में क्षैतिज जीन स्थानांतरण के अध्ययन के लिए क्रियाविधि
1Division of Biomedical Science, Faculty of Medicine, University of Tsukuba, 2Department of Basic Biomedical Science, Universidad Europea de Madrid, 3Human Biology Program, School of Integrative and Global Majors, University of Tsukuba, 4Laboratory of Nosocomial Infections, Department of Bacteriology, Centro Nacional de MicrobiologÍa, Instituto de Salud Carlos III, 5Division of Microbiology, Department of Medicine, School of Medicine, Universidad Complutense, 6Biology of Gram-Positive Pathogens, Department of Microbiology, Institut Pasteur, Paris, France, 7ERL3526, CNRS, Paris, France
* These authors contributed equally

Published 3/10/2017
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Immunology and Infection

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Summary

हम यहाँ स्ताफ्य्लोकोच्चुस में विकार, पारगमन, और प्राकृतिक परिवर्तन की इन विट्रो जांच के लिए तीन अलग-अलग प्रोटोकॉल का वर्णन है।

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Cafini, F., Thi Le Thuy, N., Román, F., Prieto, J., Dubrac, S., Msadek, T., et al. Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus. J. Vis. Exp. (121), e55087, doi:10.3791/55087 (2017).

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Abstract

प्रमुख अवसरवादी मानव रोगज़नक़ स्ताफ्य्लोकोच्चुस में से एक महत्वपूर्ण विशेषता इसकी असाधारण तेजी से एंटीबायोटिक दवाओं के लिए प्रतिरोध हासिल करने की क्षमता है। जीनोमिक अध्ययन बताते हैं कि एस ऑरियस मोबाइल आनुवंशिक तत्वों में स्थित कई डाह और प्रतिरोध जीनों किया जाता है, सुझाव है कि क्षैतिज जीन स्थानांतरण (HGT) में एस ऑरियस विकास एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। हालांकि, एस ऑरियस में HGT अध्ययन करने के लिए अभी भी कमी है, विशेष रूप से प्राकृतिक परिवर्तन है, जो हाल ही में इस जीवाणु की रिपोर्ट में किया गया है के बारे में इस्तेमाल किया पद्धति का एक पूर्ण और विस्तृत विवरण। विकार, फेज पारगमन, और प्राकृतिक परिवर्तन: यह काम तीन प्रोटोकॉल है कि एस ऑरियस में HGT की इन विट्रो जांच के लिए उपयोगी होते हैं वर्णन करता है। इस उद्देश्य, सीएफआर जीन (chloramphenicol / florfenicol प्रतिरोध) है, जो Phenicols प्रदान, Lincosamides, ओक्षज़ोलिदिनोनेस, Pleuromutilins, और Streptogramin एक (PhLOPS करने के लिएए) phenotype प्रतिरोध, इस्तेमाल किया गया था। तंत्र के माध्यम से जो एस ऑरियस अन्य नस्लों के लिए आनुवंशिक सामग्री स्थानान्तरण को समझना प्रतिरोध का तेजी से अधिग्रहण को समझने के लिए आवश्यक है और प्रसार के साधनों निगरानी कार्यक्रमों में सूचना या आगे भविष्य में फैल मोड भविष्यवाणी करने के लिए स्पष्ट करने के लिए मदद करता है।

Introduction

स्ताफ्य्लोकोच्चुस एक खानेवाला ग्राम पॉजिटिव जीवाणु कि स्वाभाविक रूप से मनुष्य और जानवरों की त्वचा और नाक गुहा में पाई जाती है। यह जीवाणु प्रजातियों अस्पतालों और स्वास्थ्य देखभाल स्थितियों में nosocomial संक्रमण का प्रमुख कारण है। इसके अलावा, विभिन्न रोगाणुरोधी यौगिकों के लिए प्रतिरोध विकसित करने की क्षमता के लिए एक वैश्विक चिंता में इस जीवाणु की वजह से संक्रमण का प्रबंधन किया है।

प्रतिरोध phenotypes के प्रसार में शामिल दो मुख्य रास्ते से जाना जाता है: प्रतिरोधी जीनोटाइप का प्रतिरूप प्रसार और बैक्टीरियल पूल के बीच आनुवंशिक निर्धारकों के प्रचार-प्रसार। एस ऑरियस, विभिन्न एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीनों (के रूप में अच्छी तरह से डाह निर्धारकों) के मामले में मोबाइल आनुवंशिक तत्वों (MGEs) के साथ जुड़े होने के लिए पाया गया है 1। एस ऑरियस के जीनोम में इन तत्वों की उपस्थिति का संकेत अधिग्रहण और जनरल के स्थानांतरण सेबैक्टीरियल आबादी के भीतर etic सामग्री के लिए एस ऑरियस अनुकूलन और विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है।

परिवर्तन, विकार, और फेज पारगमन: जेनेटिक सामग्री ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया में HGT के तीन प्रसिद्ध तंत्र के माध्यम से आदान-प्रदान किया जा सकता है। परिवर्तन मुक्त डीएनए के तेज शामिल है। क्षमता चरण: विदेशी डीएनए हासिल करने के लिए, बैक्टीरियल कोशिकाओं को एक विशेष शारीरिक चरण को विकसित करने की जरूरत है। जब इस स्तर तक पहुँच जाता है, सक्षम कोशिकाओं में डीएनए कोशिका द्रव्य के परिवहन, नए आनुवंशिक निर्धारकों को प्राप्त करने में सक्षम हैं। एस ऑरियस के मामले में, प्राकृतिक परिवर्तन के अस्तित्व को हाल ही में 2 प्रदर्शन किया गया है। इस के साथ लाइन में, हमारे समूह के विकास की क्षमता के चरण में है और पर झोंका कारक की अभिव्यक्ति की प्रासंगिकता (एक गुप्त माध्यमिक प्रतिलेखन कारक सिग्मा) कैसे अपने विधान अभिव्यक्ति renders एस ऑरियस Reachin में सक्षम पर प्रकाश डाला गया हैजी क्षमता मंच है, जो प्राकृतिक परिवर्तन 2 से प्रतिरोधी phenotypes के अधिग्रहण के लिए अनुमति देता है।

संयुग्मन एक और (प्राप्तकर्ता) के लिए एक जीवित कोशिका (दाता) से डीएनए के संचरण से जुड़े एक प्रक्रिया है। दोनों कोशिकाओं सीधे संपर्क में होना चाहिए, की अनुमति ऐसी ट्यूब या pores के रूप में विशेष संरचनाओं, से संरक्षित किया जा रहा है, जबकि डीएनए विमर्श किया जाना है। इस विधि द्वारा डीएनए के हस्तांतरण संयुग्मी मशीनरी की आवश्यकता है। एस ऑरियस में, प्रोटोटाइप संयुग्मी प्लाज्मिड PGO1, जो संयुग्मी operon TraA 3 बंदरगाहों है।

फेज पारगमन जीवाणुभोजी संक्रमण के माध्यम से सेल के लिए सेल से डीएनए के हस्तांतरण शामिल है और, जीवाणु के डीएनए की पैकिंग का तात्पर्य वायरल डीएनए के बजाय, फेज capsid में। एस ऑरियस वियोजन के अधिकांश bacteriophages 1 से lysogenized रहे हैं। तनाव की स्थिति पर, prophages बैक्टीरियल Genom से excised जा सकती हैई और अपघट्य चक्र के लिए पाली।

ये एस ऑरियस में डीएनए संचरण के लिए तीन अच्छी तरह से जाना जाता तंत्र हैं। वहाँ इस तरह के "छद्म-परिवर्तन" 2 और pathogenicity द्वीप समूह 4 के हस्तांतरण में फेज-तरह सिस्टम के रूप में कुछ अतिरिक्त हस्तांतरण तंत्र भी होता है। हाल ही में, एक समूह ने सूचना दी कि "नैनोट्यूब" पड़ोसी कोशिकाओं 5, 6 के बीच सेलुलर सामग्री (प्लास्मिड डीएनए सहित) के हस्तांतरण में शामिल कर रहे हैं, लेकिन एक अनुवर्ती अध्ययन अब तक अन्य समूहों से नहीं दिखाई दिया है।

विकार, पारगमन, और प्राकृतिक परिवर्तन: इस काम के लिए तीन मुख्य हस्तांतरण रास्ते को संबोधित द्वारा एस ऑरियस में HGT अध्ययन करने के लिए आवश्यक पद्धति प्रदान करता है। इन तरीकों के साथ प्राप्त परिणामों के बीच सीएफआर जीन का संचरण (chloramphenicol / florfenicol प्रतिरोध) का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गयाएस ऑरियस तनाव 7। इन तीनों तकनीकों एस ऑरियस में MGE संचरण की जांच के लिए बहुमुखी उपकरण हैं।

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Protocol

नोट: तनाव और सामग्री इस काम में इस्तेमाल किया, 1 टेबल में सूचीबद्ध हैं और सामग्री की तालिका में क्रमश। ट्रांसमिशन प्रयोगों में, N315 और पॉजिटिव डेरिवेटिव सीएफआर सीओएल सीएफआर जीन की दाताओं (N315-45 और कर्नल 45) के रूप में इस्तेमाल किया गया। ये उपभेदों पहले से विकार द्वारा प्राप्त किया गया, दाता एक नैदानिक सीएफआर पॉजिटिव Staphyloccocus एपिडिडर्मिस तनाव (ST2) के रूप में उपयोग कर मानक विकार प्रोटोकॉल (देखें नीचे) के बाद। इस तनाव एक pSCFS7-तरह प्लाज्मिड 7 पर सीएफआर जीन harbored।

1. संयुग्मन फ़िल्टर संभोग विधि का प्रयोग

नोट: सीएफआर जीन (N315-45) 7 (सेमी आर) ले जाने के एक एस ऑरियस N315 तनाव दाता के रूप में इस्तेमाल किया गया था। सीओएल 8 या 9 Mu50 उपभेदों (TET आर, मुख्यमंत्री एस) प्राप्तकर्ता के रूप में इस्तेमाल किया गया। डबलप्रतिरोधी कालोनियों (TET आर, मुख्यमंत्री आर), 32 मिलीग्राम / chloramphenicol प्लस 8 मिलीग्राम की एल की उपस्थिति में विकसित करने में सक्षम / टेट्रासाइक्लिन के एल ख्यात transconjugants के रूप में माना जाता था और कॉलोनी पीसीआर द्वारा सीएफआर की उपस्थिति निर्धारित करने और निर्धारित करने के लिए विश्लेषण किया गया प्राप्तकर्ता संवेदनशीलता प्रोफ़ाइल।

  1. कुछ संशोधनों के साथ एक पहले से वर्णित प्रोटोकॉल 10 निम्नलिखित विकार प्रदर्शन करते हैं:
    1. 37 डिग्री सेल्सियस पर झटकों के साथ, दाता और tryptic सोया शोरबा (टीएसबी) मध्यम (के साथ और बिना 32 मिलीग्राम / एल chloramphenicol, क्रमशः) में प्राप्तकर्ता की रात संस्कृति के 5 एमएल तैयार करें।
    2. ताजा टीएसबी माध्यम का उपयोग करके 1 (600 आयुध डिपो = 1.0) के लिए रात भर संस्कृतियों के ऑप्टिकल घनत्व (600 आयुध डिपो) समायोजित करें। प्राप्तकर्ता संस्कृति के 0.5 एमएल (सीओएल या Mu50) के साथ दाता संस्कृति (N315-45) के 0.5 एमएल मिक्स। मिश्रण करने के लिए पीबीएस के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
    3. एक 0.45 माइक्रोन फिल्टर झिल्ली यूएसआई पर बैक्टीरिया का मिश्रण स्थानांतरणएक वैक्यूम पंप प्रणाली एनजी।
    4. एक भेड़ रक्त अगर प्लेट पर फिल्टर झिल्ली रखो। 1 दिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
      नोट: इस चरण में, समृद्ध मध्यम डबल-प्रतिरोधी कोशिकाओं के विकास को अनुमति देने के लिए आवश्यक है।
    5. थाली से फिल्टर झिल्ली बाहर ले जाओ और फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 10 मिलीलीटर में निलंबित। भंवर अच्छी तरह से सभी बैक्टीरिया झिल्ली पर संलग्न इकट्ठा करने के लिए।
    6. ताजा टीएसबी का उपयोग करके जीवाणु निलंबन के एक धारावाहिक 10 गुना कमजोर पड़ने बनाओ। प्लेट टीएसबी अगर पर 0-10 -4 पतला नमूने के 100 μl (टीएसए) प्लेटों 32 मिलीग्राम / एल chloramphenicol और 8 मिलीग्राम / transconjugants के चयन के लिए एल टेट्रासाइक्लिन के साथ पूरक। प्लेट पतला निलंबन (10 -5 -10 -6) टीएसए प्लेटों पर अकेले 8 मिलीग्राम / एल टेट्रासाइक्लिन के साथ की 100 μl प्राप्तकर्ताओं की कुल संख्या गिनने के लिए। 18-24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें सेते हैं।
    7. सीएफ की उपस्थिति के लिए डबल-प्रतिरोधी कालोनियों (ख्यात transconjugants) का विश्लेषणकॉलोनी पीसीआर 7 और उनकी संवेदनशीलता प्रोफाइल (antibiogram) द्वारा जीन आर।
    8. मानक microdilution विधि या डिस्क प्रसार विधि 11 के अनुसार उचित एंटीबायोटिक दवाओं की न्यूनतम निरोधात्मक सांद्रता (mics) को मापने के द्वारा antibiogram निर्धारित करते हैं। Transconjugants की संवेदनशीलता प्रोफाइल, प्राप्तकर्ता के लिए समान होना चाहिए chloramphenicol (और अन्य यौगिकों सीएफआर जीन से प्रभावित) को छोड़कर। यह संकल्प दाता तनाव द्वारा विकसित टेट्रासाइक्लिन प्रतिरोध बाहर शासन करने के लिए आवश्यक है।

2. फेज पारगमन

नोट: जीवाणुभोजी MR83a Siphoviridae परिवार (प्रयोगशाला शेयर) से संबंधित पारगमन प्रयोगों में इस्तेमाल किया गया था। N315-45 फेज संक्रमण के लिए सीएफआर दाता के रूप में इस्तेमाल किया गया था। N315, सीओएल, या Mu50 उपभेदों प्राप्तकर्ता के रूप में इस्तेमाल किया गया। सीएफआर के अधिग्रहण के एबी द्वारा निर्धारित किया गया थाप्राप्तकर्ता तनाव का बड़प्पन 32 मिलीग्राम / एल chloramphenicol की उपस्थिति में विकसित करने के लिए। इस शर्त के तहत बढ़ रही कालोनियों सीएफआर की उपस्थिति (कॉलोनी पीसीआर) के द्वारा निर्धारित करने के लिए और संभावित प्रदूषण को बाहर शासन करने के लिए संवेदनशीलता प्रोफ़ाइल निर्धारित करने के लिए विश्लेषण किया गया।

  1. दाता पर फेज प्रवर्धन
    1. मिलाते (180 आरपीएम) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 3.6 मिमी सीए 2 + (NBCaCl 2) के साथ पूरक पोषक तत्व शोरबा के 5 मिलीलीटर में N315-45 की एक रात संस्कृति तैयार करें।
      नोट: कैल्शियम फेज संक्रमण के लिए आवश्यक है। सामग्री तालिका देखें। अन्य कंपनियों से पोषक तत्व शोरबा जैसे कैल्शियम वर्षा के रूप में मुद्दों, हो सकता है।
    2. 50 मिलीलीटर कांच की बोतल या कांच की शीशियों में NBCaCl 2 के 10 एमएल के अंतिम मात्रा में 1,000: रातोंरात संस्कृति 1 गिराए द्वारा उपसंस्कृतियाँ तैयार करें। मिलाते (180 आरपीएम) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए बैक्टीरिया बढ़ने।
    3. NBCaCl 2 मेडी में पतला फेज MR83a की एक श्रृंखला तैयारउम (10 -2, 10 -3, 10 -4, 10 -5, और 10 -6)। जीवाणु संस्कृति में पतला फेज के 20 μl जोड़ें। इसके अलावा जो बैक्टीरिया कोशिका विकास के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है और अगले दिन फेज अनुमापांक निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता फेज संक्रमण के बिना एक नियंत्रण संस्कृति, तैयार करते हैं।
    4. कोमल मिलाते (100 आरपीएम) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस रात भर संस्कृतियों आगे बढ़ें।
      नोट: कोशिकाओं को कुछ हद तक विकसित होगा जब संक्रमित फेज अधिक नहीं है; फिर, वे अपघट्य चक्र के माध्यम से फेज प्रवर्धन के कारण सेल चरण में प्रवेश करेंगे। फेज के बिना संस्कृति, पूर्ण विकास दिखाने जबकि फेज के साथ संस्कृतियों पारदर्शिता के अलग दरों शो होगा।
    5. एक या दो जोड़ा फेज के उच्चतम कमजोर पड़ने के साथ मंजूरी दे दी संस्कृति शीशियों का चयन करें।
    6. 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में संस्कृतियों स्थानांतरण। क्लोरोफॉर्म के 250 μl जोड़ें और ट्यूबों के inverting द्वारा मिश्रण अच्छी तरह से।
    7. 5000 में ट्यूबों अपकेंद्रित्र
    8. ताजा ट्यूबों के लिए supernatants स्थानांतरण और उपयोग करें जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें दुकान।
      ध्यान दें: फेज में कम से कम कुछ महीनों के लिए स्थिर है, लेकिन बहुत देर के लिए फेज तैयारी के भंडारण अनुमापांक और पारगमन क्षमता कम कर देता है।
  2. मापने फेज अनुमापांक (फेज पट्टिका परख)
    1. पोषक तत्व शोरबा अगर (1.5% अगर) के माध्यम से तैयार; यह 55 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में गर्म रहते हैं। Autoclaved 0.5 एम 2 CaCl मध्यम का हल 3.6 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए जोड़ें। 90 मिमी पेट्री डिश (NBCaCl 2 प्लेट) में डाल देना।
    2. झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर NBCaCl 2 का 5 मिलीलीटर में N315 की एक रात संस्कृति तैयार करें; इस पर नियंत्रण के संस्कृति ऊपर वर्णित (कदम 2.1.3) के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
    3. NBCaCl 2 के 200 μl में रातोंरात संस्कृति के 10 μl जोड़ें और समान रूप से NBCaCl 2 थाली पर फैला दिया। जब की सतह प्रसार को रोकने केप्लेट तरल के साथ कवर किया जाता है। प्लेट सूखा।
    4. एक सीरियल 1:10 कमजोर पड़ने बनाओ (10 -5 -10 से -10) पहले से तैयार फेज (कदम 2.1.8) NBCaCl 2 माध्यम का उपयोग कर की।
    5. स्पॉट प्लेट बैक्टीरिया के साथ कवर पर प्रत्येक फेज कमजोर पड़ने के 3 μl।
    6. 30 डिग्री सेल्सियस पर रात भर थाली सेते हैं।
    7. गणना पट्टिका संख्या और निम्न समीकरण का उपयोग फेज अनुमापांक गणना: पट्टिका गठन इकाई (pfu) / मिलीलीटर = सजीले टुकड़े की संख्या एक्स कमजोर पड़ने कारक / देखा मात्रा (3 एक्स 10 -3 एमएल)
  3. फेज पारगमन
    नोट: फेज पूल पिछले चरण (2.1.8) में तैयार एस ऑरियस उपभेदों में सीएफआर जीन के पारगमन का परीक्षण करने के लिए प्रयोग किया जाता है। इस प्रयोग में, तनाव N315, सीओएल, या Mu50 प्राप्तकर्ता के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं।
    1. मिलाते (180 आरपीएम) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर NBCaCl 2 का 5 मिलीलीटर में N315, सीओएल, या Mu50 की रात संस्कृति तैयार करें।
    2. टी पतलावह ~ 10 9 pfu / एमएल NBCaCl 2 में फेज।
    3. एक 50 मिलीलीटर कांच की शीशी में, रातोंरात संस्कृति के 500 μl, ताजा NBCaCl 2 के 500 μl, और फेज के 1 मिलीलीटर (~ 10 9 pfu / एमएल) के मिश्रण; संक्रमण की उम्मीद की बहुलता (MOI) कोमल 30 मिनट के लिए मिलाते (100 आरपीएम) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते 1. मिश्रण से अधिक नहीं होनी चाहिए।
      नोट: सिर्फ फेज के अलावा (endogeneous प्रतिबंध एंजाइमों निष्क्रिय करने के लिए 2 मिनट के लिए 52 डिग्री सेल्सियस) से पहले प्राप्तकर्ता कोशिकाओं के हीट उपचार दक्षता 12 को बढ़ा सकता है।
    4. 20% Na 3 -Citrate के 50 μl जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए मिलाते हुए कोमल जारी रखें।
      नोट: ना 3 -Citrate कैल्शियम के एक मध्यम chelator के रूप में कार्य करता है।
    5. पिघल मस्तिष्क दिल अर्क (भी) अगर (1.5% अगर) के माध्यम से तैयार है और एक पानी के स्नान में यह 55 डिग्री सेल्सियस पर रहते हैं।
    6. एक 100 मिलीलीटर कुप्पी के लिए जीवाणु-फेज मिश्रण स्थानांतरण 32 मिलीग्राम / एल chloramp के साथ पूरक गर्म BHI अगर की 50 मिलीलीटर जोड़नेhenicol, और अच्छी तरह मिलाएँ। 90 मिमी पेट्री डिश में मिश्रण डालो।
      नोट: इस विधि से बढ़ रही कालोनियों (ख्यात transductants) की एक छोटी संख्या का पता लगाने के लिए सक्षम बनाता है।
    7. 24-48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं।
    8. इसके अलावा 32 मिलीग्राम / एल chloramphenicol के साथ पूरक नई BHI अगर प्लेट पर कालोनियों के हस्तांतरण से प्रतिरोध के लिए उत्पन्न कालोनियों (transductants) का परीक्षण करें। कॉलोनी पीसीआर 7 से सीएफआर जीन की उपस्थिति की पुष्टि करें।

3. प्राकृतिक परिवर्तन

नोट: एस ऑरियस में प्राकृतिक परिवर्तन परख विधि हमारे पिछले अध्ययन 2 में वर्णित निम्नलिखित बाहर किया गया था। N315 व्युत्पन्न, N2-2.1 2, 7, प्राप्तकर्ता के रूप में इस्तेमाल किया गया था। इस तनाव में झोंका ठिकाना दोहराया गया था अनिवार्यता से एक्सप्रेस झोंका 2 करने के लिए इतनी के रूप में। Det के लिएकैसे झोंका व्यक्त क्षमता वेरिएंट को अलग करने पर ailed प्रक्रियाओं, कृपया पिछले एक विवरण 2 देखें। स्थानांतरित किया जा प्रतिरोध मार्कर chloramphenicol नहीं है, तो Prit-झोंका (सेमी आर) के रूप में पहले 2 वर्णित झोंका व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। शुद्ध प्लाज्मिड या सीएफआर से पूरे डीएनए निकालने -acquired एस ऑरियस सीओएल-45 7 परिवर्तन के लिए दाता डीएनए के रूप में प्रयोग किया जाता है।

  1. दाता डीएनए की तैयारी
    1. सीओएल -45 रात भर खेती एक 300 मिलीलीटर टीएसबी के 50 एमएल युक्त कुप्पी में 37 डिग्री सेल्सियस पर झटकों के साथ 32 मिलीग्राम / एल chloramphenicol के साथ पूरक। संस्कृति ई कोलाई HST04 ले जाने pHY300 प्लाज्मिड (TET आर) के नियंत्रण के प्रयोग के लिए प्लाज्मिड निकालने के लिए।
      नोट: HST04 (बांध - / डीसीएम -) का अभाव है डीएनए methylase जीन 13। डीएनए methylases साथ अन्य परम्परागत उपभेदों भी इस्तेमाल हो सकता हैडी डीएनए दाता तैयार करने के लिए, क्योंकि डीएनए मेथिलिकरण राज्य परिवर्तन दक्षता प्रभावित नहीं करता। वैकल्पिक रूप से, pT181 प्लाज्मिड एस ऑरियस सीओएल तनाव से शुद्ध भी परिवर्तन परख 2 के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
    2. Centrifugation (4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 8000 XG) से कोशिकाओं को इकट्ठा।
    3. एक प्लास्मिड डीएनए निष्कर्षण किट या एक पारंपरिक डीएनए शोधन विधि का उपयोग कर पूरे डीएनए को शुद्ध करने के plasmids निकालें।
    4. स्पेक्ट्रोमीटर द्वारा शुद्ध डीएनए यों और उपयोग करें जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर इसे रख लो।
      नोट: परिवर्तन परख, आम तौर पर कम से कम एक सप्ताह पुराने के लिए एक ताजा डीएनए तैयारी का प्रयोग करें। ओल्ड डीएनए की तैयारी परिवर्तन की क्षमता को कम।
  2. परिवर्तन परख
    1. संस्कृति प्राप्तकर्ता सेल (N2-2.1) टीएसबी के 5 मिलीलीटर में 37 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर झटकों के साथ।
    2. एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरण रातोंरात संस्कृति के 0.5 मिलीलीटर। Precipicentrifugation (4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 10,000 XG) द्वारा कोशिकाओं टेट।
    3. एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में CS2 माध्यम के 10 एमएल के साथ कोशिकाओं को निलंबित।
      नोट: CS2 मध्यम एक पूरा सिंथेटिक माध्यम है कि एस ऑरियस 2 में प्राकृतिक परिवर्तन के लिए क्षमता लाती है (सामग्री तालिका में मध्यम रचना देखें)। ऐसे टीएसबी या BHI के रूप में अन्य मानक प्रयोगशाला मीडिया, परिवर्तन 2, 13 के लिए उपयुक्त नहीं हैं।
    4. मिलाते (180 आरपीएम) देर घातीय चरण (लगभग 8 घंटा) तक के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर बैक्टीरिया बढ़ने।
    5. Centrifugation (4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 5000 XG) द्वारा कोशिकाओं फसल।
    6. ताजा CS2 माध्यम के 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं Resuspend।
    7. शुद्ध प्लाज्मिड या जीनोम डीएनए (कदम 3.1.4) का 10 माइक्रोग्राम प्रति सेल निलंबन में जोड़े। 37 डिग्री सेल्सियस पर हिला और 2.5 घंटे के लिए 180 आरपीएम।
      नोट: डीएनए के साथ कम ऊष्मायन बार (<2.5 घंटा) कम स्ि्न्ंतरर में परिणामormation आवृत्तियों।
    8. Centrifugation (के लिए 5000 XG 5 4 डिग्री सेल्सियस पर मिनट) से कोशिकाओं को इकट्ठा।
    9. BHI माध्यम के 10 एमएल में कोशिकाओं Resuspend। पिघल BHI अगर की 90 मिलीलीटर (55 डिग्री सेल्सियस), 32 मिलीग्राम / एल chloramphenicol (या 5 मिलीग्राम / नियंत्रण प्रयोग में एल टेट्रासाइक्लिन) के साथ पूरक के साथ सेल निलंबन मिक्स। 90 मिमी पेट्री डिश में मिश्रण डालो। तेजी से शांत और अगर जमना।
    10. 2 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें सेते हैं।
    11. नई BHI अगर उचित एंटीबायोटिक दवाओं युक्त उनके प्रतिरोध विशेषताओं की पुष्टि करने के प्लेटों के लिए कालोनियों (toothpicks का उपयोग) के हस्तांतरण से उत्पन्न कालोनियों (transformants) को दोहराने। कॉलोनी पीसीआर 7 ने अधिग्रहण प्रतिरोध जीन (सीएफआर या tetM) की पुष्टि करें।

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Representative Results

यहां का प्रतिनिधित्व परिणाम पहले से प्रकाशित किया गया है (प्रकाशक की अनुमति के साथ संदर्भ 7 से अनुकूलित)। हम सीएफआर जीन है, जो निम्न स्तर linezolid प्रतिरोध और एस ऑरियस उपभेदों में PhLOPSA प्रतिरोध phenotype 14, 15 की अभिव्यक्ति का कारण बनता है, की क्षमता का संचरण रास्ते का अध्ययन किया HGT के तीन तंत्र की जांच से।

चित्रा 1 संयुग्मी assays में प्राप्त परिणामों से पता चलता है। विकार प्रोटोकॉल अलग संयुग्मी दाताओं में एक ही संयुग्मी सदिश का उपयोग इसी तरह के परिणाम दे रही है, अंतर-प्रजाति संचरण (ए) के साथ ही इंट्रा-प्रजातियों संचरण (बी) के लिए उपयोगी है। विकार की दक्षता transconjugants की Nº (कॉलोनी के गठन इकाइयों, या CFU / एमएल) प्राप्तकर्ता कोशिकाओं की / Nº (CFU / एमएल) के रूप में गणना की जाती है। प्राप्त आवृत्तियों एस एपिडिडर्मिस या दाता के रूप में एस ऑरियस का उपयोग कर समान मूल्यों के साथ, से 1 एक्स 10 -6 1 एक्स 10 -5 तक बताया गया।

परिणाम तालिका 2 सीएफआर में संक्षेप हैं -acquired एस ऑरियस आगे विकार द्वारा और साथ ही फेज पारगमन द्वारा अन्य एस ऑरियस उपभेदों के लिए सीएफआर जीन स्थानांतरण करने में सक्षम थे। लेकिन, परिणाम, सीएफआर संचरण के लिए प्राकृतिक परिवर्तन के अभाव का सुझाव है, हालांकि यह एक अलग प्रतिरोध मार्कर (pHY300 प्लाज्मिड पर tetM जीन) के लिए खोजा गया था।

आकृति 1
चित्रा 1: संयुग्मी assays में प्राप्त प्राप्तकर्ता और transconjugant CFUs का प्रतिनिधित्व। स्पष्ट सलाखों के बाद अलग-थलग कुल प्राप्तकर्ता उपभेदों का प्रतिनिधित्वप्राप्तकर्ता उपभेदों के लिए चयनात्मक मीडिया में संस्कृति की 18-24 घंटा। भर सलाखों कुल डबल-प्रतिरोधी transconjugant उपभेदों के लिए चयनात्मक मीडिया में संस्कृति की 18-24 घंटे के बाद प्राप्त उपभेदों प्रतिनिधित्व करते हैं। (ए) अंतर-प्रजाति संयुग्मी परख। Staphylococcus एपिडिडर्मिस (SE45) सीएफआर दाता के रूप में इस्तेमाल किया गया था, और स्ताफ्य्लोकोच्चुस N315 तनाव प्राप्तकर्ता के रूप में इस्तेमाल किया गया था। N315-45 transconjugant तनाव सीएफआर जीन एक pSCFS7-तरह प्लाज्मिड में डाला harbored। इस तनाव मरसा करने वाली मरसा संचरण assays में सीएफआर के स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया गया था। (बी) मरसा करने वाली मरसा संयुग्मी प्रयोगों। पहले से प्राप्त N315-45 दाता के रूप में इस्तेमाल किया गया था, और कर्नल या Mu50 उपभेदों प्राप्तकर्ता के रूप में इस्तेमाल किया गया। दो स्वतंत्र प्रयोगों की औसत मूल्यों मानक विचलन (एसडी) के साथ दिखाया गया है। एक बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करेंयह आंकड़ा का संस्करण।

तनाव नाम विवरण संदर्भ स्रोत
जीवाणु उपभेद
SE45 नैदानिक isolatated एस एपिडिडर्मिस 7
N315 पूर्व मरसा, KMR, ErmR 9
सीओएल pT181 प्लाज्मिड पर मरसा, ले जाने टेट्रासाइक्लिन प्रतिरोध जीन 8
Mu50 मरसा, वीजा 9
N315-45 N315 के व्युत्पन्न, एक pSCFS7-जैसे विकार से एस एपिडिडर्मिस से प्राप्त प्लाज्मिड पर जीन सीएफआर ले जाने 7
सीओएल-45 घकर्नल के erivative, एक pSCFS7-जैसे विकार से एस एपिडिडर्मिस से प्राप्त प्लाज्मिड पर जीन सीएफआर ले जाने 7
RN4220-45 RN4220 के व्युत्पन्न, एक pSCFS7-जैसे विकार से एस एपिडिडर्मिस से प्राप्त प्लाज्मिड पर जीन सीएफआर ले जाने 7
N2-2.1 N315 से निकाली गई कोशिका सक्रिय झोंका, परिवर्तन के लिए सेल प्राकृतिक क्षमता की इजाजत दी 7
ई कोलाई HST04 dam- / dcm- pHY300 ई कोलाई HST04 dam- / dcm- (Takara) ले जाने टेट्रासाइक्लिन प्रतिरोध pHY300 प्लाज्मिड 1 1
अक्तेरिओफगेस
MR83a Siphoviridae परिवार प्रयोगशाला के शेयर
MR83-45 फेज MR83a एक pSCFS7 की तरह संक्रमित होने के बाद जीन सीएफआर ले जाने प्लाज्मिड पैकिंगN315-45 में आयन ये पढाई

तालिका 1: इस काम में इस्तेमाल उपभेदों की सूची।

HTG दाता प्राप्त करने वाला आवृत्ति
विकार N315-45 सीओएल 1.00 x 10 -6
N315-45 MU50 1.29 x 10 -5
पारगमन N315-45 सीओएल 1.00 x 10 -11
N315-45 MU50 3.68 x 10 -10
N315-45 N315 6.88 x 10 -10
परिवर्तन प्लास्मिड (सीओएल-45) N2-2.1 ULD
पूरे डीएनए (सीओएल-45) N2-2.1 ULD
pHY300 (नियंत्रण) N2-2.1 6.52 x 10 -10

तालिका 2: मरसा करने वाली मरसा प्रयोगों में प्राप्त सीएफआर जीन संचरण के HTG आवृत्तियों। संयुग्मी संचरण दाता के रूप में N315 सीएफआर पॉजिटिव व्युत्पन्न (N315-45) का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था। इन प्रयोगों में संचरण की आवृत्ति transconjugants / प्राप्तकर्ता कोशिकाओं के Nº के रूप में व्यक्त किया जाता है। पारगमन transducing फेज MR83a, N315-45 तनाव से परिलक्षित का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था। पारगमन आवृत्ति transductants / pfu की Nº के रूप में गणना की गई। transforसूचना assays दाताओं के रूप में शुद्ध डीएनए (प्लाज्मिड या पूरे सेलुलर डीएनए) का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया। परिवर्तन आवृत्ति transformants / प्राप्तकर्ता कोशिकाओं की संख्या के रूप में गणना की गई। ULD: सीमा का पता लगाने के अंतर्गत।

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Discussion

इस काम के एस ऑरियस में आनुवंशिक निर्धारकों के HGT अध्ययन करने के लिए तीन प्रमुख तरीकों का वर्णन है। हालांकि पारगमन और विकार दशकों के लिए अध्ययन किया गया है, प्राकृतिक परिवर्तन के अस्तित्व को हाल ही में 2 मान्यता दी गई थी। इस प्रकार, एस ऑरियस HGT के तीन प्रमुख मोड के सभी के साथ सुसज्जित है, और उन सभी का परीक्षण आनुवंशिक निर्धारकों के संभावित प्रसार रास्ते को स्पष्ट करने की आवश्यकता है। इस काम का उद्देश्य पूरा प्रोटोकॉल संकलन करने के लिए और एक पहले से प्रकाशित काम 7 में इस्तेमाल के तरीके पर व्यावहारिक जानकारी प्रदान करना है। हालांकि विकार और पारगमन प्रोटोकॉल उपलब्ध हैं, पहले इस पत्र में जो एक विस्तृत परिवर्तन प्रोटोकॉल का वर्णन किया जाता है।

फिल्टर संभोग विधि का उपयोग संयुग्मन एक सरल तकनीक है और विभिन्न प्रजातियों के जीवाणु में संयुग्मी हस्तांतरण के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता= "xref"> 7, 10। मानकीकृत inocula का उपयोग करके, प्राप्तकर्ता 18-24 घंटे के बाद ~ 10 9 CFU / एमएल के एक मूल्य तक पहुंचने में गिना जाता है। Transconjugant मायने रखता है चर रहे हैं, और मूल्यों को मजबूत करने के लिए तनाव तनाव निर्भरता दिखाने के लिए, लेकिन आम तौर पर, 10 2 10 5 से एक transconjugant रेंज प्राप्त हुई थी जब विकार परिणाम सकारात्मक थे। यहाँ प्रदान प्रोटोकॉल का प्रयोग, हासिल पता लगाने की सीमा / एमएल था <10 transconjugants। इस सीमा फिल्टर निलंबन ध्यान केंद्रित करके अनुकूलित किया जा सकता।

यहाँ वर्णित प्राकृतिक परिवर्तन प्रोटोकॉल एस ऑरियस N315-derivate उपभेदों में स्थापित किया गया था। CS2 माध्यम के उपयोग परिवर्तन के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि इस तरह के परिवर्तन टीएसबी और BHI 13 के रूप में अन्य मानक प्रयोगशाला मीडिया में undetectable है।

दाता के रूप में लंबे समय तक संग्रहित plasmids (जैसे, pT181 और pHY300) के उपयोग के बारे में एक के परिणामस्वरूप 10 से 50 गुना कम आवृत्ति (डेटा) नहीं दिखाया, कि डीएनए गुणवत्ता का सुझाव परिवर्तन आवृत्ति को प्रभावित कर सकता है। यह ज्ञात है कि nicked plasmids बी subtilis 16 में प्राकृतिक परिवर्तन के लिए उपयुक्त नहीं हैं।

दोनों एस ऑरियस और ई कोलाई से प्राप्त डीएनए सुझाव है कि प्रतिबंध बाधा प्राकृतिक परिवर्तन को बाधित नहीं करता, प्राकृतिक परिवर्तन assays में दाता के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। हम भी ई कोलाई HST04 से तैयार डीएनए के बीच एक ही परिवर्तन आवृत्ति मनाया (- / डीसीएम - बांध) डीएनए कमी जीन methylase और JM109 से, विचार है कि मेथिलिकरण स्थिति परिवर्तन आवृत्ति को प्रभावित नहीं करता है समर्थन।

यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि परिवर्तन आवृत्ति इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके पता लगाया कम था (~ 10 -9 -10 -10), और बदला उपभेदों N315 derivates तक सीमित हैंवर्ग = "xref"> 2। यह संभावना है कि एस ऑरियस में परिवर्तन दक्षता, तनाव-विशिष्ट हो सकता है के रूप में भी अन्य बदला बैक्टीरिया 15, 16, 17 में सूचित कर दिया गया है। आगे के अध्ययन परिवर्तन दक्षता में सुधार के लिए कार्य प्रगति पर है; यह कहीं वर्णित किया जाएगा।

फेज पारगमन क्योंकि ज्यादातर एस ऑरियस वियोजन bacteriophages 18 से lysogenized कर रहे हैं एस ऑरियस में सबसे अधिक प्रचलित HGT तंत्र हो रहा है। transducing फेज के संक्रमण की क्षमता मेजबान संवेदनशीलता पर निर्भर करता है और पट्टिका परख द्वारा जाँच की जरूरत है। फेज पारगमन की एक और सीमा डीएनए के आकार है। छोटे डीएनए कुशलता से स्थानांतरित किया जा सकता है, लेकिन डीएनए टुकड़े से बड़ा 45 केबी staphylococcal फेज सिर 19 में पैक नहीं किया जा सकता। हालांकि, एक उपन्यास विशाल staphylococcal फेज हाल ही में ख हैeen माहौल से अलग, और itcould क़यास बड़ा डीएनए टुकड़े 20 को हस्तांतरण करने में सक्षम हो।

पट्टिका परख विधि इस काम में वर्णित पारंपरिक प्रोटोकॉल, जहां शीर्ष-अगर प्रयोग किया जाता है की तुलना में आसान है। हालांकि, वर्तमान विधि की आवश्यकता है कि बैक्टीरियल कोशिकाओं आदेश सतह पर उत्पन्न छोटे सजीले टुकड़े का पता लगाने के लिए समान रूप से फैले हुए हैं। अगर सतह पर जीवाणु निलंबन की पूरी तरह से भी फैल रहा है, हम में फैल करने की सिफारिश करने के लिए पर्याप्त मात्रा में प्राप्त करने के लिए, रोक जब तरल समान रूप से अगर सतह को शामिल किया। फिर, एक साफ बेंच में हवा के प्रवाह में प्लेटें सूखी। यदि यह transducing फेज की lysogenization से बचने के लिए आवश्यक है, संक्रमण के एक कम बहुलता की सिफारिश की है (MOI 1 से अधिक नहीं होनी चाहिए)। Lysogenized कोशिकाओं पट्टिका परख में फेज के लिए उनकी कम संवेदनशीलता से प्रतिष्ठित किया जा सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tryptic Soy Broth (TSB)  Becton Dickinson  211825
Brain Heart Infusion (BHI) Becton Dickinson  211059
Nutrient Broth No. 2 Oxoid CM0067
Sheep blood agar Eiken Chemical Co.,Ltd. E-MR96 Tryptic soy agar added with 5% (v/v) sheep blood according to the manufacturer. 
Agar powder Wako Pure Chemical Industries 010-08725
Sodium citrate (Trisodium citrate dihydrate) Wako Pure Chemical Industries 191-01785
Cellulose Ester Gridded 0.45 μL HAWG filter Merck Milipore HAWG 02500
QIAfilter Plasmid Midi kit QIAGEN 12243

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References

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