بروتين طريقة التحضير لتحديد إنتاجية عالية من البروتينات التفاعل مع العامل المساعد النووية عن طريق LC-MS / MS تحليل

* These authors contributed equally
Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

لقد وضعنا طريقة لتنقية البروتينات التفاعل coregulatory باستخدام نظام LC-MS / MS.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Tsuchiya, M., Karim, M. R., Matsumoto, T., Ogawa, H., Taniguchi, H. A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis. J. Vis. Exp. (119), e55077, doi:10.3791/55077 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

تفاعلات البروتين البروتين تلعب دورا هاما في العديد من الوظائف البيولوجية. على هذا النحو، قد تورطت هذه التفاعلات في نقل الإشارة. نقل البروتين عبر أغشية الخلايا. استقلاب الخلية. والعديد من العمليات النووية، بما في ذلك تكرار الحمض النووي، وإصلاح الحمض النووي من التلف والتوحد، والنسخ 4. تحديد البروتينات المشاركة في هذه التفاعلات لذا فمن الأهمية بمكان تعزيز فهمنا لهذه العمليات الخلوية.

مناعي (IP) هو أسلوب التحقق من صحة استخدامها لتحليل التفاعلات البروتين البروتين. من أجل تسهيل التعرف على البروتينات immunoprecipitated المشترك، وغالبا ما يستخدم قياس الطيف الكتلي 9. من خلال استهداف عضوا معروفا في مجمع البروتين مع الأجسام المضادة، فمن الممكن لعزل بروتين معقد وتحديد وقت لاحق مكوناته غير معروفة عن طريق تحليل الطيف الكتلي. ARIP4 (الاندروجين-التفاعل مستقبلات البروتين 4)، وcoregulator النسخي، يتفاعل مع البروتينات المستقبلة النووية من أجل تنشيط أو قمع المروجين هدفه بطريقة تعتمد على السياق 9 و 10. من أجل فهم أفضل الآليات التنظيمية النسخي التي تحكم هذه العوامل النووية، وصفنا أسلوبا شاملا لتنقية وتحديد ARIP4 البروتينات التفاعل باستخدام نظام LC-MS / MS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ترنسفكأيشن

  1. البذور خلايا HEK293 في لوحات ثقافة 100 ملم (2 × 10 6 خلية / طبق). ثقافة الخلايا في المتوسط ​​Dulbecco لتعديل النسر تستكمل مع 10٪ مصل العجل الجنين، و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، و 100 وحدة / مل البنسلين. احتضان الخلايا في حاضنة ترطيب عند 5٪ CO 2 و 37 درجة مئوية.
  2. في اليوم التالي، transfect الخلايا مع 10 ميكروغرام من الموسومة FLAG ARIP4 البلازميد باستخدام 40 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن وفقا لتوجيهات المصنع 11.

2. البروتين استخراج

  1. ما يقرب من 36 ساعة بعد ترنسفكأيشن، وغسل الخلايا مع الثلج الباردة برنامج تلفزيوني وحصاد الخلايا باستخدام مكشطة. نقل الخلايا إلى mltube 1.5 وأجهزة الطرد المركزي أنه في 8000 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية. نضح في وطاف و resuspend بيليه خلية في 5X حجم بيليه من 0.4 عازلة M بوكل (عالية عازلة الملح: 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8.0) و 0.4 M بوكلو 5 ملي MgCl 10٪ الجلسرين، 0.1٪ NP-40، و 10 ملي ب-mercaptethanol، 1X مثبط البروتياز كوكتيل). تدوير الخليط لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  2. أنبوب الطرد المركزي في 17700 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  3. نقل طاف (استخراج خلية كاملة) لأنبوب جديد 2 مل وإضافة 3X حجم الأولي من 0 عازلة M بوكل (التخفيف المخزن المؤقت: 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8.0)، 5 ملي MgCl 10٪ الجلسرين، 0.1٪ NP-40، و 10 ملي β-المركابتويثانول، 1X مثبط البروتياز كوكتيل).
  4. أداء الطرد المركزي أخرى (17700 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية)، ونقل طاف (كله استخراج الخلايا) إلى أنبوب 2 مل الجديد.

3. مناعي

  1. أثناء الطرد المركزي (2.4)، وغسل 50 ميكرولتر من الخرز مكافحة FLAG مع برنامج تلفزيوني، 0.1 M الجلايسين-هيدروكلوريد، ثم 1 M تريس، هيدروكلوريد، تليها غسل مرتين مع 0.1M العازلة بوكل (منخفض عازلة الملح: 20 ملي Tris- حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8.0)، 0.1 م بوكل، 5 ملي MgCl2، 10٪ الجلسرين، 0.1٪ NP-40، 10 مM ب المركابتويثانول، 1X مثبط البروتياز كوكتيل). يتم تنفيذ الطرد المركزي لعملية غسل هذا في 2000 x ج لمدة 1 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  2. مزيج 50 ميكرولتر من الخرز FLAG مع مقتطفات خلية كاملة وتناوب بلطف الخليط لمدة 4 ساعات في 2-4 درجة مئوية (وينبغي أيضا أن تبقى 1٪ من استخراج خلية كاملة من الخطوة 2.4 في -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل كمدخل).
  3. نقل العينة إلى عمود الدوران الصغير (انخفاض الجاذبية). الحفاظ على التدفق من خلال في أنبوب 1.5 مل، وتجميد باستخدام النيتروجين السائل، وتخزينه في -80 درجة مئوية (فحص مستويات البروتين من كل من المدخلات والتدفق من خلال استخدام تحليل لطخة غربية).
  4. إضافة 1 مل من 0.1 العازلة M بوكل (منخفض عازلة الملح) لتغسل حبات FLAG (انخفاض الجاذبية).
  5. كرر الخطوة 3.4 على الأقل أربع مرات أكثر (أي ما مجموعه خمسة يغسل).

4. شطف

  1. وضع عمود في أنبوب 1.5 مل وأجهزة الطرد المركزي أنه في 2000 x ج لمدة 1 دقيقة. والخرز يجف.
  2. سقف أسفل العمود.
  3. إضافة 50 ميكرولتر (مساو لحجم حبات FLAG) من 0.1 M جليكاين، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 2.5).
  4. يهز بلطف الخليط لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. وضع عمود في أنبوب 1.5 مل جديد وأجهزة الطرد المركزي أنه في 2000 x ج لمدة 1 دقيقة.
  6. هو تحييد الحل مزال مع 10 ميكرولتر من 1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8.0)؛ تخلط جيدا من قبل pipetting أو باستخدام آلة دوامة.

5. الألكلة وTrypsinization

  1. إضافة 50 ميكرولتر من 100 ملي NH 4 HCO 3 و 10 ميكرولتر من CH 3 CN، و 2 ميكرولتر من dithiothreitol إلى الخليط (112 ميكرولتر اجمالى حجم).
  2. احتضان العينة لمدة 30 دقيقة عند 56 درجة مئوية.
  3. وضع العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
  4. إضافة 10 ميكرولتر من 333 ملي iodoacetamide إلى العينة واحتضان في الظلام لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  5. إضافة 10 ميكرولتر من التربسين (33 نانوغرام / ميكرولتر) إلى الخليط، واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.

معشوقة = "jove_title"> 6. LC-MS / MS تحليل

  1. وبعد trypsinization بين عشية وضحاها، نقل المنتج النهائي إلى MS-LC مرفق / MS أو لطرف ثالث مختبر قياس الطيف الكتلي لتحليل 12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

حددنا إشارة قوية ARIP4، حوالي 160 كيلو دالتون، فضلا عن تلك التي تحكم عينة وهمية وعدة بروتينات أخرى غير معروفة (الشكل 1). التحليل الذي LC-MS / MS كل من الببتيدات المعقدة ARIP4 والعوامل المساعدة الببتيد المحتملة داخل جزء من الخرز FLAG (الجدول 1). P62 (Sequestosome1)، اكتشف وجود العامل المساعد ARIP4 يعرف 11 في التحليل (الجدول 1)، مما يؤكد كفاءة هذا النظام 11. نحن أيضا تحديد العديد من البروتينات التي تم الإبلاغ عنها سابقا والتي تتفاعل مع ARIP4. وبهذه الطريقة، تم الكشف عن Sumo2 10 و 13 DryK عن طريق تحليل LC-MS / MS. وقد تم تحديد الببتيدات ARIP4 أيضا باستخدام التحليل LC-MS / MS، مما يوحي بأن الملكية الفكرية ذات جودة عالية. وعموما، فإن تقنية LC-MS / MS هو أداة قوية التي يمكن استخدامها لتحديد مجهول صلة الأحداث النوويإد للتفاعلات البروتين البروتين. سوف يكون كامل النتائج الطيفي الشامل متوفرة عند الطلب.

شكل 1
الشكل 1: تنقية ARIP4 المجمعات. أعرب تلطيخ الفضة من FLAG ARIP4-حاتمة الموسومة (ARIP4-F) في الخلايا HEK293 ومناعي مع الأجسام المضادة FLAG محددة. تم حل تنقية البروتينات باستخدام هلام الكهربائي وتصور مع وصمة عار الفضة. كعنصر تحكم، تم إجراء تنقية وهمية على HEK293 الخلايا التي لم تعبر عن البروتينات الخارجية. وترد معايير الوزن الجزيئي على اليسار. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1
الجدول 1: Identificatioن من رواية ARIP4 البروتينات ملزم. تم فصل حبات FLAG بد أن المجمعات البروتين المنقى عن طريق الهضم على أساس التربسين. وقد تم تحديد هذه البروتينات في وقت لاحق باستخدام التحليل LC-MS / MS. تم تحليل البيانات LC-MS / MS باستخدام قاعدة بيانات السويسري بروت والبرمجيات التميمة. يتم عرض عدد من الببتيدات وهوية هذه البروتينات. وقد تم اختيار البروتينات الوحيدة مع عشرات التميمة معنويا (P <0.05).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ترنسفكأيشن كفاءة ضروري للحصول على نتيجة ناجحة مع هذا البروتوكول. وفقا لذلك، فإننا نوصي باستخدام تحليل لطخة غربية لتحديد مستويات البروتين FLAG الموسومة immunoprecipitated. هذه الخطوة تمكن المستخدمين من التحقق من أن البروتين اهتمامهم هى overexpressed بشكل صحيح، وعلاوة على ذلك، أن الملكية الفكرية أجريت بنجاح. وينبغي أيضا فحص مستويات البروتين الموسومة FLAG مسبق لتحليل الطيف الكتلي.

وينبغي استخدام عينة همية كعنصر تحكم السلبية لتجنب الحصول على نتيجة إيجابية كاذبة والتمييز على خلفية من التفاعلات الحقيقية. وعلاوة على ذلك، عند دراسة بروتينات بشرية، يجب أن يتم تنفيذ التجارب في بيئة نظيفة نسبيا (على سبيل المثال، غرفة نظيفة) لتجنب التلوث. على الرغم من أن استخراج العازلة البروتين مع تركيز عال الملح (0.3-0.4 م) يمكن أن تستخدم في بعض الأحيان لاستخراج البروتينات النووية، وجود مخزن مؤقت IP مع تركيز 0،1-،15 M الملح هو أكثر منعشرة الموصى بها. وهذا يسمح الإجراء IP للمضي قدما دون تعطيل البروتين البروتين التفاعلات. لمزيد من تقليل إشارة الخلفية، حبات مغناطيسية يمكن استخدامها لعملية التنقية. ومن المهم أيضا لتحسين ظروف خلية تحلل من أجل الحد من النتائج الإيجابية الكاذبة.

(الهوية على سبيل المثال، في جل الهضم المستندة إلى واحد من البروتين) أهمية الطريقة الموصوفة في هذه الدراسة فيما يتعلق بتقنيات أخرى 10، 11 هو أنه يتيح للمستخدمين القيام التحليل LC-MS / MS لتحديد الإنتاجية العالية من تفاعلات البروتين بين العوامل المساعدة النووية والشركاء ملزمة لهم. تنظيم الجينات النسخي يعتمد بشكل كبير على التعاون من الحمض النووي ملزمة البروتينات تسلسل معين. وفقا لذلك، عوامل النسخ وعادة ما يتعامل مع عدد كبير من العوامل المشتركة لتغيير الجينات المستهدفة. عشر erefore، لفهم أفضل للأحداث الخلوية التي تنظم هذه الآليات النسخي، وتحديد شركاء النسخي التي تعزز نشاط البروتين الهدف هو الهدف الأسمى. لدينا وسيلة تتيح للمستخدمين التعرف بسرعة العوامل المساعدة النووية المفترضة عبر عامل النسخ اهتمامهم ويعزز فهمنا لآليات تنظيمية النسخي.

ويمكن أيضا أن تستخدم FLAG الببتيد بدلا من 0.1 M الجلايسين حمض الهيدروكلوريك الحل (درجة الحموضة 2.5) أثناء عملية شطف. ومع ذلك، إذا يعمل هذا التعديل، يجب مراقبة درجة الحموضة في المخزن المؤقت المستخدم لتمييع الببتيدات FLAG. وينبغي أيضا أن تستخدم 3X الببتيدات FLAG إلى أزل البروتينات من الخرز FLAG. وفقا لذلك، وإيجاد حل مع درجة الحموضة العالية نسبيا وينبغي أن تستخدم لتخفيف الببتيدات FLAG في ظل هذه الظروف التي تم تعديلها. ومن الأهمية بمكان أيضا لتجنب تجميد المتكررة والذوبان من العينات من أجل الحفاظ على تفاعلات البروتين البروتين المناسبة.

ر "> في بعض الأحيان، وتعظيم الاستفادة من عملية trypsinization قد تكون هناك حاجة أيضا لتعزيز دقة نتائج فحص البروتين التفاعل. على الرغم من أن طريقة LC-MS / MS هو الأداة التي يمكن استخدامها لتحديد التفاعلات بين النووية البروتينات، واحد من قصوره هو أنه لا يقدم التفاصيل الدقيقة بشأن تجميع بروتين معقد. لتعزيز الاستقرار معقدة والكيميائية يشابك العلاجات يمكن استخدام 14. كطريقة بديلة، الشعرية الكهربائي-MS / MS مفيد أيضا 15 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 11668019
Protease Inhibitor Cocktail (EDTA free) (100x) nacalai tesque 03969-21
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel Sigma-Aldrich A2220
Micro Bio-Spin Columns BIO-RAD 732-6204

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Comput.Biol. 6, (6), e1000807 (2010).
  2. Westermarck, J., Ivaska, J., Corthals, G. L. Identification of protein interactions involved in cellular signaling. Mol.Cell.Proteomics. 12, (7), 1752-1763 (2013).
  3. MacPherson, R. E., Ramos, S. V., Vandenboom, R., Roy, B. D., Peters, S. J. Skeletal muscle PLIN proteins, ATGL and CGI-58, interactions at rest and following stimulated contraction. Am.J.Physiol.Regul.Integr.Comp.Physiol. 304, (8), 644-650 (2013).
  4. Qin, K., Dong, C., Wu, G., Lambert, N. A. Inactive-state preassembly of G(q)-coupled receptors and G(q) heterotrimers. Nat.Chem.Biol. 7, (10), 740-747 (2011).
  5. Ogawa, H., Ishiguro, K., Gaubatz, S., Livingston, D. M., Nakatani, Y. A complex with chromatin modifiers that occupies E2F- and Myc-responsive genes in G0 cells. Science. 296, (5570), 1132-1136 (2002).
  6. Shi, Y., et al. Coordinated histone modifications mediated by a CtBP co-repressor complex. Nature. 422, (6933), 735-738 (2003).
  7. Huh, K. W., DeMasi, J., Ogawa, H., Nakatani, Y., Howley, P. M., Munger, K. Association of the human papillomavirus type 16 E7 oncoprotein with the 600-kDa retinoblastoma protein-associated factor, p600. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 102, (32), 11492-11497 (2005).
  8. Huang, B. X., Kim, H. Y. Effective identification of Akt interacting proteins by two-step chemical crosslinking, co-immunoprecipitation and mass spectrometry. PLoS One. 8, (4), 61430 (2013).
  9. ten Have, S., Boulon, S., Ahmad, Y., Lamond, A. I. Mass spectrometry-based immuno-precipitation proteomics - the user's guide. Proteomics. 11, (6), 1153-1159 (2011).
  10. Ogawa, H., Komatsu, T., Hiraoka, Y., Morohashi, K. Transcriptional Suppression by Transient Recruitment of ARIP4 to Sumoylated nuclear receptor Ad4BP/SF-1. Mol.Biol.Cell. 20, (19), 4235-4245 (2009).
  11. Tsuchiya, M., et al. Selective autophagic receptor p62 regulates the abundance of transcriptional coregulator ARIP4 during nutrient starvation. Sci.Rep. 5, 14498 (2015).
  12. Watanabe, T., Matsuo, I., Maruyama, J., Kitamoto, K., Ito, Y. Identification and characterization of an intracellular lectin, calnexin, from Aspergillus oryzae using N-glycan-conjugated beads. Biosci.Biotechnol.Biochem. 71, (11), 2688-2696 (2007).
  13. Sitz, J. H., Tigges, M., Baumgartel, K., Khaspekov, L. G., Lutz, B. Dyrk1A potentiates steroid hormone-induced transcription via the chromatin remodeling factor Arip4. Mol.Cell.Biol. 24, (13), 5821-5834 (2004).
  14. Mohammed, H., Taylor, C., Brown, G. D., Papachristou, E. K., Carroll, J. S., D'Santos, C. S. Rapid immunoprecipitation mass spectrometry of endogenous proteins (RIME) for analysis of chromatin complexes. Nat.Protoc. 11, (2), 316-326 (2016).
  15. Fonslow, B. R., Yates, J. R. Capillary electrophoresis applied to proteomic analysis. J.Sep.Sci. 32, (8), 1175-1188 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics