Een eiwit Bereidingswijze voor de High-throughput identificatie van eiwitten Interactie met een nucleair Cofactor Met behulp van LC-MS / MS Analysis

* These authors contributed equally
Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

We hebben een werkwijze voor het zuiveren van eiwitten mederegulerende interactie met de LC-MS / MS systeem.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Tsuchiya, M., Karim, M. R., Matsumoto, T., Ogawa, H., Taniguchi, H. A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis. J. Vis. Exp. (119), e55077, doi:10.3791/55077 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Eiwit-eiwit interacties een belangrijke rol in vele biologische functies. Als zodanig zijn deze interacties betrokken bij signaaltransductie; eiwit transport over celmembranen; celstofwisseling; en verschillende nucleaire processen, waaronder DNA-replicatie, DNA schade herstel, recombinatie en transcriptie 1, 2, 3, 4. Het identificeren van de eiwitten die betrokken zijn bij deze interacties is daarom van cruciaal belang voor onze kennis van deze cellulaire processen.

Immunoprecipitatie (IP) is een gevalideerde techniek om eiwit-eiwit interacties analyseren. Om de identificatie van co-immunogeprecipiteerd eiwitten vergemakkelijken, wordt vaak gebruikt massaspectrometrie 5, 6, 7, 8,9. Door zich te richten een bekend lid van een eiwitcomplex met een antilichaam, is het mogelijk om het eiwitcomplex te isoleren en vervolgens de onbekende componenten identificeren via massaspectrometrie analyse. ARIP4 (androgeen-receptor interactie eiwit 4), een transcriptie coregulator samenwerkt met nucleaire receptoreiwitten voor het activeren of onderdrukken zijn doel promotors in een context-afhankelijke wijze 9, 10. Om beter te begrijpen van de transcriptie regulerende mechanismen die deze nucleaire factoren beschrijven we een uitgebreide methode te zuiveren en te identificeren ARIP4 interagerende eiwitten met behulp van de LC-MS / MS-systeem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Transfectie

  1. Zaad HEK293 cellen in 100 mm kweekplaten (2 x 10 6 cellen / schaal). Cultuur van de cellen in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium gesupplementeerd met 10% foetaal kalfsserum, 100 ug / ml streptomycine en 100 eenheden / ml penicilline. Incubeer de cellen in een vochtige incubator bij 5% CO2 en 37 ° C.
  2. De volgende dag transfecteren de cellen met 10 ug-FLAG tag ARIP4 plasmide middels 40 gl transfectiereagens volgens de instructies van de fabrikant 11.

2. Eiwitextractie

  1. Ongeveer 36 uur na transfectie, was de cellen met ijskoude PBS en oogst de cellen met behulp van een schraper. Breng de cellen in een 1,5 mltube en Centrifugeer bij 8000 xg gedurende 2 min bij 4 ° C. Zuig het supernatant en resuspendeer de celpellet in 5x het volume pellet van 0,4 M KCl-buffer (met hoge zout buffer: 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,4 M KCl, 5 mM MgCl2, 10% glycerol, 0,1% NP-40, 10 mM b-mercaptethanol, 1x proteaseremmer cocktail). Draai het mengsel gedurende 20 minuten bij 4 ° C.
  2. Centrifugeer de buis bij 17.700 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
  3. Breng de bovenstaande (whole-cell extract) naar een nieuwe 2 ml buis en voeg 3x het beginvolume van 0 M KCl-buffer (verdunning buffer: 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM MgCl2, 10% glycerol, 0,1% NP-40, 10 mM β-mercaptoethanol, 1x proteaseremmer cocktail).
  4. Maak een andere centrifugatie (17.700 g gedurende 10 min bij 4 ° C) en giet het supernatant (cellulair extract) naar een nieuwe 2 ml buis.

3. Immunoprecipitatie

  1. Tijdens de centrifugatie (2,4), was 50 pl anti-FLAG kralen met PBS, 0,1 M glycine-hydrochloride, en vervolgens 1 M Tris-hydrochloride, gevolgd door tweemaal wassen met 0,1 M KCl-buffer (lage zout buffer: 20 mM Tris HCl (pH 8,0), 0,1 m KCl, 5 mM MgCl2, 10% glycerol, 0,1% NP-40, 10 mM b-mercaptoethanol, 1x proteaseremmer cocktail). De centrifugatie gedurende dit wasproces wordt uitgevoerd bij 2000 xg gedurende 1 min bij 4 ° C.
  2. Meng 50 pl FLAG kralen met de gehele celextracten en voorzichtig zwenken het mengsel gedurende 4 uur bij 2-4 ° C (1% van het gehele celextract uit stap 2.4 moeten ook bij -80 ° C voor toekomstig gebruik bewaard als ingang).
  3. Breng het monster op een micro-spin-kolom (zwaartekracht drop). Houd het doorstroomkanaal in een 1,5 ml buis, bevriezen met vloeibare stikstof, en het op -80 ° C (controleer de eiwit niveaus van zowel de input en doorstroming via Western blot analyse).
  4. Voeg 1 ml 0,1 M KCl-buffer (laag zout buffer) aan de FLAG parels (zwaartekracht drop) wassen.
  5. Herhaal stap 3,4 ten minste vier keer (voor een totaal van vijf wassingen).

4. Elutie

  1. Plaats de kolom in een 1,5 ml buis en centrifugeer het op 2000 g gedurende 1 min; de korrels droogt.
  2. Cap de onderkant vande kolom.
  3. Voeg 50 ul (gelijk aan het volume van FLAG parels) van 0,1 M glycine-HCl (pH 2,5).
  4. Schud het mengsel gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  5. Plaats de kolom in een nieuwe 1,5 ml buis en centrifugeer bij 2000 xg deze gedurende 1 min.
  6. De geëlueerde oplossing wordt geneutraliseerd met 10 pi 1 M Tris-HCl (pH 8,0); Meng goed door pipetteren of met een vortexmachine.

5. Alkylering en trypsine

  1. Voeg 50 ul van 100 mM NH 4 HCO 3, 10 pl CH3CN en 2 pl dithiothreitol aan het mengsel (112 ui totaal volume).
  2. Incubeer het monster gedurende 30 minuten bij 56 ° C.
  3. Het monster wordt bij kamertemperatuur gedurende 10 min.
  4. Voeg 10 ul van 333 mM joodaceetamide om het monster en incubeer in het donker gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
  5. Voeg 10 ul trypsine (33 ng / ul) aan het mengsel en incubeer deze overnacht bij 37 ° C.

  1. Na 's nachts trypsine, vervoeren het eindproduct van een LC-MS / MS voorziening of aan een derde partij massaspectrometrie laboratorium voor analyse 12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

We identificeerden een sterk signaal ARIP4, ongeveer 160 kDa, evenals die van een mock vergelijkingsmonster en verscheidene andere onbekende eiwitten (Figuur 1). LC-MS / MS analyse identificeerde zowel ARIP4 complex peptiden en de potentiële peptide cofactoren in de fractie van FLAG parels (tabel 1). p62 (Sequestosome1), een bekende ARIP4 cofactor 11 werd geïdentificeerd in de analyse (tabel 1), waarbij de werkzaamheid van dit systeem 11 wordt bevestigd. We zijn ook veel andere eerder gerapporteerde eiwitten die interageren met ARIP4. Zo SUMO2 10 en DryK 13 werden gedetecteerd via de LC-MS / MS analyse. ARIP4 peptiden werden geïdentificeerd met behulp van LC-MS / MS analyse, wat suggereert dat het OT van hoge kwaliteit. Over het algemeen, de LC-MS / MS techniek is een krachtig instrument dat kan worden gebruikt om onbekende gebeurtenissen koppeling nucleaire identificerened eiwit-eiwit interacties. Volledige massaspectrometrische resultaten zullen op aanvraag beschikbaar zijn.

Figuur 1
Figuur 1: Zuivering van ARIP4 complexen. Zilverkleuring van FLAG epitoop-gemerkte ARIP4 (ARIP4-F) tot expressie gebracht in HEK293-cellen en immunoprecipitatie met een FLAG-specifiek antilichaam. Gezuiverde eiwitten werden gescheiden met behulp van gelelektroforese en gevisualiseerd met zilverkleuring. Als controle werd een mock zuivering uitgevoerd op HEK293 cellen die geen exogene eiwitten heeft uitgesproken. Moleculair gewicht normen worden getoond aan de linkerkant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

tafel 1
Tabel 1: Identification van Novel ARIP4 bindende eiwitten. FLAG parels gebonden aan gezuiverde eiwit complexen werden gedissocieerd door trypsine-digestie basis. Deze eiwitten werden vervolgens geïdentificeerd met behulp van LC-MS / MS analyse. LC-MS / MS gegevens werden geanalyseerd met de Swiss-Prot database en MASCOT software. Het aantal peptiden en de identiteit van deze eiwitten zijn weergegeven. Alleen eiwitten met significante MASCOT scores (p <0,05) werden geselecteerd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Efficiënte transfectie is essentieel voor een succesvol resultaat met dit protocol verkregen. Daarom raden wij u aan Western blot analyse om de immunogeprecipiteerd FLAG-gemerkte eiwitten te bepalen. Deze stap kan de gebruiker controleren of hun eiwit van interesse behoren tot overexpressie wordt gebracht en bovendien dat de IP is gelukt. FLAG-gemerkt eiwit niveaus ook vóór de massaspectrometrie analyse gecontroleerd.

Een mock monster moet worden gebruikt als een negatieve controle te vermijden verkrijgen van een vals positief resultaat en de achtergrond van de ware interacties discrimineren. Bovendien, bij het bestuderen van humane eiwitten, experimenten worden uitgevoerd in een relatief schone omgeving (bijvoorbeeld een schone ruimte) om vervuiling te voorkomen. Hoewel een proteïne extractiebuffer met een hoge zoutconcentratie (0,3-0,4 M) soms direct gebruikt kerneiwitten extraheren, een IP buffer met 0,1-0,15 M zoutconcentratie meestetien bevelen. Hierdoor kan de regeling AV om zonder verstoring eiwit-eiwit interacties. Het achtergrondsignaal verder te minimaliseren, kunnen magnetische korrels worden gebruikt voor het zuiveringsproces. Het is ook belangrijk om de cellyse te optimaliseren om vals-positieve resultaten te verminderen.

De betekenis van de in deze studie beschreven met betrekking tot andere technieken methode (bijvoorbeeld gel digestie gebaseerde enkel eiwit identificatie) 5, 10, 11 is dat het mogelijk gebruikers LC-MS / MS analyses uit te voeren voor de snelle identificatie eiwit interacties tussen nucleaire cofactoren en hun bindingspartners. Transcriptionele genregulatie is sterk afhankelijk van de medewerking van sequentie-specifieke DNA-bindende eiwitten. Dienovereenkomstig transcriptiefactoren vaak samenwerken met een groot aantal cofactoren expressie van het doelwitgen te wijzigen. th erefore, beter inzicht in de cellulaire gebeurtenissen die op deze transcriptie mechanismen, het identificeren van transcriptie partners ter bevordering doeleiwit activiteit is van cruciaal belang. Onze methode stelt gebruikers in staat om vermeende nucleaire co-factoren snel te identificeren via hun transcriptiefactor van interesse en een verdere versterking van ons begrip van de transcriptie regulerende mechanismen.

FLAG peptide kan ook worden gebruikt in plaats van een 0,1 M glycine-HCl (pH 2,5) tijdens de elutie. Indien deze modificatie wordt toegepast, de pH van de buffer gebruikt voor de FLAG peptiden verdund moeten worden gecontroleerd. 3x FLAG peptiden ook worden gebruikt om de eiwitten elueren uit de FLAG parels. Dienovereenkomstig moet een oplossing met een relatief hoge pH worden gebruikt voor het FLAG peptiden onder deze gewijzigde omstandigheden verdunnen. Het is ook belangrijk om de herhaaldelijk bevriezen en ontdooien van de monsters om de juiste eiwit-eiwitinteracties behouden voorkomen.

t "> Soms, het optimaliseren van de behandeling met trypsine werkwijze kan nodig zijn voor het verbeteren van de nauwkeurigheid van de resultaten van het eiwit interactie screening. Hoewel de LC-MS / MS methode is een instrument dat kan worden gebruikt om de interactie tussen nucleaire identificeren eiwitten, één van de beperkingen is dat het geen exacte informatie over het samenstel van het eiwitcomplex biedt. Om complexe stabiliteit, chemische verknoping behandelingen kunnen worden gebruikt 14. Als alternatieve methode, capillaire elektroforese-MS / MS is ook nuttig 15 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 11668019
Protease Inhibitor Cocktail (EDTA free) (100x) nacalai tesque 03969-21
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel Sigma-Aldrich A2220
Micro Bio-Spin Columns BIO-RAD 732-6204

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Comput.Biol. 6, (6), e1000807 (2010).
  2. Westermarck, J., Ivaska, J., Corthals, G. L. Identification of protein interactions involved in cellular signaling. Mol.Cell.Proteomics. 12, (7), 1752-1763 (2013).
  3. MacPherson, R. E., Ramos, S. V., Vandenboom, R., Roy, B. D., Peters, S. J. Skeletal muscle PLIN proteins, ATGL and CGI-58, interactions at rest and following stimulated contraction. Am.J.Physiol.Regul.Integr.Comp.Physiol. 304, (8), 644-650 (2013).
  4. Qin, K., Dong, C., Wu, G., Lambert, N. A. Inactive-state preassembly of G(q)-coupled receptors and G(q) heterotrimers. Nat.Chem.Biol. 7, (10), 740-747 (2011).
  5. Ogawa, H., Ishiguro, K., Gaubatz, S., Livingston, D. M., Nakatani, Y. A complex with chromatin modifiers that occupies E2F- and Myc-responsive genes in G0 cells. Science. 296, (5570), 1132-1136 (2002).
  6. Shi, Y., et al. Coordinated histone modifications mediated by a CtBP co-repressor complex. Nature. 422, (6933), 735-738 (2003).
  7. Huh, K. W., DeMasi, J., Ogawa, H., Nakatani, Y., Howley, P. M., Munger, K. Association of the human papillomavirus type 16 E7 oncoprotein with the 600-kDa retinoblastoma protein-associated factor, p600. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 102, (32), 11492-11497 (2005).
  8. Huang, B. X., Kim, H. Y. Effective identification of Akt interacting proteins by two-step chemical crosslinking, co-immunoprecipitation and mass spectrometry. PLoS One. 8, (4), 61430 (2013).
  9. ten Have, S., Boulon, S., Ahmad, Y., Lamond, A. I. Mass spectrometry-based immuno-precipitation proteomics - the user's guide. Proteomics. 11, (6), 1153-1159 (2011).
  10. Ogawa, H., Komatsu, T., Hiraoka, Y., Morohashi, K. Transcriptional Suppression by Transient Recruitment of ARIP4 to Sumoylated nuclear receptor Ad4BP/SF-1. Mol.Biol.Cell. 20, (19), 4235-4245 (2009).
  11. Tsuchiya, M., et al. Selective autophagic receptor p62 regulates the abundance of transcriptional coregulator ARIP4 during nutrient starvation. Sci.Rep. 5, 14498 (2015).
  12. Watanabe, T., Matsuo, I., Maruyama, J., Kitamoto, K., Ito, Y. Identification and characterization of an intracellular lectin, calnexin, from Aspergillus oryzae using N-glycan-conjugated beads. Biosci.Biotechnol.Biochem. 71, (11), 2688-2696 (2007).
  13. Sitz, J. H., Tigges, M., Baumgartel, K., Khaspekov, L. G., Lutz, B. Dyrk1A potentiates steroid hormone-induced transcription via the chromatin remodeling factor Arip4. Mol.Cell.Biol. 24, (13), 5821-5834 (2004).
  14. Mohammed, H., Taylor, C., Brown, G. D., Papachristou, E. K., Carroll, J. S., D'Santos, C. S. Rapid immunoprecipitation mass spectrometry of endogenous proteins (RIME) for analysis of chromatin complexes. Nat.Protoc. 11, (2), 316-326 (2016).
  15. Fonslow, B. R., Yates, J. R. Capillary electrophoresis applied to proteomic analysis. J.Sep.Sci. 32, (8), 1175-1188 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics