Мышиные Полная толщина кожи Трансплантация

* These authors contributed equally
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Мышиные полная толщина трансплантация кожи является хорошо известной моделью для изучения отказа в установке аллоиммунная. Здесь мы предоставляем учебник каждого шага, участвующих в выполнении / с BALB -> C57BL / 6 всю толщину трансплантата кожи.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Cheng, C. H., Lee, C. F., Fryer, M., Furtmüller, G. J., Oh, B., Powell, J. D., Brandacher, G. Murine Full-thickness Skin Transplantation. J. Vis. Exp. (119), e55105, doi:10.3791/55105 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Мышиные полная толщина трансплантация кожи является хорошо создана в естественных условиях модель для изучения аллоиммунная реакции и отторжения трансплантата. Несмотря на ограниченное применение для человека, трансплантация кожи у мышей широко применяется для исследования трансплантации. Процедура проста в освоении и выполнять, и это не требует тонких методов микрохирургических, ни интенсивное обучение. Кроме того, отторжение трансплантата в этой модели имеет место в очень воспроизводимым иммунологической реакции и легко контролировать путем непосредственного осмотра и пальпации. Кроме того, вторичная трансплантация кожи с донорскими соответствием или третьей стороной кожи трансплантаты могут быть выполнены на более сложные модели трансплантации в качестве альтернативы и несложный метод оценки донорского-специфической толерантности. Осложнения низкие, и в общем случае ограничено анестезии передозировки или респираторного дистресс-синдрома после процедуры. отказ привитые, с другой стороны, происходит обычно в результате плохой подготовки гркормовой части, неправильное положение в привитой постели, или несоответствующее размещение повязки. В этой статье мы приводим протокол для полной толщины пересадки кожи у мышей и описывают важные шаги, необходимые для успешной процедуры.

Introduction

Трансплантация органов является методом выбора при лечении больных с недостаточностью терминальной стадии органов, а также исходы значительно улучшилось с прогрессом в области хирургических процедур и протоколов иммуносупрессии. Тем не менее, длительное подавление иммунитета связано со значительными побочными эффектами, а также разработка новых стратегий, способствующих толерантности остается целью современных исследований трансплантации.

Многочисленные животные модели были разработаны для фундаментальных исследований в области трансплантации, чтобы изучить механизмы отторжения трансплантата и испытать иммуносупрессии подходы для предотвращения отторжения трансплантата и для содействия долгосрочному толерантности 1-3. Мышиные модели стали основой иммунологического исследований в связи с исключительной и обширной доступности диагностических и терапевтических антител и четко определенных инбредных и трансгенных линий. Пересадка кожи является простая процедура, которая не требует специальных навыков микрохирургических и можетлегко контролировать в послеоперационном периоде. Взятые вместе, трансплантация кожи мыши была исключительным инструментом для изучения многих аспектов , участвующих в реакции аллоиммунная, включая доставку антигена, незаконный оборот клеток и разрушения тканей во время отторжения трансплантата 4,5.

Здесь мы покажем процедуру шаг за шагом для полной толщины пересадки кожи с использованием модели мыши, и мы опишем важные шаги, необходимые для успешного приживления пересаженного кожи.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все процедуры были проведены в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных Национального института здоровья (NIH) и были одобрены Университета животных по уходу и использованию комитета Джона Хопкинса (JHUACUC) путем. Конкретные процедуры были выполнены в соответствии с утвержденными протоколами ACUC MO13M292 и MO13M370.

1. Донор Урожай кожи

  1. Обезболить мыши-донора с изофлуран (индукционным испарителем на уровне 4%, обслуживание на 1 - 2% через конус мыши). Используйте носок вывода пинч рефлекс контролировать глубину анестезии.
  2. Используя электрическую бритву, брить спину животного и дезинфицировать его с 10% повидон йода (например, Бетадин).
  3. Используя стерильные ножницы, перчатки и асептики, донорские урожай кожи спины от бедра до шеи, с тупым на уровне рыхлой соединительной ткани.
  4. Усыпить животное шейки дислокации после сбора урожаякожа трансплантат.
  5. Под микроскопом, отделить соединительной ткани, жировой ткани, и panniculus carnosus из кожи спины с помощью тонких ножниц тенотомию. Panniculus carnosus представляет собой тонкий, прозрачный мышцы отвечают за подергивание движений кожи.
  6. Использование стерильных инструментов, вырезать 15-мм х 15-мм трансплантаты из кожи спины для 10-мм х 10 мм до 15 мм х 15 мм привитого кровати.
  7. Хранить трансплантатов на марли, смоченными стерильным фосфатно-солевом буфере (PBS) в чашке Петри на льду.
    Примечание: 8 - 10 трансплантаты могут быть получены из одной мыши-донора.

2. Получатель Пересадка кожи

  1. Обезболить мышь получателя с изофлуран (индукционным испарителем на уровне 4%, обслуживание на 1 - 2% через конус мыши). Используйте носок вывода пинч рефлекс контролировать глубину анестезии.
  2. Администрирование 0,02 мг / кг веса тела бупренорфина для послеоперационного обезболивания.
  3. Бритье сторону задней части животного, где трансплантат WiLL быть вставлена ​​и дезинфицируют 10% повидон-йод.
  4. Используя ножницы, вырезать 10 мм х 10 мм до 15 мм-х 15-мм квадратной кожи. Размер дефекта должен быть немного больше (10%), чем трансплантата. Вырезать так же поверхностно, насколько это возможно. Позаботьтесь, чтобы сохранить panniculus carnosus и сосуды. Panniculus carnosus можно отличить от основной лицевой панели его подвижности и кровеносных сосудов, которые работают поверхностные к нему.
  5. Поместите трансплантат на привитой постели, избегая складок по краям.
  6. Поместите 8 швов на углах и на середине каждого края. Для каждого шва, проходят через иглу трансплантата, а затем через panniculus carnosus трансплантата дну ниже окружающей кожи реципиента.
  7. Снимите маску обезболивающий и пусть животное частично восстановиться после анестезии перед нанесением клеевой повязку.
  8. Оберните мышь получателя в клеевой повязка с сложенную марлю над трансплантатом. Повязка путем объединения двух бинты, резкаклеевой состав одного и размещения двух впитывающие прокладки вместе.
  9. Монитор мыши тесно во время восстановления, чтобы убедиться, что повязка не ограничивая грудную клетку экскурсии и дыхания. Снимите повязку, если частота дыхания снижается или животное начинает задыхаться или дыхание неглубоко.

3. Послеоперационный

  1. Администрирование Энрофлоксацин 5 мг / кг после операции по поводу инфекции профилактики.
  2. Поместите пересаженных мышь в чистой клетке над Microwavable грелку, пока она полностью не оправится от анестезии.
  3. Соблюдайте мыши в течение 1 часа после операции до возвращения его к жилому объекту.
  4. Через семь дней после операции, анестезию мыши, как на шаге 2.1. Снимите повязку путем разрезания только через брюшную сторону повязки.
  5. Наблюдайте и ощупывать трансплантата на следующий день на наличие признаков струпьев, сокращения или твердости. Если он присутствует, трансплантат не может быть достигнуто надлежащее vascularizaции и следует рассматривать как технический сбой.
  6. ежедневно контролировать на наличие признаков отторжения. Рассмотрим трансплантатов отвергнута при ≥90% от трансплантата ткани становится некротической.
  7. Эвтаназии отклоненные животных и собирать их для анализа.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Размещение повязкой на мыши-реципиента является важным шагом процедуры. Кожный трансплантат позиционируется на стволе получателя, между плеча, бедра и позвоночника (рисунок 1). Бандаж выполнен со сложенным марлю и сочетание двух пластиковых пластырей. Мышь получатель помещается с трансплантатом вниз через марлю в центре бинта. С помощью двух изогнутых микро щипцами, нижний конец бинта вытягивается, а затем верхняя часть бинта оборачивают над мышью в живот.

В полных моделей рассогласования, полная толщина пересадка кожи, как правило, отвергается в 8 до 12 дней. В незначительных моделях несоответствия, отказ ответы медленнее, более изменчивы, и внешний вид кожного трансплантата характеризуется меньшим количеством различных изменений, таких как сжатие или потери волос (рисунок 2). Острый отторжение трансплантата родыLLY начинается с отеком и эритемы трансплантата. Эти события сопровождаются привитого высыхании, усадке и образованию струпа (рис 2B и C). В зависимости от степени несоответствия MHC и протокол иммуносупрессии, отказ может происходить с помощью процесса подострого, отмечены небольшие изменения, такие как выпадение волос, пигментация, кожными гребнями, и объем трансплантата. В этих случаях, отвергнутый трансплантата появляется блестящий, белый, и голые, с неровными краями (рис 2F) 14.

Используя эту модель пересадки кожи, мы исследовали новый подход таргетирования Т-клеточный метаболизм для предотвращения отторжения трансплантата 15. Хорошо известно , что метаболические сигнальные пути играют решающую роль в диктуя результаты Т-клеточных реакций 16. Наивные Т-клетки полагаются на митохондриального окислительного фосфорилирования для выработки энергии, необходимой для основного иммунного надзора. Однако,при активации, эффекторные Т - клетки метаболически перепрограммировать к аэробного гликолиза и демонстрируют повышенную глутамин метаболизм 16,17. Использование BALB / C в качестве доноров и C57BL / 6 в качестве получателей, мы наблюдали, что ингибирование гликолиза и окислительного фосфорилирования (2DG + метформин) или глутамин метаболизм в покое (ДОН) увеличивал выживаемость трансплантата кожи, но блокирует три пути одновременно привело к значительному-повышенную трансплантат выживаемости (рис 3C). Кроме того, тройной метаболическая терапия была более эффективна , чем традиционная циклоспорина или рапамицина (Фигура 3А и В). Постоянный прием не было достигнуто, и дальнейшие стратегии, включая истощение терапии, костимуляцию блокады, или более новых метаболических терапии, может способствовать лучшей индукции толерантности трансплантации. Тем не менее, исследование дало два новых идеи: использование неспецифических ингибиторов целевой селективные клетки иммунной системы с увеличением метаболических потребностей, а также требование т O блокировать три пути метаболизма одновременно, чтобы получить более надежную иммуносупрессии в отторжения трансплантата.

ингибиторы кальциневрина и мишени рапамицина у млекопитающих (МРМ) ингибиторы представляют собой большую часть традиционной иммуносупрессивной терапии, используемой в клинической трансплантации. Срединные привитые выживаемости Balb / с до C57BL / 6 трансплантатов кожи, обработанных циклоспорином и рапамицина были 17 и 16 дней, соответственно. Для сравнения, получатели обрабатывают метаболических ингибиторов, которые ингибируют клеточную гликолиза T, митохондриальной окислительного фосфорилирования, и глютамин метаболизма продлил выживание: медиана выживаемости трансплантата составила 29 дней. Кроме того, гистология кожных трансплантатов из метаболической терапии группы выставлены выравнивание более неповрежденной ткани и меньше лимфоцитарный воспалительный инфильтрат (рисунок 4).

105 / 55105fig1.jpg "/>
Рисунок 1: Покрытие привитого с повязкой. Трансплантат (А) кожи на правой ствола. (B) Бинт сделал со сложенным марлю и двух пластиковых полосок бинтов. (С) Получатель мышь помещают на марлю. (DF) бинт оборачивают вокруг мыши. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2: Внешний вид Прививка во время острого и хронического отторжения. (A) BALB / C до C57BL / 6 (полное несоответствие) полную толщину пересадки кожи без признаков отторжения (день 8). (B) BALB / C в C57BL / 6 полную толщину пересадки кожи с 50% отторжения трансплантата (день 13). (C) BALB / C в C57BL / 6 полную толщину пересадки кожи с полным отторжения трансплантата (день 18). (D) Сингенная полная толщина трансплантация кожи (8 -й день). (E) Сингенная полная толщина трансплантация кожи (день 30). (F) C57BL / 10 до C57BL / 6 (незначительное несоответствие) полную толщину пересадки кожи с хроническим отторжением трансплантата (день 100). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3: Balb / с до C57BL / 6 Skin Graft выживания. (А) Лечение с помощью циклоспорина (25 мг / кг QD). (Б) Обработка рапамицина (3 мг / кг QD). (С) Лечение с метаболическими ингибиторами, 2-дезокси-D-глюкоза (2DG) 500мг / кг QD, метформин 150 мг / кг QD и 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин (ДОН) 1,6 мг / кг QOD. Все процедуры были введены со дня трансплантации до отказа. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4: гематоксилином и эозином Пятно (справа, X100, слева, X200) кожных графты с метаболической терапии в послеоперационный день 7. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

С момента своего появления по Medawar, во- первых , в исследованиях на людях , а затем у кроликов и мышей, трансплантация кожи была бесценным моделью для изучения аллогенных иммунных ответов 6,7. В этой рукописи, мы представляем модель крупномасштабного, не кровоснабжением, полную толщину пересадки кожи с помощью верхней и нижней части спины кожу. Различные альтернативные методы, в том числе с помощью хвоста кожи или уха кожи мыши в качестве источника ткани трансплантата, было зарегистрировано на сегодняшний день 8,9. Эти модели представляют явное преимущество технической простотой и позволяют крупносерийного пропускную способность. Относительный дефицит эпидермальных клеток Лангерганса и дермальные дендритных клеток в трансплантатов кожи хвоста, однако, приводит к задержке отторжения, а также упрощенную процедуру принятия трансплантата хозяином, в частности , в небольших моделей несовпадение MHC 10,11. Таким образом, полная толщина-прививка ствол кожа считается более надежной моделью и более подходящим для изучения Т-клетками СМИTed острое отторжение 12.

Кроме того, наша модель использует простые методы и не требует продвинутых микрохирургических навыков. Время работы короткий (~ 10 мин на мышь от начала анестезии до завершения процедуры), а также послеоперационная заболеваемость и смертность незначительна. Общая операционная смертность (смерть в течение 24 часов после операции плюс смерть до снятия повязки) было сообщено, что на 3,8% 13. Большинство осложнений возникают в результате анестезии передозировки или чрезмерно ограничительных повязок, которые можно легко предотвратить путем тщательного контроля функции дыхания в течение ближайшем послеоперационном периоде и быстрое удаление повязки при первых признаках респираторного дистресса 6,17.

Самым важным фактором в процессе приживления является реваскуляризации трансплантата ткани за счет врастания сосудов принимающих к трансплантата 6. Собранный кожа требуетS тщательной подготовки, а также рассечение panniculus carnosus является важным шагом. Мы предпочитаем, чтобы удалить panniculus carnosus под микроскопом. Рекомендуется начать рассечение от одного из краев и медленно продвигаться вперед, нажав на мышцы и отделяя ее от кожи с лезвием изогнутой тенотомии под небольшим углом. Сайт привитого слоя должно быть далеко от суставов и позвоночника. Перед тем как сделать надрезы в мышь-реципиента, плеча и бедра должны быть перемещены, чтобы визуализировать складки кожи, которые помогают разграничить уровень суставов. При удалении кожи получателя, важно, чтобы не повредить кровеносные сосуды, которые бегут к поверхностным panniculus carnosus. В случае возникновения кровотечения, применяют местную компрессию и удалить кровь и сгустки, которые могут помешать приживления. Наконец, повязка не должна вызывать трудности с дыханием, что компромисс восстановления, хотя оно должно быть достаточно констриктивно, чтобы предотвратить смещение трансплантата и авто-муtilation в процессе реваскуляризации. Пластиковые Полоски бинты являются приверженцем и достаточно сильны для этой цели. Мы объединяем два бинты , чтобы полностью обернуть талию мыши и позволяют размещать в сложенном марли между повязкой и трансплантат (рисунок 1). Повязка удаляется путем разрезания вентральной стороне его, а остальные удаляют животного, для того, чтобы избежать нарушения трансплантата при попытке удалить повязку вручную.

Таким образом, полная толщина трансплантация кожи является хорошо известной моделью с обильными ссылками в литературе. Процедура проста в исполнении, время работы мало, и послеоперационные осложнения ограничены. Критические шаги связаны с дотошной урожая донорской кожи и правильного размещения бинта получателя. Дальнейшие исследования с участием биоматериалы, которые способствуют ангиогенез и восстановление тканей может дополнительно повысить вероятность успеха процедуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа финансировалась грантом NIH R01AI077610.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Straight micro forceps Sigma F4017
Curved micro forceps Aesculap BD333R
Curved Stevens tenotomy scissors Aesculap BC905R
Mayo dissecting scissors Sigma S3146
Micro needle holder Aesculap BM563R
Sterile gauze Covidien 441218
6-0 Nylon suture MWI 31849
Plastic Strips Band-Aid Johnson & Johnson Obtained from pharmacy
10 cm Petri dish Fisherbrand FB0875712
PBS Quality Biological 119069131
Buprenorphine DEA Number required; Obtained from hospital pharmacy
Enrofloxacin Bayer Health Care 186599

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Furtmuller, G. J., et al. Orthotopic Hind Limb Transplantation in the Mouse. J Vis Exp. (2016).
  2. Oh, B., et al. A Novel Microsurgical Model for Heterotopic, En Bloc Chest Wall, Thymus, and Heart Transplantation in Mice. J Vis Exp. (2016).
  3. Oberhuber, R., et al. Murine cervical heart transplantation model using a modified cuff technique. J Vis Exp. e50753 (2014).
  4. Jones, T. R., Shirasugi, N., Adams, A. B., Pearson, T. C., Larsen, C. P. Intravital microscopy identifies selectins that regulate T cell traffic into allografts. J Clin Invest. 112, 1714-1723 (2003).
  5. Celli, S., Albert, M. L., Bousso, P. Visualizing the innate and adaptive immune responses underlying allograft rejection by two-photon microscopy. Nat Med. 17, 744-749 (2011).
  6. Medawar, P. B. The behaviour and fate of skin autografts and skin homografts in rabbits: A report to the War Wounds Committee of the Medical Research Council. J Anat. 78, 176-199 (1944).
  7. Billingham, R. E., Brent, L., Medawar, P. B., Sparrow, E. M. Quantitative studies on tissue transplantation immunity. I. The survival times of skin homografts exchanged between members of different inbred strains of mice. Proc R Soc Lond B Biol Sci. 143, 43-58 (1954).
  8. Garrod, K. R., Cahalan, M. D. Murine skin transplantation. J Vis Exp. (2008).
  9. Schmaler, M., Broggi, M. A., Rossi, S. W. Transplantation of tail skin to study allogeneic CD4 T cell responses in mice. J Vis Exp. e51724 (2014).
  10. Bergstresser, P. R., Toews, G. B., Gilliam, J. N., Streilein, J. W. Unusual numbers and distribution of Langerhans cells in skin with unique immunologic properties. J Invest Dermatol. 74, 312-314 (1980).
  11. Chen, H. D., Silvers, W. K. Influence of Langerhans cells on the survival of H-Y incompatible skin grafts in rats. J Invest Dermatol. 81, 20-23 (1983).
  12. Chong, A. S., Alegre, M. L., Miller, M. L., Fairchild, R. L. Lessons and limits of mouse models. Cold Spring Harb Perspect Med. 3, a015495 (2013).
  13. Mayumi, H., Nomoto, K., Good, R. A. A surgical technique for experimental free skin grafting in mice. Jpn J Surg. 18, 548-557 (1988).
  14. McFarland, H. I., Rosenberg, A. S. Skin allograft rejection. Curr Protoc Immunol. Chapter 4, (2009).
  15. Lee, C. F., et al. Preventing Allograft Rejection by Targeting Immune Metabolism. Cell reports. 13, 760-770 (2015).
  16. Pollizzi, K. N., Powell, J. D. Integrating canonical and metabolic signalling programmes in the regulation of T cell responses. Nat Rev Immunol. 14, 435-446 (2014).
  17. Pearce, E. L., Poffenberger, M. C., Chang, C. H., Jones, R. G. Fueling immunity: insights into metabolism and lymphocyte function. Science. 342, 1242454 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics