Murine Transplantation de peau pleine épaisseur

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Immunology and Infection

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Summary

Murine transplantation pleine épaisseur peau est un modèle bien établi pour étudier le rejet dans un cadre de allo. Ici, nous vous proposons un tutoriel de chaque étape impliquée dans la réalisation d'une / c BALB -> C57BL / 6 de pleine épaisseur greffe de peau.

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Cheng, C. H., Lee, C. F., Fryer, M., Furtmüller, G. J., Oh, B., Powell, J. D., Brandacher, G. Murine Full-thickness Skin Transplantation. J. Vis. Exp. (119), e55105, doi:10.3791/55105 (2017).

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Abstract

Murine transplantation pleine épaisseur peau est un modèle in vivo bien établi pour étudier la réponse allo et le rejet de greffe. En dépit de son application limitée à l'homme, la transplantation de la peau chez la souris a été largement utilisé pour la recherche sur la transplantation. La procédure est facile à apprendre et à exécuter, et il ne nécessite pas de techniques de microchirurgie délicates, ni une formation approfondie. De plus, le rejet de greffe dans ce modèle se produit dans une réaction immunologique très reproductible et est aisément contrôlée par inspection directe et palpation. En outre, la transplantation de la peau secondaire avec des greffes de donneurs appariés ou de la peau par des tiers peut être effectuée sur des modèles plus complexes de transplantation comme une méthode alternative et simple pour évaluer la tolérance spécifique du donneur. Les complications sont faibles et sont en général limités à une surdose d'anesthésie ou de détresse respiratoire après la procédure. échec de la greffe, d'autre part, se produit fréquemment par suite d'une mauvaise préparation du grà l'arrière, un mauvais positionnement dans le lit de greffe, ou un emplacement inapproprié de la bande. Dans cet article, nous présentons un protocole de pleine épaisseur transplantation de la peau chez la souris et de décrire les étapes importantes nécessaires à une procédure réussie.

Introduction

La transplantation d'organes est le traitement de choix pour les patients souffrant d'insuffisance d'organes en phase terminale, et les résultats se sont améliorés remarquablement avec les progrès des interventions chirurgicales et des protocoles d'immunosuppression. Cependant, immunosuppression à long terme est associée à des effets secondaires importants, et le développement de nouvelles stratégies qui promeuvent la tolérance demeure l'objectif de la recherche en transplantation moderne.

De nombreux modèles animaux ont été développés pour la recherche fondamentale en transplantation, pour étudier les mécanismes de rejet d'allogreffe et de tester immunosuppression approches pour prévenir le rejet de greffe et pour la promotion de la tolérance à long terme 1-3. Des modèles de souris sont devenus le pilier de la recherche immunologique due à la disponibilité exclusive et vaste d'anticorps diagnostiques et thérapeutiques et les souches consanguines et transgéniques bien définies. la transplantation de la peau est une procédure simple qui ne nécessite pas de compétences particulières de microchirurgie et peutêtre facilement contrôlé postopératoires. Pris ensemble, la transplantation de la peau de la souris a été un outil exceptionnel pour étudier de nombreux aspects impliqués dans la réponse allo, y compris la livraison de l' antigène, le trafic cellulaire, et la destruction des tissus pendant le rejet de greffe 4,5.

Ici, nous montrons la procédure étape par étape pour la transplantation de la peau de pleine épaisseur en utilisant le modèle de la souris, et nous décrivons les étapes importantes nécessaires pour une prise de greffe réussie de la peau transplantée.

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Protocol

Toutes les procédures ont été menées en conformité avec le Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire de l'Institut national de la santé (NIH) et ont été approuvés par le Comité de l'Université Johns Hopkins et l'utilisation des soins aux animaux (JHUACUC). Les procédures spécifiques ont été réalisées dans le cadre du protocole ACUC approuvé MO13M292 et MO13M370.

Récolte de la peau 1. Donateur

  1. Anesthésier la souris donneuse avec de l'isoflurane (induction vaporiseur à 4%, la maintenance à 1 - 2% à travers le cône de la souris). Utilisez l'orteil retrait de pincement réflexe pour contrôler la profondeur de l'anesthésie.
  2. L' utilisation d' un rasoir électrique, de se raser le dos de l'animal et la désinfecter avec 10% de povidone iode (par exemple, Betadine).
  3. Avec des ciseaux stériles, des gants et une technique aseptique, récolte donneur peau du dos de la hanche au cou, avec dissection au niveau du tissu conjonctif aréolaire.
  4. Euthanasier l'animal par dislocation cervicale après la récolte desgreffe de peau.
  5. Sous un microscope, séparer le tissu conjonctif, le tissu adipeux, et pannicule carnosus de la peau du dos en utilisant des ciseaux fins de ténotomie. Le carnosus pannicule est une mince musculaire transparente responsable des mouvements saccadés de la peau.
  6. En utilisant la technique des instruments stériles, découper 15 mm x 15 mm greffes de la peau du dos pour un 10 mm x 10 mm à 15 mm lit de greffe x 15 mm.
  7. Stocker les greffes sur des gazes imbibées avec une solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS) dans une boîte de Pétri sur de la glace.
    NOTE: 8 - 10 greffes peuvent être obtenues à partir d'une souris donneuse.

Transplant de la peau 2. Destinataire

  1. Anesthésier la souris receveuse avec isoflurane (induction vaporiseur à 4%, la maintenance à 1 - 2% à travers le cône de la souris). Utilisez l'orteil retrait de pincement réflexe pour contrôler la profondeur de l'anesthésie.
  2. Administrer 0,02 mg / kg de poids corporel de la buprénorphine pour le soulagement de la douleur postopératoire.
  3. Rasez le côté du dos de l'animal, où la greffe will être inséré et désinfecter avec 10% de povidone iode.
  4. Avec des ciseaux, couper 10 mm x 10 mm à 15 mm x 15 mm carré de peau. La taille du défaut devrait être légèrement plus grande (10%) que le greffon. Coupez aussi superficiellement que possible. Prenez soin de préserver la carnosus pannicule et les vaisseaux. Le panniculus carnosus peut être distinguée de la planche de bord sous-jacent, par sa mobilité et les vaisseaux sanguins superficiels qui courent à lui.
  5. Positionner le greffon sur le lit de greffe, ce qui évite des plis le long des bords.
  6. Placez 8 sutures sur les coins et sur le milieu de chaque bord. Pour chaque suture, passer l'aiguille à travers le greffon et ensuite à travers l'carnosus pannicule du greffon lit sous la peau bénéficiaire environnante.
  7. Retirer le masque d'anesthésie et de laisser l'animal récupérer partiellement de l'anesthésie avant d'appliquer le pansement adhésif.
  8. Envelopper la souris receveuse dans un pansement adhésif avec de la gaze repliée sur la greffe. Faire le bandage en combinant deux bandages, coupela partie adhésive de l'une et de placer les deux tampons absorbants ensemble.
  9. Surveiller la souris lors de la récupération de près pour assurer que le bandage ne limite pas le thorax excursion et de respirer. Retirez le bandage si la fréquence respiratoire diminue ou l'animal commence à haleter ou souffle faiblement.

3. Soins postopératoires

  1. Administrer enrofloxacine 5 mg / kg après une intervention chirurgicale pour la prophylaxie de l'infection.
  2. Placez la souris transplantées dans une cage propre sur un coussin chauffant au micro-ondes jusqu'à ce qu'il récupère complètement de l'anesthésie.
  3. Observez la souris pendant 1 h après l'opération avant de le retourner à l'installation de logements.
  4. Sept jours après la chirurgie, anesthésier la souris comme dans l'étape 2.1. Retirez le bandage en coupant seulement par la face ventrale du bandage.
  5. Observer et palper la greffe le jour suivant pour des signes de scabbing, la contraction ou la dureté. Si elle est présente, la greffe peut ne pas avoir atteint vasculariza bontion et devrait être considérée comme une défaillance technique.
  6. Surveillez quotidiennement les signes de rejet. Prendre en considération les greffes rejetée lorsque ≥90% du tissu greffé devient nécrotique.
  7. Euthanasier les animaux rejetés et les récolter pour l'analyse.

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Representative Results

Le placement du bandage sur la souris receveuse est une étape importante de la procédure. La greffe de peau est positionné sur le tronc du destinataire, entre l'épaule, la hanche et la colonne vertébrale (Figure 1). Le bandage est réalisée avec de la gaze pliée et la combinaison de deux bandes adhésives en plastique. La souris receveuse est placé avec le greffon vers le bas au-dessus de la toile métallique sur le centre de la bande. L'utilisation de deux micro pince courbe, l'extrémité inférieure de la bande est tirée en premier, puis la partie supérieure de la bande est enroulée au-dessus de la souris sur l'abdomen.

Dans les modèles complets de désadaptation, de pleine épaisseur des greffes de peau sont généralement rejetées en 8 à 12 jours. Dans les modèles de non - concordance mineures, les réactions de rejet sont plus lents et plus variables, et l'apparition de greffe de peau est caractérisée par des changements distincts moins, tels que la contraction ou de la perte des cheveux (figure 2). greffe aiguë rejet des genreslly commence par un gonflement et un érythème du greffon. Ces événements sont suivis par greffe dessiccation, retrait, et la formation de la tavelure (Figure 2B et C). En fonction du degré de non-concordance de CMH et le protocole de l'immunosuppression, un rejet peut se produire par un procédé subaiguë, marqué par des changements subtils tels que la perte des cheveux, la pigmentation, des crêtes dermiques, et le volume de la greffe. Dans ces cas, une greffe rejetée apparaît brillant, blanc, et sans poils, avec des bords irréguliers (Figure 2F) 14.

Utilisant ce modèle de transplantation de la peau, nous avons étudié une nouvelle approche ciblant le métabolisme des cellules T pour prévenir le rejet de greffe 15. Il est bien connu que les voies de signalisation métaboliques jouent un rôle essentiel à dicter les résultats des réponses des lymphocytes T 16. Les cellules T naïves dépendent de la phosphorylation oxydative mitochondriale pour générer l'énergie nécessaire à la surveillance immunitaire de base. cependant,lors de l' activation, les cellules T effectrices reprogramment métaboliquement pour la glycolyse aérobie et présentent une augmentation du métabolisme de la glutamine 16,17. Utilisation de Balb / c en tant que donateurs et C57BL / 6 en tant que bénéficiaires, nous avons observé que l'inhibition de la glycolyse et la phosphorylation oxydative (2DG + metformine) ou glutamine métabolisme seul (DON) prolonge la survie du greffon de la peau, mais bloquant les trois voies simultanément a entraîné la greffe significativement-augmentation survie (figure 3C). En outre, le traitement métabolique triple était plus efficace que la ciclosporine ou la rapamycine (Figure 3A et B). l'acceptation permanente n'a pas été atteint, et d'autres stratégies, y compris la thérapie de l'épuisement, costimulation blocus, ou thérapies métaboliques nouveaux, peuvent favoriser une meilleure induction de tolérance à la transplantation. Cependant, l'étude a fourni deux nouveaux aperçus: l'utilisation d'inhibiteurs non spécifiques pour cibler les cellules immunitaires sélectives avec une demande métabolique accrue, ainsi que l'exigence de t o bloquer les trois voies métaboliques pour obtenir simultanément une immunosuppression plus robuste dans le rejet de greffe.

inhibiteurs de la calcineurine et la cible mammalienne de la rapamycine (mTOR) inhibiteurs constituent la majeure partie de la thérapie immunosuppressive conventionnelle utilisée dans la transplantation clinique. Les taux de survie médians greffés de Balb / c pour C57BL / 6 greffes de peau traitées avec la cyclosporine et la rapamycine ont été 17 et 16 jours, respectivement. A titre de comparaison, les receveurs traités avec des inhibiteurs métaboliques qui inhibent la glycolyse des cellules T, la phosphorylation oxydative mitochondriale et le métabolisme de la glutamine ont prolongé la survie: la médiane de survie du greffon était de 29 jours. En outre, l'examen histologique des greffes de peau du groupe traité présentait un alignement métabolique des tissus intacts plus et moins infiltrat inflammatoire lymphocytaire (figure 4).

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Figure 1: Recouvrement du greffon avec le Bandage. Greffé (A) de la peau placée à droite du tronc. (B) réalisée avec un bandage de gaze pliée et deux bandes de bandages en matière plastique. Souris (C) du bénéficiaire placé sur la gaze. (DF) Pansement enroulé autour de la souris. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Peau Apparence du greffon au cours aigu et le rejet chronique. (A) Balb / c à C57BL / 6 (décalage complet) de transplantation de la peau pleine épaisseur sans signe de rejet (jour 8). (B) Balb / c à C57BL / 6 de pleine épaisseur transplantation de la peau avec 50% de rejet de greffe (jour 13). (C) Balb / c à C57BL / 6 transplantation de peau totale avec le rejet de greffe complète (jour 18). (D) de la greffe de peau pleine épaisseur syngéniques (jour 8). (E) syngéniques transplantation de la peau de pleine épaisseur (30 jours). (F) C57BL / 10 à C57BL / 6 (mismatch mineur) transplantation de peau totale avec le rejet de greffe chronique (jour 100). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Balb / c à C57BL / 6 greffe de peau de survie. (A) Le traitement par la cyclosporine (25 mg / kg QD). (B) Le traitement avec la rapamycine (3 mg / kg une fois par jour). (C) Le traitement avec des inhibiteurs métaboliques, le 2-désoxy-D-glucose (2DG) 500mg / kg une fois par jour, la metformine 150 mg / kg une fois par jour, et la 6-diazo-5-oxo-L-norleucine (DON) 1,6 mg / kg tous les deux jours. Tous les traitements ont été administrés à partir du jour de la transplantation jusqu'au rejet. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4: hématoxyline et éosine ( à droite, X100, à gauche, X200) de greffes de peau avec la thérapie métabolique au postopératoires Jour 7. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Depuis son introduction par Medawar, d' abord dans des études humaines, puis chez les lapins et les souris, la transplantation de la peau a été un modèle précieux pour l'étude des réponses immunitaires allogéniques 6,7. Dans ce manuscrit, nous présentons un modèle de grande échelle, non-vascularisées, la transplantation de peau totale en utilisant la peau supérieure et inférieure du dos. Diverses méthodes alternatives, y compris en utilisant la peau de la queue ou la peau de l' oreille de la souris comme source de tissu greffé, ont été signalés à ce jour 8,9. Ces modèles présentent l'avantage de la simplicité technique et permettent à haut volume débit. La déficience relative des cellules de Langerhans épidermiques et les cellules dendritiques du derme dans les greffes de peau de queue, cependant, conduit à un rejet tardif et pour facilité l' acceptation du greffon par l'hôte, en particulier dans les modèles de non - concordance de CMH mineures 10,11. Par conséquent, la greffe de peau totale du tronc est considéré comme un modèle plus robuste et plus approprié pour étudier T-cell-mediated rejet aigu 12.

De plus, notre modèle utilise des techniques simples et ne nécessite pas de compétences avancées de microchirurgie. Le temps de fonctionnement est court (~ 10 min par souris à partir du début de l'anesthésie à l'achèvement de la procédure) et de la morbidité et de la mortalité post-opératoire est négligeable. La mortalité opératoire globale ( la mort dans les 24 heures après la chirurgie , plus la mort avant le retrait de la bande) a été rapportée à 3,8% 13. La plupart des complications découlent de surdose d'anesthésie ou de bandages trop restrictives, qui peut être facilement évitée par une surveillance étroite de la fonction respiratoire au cours de la période postopératoire immédiate et par une élimination rapide du bandage dès les premiers signes de détresse respiratoire 6,17.

Le facteur le plus critique dans le processus de prise de greffe est la revascularisation du tissu greffé par la croissance de vaisseaux hôte pour le greffon 6. La peau récoltée nécessites préparation minutieuse, et la dissection de la carnosus pannicule est une étape critique. Nous préférons enlever les carnosus de pannicule sous un microscope. Il est recommandé de commencer la dissection de l'un des bords, et pour faire avancer en poussant lentement le muscle et la séparant de la peau avec la lame d'un tenotomy courbe légèrement inclinée. Le site du lit de greffe doit être loin d'articulations et de la colonne vertébrale. Avant de faire des incisions dans la souris receveuse, l'épaule et la hanche devraient être déplacés pour visualiser les plis de la peau qui aident à délimiter le niveau des articulations. Lors du retrait de la peau du destinataire, il est important d'éviter d'endommager les vaisseaux sanguins qui vont superficielle à l'carnosus pannicule. En cas de saignement, appliquer une compression locale et éliminer le sang et les caillots qui peuvent interférer avec la greffe. Enfin, le bandage ne devrait pas causer des difficultés respiratoires qui compromettent la reprise, même si elle doit être suffisamment constrictive pour empêcher le déplacement de la greffe et l'auto-mutilation pendant le processus de revascularisation. Strips plastique Band-Aids sont adhérentes et assez fort à cet effet. Nous combinons deux bandages pour envelopper complètement la taille de la souris et de permettre la mise en place d'une gaze plié entre le bandage et le greffon (figure 1). Le bandage est enlevé en coupant la face ventrale de celui-ci, et le reste est éliminé par l'animal, afin d'éviter de perturber le greffon tout en essayant de retirer le bandage manuellement.

En résumé, la transplantation de peau totale est un modèle bien établi avec de nombreuses références dans la littérature. La procédure est facile à réaliser, le temps de fonctionnement est court, et les complications post-opératoires sont limitées. Les étapes essentielles sont liées à la récolte de la peau des donateurs méticuleux et le placement correct de la bande de destinataire. Les futures études impliquant des biomatériaux qui favorisent l'angiogenèse et la réparation des tissus peuvent en outre améliorer le taux de la procédure de succès.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Acknowledgments

Ce travail a été financé par le NIH subvention R01AI077610.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Straight micro forceps Sigma F4017
Curved micro forceps Aesculap BD333R
Curved Stevens tenotomy scissors Aesculap BC905R
Mayo dissecting scissors Sigma S3146
Micro needle holder Aesculap BM563R
Sterile gauze Covidien 441218
6-0 Nylon suture MWI 31849
Plastic Strips Band-Aid Johnson & Johnson Obtained from pharmacy
10 cm Petri dish Fisherbrand FB0875712
PBS Quality Biological 119069131
Buprenorphine DEA Number required; Obtained from hospital pharmacy
Enrofloxacin Bayer Health Care 186599

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References

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