صورة موجهة، التصنيع القائم على الليزر من شبكات ميكروفلويديك المستمدة الأوعية الدموية.

1Department of Biomedical Engineering, University of Delaware, 2Department of Electrical and Computer Engineering, University of Houston, 3Delaware Biotechnology Institute
Bioengineering
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Heintz, K. A., Mayerich, D., Slater, J. H. Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks. J. Vis. Exp. (119), e55101, doi:10.3791/55101 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

ويحدد هذا البروتوكول مفصل تنفيذ صورة موجهة، القائم على الليزر تدهور هيدروجيل لتصنيع شبكات الموائع الدقيقة المستمدة من الأوعية الدموية جزءا لا يتجزأ من الهلاميات المائية PEGDA. هنا، نحن تصف خلق أقنعة الافتراضية التي تسمح للسيطرة على الليزر الموجهة الصورة؛ وبلمرة ضوئية المنشأ من هيدروجيل PEGDA micromolded، ومناسبة لتصنيع شبكة ميكروفلويديك والضغط يحركها تدفق الرأس. إعداد واستخدام المجهر متحد البؤر المسح بالليزر المتاحة تجاريا يقترن الفيمتو ثانية نابض تي: S الليزر للحث على تدهور هيدروجيل. والتصوير شبكات الموائع الدقيقة ملفقة باستخدام الأنواع الفلورسنت والفحص المجهري متحد البؤر. وتركز جزء كبير من البروتوكول على الإعداد السليم وتنفيذ البرامج المجهر والمجهر الكلي، لأن هذه هي الخطوات الحاسمة في استخدام المجهر التجاري لأغراض التصنيع الموائع الدقيقة التي تحتوي على عدد من تعقيدات. عنصر صورة موجهة من هذه التقنيهه يسمح لتنفيذ مداخن صورة 3D أو 3D نماذج المقدم من المستخدمين، مما يسمح لتصميم ميكروفلويديك الخلاق وتصنيع أنظمة الموائع الدقيقة المعقدة من أي تكوين تقريبا. مع الأثر المتوقع في هندسة الأنسجة، يمكن أن الأساليب المذكورة في هذا البروتوكول تساعد في تصنيع التركيبات microtissue الجزيئية الحيوية المتقدمة لأجهزة الكائن الحي والإنسان على واحد في رقاقة. عن طريق محاكاة معقدة الهندسة المعمارية، وتعرج والحجم والكثافة في الجسم الحي الأوعية الدموية، وعمليات النقل البيولوجية الأساسية يمكن أن تتكرر في هذه التركيبات، مما يؤدي إلى أكثر دقة النمذجة في المختبر الدوائية المخدرات والمرض.

Introduction

نظام الأوعية الدموية، التي تتكون من كل اللمفاوية وcardiovasculature، أشكال شبكات عالية الكثافة التي هي ضرورية لنقل المواد المغذية والأكسجين وإزالة النفايات الأيضية. وفقا لذلك، وخلايا المقيمين في الأنسجة أوعية دموية هي أبدا أكثر من 50-100 ميكرون بعيدا عن سفينة 1. القدرة على الإنجاب في الجسم الحي العمارة الأوعية الدموية في المختبر أمر بالغ الأهمية لنموذج بدقة عمليات النقل في الجسم الحي باستخدام بنيات هندسيا. مع محرك أقراص مؤخرا لتطوير الجهاز على واحد في رقاقة الأجهزة 2 عن الإنتاجية العالية المخدرات فرز 3،4 والنمذجة المرض 5،6 والأساليب لإنشاء شبكات الموائع الدقيقة أن ألخص في الجسم الحي تشبه النقل في الهلاميات المائية الاصطناعية أو الطبيعية ورسم اهتماما كبيرا. لتعزيز تقليد الطبيعة من microtissues المستخدمة في هذه الأجهزة، قمنا بتطوير، القائم على الليزر طريقة تدهور هيدروجيل موجهة الصورة التي تستخدم ثلاثة dimensiona-مداخن ل (3D) صورة الأوعية الدموية الأصلي كقوالب لتوليد شبكات الموائع الدقيقة المستمدة من الأوعية الدموية جزءا لا يتجزأ من PEGDA الهلاميات المائية 7. ويحدد هذا البروتوكول استخدام المتاحة تجاريا متحد البؤر المجهر الليزر المسح مجهزة ليزر الفيمتو ثانية نابض لافتعال، وشبكات الموائع الدقيقة الجزيئية الحيوية المشتقة من الأوعية الدموية في الهلاميات المائية PEGDA عبر والتدهور القائم على الليزر الموجهة الصورة.

وتشمل النهج الحالية لfluidize الهلاميات المائية تحريض vasculogenic 8-10 أو تقنيات 10-12 خلية البطانية التجميع الذاتي والتصنيع الدقيق عائية لخلق قنوات محددة مسبقا لتبطنن 13-16. في حين الشبكات الذاتي تجميعها ألخص كثافة وبنية معقدة من الأوعية الدموية الدقيقة، فإنها غالبا ما تكون أكثر نفاذية مما كانت عليه في الجسم الحي شبكات 11،17،18، والذي قد يكون مشكلة في نقل نماذج لتطبيقات فحص المخدرات. تتكون شبكات الذاتي تجميعها من physiologذات الصلة ically، السفن الشعرية الحجم، ولكنها يمكن أن يكون من الصعب على الاندماج مع تدفق السوائل السائبة نتيجة لضيق في توليد السفن الكبيرة، شرين الحجم. حيث لا يوجد السيطرة المباشرة على تجميع هذه الشبكات، يمكن أن الهندسة المعمارية النهائية تختلف من عينة لأخذ العينات، مما يجعل من الصعب إنتاج مرارا الشبكات مع نفس خصائص تدفق ونقل السوائل.

لتوليد 3D، شبكات الموائع الدقيقة جزءا لا يتجزأ من هيدروجيل مع هندسة قابلة للتكرار والهندسة المعمارية واضحة المعالم، وضعت عددا من تقنيات التصنيع الدقيق، بما في ذلك تجميع وحدات 13، 3D الطباعة المواد الأضاحي 16، المباشر والكتابة التجميع 14، وطباعة احادي 15. تطبيق هذه الأساليب، والهندسة المعمارية الموائع الدقيقة، وبالتالي السوائل تدفق ونقل الخصائص، يمكن أن تكون ملفقة مرارا وتكرارا في العديد من التركيبات. والقيد الرئيسي من هذه الطرق، ومع ذلك، هو عدم القدرة على خلق ستوكاتشبكات luidic مع ميزات الشعرية الحجم، 4-10 ميكرون 19. وغالبا ما تقتصر معظم تقنيات التصنيع الدقيق لميزات تتراوح 150-650 ميكرون في القطر 13،16. بعض التقنيات الموجودة قادرة على توليد الشبكات الهرمية مع القنوات عبر نطاق القطر واسعة، 10-300 ميكرون لتجميع المباشر والكتابة 14، و18-600 ميكرون للطباعة احادي 15، لكنها محدودة في قدرتها على توليد شبكات كثيفة أو لإنتاج شبكات ميكروفلويديك متعددة على مقربة ضمن بناء واحد 7.

للتغلب على بعض من هذه القيود، قمنا بتطوير، تقنية تدهور هيدروجيل القائم على الليزر الموجهة الصورة التي تسمح تلفيق للتكرار من المحاكاة البيولوجية، شبكات الموائع الدقيقة الهرمية أن ألخص بنية في الجسم الحي الأوعية الدموية الدقيقة. للقيام بذلك، وهو 790 نانومتر، 140 الفيمتو ثانية (FS) ليزر نابض العاملة في 80 ميغاهيرتز هو-الممسوحة ضوئيا النقطية طن المطلوب المواقع 3D داخل هيدروجيل، على النحو المحدد من قبل صور في الجسم الحي الأوعية الدموية. نحن نفترض أن عملية التحلل تعمل من خلال انهيار الليزر التي يسببها البصرية من الماء، وتشكيل البلازما الناتجة، وتوسيع thermoelastic السريع لاحق من المياه، وتدهور المحلي للهيدروجيل مع توسع المياه 20. تختلف هذه الآلية قليلا من التدهور القائم على الليزر من الهلاميات المائية المعتمدة على البروتين 21-24. على عكس PEGDA، والتي لديها multiphoton المقطع العرضي المنخفض، والبروتينات وغالبا ما يكون multiphoton عبر قسم كبير وبالتالي المتدهورة عن طريق multiphoton الناجم عن امتصاص الكسر الكيماوية 23. لتوليد شبكات الموائع الدقيقة الموجهة صورة، يتم التحكم في مصراع الليزر عن طريق أقنعة الافتراضية المشتقة من صورة، والتي تتكون من فسيفساء من المناطق ذات الاهتمام 9 التي تحدد بنية الموائع الدقيقة. باستخدام هذا النهج، لقد أثبتنا القدرة على افتعال 3D المشتقة من الأوعية الدموية microfluid بيوميمتيكشبكات جيم، التي تلخص العمارة كثيفة ومضنية في الجسم الحي الأوعية الدموية، من أجل السيطرة محليا مسامية الهلاميات المائية عن طريق تغيير كمية الطاقة التي سلمت خلال التدهور. وكان علينا أيضا قادرة على توليد شبكتين ميكروفلويديك المستقلة التي تتشابك على مقربة (15 ميكرون)، ولكن أبدا الاتصال مباشرة 7. لقد أثبتنا أيضا القدرة على endothelialize microchannels الليزر المتدهورة من خلال وظيفة تدهور functionalization مع إنتغرين ligating تسلسل الببتيد، أرجينين، جليكاين-الأسبارتيك حمض سيرين (RGDS)، لتعزيز التصاق الخلايا البطانية وتشكيل التجويف 7.

مع هذا البروتوكول، ويتم توليد شبكات الموائع الدقيقة المعقدة في الهلاميات المائية PEGDA الممكن عبر والتدهور القائم على الليزر الموجهة صورة باستخدام مجهر المتاحة تجاريا يمكن الوصول إليها في العديد من الجامعات. كما قاد عملية التحلل بواسطة أقنعة الرقمية، الظاهري، وهذا فابريكاتقنية نشوئها وهي قابلة للتصميم الإبداعي شبكات الموائع الدقيقة، مما يتيح استخدامها في مجموعة متنوعة واسعة من التطبيقات. ونحن نتوقع أن الطريقة الموصوفة هنا سيكون الأكثر فائدة في تصميم بيوميمتيك أجهزة الكائن الحي والإنسان على واحد في رقاقة قادرة على تكرار عمليات النقل البيولوجية الهامة في نماذج النقل المخدرات 2. قد يكون هذا الأسلوب تلفيق أيضا من مصلحة لتوليد في المختبر نماذج المرض، بما في ذلك سرطان خبيث 5،6 ونماذج حاجز الدم في الدماغ 25. كما سبق استخدامها على الليزر تدهور هيدروجيل لخلق مسارات لتوجيه نمو الخلايا العصبية 21-23، يمكن أن تثبت تمديد صورة موجهة لهذه التقنية مفيدة في استراتيجيات هندسة الأنسجة المتطورة لوضع الخلايا في الترتيبات المكانية 3D المعرفة من قبل المستخدم.

Protocol

1. توليد أقنعة الظاهري

ملاحظة: كومة صورة 3D من الأوعية الدموية الدقيقة مخ الفأر تم اختيار كنموذج ميكروفلويديك لهذا البروتوكول، بعد أن تم اختيارها من مجموعة بيانات أكبر من ذلك بكثير تحتوي على صور من الأوعية الدموية الدقيقة مخ الفأر كامل. تم الحصول على الصور الاوعية الدموية الدقيقة عبر ذو حدين سكين المجهر (KESM) 26، تتوفر علنا البيانات الاوعية الدموية الدقيقة مماثلة من خلال KESM ماوس أطلس الدماغ 28.

  1. فتح الصورة برامج معالجة 29 ومفتوحة واقتصاص كومة 3D صورة TIF من الأوعية الدموية الأصلي بحيث الشبكة ميكروفلويديك المطلوب، إلى أن تتولد داخل هيدروجيل، يناسب في 450 ميكرون س 450 ميكرون × 1.5 مم (x بواسطة سنويا بحلول ض) نافذة. للقيام بذلك، ورسم مربع حول المنطقة المطلوب وانقر فوق "صورة" → "المحاصيل". إزالة شرائح في ض الاتجاه من خلال النقر على "صورة" → "تكرار" واكتب في شريحة المطلوبنطاق.
    ملاحظة: هذا يضمن أن السمات المرغوبة تناسب داخل مجال الرؤية (x بواسطة ص) (531.2 X 531.2 ميكرون عند استخدام 20X (NA1.0) هدف غمر المياه مع حجم الإطار من 2884 س 2884 بكسل وزووم 0.8 مع ليزر المسح المجهر متحد البؤر) والمسافة العمل (ض) من 20X (NA1.0) الهدف الغمر بالماء. إذا لم يكن معروفا، ومجال الرؤية لأنظمة أخرى يمكن تحديدها من خلال الحصول على صورة مع هدف والإعدادات المطلوبة.
  2. وتناوب على كومة الصورة بحيث يتم محاذاة الميزات في المقام الأول مع اتجاه المسح النقطية، أو الأشعة الاتجاه، بالنقر على "صورة" → "تحويل" → "تدوير". هذا يقلل من الوقت اللازم لتصنيع.
  3. تسلق كومة صورة اقتصاص بحيث المباريات حجم بكسل أو تتجاوز الإعدادات المستخدمة لتدهور على المجهر متحد البؤر (0.184 ميكرون / بكسل عند استخدام 20X (NA1.0) هدف غمر المياه مع حجم الإطار من 2،884 من 2،884 بكسلوالتكبير من 0.8). للقيام بذلك، انقر فوق "صورة" → "ضبط" → "الحجم"، واكتب في "2446" ل "عرض" (أي 450 ميكرون، أو حجم صورة مقسومة على 0.184 ميكرون / بكسل).
  4. عتبة / binarize كومة صورة عن طريق كتابة "السيطرة + + التحول تي". إلغاء "الخلفية المظلمة"، وانقر على "تطبيق" → "موافق". إنهاء عملية بالنقر على "صورة" → "جداول بحث" → "عكس طرفية".
  5. (هو شفرة المصدر متاحا في المواد التكميلية من المخطوطة المشار إليها) باستخدام خوارزمية مخصصة في برنامج البرمجة تناسب binarized (أبيض) ملامح مع فسيفساء من الأشكال الرباعية عالية بكسل واحدة موازية لاتجاه المسح النقطية (س -direction) لتوليد المناطق ذات الاهتمام (رويس) التي توجه موقف الليزر ومصراع 30، 31، <سوب> 32.
    ملاحظة: خوارزمية مخصصة 9 بتحويل كل طائرة الفردية في كومة صورة TIF إلى ملف المتلازمة.
  6. تغيير امتداد الملف من الملفات RLS إلى .OVL لاستخدامها خلال فترة التدهور.

2. تكوين الليزر مسح متحد البؤر مجهر

ملاحظة: في حين أن غيرها من المجاهر المسح الضوئي ليزر مجهزة ليزر نابض يمكن استخدامها، والإعدادات وبروتوكول هنا وصف استخدام المجهر الضوئي ليزر (مغلق) جنبا إلى جنب مع البرامج الخاصة به.

  1. مع متحد البؤر المجهر الليزر المسح على، فتح البرنامج المجهر، وانقر على "بدء تشغيل النظام." تحديد الهدف "W خطة-امزيغ 20x و/ 1.0 DIC VIS-IR M27 75MM" في علامة التبويب "المحافظة".
  2. وضع "هيدروجيل التصور" تكوين
    1. في علامة التبويب "الاستحواذ"، تأكد من تحديد خط ليزر (514 نانومتر الأرجون ليزر) وعلى في يندو "ليزر"ث. ملاحظة: يتم استخدام هذه القناة لصورة هيدروجيل عبر مضان يوزين Y لأغراض التوجه 7.
    2. في إطار "برنامج الإعداد التصوير"، تعيين "وضع" إلى "وضع القناة"، تعيين "تبديل تتبع كل" إلى "الإطار"، وحدد "Track1".
    3. في إطار "مسار الضوء"، حدد فقط كاشف الفلورسنت CH1، مع مجموعة من 516-735 نانومتر. الخائن الرئيسي شعاع (MBS) 458/514 مرشح على خط الضوء المرئي. ولوحة في خط ضوء غير مرئي. إلغاء كاشف أنبوب مضخم مشرق الميدان، "T-PMT".
    4. في إطار "الوضع اكتساب"، تحقق من تحديد الهدف الصحيح وتعيين "وضع المسح الضوئي" إلى "إطار" و "حجم الإطار" إلى "2884" في X و Y، و "الخط الخطوة" إلى "1" و"عدد متوسط" إلى "1" و "متوسط ​​الوضع" إلى "الخط" و "متوسط ​​الطريقة" ب "المتوسط"، و "عمق بت "إلى" 16 بت "، و" اتجاه "إلى" <-> "لمسح ثنائي الاتجاه.
    5. في إطار "الوضع اكتساب"، تعيين "سرعة" كما هو مطلوب وضبط "كور X" و "Y" إلى "0.05" أو ضبط عند الضرورة للمجهر خاص المستخدمة. إلغاء "تقرير التنمية البشرية".
    6. في إطار "الوضع اكتساب"، تأكد من أن "منطقة المسح الضوئي" يعرض "حجم الصورة" من "531.2 ميكرون س 531.2 ميكرون" و "بكسل الحجم" من "0.18"، مع "تكبير" لتعيين "0.8" . تعيين كافة القيم الأخرى "مسح المنطقة" الى نقطة الصفر.
    7. في إطار "القنوات"، حدد "Track1"، كما كشف الفلورسنت CH1. خط حدد الليزر "514"، مع قوة في المئة من "10.0"، و "الثقب" من "1AU"، وهي الأولي "كسب (ماجستير)" من "800"، و "ديجيتال أوفست" "0"، و "كسب الرقمي" لل4؛ 1 ".
      ملاحظة: ضبط هذه الإعدادات حسب الضرورة للمجهر خاص المستخدمة.
    8. حفظ هذا التكوين باسم "هيدروجيل التصور".
  3. تحديد تكوين "قناة تشكيل"
    1. في علامة التبويب "الاستحواذ"، تأكد من أن خط ليزر (790 نانومتر 140 خ نابض تي: S الليزر) محددا وعلى في إطار "ليزر". ضبط "GDD تصحيح" إلى "4000" لانتاج الطاقة القصوى في 790 نانومتر.
    2. تعيين نافذة "إعداد التصوير"، كما هو موضح في الخطوة 2.2.2.
    3. في إطار "مسار الضوء"، وضمان أن يتم اختيار أي كاشفات الفلورسنت، مع MBS 458/514/561/633 تصفية على خط الضوء المرئي وMBS 760+ تصفية على خط ضوء غير مرئي. إلغاء كاشف أنبوب مضخم مشرق الميدان، "T-PMT".
    4. في إطار "الوضع اكتساب"، تحقق من سرد الهدف الصحيح. تعيين "سرعة" إلى "3"وكافة الإعدادات الأخرى كما هو موضح في الخطوة 2.2.4.
    5. في إطار "القنوات"، حدد "Track1"، كما كشف عن T-PMT. حدد خط ليزر "790"، مع قوة في المئة من "100.0"، وهي الأولي "كسب (ماجستير)" من "800"، و "ديجيتال أوفست" "0"، و "كسب الرقمية" "1" .
    6. في إطار "المرحلة"، الصفر المرحلة بالنقر على "مجموعة الصفر". بمناسبة موقع بالنقر على "مارك". هذا أمر بالغ الأهمية للتحميل أقنعة الافتراضية إلى الماكرو المجهر في الخطوة 3.
    7. في إطار "السلاسل الزمنية"، تعيين "دورات" ك "1" و "الفاصل الزمني" ك "0".
    8. في إطار "بليتش"، تحقق "ابدأ تبييض # بالاشعة بعد" مربع وضعه إلى قيمة "0 من 1". حدد "سرعة المسح الضوئي مختلفة"، بقيمة "3" (المقابلة إلى وقت بكسل يسكن من 8.96 ميكرو ثانية / بكسل). حدد "BL آمنكل لGaAsP ".
    9. في قسم خط ليزر من النافذة "بليتش"، حدد خط ليزر 790 وتعيين قوة في المئة إلى "100.0". ترك كل المربعات الأخرى في إطار التبييض ألغى اختيار. حفظ الإعدادات التبييض في إطار "بليتش".
    10. حفظ هذا التكوين باسم "تكوين القناة".
      ملاحظة: "Z-ستاك"، "المناطق"، "التركيز"، والنوافذ "المرحلة" مهمة أيضا لهذا البروتوكول، ولكن لا بد من تعيين أو تعديلها خلال التكوين الأولي.

3. إنشاء وصفة وتحميل أقنعة الظاهري إلى البرامج مجهر وماكرو

  1. مع الليزر مجهر المسح مبائر يزال قيد التشغيل والبرمجيات المجهر زالت مستمرة، حدد فقط "المناطق" نافذة (بجانب زر "ابدأ تجربة") في تكوين "قناة تشكيل".
  2. للتأكد من أن الأقنعة تحميل إلى الماكرو المجهر الصحيحلاي، تعيين السلطة في المئة في "القنوات" نافذة إلى "0.2" و "السرعة" في "الوضع شراء" نافذة على "8"، وانقر على "عض" في الجانب الأيسر العلوي من الشاشة.
  3. تأكد من أن حجم الصورة لا يزال "531.2 ميكرون س 531.2 ميكرون"، مع حجم بكسل "0.18"، في "معلومات" علامة التبويب صورة. إذا كانت هذه القيم ليست صحيحة، والتحقق من "حجم الإطار" والقيم "تكبير" مرة أخرى.
  4. الحرجة: تأكد من أن مواقع X و Y في إطار "المرحلة" وركزت وأن موقف يتم وضع علامة قبل فتح الماكرو المجهر. الرجوع إلى الخطوة 2.3.6.
  5. لفتح المجهر ماكرو نوع "البديل + F8"، انقر فوق "تحميل"، وحدد الإصدار الصحيح. انظر التفاصيل في قائمة المواد الخاصة / معدات. وهناك قائمة طويلة من وحدات الماكرو الفرعية فتح في إطار "السيطرة الكلية".
  6. في إطار "مكافحة ماكرو"، انقر فوق "تشغيل" لفتح ميكرoscope ماكرو، ثم قم بإغلاق النافذة "السيطرة الكلية".
    ملاحظة: البديل إصدارات الماكرو المجهر قد لا تكون متوافقة مع تدهور هيدروجيل القائم على الليزر باستخدام هذا البروتوكول.
  7. في "إنقاذ" علامة التبويب الماكرو المجهر، توفير التعسفي "اسم ملف قاعدة"، اختر "إخراج ملف واحد"، واختار مجلد "الملفات المؤقتة". تعيين "مجلد Temp فتح" لموقع "1"، حدد "واحد مجلد صورة المؤقتة"، واسم وصفة في "مخزن / تطبيق وصفة" مع "قائمة نذكر المواقع" المختارة. انقر على "مخزن" لإنشاء البداية وصفة.
  8. في "اكتساب" علامة التبويب الماكرو المجهر، تأكد من أن "تكوين المسح الضوئي" يطابق الاسم الذي يطلق على برامج التكوين المجهر بتعيينه في الخطوة 2.3. تعيين "لا الزمن نقاط ضمن كتلة" إلى "1"، مع "الفاصل الزمني" "0". تأكد من أن "Z ملحوظ - الأعلى للZ STAC(ك) "هو تسليط الضوء الأخضر. جميع الإعدادات الافتراضية الأخرى على ما يرام كما هي.
  9. في "التوقيت" علامة التبويب الماكرو المجهر، تأكد من أن "انتظر تأخير" هو تسليط الضوء الأخضر، تعيين "التكرار تجربة" و "التكرار المجموعة" ب "1" و "الانتظار الفاصل الزمني قبل كتلة في الموقع الأول فقط" إلى "0" . كافة الإعدادات الافتراضية الأخرى على ما يرام كما هي.
    ملاحظة: "المجموعة التكرار" (وليس "التكرار تجربة") المربع هو واحد حيث يمكن تعيين عدد مرات مسح الليزر على منطقة (أي تكرار وصفة).
  10. في "Z قائمة" علامة التبويب الماكرو المجهر، يتم تحديد الطائرات تدهور في زي الاتجاه. تعيين ض تباعد، "DZ"، إلى "1 ميكرون"، مع "عدد من المراكز" مجموعة لتتناسب مع عدد من الأقنعة افتراضية لاستخدامها.
  11. انقر على زر "إنشاء Z المكدس" لجعل "قائمة Z" تظهر في القائمة المنسدلة "ليشارع من المواقع "نحو الجزء السفلي من الإطار. تأكد من أن عدد من المواقع وض التباعد صحيحة وأن مواقع X و Y وركزت.
    ملاحظة: إذا لم تكن كذلك، لا تخزن وصفة. إغلاق الماكرو المجهر وكرر الخطوة 2.3.6 قبل إعادة فتح الماكرو المجهر ووضع الوصفة مرة أخرى.
    ملاحظة: بدلا من وجود 100 أقنعة متباعدة من قبل 1 ميكرون لكل منهما، على سبيل المثال، يمكن أن يكون من المفيد أن يكون 50 الأقنعة، كل العاملين مرتين ومتباعدة من قبل 1 ميكرون، للحصول على هيكل ميكروفلويديك يعادل، كما تحميل أقنعة الفردية إلى الماكرو المجهر يمكن أن تستغرق وقتا طويلا.
  12. في "بليتش" علامة التبويب الماكرو المجهر، كل الأقنعة يجب تحميل والمتطابقة مع موقع مرقمة محدد في "قائمة من المواقع". للبدء، حدد خانة "بليتش" وضمان "تكوين". مباريات اسم إعدادات التبييض في إطار "بليتش" في الشاشة الرئيسية البرمجيات المجهر (الرجوع إلى الخطوة 2.3.8). مجموعة "انتظر تأخير بعد بليتش" إلى "0"، قم بإلغاء تحديد "بقعة"، وترك "العائد على الاستثمار" فارغة.
  13. لا تغير أي شيء في "الموقع"، "بلاطة"، "الشبكة"، "ضبط تلقائي للصورة"، "بنات"، و "خيارات" علامات التبويب من الإعدادات الافتراضية.
  14. لتحميل أقنعة لالماكرو المجهر، حدد فقط "المناطق" نافذة في البرنامج المجهر وفتح "بليتش" علامة التبويب الماكرو المجهر. في إطار "المناطق"، انقر فوق "تحميل" وحدد ملف .OVL للقناع في الجزء السفلي من ض المكدس تتعرض للتدهور.
    ملاحظة: الموقع الأول في قائمة "Z" هي الجزء السفلي من ض المكدس، والماكرو المجهر يعمل طريقها إلى الجزء العلوي من ض المكدس، أو هيدروجيل.
  15. عندما تظهر قائمة رويس في إطار "المناطق"، انقر فوق زر السهم لعرض رويس القناع داخل مجال الرؤية (على الصورة قطعت في الخطوة 3.2). تحقق من أن رويس تناسب داخلمجال الرؤية.
  16. على حفظ القناع تحميل في الماكرو المجهر، وإعطاء قناع اسم ورقم في مربع "إضافة منطقة الحالية إلى قائمة العائد على الاستثمار" في علامة التبويب "بليتش"، ثم انقر فوق الزر "إضافة منطقة الحالية إلى قائمة العائد على الاستثمار". سيظهر اسم ورقم في "العائد على الاستثمار" القائمة المنسدلة مع أي أقنعة أخرى (بما في ذلك الأقنعة عن غيرها من الوصفات التي تم إنشاؤها مسبقا). حذف القناع في نافذة "المناطق" في البرنامج المجهر.
  17. كرر الخطوات من 3.14 و 3.16 لتحميل وحفظ كل الأقنعة إلى الماكرو المجهر.
  18. تعيين أقنعة محملة على كل في الموقع Z، تسليط الضوء على موقف (1) في "قائمة المواقع" المنسدلة. تحديد العائد على الاستثمار المناسب من "العائد على الاستثمار" القائمة المنسدلة. تأكد من تحديد خانة "بليتش" في الجزء العلوي من "بليتش" علامة التبويب في الماكرو المجهر.
  19. كرر الخطوة 3.18 لجميع المناصب في القائمة المنسدلة "قائمة المواقع"، ثم انقر فوق "مخزن" على و# 34؛ توفير "علامة التبويب لإنقاذ صفة في شكله النهائي.

4. Photopolymerizing على PEGDA هيدروجيل

  1. جعل العقيمة HEPES مخزنة المالحة (HBS) مع ترايثولامين (TEOA)
    1. في كوب 1-L، إضافة 500 مل من DI H 2 O. مع بقضيب، وإثارة في 2.922 غرام من كلوريد الصوديوم، 1.196 غرام من HEPES، و 7.5 مل من TEOA في غطاء الدخان.
    2. ضبط درجة الحموضة إلى 8.3 مع 1 N محلول هيدروكسيد الصوديوم بإضافة قطرة قطرة مع ماصة باستور.
    3. تصفية العقيمة الحل من خلال 0.2 ميكرون فراغ الكأس الترشيح في زجاجة وسائل الإعلام الزجاج تعقيمها 500 مل. قسامة وتخزينها في 4 درجات مئوية.
  2. إرفاق حلقة من مادة لاصقة على الوجهين مع دعم لالمتخصصة طبق 60 ملم بيتري مع خفض حفرة 20 ملم من أسفل. ترك الدعم على عصابة لاصقة، اضغط على أي فقاعات الهواء من بين طبق بتري ولاصقة.
  3. إعداد المواد. جلب 33 توليفها 3.4 كيلو دالتون PEGDA من -80 درجة مئوية الثلاجة واتركه لتصل إلى درجة حرارة الغرفة. بدوره على مصدر الضوء الأبيض لا يقل عن 15 دقيقة قبل photopolymerizing الهلاميات المائية.
  4. في غطاء الدخان، إضافة 1 مل من HBS مع TEOA ل، 2 مل أنبوب الطرد المركزي العنبر المغطاة احباط (التي تستخدم لمنع التعرض للضوء من photoinitiator، يوزين Y). إضافة 10 ميكرولتر من 1 ملم يوزين Y ثنائي الصوديوم والملح في دي H 2 O.
  5. في غطاء الدخان، استخراج كمية صغيرة من 1-فينيل-2-pyrrolidinone (NVP) في دورق زجاجي مع ماصة باستور. من هذا الحجم، ماصة 3.5 ميكرولتر من برنامج المتطوعين الوطنيين في أنبوب الطرد المركزي العنبر مع مسح ميزانية الأسرة، TEOA، وY. يوزين
  6. في، 2 مل أنبوب الثاني العنبر الطرد المركزي المغطاة احباط (التي تستخدم لمنع تنشيط ضوئي المخطئين من الحل prepolymer)، إضافة 10 ملغ من 3.4kDa PEGDA. إضافة 0.2 مل من مسح ميزانية الأسرة، TEOA، يوزين Y، حل NVP ل5٪ ث / ت PEGDA حل قبل البوليمر. يذوب تماما الدوامة حتى PEGDA. باستخدام السلطة متر وكشف عصا، وضبط شدة لى الأبيضمصدر GHT إلى 95 ميغاواط.
  7. بناء بولي (dimethylsiloxane) (PDMS) القالب
    1. بناء قالب PDMS 7 على سطح أكبر (الزجاج والنسيج البوليسترين طبق ثقافة) لسهولة التعامل وتجميع قوالب بحيث الهلاميات المائية مصبوب تناسب ضمن دائرة قطرها 20 ملم.
    2. لتوليد هيدروجيل مستطيل الشكل بسمك 500 ميكرون، ووضع اثنين PDMS الفواصل 500 ميكرون سميكة على سطح PDMS لإنشاء اثنين من حواف هيدروجيل محددة.
    3. تشمل 300 ميكرون PDMS هل لإضفاء من 300 ميكرومتر في عمق سطح هيدروجيل، وهو أمر مفيد لإدخال السوائل.
  8. ماصة 60 ميكرولتر من 5٪ ث / ت PEGDA حل قبل البوليمر داخل القالب PDMS. يجب الحرص على عدم إدخال أي فقاعات خلال pipetting ل.
  9. مركز ووضع [3- (methacryloyloxy) بروبيل] trimethoxysilane (TMPSA) functionalized قطرها 40 مم، # 1.5 ساترة الزجاج على رأس من الحل. تأكد من أن coverslالملكية الفكرية يقوم على الفواصل PDMS 500 ميكرون. سوف هيدروجيل السندات إلى ساترة methacrylated ومنع هيدروجيل من العائمة في الحل.
  10. ضع PDMS، PEGDA حل قبل البوليمر وساترة والتجمع تحت مصدر الضوء الأبيض لمدة 3 دقائق.
  11. تدفق DI H 2 O بين العفن وساترة لفصل هيدروجيل من PDMS. شطف هيدروجيل مع DI H 2 O. تجفيف حواف ساترة مع النسيج المختبر. يجب الحرص على عدم لمس أو ماء الفتيل من هيدروجيل.
  12. بعد إزالة الدعم عن لاصق، والتمسك ساترة للطبق بيتري استعداد وبلطف إزالة فقاعات الهواء من بين لاصقة والزجاج. غمر هيدروجيل في طبق بيتري مع DI H 2 O.
    ملاحظة: قالب PDMS يمكن إعادة استخدامها لجعل الهلاميات إضافية إذا تشطف DI H 2 O، والمجففة مع النيتروجين، وأبقى خالية من الغبار.

5. شبكة ميكروفلويديك المستمدة الأوعية الدموية، بتلفيقالصورة عن طريق تدهور القائم على الليزر

  1. مع المجهر متحد البؤر ليزر المسح الضوئي والبرمجيات المجهر على، تحديد الهدف "W خطة-امزيغ 20x و/ 1.0 DIC VIS-IR M27 75MM" في علامة التبويب "المحافظة". في علامة التبويب "الاستحواذ"، تأكد من خطوط اللازمة ليزر (514 نانومتر الأرجون ليزر و 790 نانومتر 140 خ نابض تي: S ليزر) وعلى واستعد.
  2. إعداد هيدروجيل لتشكيل قناة مدخل
    1. تناسب هيدروجيل وطبق بيتري على إدراج المسرح ووضع إدراج مرحلة على المسرح المجهر. ملء طبق بيتري مع لا يقل عن 5 مل من DI H 2 O. مركز هيدروجيل وكذلك ميزات بالعين قبل خفض الهدف الغمر بالماء في O. DI H 2
      ملاحظة: لا سحق هيدروجيل مع الهدف، وهما ينبغي أن لا تلمس!
    2. العثور على هيدروجيل، والتحول إلى تكوين "هيدروجيل التصور" من الخطوة 2.2. انقر على "لايف" لتحويل خط ليزر على وجلب الالبريد أقرب إلى الهدف هيدروجيل حتى إشارة يوزين Y (الكشف عنها بواسطة كاشف الفلورسنت CH1) من الجزء العلوي من هيدروجيل يمكن أن ينظر إليه.
      ملاحظة: للعثور على هيدروجيل بسهولة، وقوة في المئة ويمكن زيادة أو يمكن فتح الثقب. مرة واحدة ويركز الهدف على هيدروجيل، ومع ذلك، إسقاط السلطة في المئة لحماية كاشف الفلورسنت وخفض الثقب إلى 1AU لتجنب oversaturation للكشف وإيجاد بدقة السطح هيدروجيل.
    3. في إطار "المرحلة"، بمناسبة مواقع أعلى وأسفل هيدروجيل ومن قاع البئر.
      ملاحظة: إن القيم ض هنا تساعد في تحديد سمك هيدروجيل وعمق البئر.
    4. استخدم عصا التحكم للتحرك في X و Y للعثور على حافة البئر. وضع هيدروجيل على يمين الشاشة، مع البئر في الجهة اليسرى، أو العكس بالعكس. السماح للهيدروجيل لملء أي أكثر من ثلثي مجال الرؤية.
    5. إسقاط ررانو التركيز أسفل 150 ميكرون في هيدروجيل من خلال وضع "الخطوة الحجم" إلى "150" في إطار "التركيز" والنقر على السهم لأسفل بجانب مربع "Z-الوظيفة". كرر الخطوة 5.2.4، إذا لزم الأمر.
      ملاحظة: س، ص، و z موقف مدخل تعتمد فقط على تصميم أقنعة الظاهري.
    6. الحرجة: صفر X و Y الموقع في إطار "المرحلة"، وحذف جميع المواقع الأخرى ملحوظ، ووضع علامة فقط هذا الموقع.
      ملاحظة: إذا لم يتم تنفيذ هذه الخطوة، سوف الماكرو المجهر لن يعيد بشكل صحيح المواقع على حد وصفه المحفوظة مسبقا، ولن تدهور هيدروجيل في الموقع المطلوب.
  3. تشكيل قناة مدخل
    1. "عض" صورة ورسم المنطقة المستطيلة والتي ستكون مدخل لشبكة الأوعية الدموية باستخدام زر مستطيل في إطار "المناطق".
      ملاحظة: تأكد جزء متأكدا من المنطقة يمتد من داخل البئر لضمان عشروه مدخل ربط البئر إلى شبكة الأوعية الدموية.
    2. بجانب العائد على الاستثمار ولدت في إطار "المناطق"، حدد "شراء" وإلغاء "بليتش" و "تحليل".
    3. حفظ "هيدروجيل التصور" التكوين، قم بإلغاء تحديد "المناطق"، وتغيير لتكوين "قناة تشكيل"، التي أنشئت في خطوة 2.3. في تكوين "قناة تشكيل"، حدد "المناطق" مرة أخرى.
      ملاحظة: عند التبديل بين "هيدروجيل التصور" وتكوينات "قناة تشكيل"، تأكد من إلغاء تحديد المناطق في الجزء العلوي الأيسر من الشاشة. في بعض الأحيان التحجيم من المناطق يمكن أن تتغير بشكل غير متوقع بين تكوينات إذا لم يتم ذلك.
    4. في تكوين "قناة تشكيل"، تأكد من أن يتم اختيار فقط "المناطق" و "Z-ستاك". في إطار "Z-ستاك"، انقر فوق الزر "مركز" في الجزء العلوي ثم "المركز" بعقبعلى فوق "الأوفست" لتعيين مركز ض المكدس كما الحالي Z-الموقف. اعتمادا على كيفية كبيرة يحتاج مدخل أن يكون، تعيين عدد من "شرائح" مع "الفاصل الزمني" "1". سوف يتم عرض حجم Z كومة تحت "المدى".
    5. تحقق من أن يتم تعيين "سرعة" في إطار "الوضع شراء" إلى "3" وأنه تم تعيين "نسبة الطاقة" في إطار "قنوات" إلى "100". حفظ التكوين وانقر على زر "ابدأ تجربة".
      ملاحظة: ليس مطلوبا الماكرو المجهر في انحطاط نفس الشكل بسيط على الطائرات متعددة، حيث يقوم هنا لإنشاء قناة مدخل. مطلوب الماكرو فقط عندما المهينة مناطق مختلفة على كل طائرة على حدة، ويتم استخدامه لتخزين أقنعة الافتراضية من خلال وصفة.
    6. لتصور هيدروجيل خلال التدهور، إما زيادة "الربح (ماجستير)" في إطار "قنوات" اذا كانت المنطقة في ركان مجال الرؤية هو أسود، أو يقلل من "كسب (ماجستير)" إذا كانت المنطقة البيضاء.
      ملاحظة: تشكيل فقاعة هنا هو مؤشر الليزر التي يسببها تدهور هيدروجيل.
    7. للحط من مدخل عدة مرات بدلا من مرة واحدة فقط، وضبط "دورات" في إطار "السلاسل الزمنية".
    8. في تكوين "هيدروجيل التصور"، انقر فوق "العيش" للتأكد من أن مدخل تشكلت.
  4. إعداد هيدروجيل لتوليد شبكة ميكروفلويديك
    1. في إطار "المناطق"، تحميل أي ملف .OVL من ض المكدس من أقنعة الافتراضية وانقر فوق زر السهم لرؤية رويس في مجال الرؤية.
    2. انقر على "لايف" للعيش مسح "هيدروجيل التصور" التكوين واستخدام عصا التحكم أو إطار "المرحلة" لوضع هيدروجيل في X و Y، على ان يكون مدخل يربط إلى الموقع الصحيح داخل شبكة الأوعية الدموية.
      ملاحظة: تأكد من أنرويس القناع الظاهري تتداخل قليلا مع مدخل شكلت سابقا.
    3. إسقاط طائرة من التركيز بنسبة 50 ميكرون من السابق تركز Z-الموقع، أو 200 ميكرون من سطح هيدروجيل، وذلك باستخدام "الخطوة الحجم" في إطار "التركيز" والنقر على السهم لأسفل بجوار "Z-الوظيفة "مربع. وسيكون هذا المركز الأول في الماكرو المجهر.
      ملاحظة: المسافة الفعلية للتحرك في الاتجاه ض يعتمد على تصميم الشبكات. تأكد من أن الشبكة المطلوبة لا تتجاوز السطح العلوي أو السفلي من هيدروجيل في زي الاتجاه.
    4. الحرجة: صفر مواقع X و Y في إطار "المرحلة"، وحذف جميع المواقع الأخرى ملحوظ، ووضع علامة فقط هذا الموقع.
      ملاحظة: ستكون هذه هي نقطة البداية في الماكرو المجهر. فإن صفة العمل طريقها نحو العودة الى سطح هيدروجيل.
    5. "عض" صورة في تكوين "هيدروجيل التصور"، وحذف وdeselecر "المناطق"، وحفظ التكوين.
  5. توليد شبكة ميكروفلويديك
    1. تغيير إلى تكوين "قناة تشكيل"، وفقط تحديد "السلاسل الزمنية" ويندوز "التبييض". تحقق من إعدادات "السلاسل الزمنية" ويندوز "التبييض" كما أنها وضعت في البداية في خطوات 2.3.7 و 2.3.8.
    2. تعيين "سرعة" في إطار "الوضع شراء" إلى "8" والسلطة في المئة من خط ليزر إلى "0.2" في إطار "القنوات". حفظ التكوين.
    3. فتح الماكرو المجهر بعد خطوة 3.5. على "إنقاذ" علامة التبويب الماكرو، حدد صفة التي سبق من الخطوة 3 وانقر على "تطبيق".
      ملاحظة: لا انقر فوق "مخزن" أو سيتم الكتابة وصفة!
    4. تحقق من إعدادات على كافة علامات التبويب والتحقق من أن الأقنعة الظاهرية (الملفات .OVL) ما تزال مرتبطة بشكل صحيح مع تيانه Z-المواقع في القائمة المنسدلة. تحقق أيضا أن أول Z-موقع يطابق موقع ملحوظا في إطار "المرحلة" من البرنامج المجهر.
      ملاحظة: Counterintuitively، والموقع الثاني في القائمة المنسدلة يكون جسديا فوق الموقع الأول، كما الماكرو المجهر ستعمل طريقها من الجزء السفلي من هيدروجيل (الأبعد عن الهدف) إلى الجزء العلوي من هيدروجيل (الأقرب إلى موضوعي).
    5. حفظ "قناة تشكيل" التكوين مرة أخرى، ومن ثم انقر فوق "تحديث" في الماكرو المجهر. انقر على "لا" إلى "الكتابة فوق قائمة الموقع الحالية؟"، ثم انقر على زر "البدء" في الماكرو المجهر لبدء صفة.

6. تصور شبكة ميكروفلويديك

  1. لعرض هيدروجيل وشبكة ميكروفلويديك تشكلت بعد تدهور، أغلق الماكرو المجهر. التبديل إلى تكوين "هيدروجيل التصور" لعرض الاشتراكية يوزين Ygnal من هيدروجيل. ستظهر شبكة المتدهورة الظلام.
    ملاحظة: تدهور هيدروجيل لا يمكن تصور أثناء تشغيل الماكرو المجهر.
  2. لعرض شبكة ميكروفلويديك على وجه التحديد، واستخدام "هيدروجيل التصور" التكوين في قوة الليزر أقل لتمكين التصوير من قدم فلوريسئين (FITC) ديكستران -labeled، والتي لديها إشارة أكثر إشراقا من الأم إشارة يوزين Y من هيدروجيل.
  3. قبل إدخال ديكستران fluorescently المسمى، الفتيل الماء من البئر في هيدروجيل باستخدام الأنسجة مختبر. ماصة في 10 ميكرولتر من 5 ملغ / مل 2000 كيلو دالتون FITC المسمى ديكستران في دي H 2 O (قبل تصفيته من خلال مرشح حقنة 0.2 ميكرومتر).
    ملاحظة: استخدم أي ديكستران الحجم 2000 كيلو دالتون أو أكبر لمنع نشر في هلام. إذا التصوير لمدة تزيد عن 30 دقيقة، واستخدام مرحلة حضنت مع الرطوبة 60٪ (أو أعلى) لمنع جفاف هيدروجيل وتبخر الماء من الحل ديكستران FITC المسمى.
  4. إزالة هيدروجيل لالثانية طبق بيتري من مرحلة وبمناسبة طبق بيتري لتمكين الموقع سهل من شبكة الأوعية الدموية تشكلت خلال التجريب في وقت لاحق.

Representative Results

للتدليل على تنفيذ صورة موجهة، القائم على الليزر تدهور هيدروجيل لتوليد شبكة ميكروفلويديك 3D، الأوعية الدموية، اشتقاق، ونحن استخدام كومة صورة 3D من الأوعية الدموية مخ الفأر التي تم الحصول عليها عن طريق ذو حدين سكين المجهر (KESM) 26، 27 . تم تحويل والمنطقة 3D مختارة من مجموعة البيانات الاوعية الدموية الدقيقة الأكبر في سلسلة من أقنعة افتراضية لتشكيل شبكة ميكروفلويديك صورة موجهة، كما هو موضح أعلاه. بعد التصنيع، وperfused شبكة ميكروفلويديك الناتج بمحلول مكون من FITC المسمى، 2000 كيلو دالتون ديكستران وتصويرها عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر. واستخدمت صورة كومة من الأوعية الدموية في الجسم الحي التي تحدد بنية الشبكة (الشكل 1A و C) وشبكة ميكروفلويديك ملفقة (الشكل 1B و D) لتوليد Z-توقعات (الشكل 1A و B) والاداءات 3D (الشكل 1C و د في الجسم الحي الأوعية الدموية. هذه التقنية قابلة للتصنيع الشبكات التي تحتوي على مجموعة واسعة من أقطار. في الشكل 1، تم إنشاؤها قنوات تتراوح 3،3 حتي 28،8 ميكرون في القطر. لاحظ أن بنية مستطيلة أكبر في الجزء العلوي الأيسر من الشكل 1B وفي الزاوية اليسرى من 1D الشكل هو قناة مدخل لإدخال التدفق في الشبكة.

شكل 1
الشكل 1: الأوعية الدموية المستمدة شبكة ميكروفلويديك. سلسلة من أقنعة الافتراضية، والمستمدة من كومة صورة الأوعية الدموية مخ الفأر (A و C)، كانت تستخدم لفابريكاالشركة المصرية للاتصالات شبكة الموائع الدقيقة الجزيئية الحيوية 3D جزءا لا يتجزأ من هيدروجيل PEGDA (B و D) عن طريق والتدهور القائم على الليزر الموجهة الصورة. وقد perfused شبكة ميكروفلويديك مع ديكستران FITC المسمى 2000 كيلو دالتون والتقط عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر. Z-توقعات (A و B) والاداءات 3D (C و D) من الشبكتين تثبت القدرة على توليد شبكات الموائع الدقيقة أن ألخص الكثافة، والتنظيم، والهندسة المعمارية الشاملة في الجسم الحي الأوعية الدموية. السهم (D) يصادف مدخل مستطيل أنشئت لتقديم ديكستران. ويمثل الشريط على نطاق و50 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

قمنا بتنفيذ طريقتين، رؤساء الضغط ومضخات الحقنة، لبدء السائل وانخفاض في هذه الشبكات ميكروفلويديك المضمنة. على سبيل المثال، كانت ملفقة قناة مستطيلة 30 من 30 ميكرون لربط بئرين في هيدروجيل PEGDA micromolded (الشكل 2A)، مع تدفق السوائل مدفوعة عن طريق رئيس الضغط 7. ولدت في اليسار بشكل جيد، ورئيس الضغط التي يسببها تدفق من خلال متناهية وفي البئر على اليمين. في -labeled الشكل 2A، جبهة الأولية من tetramethylrhodamine (TRITC)، 70 كيلو دالتون ديكستران وحظ تتحرك من خلال قناة باستخدام الوقت الفاصل بين المجهري. وفي وقت لاحق، في الشكل 2B، تدفقت قطرها 10 ميكرومتر البوليسترين الفلورسنت المجال من الناحية اليسرى بشكل جيد، من خلال القناة، إلى البئر على اليمين. مع مدة تدفق تسيطر عليها حجم الحاضر السوائل في micromolded جيدا في المدخل، ومعدل التدفق الذي تسيطر عليه من قبل الانحدار الهيدروليكي ولدت بين مدخل ومخرج جيد، ضغط يحركها تدفق رأس في الهلاميات المائية micromolded يوفر طريقة بسيطة لتدفق فيالدرفلة الجديد، من دون الحاجة إلى السكن الخارجي أو ضخ حقنة.

الشكل 2
الشكل 2: ضغط يحركها رئيس التدفق في Micromolded PEGDA هيدروجيل. وقد micromolded PEGDA لتشكيل هيدروجيل تحتوي على بئرين متصلة بواسطة متناهية المضمنة. ولدت رأس الضغط في اليسار جيدا لبدء تدفق TRITC المسمى، 70 كيلو دالتون ديكستران (A1-A3) و 10 ميكرون البوليسترين المجال (B1-B3) من خلال 30 من 30 ميكرون قناة مستطيلة من بئر واحد ل آخر. ويمثل الشريط على نطاق و50 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

بدلا من ذلك، لتوليد تدفق السوائل ثابت داخل شبكات الموائع الدقيقة، حقنة مدفوعة مضخة ومنخفضة يمكن أن تبدأ من قبل photopolymerizing هيدروجيل داخل جهاز ميكروفلويديك الثانوي مع مدخل ومخرج الموانئ لضخ حقنة تفاعل. في الشكل 3A، ويظهر ذلك، جهاز ميكروفلويديك قبل ملفقة المتاحة تجاريا مع فرقة 1 ملم من هيدروجيل photopolymerized عبر عرض الجهاز 7. وقد تم تنفيذ تدهور القائم على الليزر لافتعال قنوات وشبكات الموائع الدقيقة في الهلاميات المائية يضم باستخدام نفس البروتوكول الموصوفة هنا لبذاته الهلاميات المائية. يمكن أن ينظر إليه حقنة تدفق المولدة مضخة في الشكل 3B، حيث كانت ملفقة قناة قطر أسطواني 20 ميكرون في هيدروجيل الموجودة في جهاز ميكروفلويديك. في هذه القناة قطرها 20 ميكرومتر، يتم حلها الفردية 2 ميكرومتر المجالات البوليسترين الفلورسنت بسهولة دون تدفق السوائل (الشكل 3B1)، في حين عندما يتم تطبيق / ثانية معدل التدفق 5 ميكرولتر، المجالات تتحرك من خلال مجال الرؤية، كما يتضح من تسليط الضوء على (الشكل 3B2 </ قوي>). وقد استخدم هذا النهج نفسه للحث على تدفق من خلال شبكة المشتقة من الأوعية الدموية 2D لمراقبة تدفق TRITC المسمى، 65 كيلو دالتون ديكستران من خلال الشبكة ونشرها في هيدروجيل المحيطة بها (الشكل 3C).

الشكل (3)
الشكل (3): انطلاقا مضخة الحقنة التدفق في PEGDA الهلاميات المائية مبلمر في مساكن ميكروفلويديك. ومتاح تجاريا، ملفقة قبل جهاز ميكروفلويديك (A) مع متناهية 17 س 3.8 س 0.53 ملم (س، ص، ض) يضم photopolymerized 1 × 3.8 × 0.53 ملم (س، ص، ض) PEGDA هيدروجيل، التي أشار إليها سهم أسود. وقد تدهورت قناة قطر أسطواني 20 ميكرون من خلال هيدروجيل، وتم ضخ المجالات البوليسترين 2 ميكرومتر من خلال جهاز (B). يتم حل المجالات بوضوح دون تدفق السوائل (B1)، لكنها تبدو وكأنها الشرائط في معدل التدفق من 5 ميكرولتر / ثانية(B2). في هيدروجيل آخر يضم، كانت ملفقة شبكة المستمدة الأوعية الدموية-2D وصفت TRITC، تم ضخ 65 كيلو دالتون ديكستران من خلال شبكة (C). تم استخدام الوقت الفاصل بين المجهر لمراقبة ديكستران الفلورسنت كما شغل القنوات وتنتشر في هيدروجيل المحيطة بها. السهام البيضاء في (ب) و (ج) تشير إلى اتجاه تدفق السوائل. شريط المعايرة في (C) يدل على شدة ديكستران الفلورسنت. تمثل الحانات نطاق 20 ميكرون في (B1) و (B2) و 50 ميكرون في (C). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

حرج في تجاوز الوظائف القياسية من البرنامج المجهر لتمكين استخدام أقنعة افتراضية لوالتدهور القائم على الليزر الموجهة صورة، يجب أن يكون الماكرو المجهر الإعداد والتلاعب بعناية. كيف واجهات البرامج المجهر مع الماكرو المجهر يمكن أن يكون أحيانا غير متوقع، واستثمرت الكثير من الجهد في تحديد الإعدادات المثلى في كلا البرنامجين لتطوير هذا الأسلوب. ينصح الفهم العام لالأساسية الليزر مسح استخدام المجهر متحد البؤر، وخصوصا مع "المرحلة" و "فوكس" ويندوز لإيجاد وتحديد المواقع هيدروجيل في س، ص، وأبعاد ض، قبل محاولة التدهور القائم على الليزر بشكل صحيح. بالإضافة إلى ذلك، تلفيق قناة مدخل ضروري لبروتوكول. يجب أن يكون الأنواع الفلورسنت مع وقف التنفيذ قادرا على إدخال أنظمة الموائع الدقيقة للتصوير ناجحة وتوصيف الشبكة. من المهم أن نلاحظ أن هذا البروتوكول ينطبق على محددة laser-مجهر المسح مبائر تكوينه مع ليزر الفيمتو ثانية نابض معين، تشغيل إصدارات معينة من البرنامج المجهر والماكرو المجهر (انظر التفاصيل في قائمة المواد الخاصة / معدات). لقد اكتشفت أن أحدث إصدارات الماكرو المجهر تفتقر إلى الرقابة وظائف اللازمة للسيطرة على الليزر الموجهة الصورة. في حين منصات المجهر الأخرى ومصادر ليزر نابض يمكن استخدامها، وينطبق هذا البروتوكول خصيصا لهذا النظام، وسوف تحتاج إلى تعديل وفقا لمنصة، مصدر الليزر، وبرامج تنفيذها. المبادئ الأساسية في جميع أنحاء هذا البروتوكول لا تزال سارية، ولكن.

وهناك تعديل محتمل لهذا البروتوكول ينطوي على تغيير تركيبة هيدروجيل. هنا، نحن تستخدم 5٪ بالوزن، 3.4 الهلاميات المائية كيلو دالتون PEGDA، ولكن تدهور القائم على الليزر (لأغراض جانبا من الجيل شبكة ميكروفلويديك) تم تنفيذه لتحط على حد سواء الهلاميات المائية الاصطناعية والطبيعية، بما في ذلك مضاد للفيروسات الفيبرينogen 21،22، بروتين الحرير الهلاميات 23، والكولاجين 24. فالتنظيم سينشئ قوة الليزر، سرعة المسح الضوئي، والتباعد بين Z-شرائح، وعدد من حالات التكرار تساعد في تحديد المعايير المثلى لصنع شبكات الموائع الدقيقة في الصيغ هيدروجيل الأخرى.

واحد الحد الحالي للتقنية هو الحجم الكلي للهيدروجيل التي يمكن أن تتحلل في كمية ممكن من الوقت. لخلق فراغات مفتوحة أو ميزات الموائع الدقيقة داخل هيدروجيل، يسكن الليزر يجب أن يكون الوقت عند أو فوق 8.96 ميكرو ثانية / بكسل (أو ليزر سرعة المسح الضوئي من 0.021 ميكرون / ميكرو ثانية) عند استخدام فلوينس الليزر من 37.7 NJ / ميكرون 2. مع هذه الإعدادات، فإنه يأخذ 1.4 ساعة للحط من السفن ضمن حجم 0.014 مم 3 (كما رأينا في الشكل 1). باستخدام زمن السكون ليزر من 4.48 ميكرو ثانية / بكسل أو أقل، والطاقة تسليمها ليست كافية لتدهور الكامل للصياغة هيدروجيل المستخدمة هنا. تنفيذ هيدروجيل مختلفةتكوين يمكن التغلب على هذا القيد. استخدام المواد الهلامية عطوب بالضوء التي تحتوي على مكونات حساسة للضوء 34-36 أو الهلاميات المائية التي لديها multiphoton كبير عبر أقسام 21-24 هي خيارات جيدة من شأنها أن تمكن من استخدام كميات أقل من الطاقة، وأن يؤدي إلى تدهور أسرع. وفيما يتعلق القيود الأبعاد، تم ملفقة ميزات تصل إلى 1.5 ملم عميقة في هيدروجيل 7. على تحقيقه عمق وظيفة من مسافة العمل من الهدف ويمكن زيادة استخدام الأهداف والعمل لمسافات طويلة جدا الأمثل للتصوير في الجسم الحي. خلقت أصغر قناة قياس 7 باستخدام كان له 20X (NA1.0) الهدف الغمر بالماء بعرض 3.3 ميكرون وعمق 8.9 ميكرون، والتي هي على قدم المساواة مع حجم أصغر القنوات ولدت في الشكل 1. في حين مختبرات أخرى قد استخدمت أقل أهداف NA 21،23،24، فإننا نتوقع أن شبكات الموائع الدقيقة مع ميزات أصغر يمكن إنشاؤها باستخدام عاليةأهداف إيه NA على حساب مسافة عمل مخفضة. في نهاية المطاف، فإن حل هذه التقنية هي وظيفة من وظيفة انتشار نقطة من تركيز شعاع الليزر، خصائص المسح الضوئي ليزر، وكمية الطاقة التي ألقاها الليزر، وخصائص امتصاص الليزر من المواد التي يجري المتدهورة.

وعلاوة على ذلك، خصائص الليزر (السرعة، فلوينس، تباعد بين أقنعة الظاهري، وعدد من حالات التكرار) يجب أن يكون الأمثل على أساس الخصائص هيدروجيل (كثافة تشعبي، macromer / مونومر الوزن الجزيئي، وزن في المئة، ونوع من هيدروجيل: المستندة إلى البروتين مقابل الاصطناعية )، وهذه سوف يغير بطبيعتها التفاعل مع الليزر وبالتالي فإن القرار النهائي للعملية. كما يتأثر الطاقة تسليمها أيضا الهدف المستخدمة، مطلوب الأمثل إضافية عند التبديل بين الأهداف. وفيما يتعلق التكاليف المترتبة على ذلك، لا بد من الوصول إلى المجهر مع ليزر نابض، وعلى الرغم من العديد من objec مختلفةالأقارب يمكن استخدامها، وتلك مع NA عالية والعمل لمسافات طويلة (للتصوير في الجسم الحي) يمكن أن تكون مكلفة.

وتتجاوز مفصلة هنا البروتوكول، شبكات ميكروفلويديك تم إنشاؤها باستخدام هذه التقنية يمكن أيضا أن functionalized مع الببتيدات خلية لاصقة بعد قناة تلفيق للحث على التصاق الخلايا البطانية وتشكيل التجويف 7. بالإضافة إلى ذلك، يمكن إدراج تسلسل الببتيد الخلايا القابلة للتحلل في المواد السائبة 9 قبل توجيه تدهور تسمح لدراسة الهجرة الخلية من وإلى هيدروجيل. لالتميع المستمر للشبكة ميكروفلويديك داخل هيدروجيل، الهلاميات المائية يمكن photopolymerized في الأجهزة أو العلب الموائعية أكبر، كما هو موضح في الشكلين 2 و 3 7.

توليد شبكات الأوعية الدموية عن طريق vasculogenic أو عائية التجميع الذاتي 8-12 يوفر نهجا واضحة للحث زارة شؤون المحاربين القدامىscularization طوال حجم هيدروجيل كبير نسبيا. بينما يؤدي هذا النهج في شبكات الموائعية perfusable، فمن الصعب السيطرة عليها بشكل مباشر على حجم، تعرج، والكثافة، وبنية الشبكة العامة. ونتيجة لهذا الحد، قد تختلف البيانات الشخصية تدفق ومعدلات القص في الأوعية الدموية بين التجارب. بدلا من ذلك، وتقنيات التصنيع الدقيق 13-16 تسمح للسيطرة المباشرة على بنية الشبكة ولكن غالبا ما تكون محدودة بسبب عدم قدرتهم على توليد، قنوات الشعرية الحجم صغيرة أو تلفيق الشبكات الكثيفة التي تحاكي في الهندسة المعمارية الجسم الحي والأوعية الدموية. في حين أن تقنية تدهور هيدروجيل القائم على الليزر المذكورة هنا تم أغراض أخرى حديثا لتوليد ميكروفلويديك، فإنه يتغلب في وقت واحد كلا من السيطرة المعمارية والقيود القائمة على حجم أساليب التصنيع الدقيق القائمة التي تمكن من خلق 3D شبكات الموائع الدقيقة الجزيئية الحيوية أن ألخص كثافة، تعرج، مجموعة الحجم، والبنيان العامة(ه) في الجسم الحي الأوعية الدموية. وعلاوة على ذلك، شبكات الموائعية متعددة يمكن أن تتولد في هيدروجيل واحد، مما يتيح للدراسة النقل بين الشبكة 7. لتطبيقات هندسة الأنسجة التي تسعى لتكرار بشكل وثيق في عمليات النقل المجراة في المختبر، وشبكات الموائع الدقيقة جزءا لا يتجزأ من هيدروجيل حل للغاية المذكورة هنا هي مناسبة تماما. ونحن نتوقع أن هذا البروتوكول سيكون مفيدا في تطوير البنى الأنسجة أن أكثر تقليد بدقة في الجسم الحي والنقل لاستخدامها في أجهزة فحص المخدرات وفي نماذج المرض في المختبر.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MATLAB Mathworks R2015a named "programming software" in protocol; refer to source 9 for details on algorithm
FIJI (Fiji is Just Image J) NIH version 1.51a named "image processing software" in protocol
LSM 780 Confocal Microscope Zeiss named "laser-scanning confocal microscope" in protocol; for laser-based hydrogel degradation
Zen 2010B SP1 Zeiss release version 6.0 named "microscope software" in protocol; for use on Zeiss LSM-780
Multitime, 2010 Zeiss v16.0 named "microscope macro" in protocol; for use on Zeiss LSM-780 (in conjunction with Zen)
Objective W Plan-Apochromat 20X/1.0 DIC D=0.17 M27 75 mm Zeiss 421452-9880-000 for use on Zeiss LSM-780
Chameleon Vision II Modelocked Ti:S Laser Coherent named "high-powered pulsed laser" in protocol
Sodium chloride Sigma-Aldrich S5886-1KG
HEPES Sigma-Aldrich H3375-250G
Triethanolamine (TEOA) Sigma-Aldrich 90279-100ML flammable; skin and eye irritant; work with in a fume hood
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S5881-500G
150 mL Vacuum Filtration Cups with 0.2 µm PES Membrane VWR 10040-460
PEGDA synthesized in house refer to source 33 for synthesis methods; store under argon
Eosin Y disodium salt Sigma-Aldrich E6003-25G
1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) Sigma-Aldrich V3409-5G store under argon; carcinogenic; work with in a fume hood
3M Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil Thomas Goldkamp 37728
Flexmark 90 PFW Liner FLEXcon FLX000620 backing for handling of double coated tape
Model SC Plotter (adhesive cutter) USCutter SC631E used to cut adhesive in ring shapes to connect coverslips to petri dishes
60 mm Petri Dish with 20 mm Hole MatTek Corporation P60-20-F-NON
High Intensity Illuminator (white light source) Fiber-Lite 4715MS-12WB10
Power Meter Newport 1916-R detect power at 524 nm when using white light source
Slim Profile Wand Detector Newport 918D-ST for use with power meter
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning 3097358-1004 used to make PDMS molds; refer to source 7 for methods
TMPSA-Functionalized #1.5 Coverslips, 40 mm Round synthesized in house refer to source 7 for methods
Dextran, Fluorescein, 2,000,000 MW, Anionic, Lysine Fixable Life Technologies D7137 can use alternative tagged dextrans; 2,000 kDa does not diffuse readily into a 5% 3.4 kDa PEGDA hydrogel
1 mL Syringe, Luer-Lok BD 309628
Acrodisc Syring Filter, 0.2 µm Supor Membrane, Low Protein Binding Pall PN 4602
sticky-Slide VI0.4  Ibidi 80601 microfluidic devices that can be used to house hydrogels

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baish, J. W., Stylianopoulos, T., et al. Scaling rules for diffusive drug delivery in tumor and normal tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108, (5), 1799-1803 (2011).
  2. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnol. 32, (8), 760-772 (2014).
  3. Esch, E. W., Bahinski, A., Huh, D. Organs-on-chips at the frontiers of drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 14, (4), 248-260 (2015).
  4. Ghaemmaghami, A. M., Hancock, M. J., Harrington, H., Kaji, H., Khademhosseini, A. Biomimetic tissues on a chip for drug discovery. Drug Discov. Today. 17, (3-4), 173-181 (2012).
  5. Jeon, J. S., Bersini, S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112, (1), 214-219 (2015).
  6. Pisano, M., Triacca, V., Barbee, K. A., Swartz, M. A. An in vitro model of the tumor-lymphatic microenvironment with simultaneous transendothelial and luminal flows reveals mechanisms of flow enhanced invasion. Integr. Biol. 7, (5), 525-533 (2015).
  7. Heintz, K. A., Bregenzer, M. E., Mantle, J. L., Lee, K. H., West, J. L., Slater, J. H. Fabrication of 3D Biomimetic Microfluidic Networks in Hydrogels. Adv. Healthc. Mater. (2016).
  8. Cuchiara, M. P., Gould, D. J., McHale, M. K., Dickinson, M. E., West, J. L. Integration of Self-Assembled Microvascular Networks with Microfabricated PEG-Based Hydrogels. Adv. Funct. Mater. 22, (21), 4511-4518 (2012).
  9. Culver, J. C., Hoffmann, J. C., Poché, R. A., Slater, J. H., West, J. L., Dickinson, M. E. Three-Dimensional Biomimetic Patterning in Hydrogels to Guide Cellular Organization. Adv. Mater. 24, (17), 2344-2348 (2012).
  10. Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab Chip. 13, (8), 1489 (2013).
  11. Saik, J. E., Gould, D. J., Keswani, A. H., Dickinson, M. E., West, J. L. Biomimetic Hydrogels with Immobilized EphrinA1 for Therapeutic Angiogenesis. Biomacromolecules. 12, (7), 2715-2722 (2011).
  12. Zisch, A. H., Lutolf, M. P., et al. Cell-demanded release of VEGF from synthetic, biointeractive cell-ingrowth matrices for vascularized tissue growth. FASEB J. (2003).
  13. He, J., Zhu, L., Liu, Y., Li, D., Jin, Z. Sequential assembly of 3D perfusable microfluidic hydrogels. J. Mater. Sci. Mater. Med. 25, (11), 2491-2500 (2014).
  14. Therriault, D., White, S. R., Lewis, J. A. Chaotic mixing in three-dimensional microvascular networks fabricated by direct-write assembly. Nat. Mater. 2, (4), 265-271 (2003).
  15. Wu, W., DeConinck, A., Lewis, J. A. Omnidirectional Printing of 3D Microvascular Networks. Adv. Mater. 23, (24), H178-H183 (2011).
  16. Kolesky, D. B., Truby, R. L., Gladman, A. S., Busbee, T. A., Homan, K. A., Lewis, J. A. 3D Bioprinting of Vascularized, Heterogeneous Cell-Laden Tissue Constructs. Adv. Mater. 26, (19), 3124-3130 (2014).
  17. Zervantonakis, I. K., Hughes-Alford, S. K., Charest, J. L., Condeelis, J. S., Gertler, F. B., Kamm, R. D. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, (34), 13515-13520 (2012).
  18. Roudsari, L. C., West, J. L. Studying the influence of angiogenesis in in vitro cancer model systems. Adv. Drug Deliv. Rev. (2015).
  19. Dawson, T. H. Scaling laws for capillary vessels of mammals at rest and in exercise. Proc. R. Soc. Long. [Biol.]. 270, (1516), 755-763 (2003).
  20. Vogel, A., Noack, J., Hüttman, G., Paltauf, G. Mechanisms of femtosecond laser nanosurgery of cells and tissues. Appl. Phys. B. 81, (8), 1015-1047 (2005).
  21. Sarig-Nadir, O., Livnat, N., Zajdman, R., Shoham, S., Seliktar, D. Laser Photoablation of Guidance Microchannels into Hydrogels Directs Cell Growth in Three Dimensions. Biophys. J. 96, (11), 4743-4752 (2009).
  22. Three-dimensional guidance of DRG neurite outgrowth using multi-photon photo-ablation. Livnat, N., Sarig-Nadir, O., Seliktar, D., Shoham, S. 2009 4th International IEEE/EMBS Conference on Neural Engineering, 116-119 (2009).
  23. Applegate, M. B., Coburn, J., et al. Laser-based three-dimensional multiscale micropatterning of biocompatible hydrogels for customized tissue engineering scaffolds. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112, (39), 12052-12057 (2015).
  24. Ilina, O., Bakker, G. J., Vasaturo, A., Hoffman, R. M., Friedl, P. Two-photon laser-generated microtracks in 3D collagen lattices: principles of MMP-dependent and -independent collective cancer cell invasion. PB. 8, (2), (2011).
  25. Naik, P., Cucullo, L. In Vitro Blood-Brain Barrier Models: Current and Perspective Technologies. J. Pharm. Sci. 101, (4), 1337-1354 (2012).
  26. Choe, Y., Mayerich, D., et al. Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy. JoVE. (58), (2011).
  27. Mayerich, D., Kwon, J., Sung, C., Abbott, L., Keyser, J., Choe, Y. Fast macro-scale transmission imaging of microvascular networks using KESM. Biomed. Opt. Express. 2, (10), 2888-2896 (2011).
  28. Chung, J. R., Sung, C., et al. Multiscale Exploration of Mouse Brain Microstructures Using the Knife-Edge Scanning Microscope Brain Atlas. Front. Neuroinform. 5, (2011).
  29. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  30. Shukla, A., Slater, J. H., Culver, J. C., Dickinson, M. E., West, J. L. Biomimetic Surface Patterning Promotes Mesenchymal Stem Cell Differentiation. ACS Appl. Mater. Interfaces. (2015).
  31. Slater, J. H., Culver, J. C., et al. Recapitulation and Modulation of the Cellular Architecture of a User-Chosen Cell of Interest Using Cell-Derived, Biomimetic Patterning. ACS Nano. 9, (6), 6128-6138 (2015).
  32. Slater, J. H., West, J. L. Fabrication of Multifaceted, Micropatterned Surfaces and Image-Guided Patterning Using Laser Scanning Lithography. Methods Cell Biol. 119, 193-217 (2014).
  33. DeLong, S. A., Gobin, A. S., West, J. L. Covalent immobilization of RGDS on hydrogel surfaces to direct cell alignment and migration. J. Control. Release. 109, (1-3), 139-148 (2005).
  34. DeForest, C. A., Anseth, K. S. Cytocompatible click-based hydrogels with dynamically-tunable properties through orthogonal photoconjugation and photocleavage reactions. Nat. Chem. 3, (12), 925-931 (2011).
  35. Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. Photodegradable Hydrogels for Dynamic Tuning of Physical and Chemical Properties. Science. 324, (5923), 59-63 (2009).
  36. Tibbitt, M. W., Kloxin, A. M., Dyamenahalli, K. U., Anseth, K. S. Controlled two-photon photodegradation of PEG hydrogels to study and manipulate subcellular interactions on soft materials. Soft Matter. 6, (20), 5100-5108 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics