om det inte beskrivs här, olika anatomiska strukturer i samband med hörsel bulla och kapsel såsom perifera nerver, blodkärl, ochtrumhinnan i mellanörat kan också utvärderas med hjälp av detta protokoll.

Observera att paraffinsektionering kräver avkalkning av benvävnad före inbäddning och därför inte tillåter analys av mineralisering. Däremot kan den Kawamoto filmmetod 43 användes för att framställa frusna snitt utföras utan urkalkning och är lämplig för mineralisering studier med användning av in vivo ben-märkningstekniker eller speciella färgning såsom Alizarin färgning. Cryo-sektione villkor bör optimeras enligt baserad på mus ålder. Till exempel, är en mindre sval temperatur inuti kryostaten kammaren rekommenderas till äldre mus prover för att minimera skador på sektioner.

I mus, är den korrekta termen för den framstående halvsfäriska utsprång av hammaren "orbicular apophysis". Ändå har termen "processus brevis" i stor utsträckning använts för att ange orbicular apophysis för mer then två decennier, i synnerhet bland mus utvecklings biologer 16,20,22-25. "Processus brevis" ursprungligen till den laterala processen (processus later), som skiljer sig från den orbicular apophysis. Hos människa, en lateral process som liknar en liten konisk projektion bildar den allmänna linjen i anslutning till trumhinnan, som sträcker sig från manubrium (inte sett i figur 6B, medial vy). I möss, är den laterala process också en projektion av manubrium vid den motsatta änden till Umbo 48. Pars flaccida av trumhinnan är över den laterala processen med malleus. Orbicular apophysis framgår inte i den mänskliga hammaren.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tools/Equipment
Paper towel Daio Paper Corporation 703347 can be purchased from other vendors
Glass Jar Various can be purchased from other vendors
14 cm surgical scissors Fine Science Tools (F.S.T.) 91400-14 can be purchased from other vendors
Extra fine scissors-straight Fine Science Tools (F.S.T.) 14084-08 can be purchased from other vendors
Fine Forceps Angled 45° Fine Science Tools (F.S.T.) 11063-07 can be purchased from other vendors
Dissecting microscope Nikon SMZ800N for routine dissection
Dissecting microscope Nikon SMZ18 for movies 
Injection needle 27 G TERUMO NN-2719S
Syringe (1 mL) TERUMO SS-01T
Marking Pin Various
Tube rotator RT-50 TAITEC 0000165-000 can be purchased from other vendors
Cryostat Leica CM3050S http://www.leicabiosystems.com/histology-equipment/cryostats/details/product/leica-cm3050-s/
TC-65 Tungsten blade Leica 14021626379 for Kawamoto's firm method
Stainless containers Leica for Kawamoto's firm method
Cryofilm type IIC Leica for Kawamoto's firm method
Silane coated slide (New Silane II) Muto Pure Chemicals 511617 can be purchased from other vendors
Cover glass Matsunami can be purchased from other vendors
Tissue processor Sakura Finetek VIP-5 can be purchased from other vendors
Tissue Embedding Console System Sakura Finetek Tissue-Tek TEC 5  can be purchased from other vendors
Sliding microtome for paraffin Yamato Kohki Industrial REM-710 can be purchased from other vendors
Path Blade+pro for hard tissue Matsunami PB3503C for paraffin section
Micro-CT RIGAKU R_mCT2 http://www.rigaku.com/en
Fluorescence microscope KEYENCE BZ-9000
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Isoflurane Maruishi pharmaceutical Co. Ltd
NaCl wako 191-01665 for PBS
KCl wako 285-14 for PBS
Na2HPO4 12H2O wako 196-02835 for PBS
KH2PO4 wako 287-21 for PBS
Paraformaldehyde (PFA, EM Grade) TAAB P001
EDTA-2Na wako 15111-45
Trizma base Sigma T1503-1KG
Super Cryoembedding Medium Leica for Kawamoto's firm method
Dry Ice Various for Kawamoto's firm method
Hexane wako 080-03423 for Kawamoto's firm method
Super Cryomouting Medium type R2 Leica for Kawamoto's firm method
Paraffin Sakura Finetek 781001A0107
Histo-Clear NDS HS-200
Calcein DOJINDO 340-00433
Hematoxylin  wako 131-09665
Eosin wako 051-06515

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mallo, M. Formation of the middle ear: recent progress on the developmental and molecular mechanisms. Dev Biol. 231, 410-419 (2001).
  2. Manley, G. A. An evolutionary perspective on middle ears. Hear Res. 263, 3-8 (2010).
  3. Kanzaki, S., Ito, M., Takada, Y., Ogawa, K., Matsuo, K. Resorption of auditory ossicles and hearing loss in mice lacking osteoprotegerin. Bone. 39, 414-419 (2006).
  4. Kanzaki, S., Takada, Y., Ogawa, K., Matsuo, K. Bisphosphonate therapy ameliorates hearing loss in mice lacking osteoprotegerin. J Bone Miner Res. 24, 43-49 (2009).
  5. Cordas, E. A., et al. Thyroid hormone receptors control developmental maturation of the middle ear and the size of the ossicular bones. Endocrinology. 153, 1548-1560 (2012).
  6. Dong, W., Varavva, P., Olson, E. S. Sound transmission along the ossicular chain in common wild-type laboratory mice. Hear Res. 301, 27-34 (2013).
  7. Kanzaki, S., et al. Impaired vibration of auditory ossicles in osteopetrotic mice. Am J Pathol. 178, 1270-1278 (2011).
  8. Qin, Z., Wood, M., Rosowski, J. J. Measurement of conductive hearing loss in mice. Hear Res. (2009).
  9. Klein, J. O. Is acute otitis media a treatable disease? N Engl J Med. 364, 168-169 (2011).
  10. Rosch, J. W., et al. A live-attenuated pneumococcal vaccine elicits CD4+ T-cell dependent class switching and provides serotype independent protection against acute otitis media. EMBO Mol Med. 6, 141-154 (2014).
  11. Li, X., et al. Otitis media in sperm-associated antigen 6 (Spag6)-deficient mice. PLoS One. 9, e112879 (2014).
  12. Rodríguez Vázquez, J. F., Mérida Velasco, J. R., Jiménez Collado, J. A study of the os goniale in man. Acta Anat (Basel). 142, 188-192 (1991).
  13. Tucker, A. S., Watson, R. P., Lettice, L. A., Yamada, G., Hill, R. E. Bapx1 regulates patterning in the middle ear: altered regulatory role in the transition from the proximal jaw during vertebrate evolution. Development. 131, 1235-1245 (2004).
  14. Matsuo, K., et al. Osteogenic capillaries orchestrate growth plate-independent ossification of the malleus. Development. 142, 3912-3920 (2015).
  15. Matsuo, K. Cross-talk among bone cells. Curr Opin Nephrol Hypertens. 18, 292-297 (2009).
  16. Rijli, F. M., et al. A homeotic transformation is generated in the rostral branchial region of the head by disruption of Hoxa-2, which acts as a selector gene. Cell. 75, 1333-1349 (1993).
  17. Mallo, M., Gridley, T. Development of the mammalian ear: coordinate regulation of formation of the tympanic ring and the external acoustic meatus. Development. 122, 173-179 (1996).
  18. O'Gorman, S. Second branchial arch lineages of the middle ear of wild-type and Hoxa2 mutant mice. Dev Dyn. 234, 124-131 (2005).
  19. Santagati, F., Minoux, M., Ren, S. Y., Rijli, F. M. Temporal requirement of Hoxa2 in cranial neural crest skeletal morphogenesis. Development. 132, 4927-4936 (2005).
  20. Satokata, I., Maas, R. Msx1 deficient mice exhibit cleft palate and abnormalities of craniofacial and tooth development. Nat Genet. 6, 348-356 (1994).
  21. Zhang, Z., et al. Malleal processus brevis is dispensable for normal hearing in mice. Dev Dyn. 227, 69-77 (2003).
  22. Houzelstein, D., Cohen, A., Buckingham, M. E., Robert, B. Insertional mutation of the mouse Msx1 homeobox gene by an nlacZ reporter gene. Mech Dev. 65, 123-133 (1997).
  23. Martin, J. F., Bradley, A., Olson, E. N. The paired-like homeo box gene MHox is required for early events of skeletogenesis in multiple lineages. Genes Dev. 9, 1237-1249 (1995).
  24. Yamada, G., et al. Targeted mutation of the murine goosecoid gene results in craniofacial defects and neonatal death. Development. 121, 3005-3012 (1995).
  25. Rivera-Pérez, J. A., Mallo, M., Gendron-Maguire, M., Gridley, T., Behringer, R. R. Goosecoid is not an essential component of the mouse gastrula organizer but is required for craniofacial and rib development. Development. 121, 3005-3012 (1995).
  26. Coré, N., et al. Tshz1 is required for axial skeleton, soft palate and middle ear development in mice. Dev Biol. 308, 407-420 (2007).
  27. Li, C., Scott, D. A., Hatch, E., Tian, X., Mansour, S. L. Dusp6 (Mkp3) is a negative feedback regulator of FGF-stimulated ERK signaling during mouse development. Development. 134, 167-176 (2007).
  28. Hwang, C. H., Wu, D. K. Noggin heterozygous mice: an animal model for congenital conductive hearing loss in humans. Hum Mol Genet. 17, 844-853 (2008).
  29. Calvert, J. A., et al. A missense mutation in Fgfr1 causes ear and skull defects in hush puppy mice. Mamm Genome. 22, 290-305 (2011).
  30. Carpinelli, M. R., et al. Anti-apoptotic gene Bcl2 is required for stapes development and hearing. Cell death dis. 3, e362 (2012).
  31. Chapman, S. C. Can you hear me now? Understanding vertebrate middle ear development. Front Biosci (Landmark Ed). 16, 1675-1692 (2011).
  32. Kitazawa, T., et al. Distinct effects of Hoxa2 overexpression in cranial neural crest populations reveal that the mammalian hyomandibular-ceratohyal boundary maps within the styloid process. Dev Biol. 402, 162-174 (2015).
  33. Wang, L., et al. Scleraxis is required for differentiation of the stapedius and tensor tympani tendons of the middle ear. J Assoc Res Otolaryngol. 12, 407-421 (2011).
  34. Amin, S., Tucker, A. S. Joint formation in the middle ear: lessons from the mouse and guinea pig. Dev Dyn. 235, 1326-1333 (2006).
  35. Amin, S., Matalova, E., Simpson, C., Yoshida, H., Tucker, A. S. Incudomalleal joint formation: the roles of apoptosis, migration and downregulation. BMC Dev Biol. 7, 134 (2007).
  36. Hiruma, T., Nakajima, Y., Nakamura, H. Development of pharyngeal arch arteries in early mouse embryo. Journal of anatomy. 201, 15-29 (2002).
  37. Treuting, P. M., Dintzis, S. M. Ch. 22, Special senses: ear. Comparative Anatomy and Histology: A Mouse and Human Atlas. Treuting, P. M., Dintzis, S. M. 22, Academic Press. 419-432 (2012).
  38. Mallo, M., Schrewe, H., Martin, J. F., Olson, E. N., Ohnemus, S. Assembling a functional tympanic membrane: signals from the external acoustic meatus coordinate development of the malleal manubrium. Development. 127, 4127-4136 (2000).
  39. Anthwal, N., Joshi, L., Tucker, A. S. Evolution of the mammalian middle ear and jaw: adaptations and novel structures. Journal of anatomy. 222, 147-160 (2013).
  40. Takechi, M., Kuratani, S. History of studies on mammalian middle ear evolution: a comparative morphological and developmental biology perspective. J Exp Zool B Mol Dev Evol. 314, 417-433 (2010).
  41. Henson, O. W. Jr Ch. 3, Comparative Anatomy of the Middle Ear. Handbook of Sensory Physiology. Keidel, W. D., Neff, W. D. Vol. 1, Auditory System. Anatomy, Physiology (Ear), Springer. Berlin Heidelberg. 39-110 (1974).
  42. Handbook of Histology Methods for Bone and Cartilage. Humana Press. (2003).
  43. Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch Histol Cytol. 66, 123-143 (2003).
  44. Kampen, P. N. V. Gegenbaurs Morphologiesches Jahrbuch. 34, W. Engelmann. 321-722 (1905).
  45. Lee, J. H., Park, K., Kang, T. C., Choung, Y. H. Three-dimensional anatomy of the temporal bone in normal mice. Anat Histol Embryol. 38, 311-315 (2009).
  46. Fleischer, G. Evolutionary principles of the mammalian middle ear. Adv Anat Embryol Cell Biol. 55, 3-70 (1978).
  47. Lavender, D., Taraskin, S. N., Mason, M. J. Mass distribution and rotational inertia of "microtype" and "freely mobile" middle ear ossicles in rodents. Hear Res. 282, 97-107 (2011).
  48. Mason, M. J. Of mice, moles and guinea pigs: functional morphology of the middle ear in living mammals. Hear Res. 301, 4-18 (2013).
  49. Willi, U. B., Ferrazzini, M. A., Huber, A. M. The incudo-malleolar joint and sound transmission losses. Hear Res. 174, 32-44 (2002).
  50. Richter, C. A., et al. Defects in middle ear cavitation cause conductive hearing loss in the Tcof1 mutant mouse. Hum Mol Genet. 19, 1551-1560 (2010).
  51. Buytaert, J. A., Johnson, S. B., Dierick, M., Salih, W. H., Santi, P. A. MicroCT versus sTSLIM 3D imaging of the mouse cochlea. J Histochem Cytochem. 61, 382-395 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics