एक प्रोटीन प्रोटीन की उच्च throughput पहचान नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस विश्लेषण का प्रयोग एक परमाणु cofactor साथ बातचीत के लिए तैयारी विधि

* These authors contributed equally
Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

हम नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस प्रणाली का उपयोग कर coregulatory बातचीत प्रोटीन की शुद्धि के लिए एक विधि की स्थापना की है।

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Tsuchiya, M., Karim, M. R., Matsumoto, T., Ogawa, H., Taniguchi, H. A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis. J. Vis. Exp. (119), e55077, doi:10.3791/55077 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत में कई जैविक कार्यों में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। जैसे, इन मुलाकातों संकेत पारगमन में फंसाया गया है; कोशिका झिल्ली भर में प्रोटीन परिवहन; सेल चयापचय; और डीएनए प्रतिकृति, डीएनए की क्षति की मरम्मत, पुनर्संयोजन, और प्रतिलेखन 1, 2, 3, 4 सहित कई परमाणु प्रक्रियाओं। इन मुलाकातों में शामिल प्रोटीन की पहचान करना इसलिए इन सेलुलर प्रक्रियाओं के बारे में हमारी समझ को आगे बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण है।

Immunoprecipitation (आईपी) प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल एक मान्य तकनीक है। आदेश सह immunoprecipitated प्रोटीन की पहचान की सुविधा के लिए, मास स्पेक्ट्रोमेट्री अक्सर उपयोग किया जाता है 5, 6, 7, 8,9। एक एंटीबॉडी के साथ एक प्रोटीन परिसर के एक ज्ञात सदस्य को लक्षित करके, यह प्रोटीन जटिल अलग-थलग करने और बाद में मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के माध्यम से अपनी अज्ञात घटकों की पहचान करने के लिए संभव है। ARIP4 (एण्ड्रोजन रिसेप्टर बातचीत प्रोटीन 4), एक ट्रांसक्रिप्शनल coregulator, आदेश में सक्रिय या एक संदर्भ पर निर्भर ढंग से 9, 10 में अपने लक्ष्य के प्रमोटरों को दबाने के लिए परमाणु रिसेप्टर प्रोटीन के साथ सूचना का आदान प्रदान। बेहतर इन परमाणु कारकों गवर्निंग विनियामक तंत्र को समझने के लिए, हम शुद्ध और नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस प्रणाली का उपयोग करके ARIP4 बातचीत प्रोटीन की पहचान करने के लिए एक व्यापक विधि का वर्णन है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. अभिकर्मक

  1. 100 मिमी संस्कृति प्लेट (2 एक्स 10 6 कोशिकाओं / पकवान) में HEK293 कोशिकाओं बीज। संस्कृति Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम में कोशिकाओं 10% भ्रूण बछड़ा सीरम, 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 100 इकाइयों / एमएल पेनिसिलिन के साथ पूरक। 5% सीओ 2 और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को सेते हैं।
  2. अगले दिन, झंडा टैग ARIP4 प्लाज्मिड के 10 माइक्रोग्राम निर्माता के निर्देशों के अनुसार 11 अभिकर्मक अभिकर्मक के 40 μl का उपयोग कर के साथ कोशिकाओं transfect।

2. प्रोटीन निष्कर्षण

  1. लगभग 36 घंटे बाद अभिकर्मक, ठंडा पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोने और एक खुरचनी का उपयोग कोशिकाओं फसल। एक 1.5 mltube में कोशिकाओं स्थानांतरण और 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 8000 XG पर यह अपकेंद्रित्र। महाप्राण सतह पर तैरनेवाला और 5x में सेल गोली resuspend 0.4 एम KCl बफर की गोली की मात्रा (उच्च नमक बफर: 20 मिमी Tris एचसीएल (8.0 पीएच), 0.4 एम KCl, 5 मिमी MgCl 2, 10% ग्लिसरॉल, 0.1% एनपी 40, 10 मिमी बी mercaptethanol, 1x protease अवरोध कॉकटेल)। 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए मिश्रण घुमाएँ।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 17,700 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र।
  3. एक नया 2 एमएल ट्यूब सतह पर तैरनेवाला (पूरे सेल निकालने) स्थानांतरण और 0 एम KCl बफर के प्रारंभिक मात्रा 3x जोड़ने (कमजोर पड़ने बफर: 20 मिमी Tris एचसीएल (पीएच 8.0), 5 मिमी MgCl 2, 10% ग्लिसरॉल, 0.1% एनपी 40, 10 मिमी β-Mercaptoethanol, 1x protease अवरोध कॉकटेल)।
  4. एक और centrifugation (4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 17,700 XG) प्रदर्शन और एक नया 2 मिलीलीटर ट्यूब सतह पर तैरनेवाला (पूरे सेल निकालने) हस्तांतरण।

3. Immunoprecipitation

  1. 20 मिमी Tris-: centrifugation (2.4) के दौरान, पीबीएस के साथ विरोधी झंडा मोतियों की 50 μl, 0.1 एम ग्लाइसिन-हाइड्रोक्लोराइड, और फिर 1 एम Tris-हाइड्रोक्लोराइड, कपड़े धोने के द्वारा पीछा दो बार 0.1M KCl बफर के साथ (कम नमक बफर धोने एचसीएल (8.0 पीएच), 0.1 एम KCl, 5 मिमी MgCl2, 10% ग्लिसरॉल, 0.1% एनपी 40, 10 मीटरएम बी Mercaptoethanol, 1x protease अवरोध कॉकटेल)। इस कपड़े धोने की प्रक्रिया के लिए centrifugation 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 2,000 XG पर किया जाता है।
  2. पूरे सेल के अर्क के साथ ध्वज मोतियों की 50 μl मिक्स और धीरे 2-4 डिग्री सेल्सियस (2.4 कदम से पूरे सेल निकालने के 1% भी भविष्य में उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाना चाहिए पर 4 घंटे के लिए मिश्रण को बारी बारी से एक निवेश के रूप में)।
  3. एक माइक्रो स्पिन स्तंभ (गुरुत्वाकर्षण ड्रॉप) के लिए नमूना हस्तांतरण। एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में प्रवाह के माध्यम से रखें तरल नाइट्रोजन का उपयोग कर इसे फ्रीज, और -80 डिग्री सेल्सियस पर यह दुकान (दोनों इनपुट और प्रवाह के माध्यम से पश्चिमी धब्बा विश्लेषण का उपयोग करने के प्रोटीन के स्तर की जांच)।
  4. 0.1 एम KCl बफर (कम नमक बफर) के 1 मिलीलीटर झंडा मोती (गुरुत्वाकर्षण ड्रॉप) धोने के लिए जोड़ें।
  5. 3.4 कम से कम चार गुना अधिक (पांच washes के एक कुल के लिए) चरण को दोहराएँ।

4. क्षालन

  1. स्तंभ एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में रखें और 1 मिनट के लिए 2,000 XG पर यह अपकेंद्रित्र; मोती सूख जाएगा।
  2. के नीचे टोपीस्तंभ।
  3. 50 μl 0.1 एम ग्लाइसिन एचसीएल (पीएच 2.5) के (फ्लैग मोतियों की मात्रा के बराबर) जोड़ें।
  4. धीरे कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए मिश्रण हिला।
  5. स्तंभ एक नया 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में रखें और 1 मिनट के लिए 2,000 XG पर यह अपकेंद्रित्र।
  6. eluted समाधान 1 एम Tris एचसीएल (पीएच 8.0) के 10 μl के साथ निष्प्रभावी है; pipetting द्वारा या एक भंवर मशीन का उपयोग करके अच्छी तरह मिला लें।

5. Alkylation और trypsinization

  1. 100 मिमी एनएच 4 HCO 3, सीएच 3 सीएन के 10 μl, और मिश्रण को dithiothreitol के 2 μl (112 μl की कुल मात्रा) के 50 μl जोड़ें।
  2. 56 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए नमूना सेते हैं।
  3. कमरे के तापमान पर नमूना 10 मिनट के लिए रखें।
  4. iodoacetamide नमूना करने के लिए 333 मिमी के 10 μl जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए अंधेरे में यह सेते हैं।
  5. मिश्रण करने के लिए trypsin के 10 μl (33 एनजी / μl) जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर यह सेते हैं।

  1. रात भर trypsinization के बाद, एक नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस की सुविधा के लिए या विश्लेषण 12 के लिए एक तीसरी पार्टी मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रयोगशाला के लिए अंतिम उत्पाद परिवहन।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

हम एक मजबूत संकेत ARIP4, लगभग 160 केडीए, के रूप में अच्छी तरह से एक नकली नमूना नियंत्रण और कई अन्य अज्ञात प्रोटीन के रूप में उन (चित्रा 1) की पहचान की। नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस विश्लेषण दोनों ARIP4 जटिल पेप्टाइड्स और झंडा मोती (तालिका 1) के अंश के भीतर संभावित पेप्टाइड सहकारकों की पहचान की। p62 (Sequestosome1), एक ज्ञात ARIP4 सहायक कारक के 11 विश्लेषण (1 टेबल) है, जो इस प्रणाली 11 की प्रभावकारिता की पुष्टि में पहचान की थी। हम भी कई अन्य पूर्व-सूचना प्रोटीन है कि ARIP4 के साथ बातचीत की पहचान की। इस तरह, Sumo2 10 और ड्रिक 13 नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस विश्लेषण के माध्यम से पता चला रहे थे। ARIP4 पेप्टाइड्स भी नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस विश्लेषण है, जो पता चलता है कि आईपी उच्च गुणवत्ता की थी का उपयोग कर पहचान की गई। कुल मिलाकर, नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस तकनीक के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है कि अज्ञात परमाणु घटनाओं लिंक की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैप्रोटीन, प्रोटीन बातचीत करने के लिए एड। पूर्ण बड़े पैमाने पर spectrometric परिणाम अनुरोध पर उपलब्ध हो जाएगा।

आकृति 1
चित्रा 1: ARIP4 परिसरों की शुद्धि। झंडा मिलान टैग ARIP4 के रजत धुंधला (ARIP4-एफ) एक झंडा विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ HEK293 कोशिकाओं और immunoprecipitation में व्यक्त किया। शुद्ध प्रोटीन जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग संकल्प लिया और एक रजत दाग के साथ कल्पना थे। एक नियंत्रण के रूप में, एक नकली शुद्धि HEK293 कोशिकाओं है कि exogenous प्रोटीन व्यक्त नहीं किया था पर प्रदर्शन किया गया था। आणविक भार मानकों छोड़ दिया पर दिखाए जाते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका एक
तालिका 1: Identificatioउपन्यास ARIP4 बंधनकारी प्रोटीन के एन। शुद्ध प्रोटीन परिसरों के लिए बाध्य झंडा मोती trypsin आधारित पाचन द्वारा अलग किए गए थे। ये प्रोटीन बाद में नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस विश्लेषण का उपयोग पहचान की गई। नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस डेटा स्विस Prot डेटाबेस और शुभंकर सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था। पेप्टाइड्स की संख्या और इन प्रोटीनों की पहचान दिखाए जाते हैं। महत्वपूर्ण शुभंकर स्कोर (पी <0.05) के साथ ही प्रोटीन चयन किया गया था।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

कुशल अभिकर्मक इस प्रोटोकॉल के साथ एक सफल परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। तदनुसार, हम पश्चिमी धब्बा विश्लेषण का उपयोग immunoprecipitated झंडा टैग प्रोटीन का स्तर निर्धारित करने के लिए सलाह देते हैं। यह कदम उन सत्यापित करने के लिए है कि ब्याज की उनके प्रोटीन ठीक से overexpressed है और, इसके अलावा सक्षम बनाता है, कि आईपी सफलतापूर्वक प्रदर्शन किया गया था। झंडा टैग प्रोटीन का स्तर भी मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण करने से पहले जाँच की जानी चाहिए।

एक नकली नमूना एक झूठी सकारात्मक परिणाम प्राप्त करने से बचने के लिए और सच बातचीत से पृष्ठभूमि भेदभाव करने के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए। इसके अलावा, जब मानव प्रोटीन का अध्ययन, प्रयोगों (जैसे, एक साफ कमरे) एक अपेक्षाकृत स्वच्छ वातावरण में संक्रमण से बचने के लिए किया जाना चाहिए। हालांकि एक उच्च नमक एकाग्रता (0.3-0.4 एम) के साथ एक प्रोटीन निष्कर्षण बफर कभी कभी परमाणु प्रोटीन निकालने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, एक 0.1-0.15 एम नमक एकाग्रता के साथ एक आईपी बफर के सबसे अधिक हैदस की सिफारिश की। यह आईपी प्रक्रिया प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत में खलल न डालें बिना आगे बढ़ने की अनुमति देता है। आगे पृष्ठभूमि संकेत को कम करने के लिए, चुंबकीय मोती शुद्धिकरण की प्रक्रिया के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह भी आदेश झूठी सकारात्मक परिणामों को कम करने में सेल शर्तों का अनुकूलन करने के लिए महत्वपूर्ण है।

विधि अन्य तकनीकों के संबंध में इस अध्ययन में वर्णित के महत्व (जैसे, जेल में पाचन आधारित एकल प्रोटीन की पहचान) 5, 10, 11 है कि यह उन उच्च throughput पहचान के लिए नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस विश्लेषण करने के लिए अनुमति देता है परमाणु सहकारकों और उनके बंधन भागीदारों के बीच प्रोटीन बातचीत की। Transcriptional जीन विनियमन अनुक्रम विशिष्ट डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन के सहयोग पर निर्भर है। तदनुसार, प्रतिलेखन कारक अक्सर लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति को बदलने के लिए सह कारकों की एक बड़ी संख्या के साथ बातचीत। गु erefore, बेहतर सेलुलर घटनाओं इन transcriptional तंत्र गवर्निंग, ट्रांसक्रिप्शनल भागीदार है कि को बढ़ावा देने के लक्ष्य प्रोटीन गतिविधि सर्वोपरि है की पहचान करने को समझते हैं। हमारे विधि उपयोगकर्ताओं को जल्दी से अपने हित के प्रतिलेखन कारक के माध्यम से ख्यात परमाणु सहकारकों की पहचान करने की अनुमति देता है और आगे विनियामक तंत्र के बारे में हमारी समझ को बढ़ाता है।

झंडा पेप्टाइड भी एक 0.1 एम ग्लाइसिन एचसीएल समाधान (2.5 पीएच) क्षालन प्रक्रिया के दौरान की बजाय प्रयोग किया जा सकता है। हालांकि, अगर यह संशोधन कार्यरत है, झंडा पेप्टाइड्स कमजोर करने के लिए इस्तेमाल किया बफर का पीएच निगरानी की जानी चाहिए। 3x झंडा पेप्टाइड्स भी झंडा मोतियों से प्रोटीन elute करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। तदनुसार, एक अपेक्षाकृत उच्च पीएच के साथ एक समाधान के लिए इन शर्तों के तहत संशोधित झंडा पेप्टाइड्स कमजोर करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। यह भी आदेश में उचित प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत बनाए रखने के लिए दोहराया ठंड और नमूने का विगलन से बचने के लिए महत्वपूर्ण है।

टी "> इस अवसर पर trypsinization प्रक्रिया का अनुकूलन भी प्रोटीन बातचीत स्क्रीनिंग के परिणामों की सटीकता को बढ़ाने के लिए आवश्यक हो सकता है। हालांकि नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस विधि एक उपकरण है कि परमाणु के बीच बातचीत की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है प्रोटीन, अपनी सीमाओं में से एक यह है कि यह प्रोटीन परिसर के विधानसभा के बारे में सटीक जानकारी प्रदान नहीं करता है, रासायनिक उपचार crosslinking 14 इस्तेमाल किया जा सकता है। जटिल स्थिरता को बढ़ाने के लिए। एक वैकल्पिक पद्धति के रूप में, केशिका वैद्युतकणसंचलन-एमएस / एमएस भी उपयोगी है 15

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 11668019
Protease Inhibitor Cocktail (EDTA free) (100x) nacalai tesque 03969-21
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel Sigma-Aldrich A2220
Micro Bio-Spin Columns BIO-RAD 732-6204

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Comput.Biol. 6, (6), e1000807 (2010).
  2. Westermarck, J., Ivaska, J., Corthals, G. L. Identification of protein interactions involved in cellular signaling. Mol.Cell.Proteomics. 12, (7), 1752-1763 (2013).
  3. MacPherson, R. E., Ramos, S. V., Vandenboom, R., Roy, B. D., Peters, S. J. Skeletal muscle PLIN proteins, ATGL and CGI-58, interactions at rest and following stimulated contraction. Am.J.Physiol.Regul.Integr.Comp.Physiol. 304, (8), 644-650 (2013).
  4. Qin, K., Dong, C., Wu, G., Lambert, N. A. Inactive-state preassembly of G(q)-coupled receptors and G(q) heterotrimers. Nat.Chem.Biol. 7, (10), 740-747 (2011).
  5. Ogawa, H., Ishiguro, K., Gaubatz, S., Livingston, D. M., Nakatani, Y. A complex with chromatin modifiers that occupies E2F- and Myc-responsive genes in G0 cells. Science. 296, (5570), 1132-1136 (2002).
  6. Shi, Y., et al. Coordinated histone modifications mediated by a CtBP co-repressor complex. Nature. 422, (6933), 735-738 (2003).
  7. Huh, K. W., DeMasi, J., Ogawa, H., Nakatani, Y., Howley, P. M., Munger, K. Association of the human papillomavirus type 16 E7 oncoprotein with the 600-kDa retinoblastoma protein-associated factor, p600. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 102, (32), 11492-11497 (2005).
  8. Huang, B. X., Kim, H. Y. Effective identification of Akt interacting proteins by two-step chemical crosslinking, co-immunoprecipitation and mass spectrometry. PLoS One. 8, (4), 61430 (2013).
  9. ten Have, S., Boulon, S., Ahmad, Y., Lamond, A. I. Mass spectrometry-based immuno-precipitation proteomics - the user's guide. Proteomics. 11, (6), 1153-1159 (2011).
  10. Ogawa, H., Komatsu, T., Hiraoka, Y., Morohashi, K. Transcriptional Suppression by Transient Recruitment of ARIP4 to Sumoylated nuclear receptor Ad4BP/SF-1. Mol.Biol.Cell. 20, (19), 4235-4245 (2009).
  11. Tsuchiya, M., et al. Selective autophagic receptor p62 regulates the abundance of transcriptional coregulator ARIP4 during nutrient starvation. Sci.Rep. 5, 14498 (2015).
  12. Watanabe, T., Matsuo, I., Maruyama, J., Kitamoto, K., Ito, Y. Identification and characterization of an intracellular lectin, calnexin, from Aspergillus oryzae using N-glycan-conjugated beads. Biosci.Biotechnol.Biochem. 71, (11), 2688-2696 (2007).
  13. Sitz, J. H., Tigges, M., Baumgartel, K., Khaspekov, L. G., Lutz, B. Dyrk1A potentiates steroid hormone-induced transcription via the chromatin remodeling factor Arip4. Mol.Cell.Biol. 24, (13), 5821-5834 (2004).
  14. Mohammed, H., Taylor, C., Brown, G. D., Papachristou, E. K., Carroll, J. S., D'Santos, C. S. Rapid immunoprecipitation mass spectrometry of endogenous proteins (RIME) for analysis of chromatin complexes. Nat.Protoc. 11, (2), 316-326 (2016).
  15. Fonslow, B. R., Yates, J. R. Capillary electrophoresis applied to proteomic analysis. J.Sep.Sci. 32, (8), 1175-1188 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics