Murine Vollhauttransplantation

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Immunology and Infection

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Summary

Murine Vollhauttransplantation ist ein gut etabliertes Modell Ablehnung in einer alloimmune Einstellung zu studieren. Hier bieten wir ein Tutorial von jedem Schritt beteiligt bei der Durchführung einer Balb / c -> C57BL / 6 Vollhauttransplantation.

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Cheng, C. H., Lee, C. F., Fryer, M., Furtmüller, G. J., Oh, B., Powell, J. D., Brandacher, G. Murine Full-thickness Skin Transplantation. J. Vis. Exp. (119), e55105, doi:10.3791/55105 (2017).

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Abstract

Murine Vollhauttransplantation ist ein gut etabliertes in vivo - Modell alloimmune Antwort und Transplantatabstoßung zu studieren. Trotz seiner begrenzten Anwendung auf den Menschen, Hauttransplantation bei Mäusen wurde für Transplantationsforschung weit verbreitet eingesetzt. Das Verfahren ist einfach zu erlernen und durchzuführen, und es erfordert keine empfindliche mikrochirurgischer Techniken noch eine umfassende Ausbildung. Darüber hinaus tritt Ablehnung Transplantat in diesem Modell in einer sehr reproduzierbaren immunologischen Reaktion und leicht durch direkte Inspektion und Palpation überwacht wird. Darüber hinaus können sekundäre Hauttransplantation mit Spender abgestimmt oder von Drittanbietern Hauttransplantationen auf komplexere Transplantationsmodelle als Alternative und unkomplizierte Methode durchgeführt werden spenderspezifischen Toleranz zu beurteilen. Die Komplikationen sind niedrig und sind in der Regel auf die Anästhesie Überdosierung oder Atemnot nach dem Verfahren beschränkt. Transplantatversagen, auf der anderen Seite, tritt häufig als Folge der schlechten Vorbereitung der grachtern, falsche Positionierung im Transplantat-Bett, oder unangemessene Platzierung der Bandage. In diesem Artikel präsentieren wir ein Protokoll für Vollhauttransplantation bei Mäusen und beschreiben die wichtigen Schritte, die für eine erfolgreiche Prozedur.

Introduction

Organtransplantation ist die Behandlung der Wahl für Patienten im Endstadium einer Organversagen, und die Ergebnisse haben sich verbessert bemerkenswert mit den Fortschritten bei chirurgischen Eingriffen und Immunsuppression Protokolle. Allerdings ist die langfristige Immunsuppression mit erheblichen Nebenwirkungen verbunden sind, und die Entwicklung neuer Strategien, die Toleranz bleibt das Ziel der modernen Transplantationsforschung fördern.

Zahlreiche Tiermodelle wurden für die Grundlagenforschung in der Transplantationsmedizin entwickelt, die Mechanismen der Abstoßungsreaktionen zu untersuchen und zur Verhinderung einer Transplantatabstoßung Immunsuppression Ansätze zu testen und 1-3 langfristige Toleranz zu fördern. Mausmodelle sind die tragende Säule der immunologischen Forschung aufgrund der exklusiven, großen Verfügbarkeit von diagnostischen und therapeutischen Antikörpern und gut definierten Inzucht und transgenen Stämme werden. Hauttransplantation ist ein einfaches Verfahren, das keine spezielle mikrochirurgische Fähigkeiten erfordert und kannleicht postoperativ überwacht. Zusammengenommen Maus Hauttransplantation hat in der alloimmune Antwort beteiligt ein hervorragendes Instrument zu studieren viele Aspekte, einschließlich der Antigenabgabe, Zellhandel und Gewebezerstörung bei Transplantatabstoßung 4,5.

Hier zeigen wir den Schritt-für-Schritt-Verfahren für Vollhauttransplantation das Maus-Modell, und wir beschreiben die wichtigen Schritte, die für eine erfolgreiche Verpflanzung der transplantierten Haut.

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Protocol

Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren des National Institute of Health (NIH) durchgeführt und wurden von der Johns Hopkins University Animal Care und Use Committee (JHUACUC) zugelassen. Die spezifischen Verfahren wurden im Rahmen der genehmigten ACUC Protokolle MO13M292 und MO13M370 ausgeführt.

1. Spenderhaut-Ernte

  1. Anesthetize die Spendermaus mit Isofluran (Induktionsverdampfer bei 4%, Wartung mit einem 1 - 2% durch die Maus Kegel). Verwenden Sie die Zehe Prise Rückzug Reflex die Tiefe der Narkose zu überwachen.
  2. Mit einem elektrischen Rasierer, rasieren den Rücken des Tieres und desinfizieren sie mit 10% Povidon - Iod (zB Betadine).
  3. Mit einer sterilen Schere, Handschuhe und aseptischer Technik, Ernte Spender Rückenhaut von der Hüfte bis zum Hals, mit stumpfer Präparation auf der Ebene des areolar Bindegewebe.
  4. Euthanize das Tier durch Genickbruch nach der Ernte derHauttransplantation.
  5. Unter einem Mikroskop, trennen das Bindegewebe, Fettgewebe und panniculus carnosus von der Rückseite Haut fein tenotomy Schere. Die panniculus carnosus ist eine dünne, transparente Muskel verantwortlich für die Haut Zucken Bewegungen.
  6. Mit einer sterilen Instrumenten Technik, ausschneiden 15 mm x 15 mm Transplantate von der Rückseite Haut für einen 10-mm x 10 mm bis 15 mm x 15 mm Transplantats Bett.
  7. Speichern der Transplantate auf Gazen getränkt mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in einer Petrischale auf Eis.
    HINWEIS: 8 - 10 Transplantate können von einem Spender Maus erhalten werden.

2. Empfänger Hauttransplantat

  1. Anesthetize die Empfängermaus mit Isofluran (Induktionsverdampfer bei 4%, Wartung mit einem 1 - 2% durch die Maus Kegel). Verwenden Sie die Zehe Prise Rückzug Reflex die Tiefe der Narkose zu überwachen.
  2. Verwalten 0,02 mg / kg KG von Buprenorphin zur postoperativen Schmerzlinderung.
  3. Rasur auf die Seite der Rücken des Tieres, wo das Transplantat will eingeführt werden und mit 10% Povidon-Jod desinfizieren.
  4. Mit einer Schere, schneiden Sie ein 10-mm x 10 mm bis 15 mm x 15 mm im Quadrat der Haut. Die Defektgröße sollte etwas größer (10%) als das Transplantat sein. Schneiden Sie so oberflächlich wie möglich. Achten Sie darauf, die panniculus carnosus und Gefäße zu erhalten. Die panniculus carnosus kann von der darunter liegenden Faszie durch seine Beweglichkeit und die Blutgefäße zu unterscheiden, die es oberflächlich laufen.
  5. Positionieren Sie das Transplantat auf dem Transplantat-Bett, zu vermeiden Falten entlang der Kanten.
  6. Platzieren 8 Nähte an den Ecken und auf der Mitte jeder Kante. Für jede Naht, die Nadel durch das Transplantat und dann durch die panniculus carnosus der unterhalb der umgebenden Haut Empfängerbett Transplantat.
  7. Entfernen Sie die Narkosemaske und lassen Sie das Tier erholen teilweise aus der Narkose, bevor der Klebstoff Verband angelegt wird.
  8. Wickeln Sie die Empfängermaus in einem Pflaster mit gefalteten Gaze über das Transplantat. Machen Sie den Verband zwei Bandagen durch Kombinieren, Schneidender Klebstoff Teil ein und die beiden saugfähigen Kissen zusammen setzt.
  9. Überwachen Sie die Maus genau während der Wiederherstellung, um sicherzustellen, dass der Verband nicht Thorax Exkursion einschränkt und zu atmen. Entfernen Sie den Verband, wenn die Atemfrequenz verringert oder das Tier beginnt zu seicht nach Luft schnappen oder Atem.

3. Nachsorge

  1. Verabreichen Enrofloxacin 5 mg / kg nach der Operation zur Infektionsprophylaxe.
  2. Legen Sie die transplantierten Maus in einem sauberen Käfig über einen mikrowellentauglichen Heizkissen, bis sie vollständig aus der Narkose erholt.
  3. Beachten Sie die Maus für 1 Stunde der Operation, bevor es in das Gehäuse Anlage zurück.
  4. Sieben Tage nach der Operation, anästhesieren der Maus, wie in Schritt 2.1. Entfernen Sie den Verband nur durch die Bauchseite der Bandage zu schneiden.
  5. Bitte beachten und das Transplantat am folgenden Tag auf Anzeichen von Schorf, Kontraktion oder Härte abtasten. Falls vorhanden, kann das Transplantat nicht ordnungsgemäße vasculariza erreicht habention und sollte ein technisches Versagen in Betracht gezogen werden.
  6. Überwachen täglich auf Anzeichen von Abstoßung. Betrachten wir Transplantate abgelehnt, wenn ≥90% des Transplantats Gewebe nekrotisch wird.
  7. Euthanize die zurückgewiesenen Tiere und ernten sie für die Analyse.

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Representative Results

Die Platzierung der Verband auf der Empfängermaus ist ein wichtiger Schritt des Verfahrens. Die Hauttransplantation ist auf dem Empfängerstamm positioniert, zwischen der Schulter, Hüfte und Wirbelsäule (Abbildung 1). Die Binde wird mit gefalteten Gaze und die Kombination von zwei Kunststoffklebeverbänden hergestellt. Die Empfängermaus wird mit dem Transplantat nach unten über die Gaze auf die Mitte der Binde angeordnet. Verwendung von zwei gekrümmten Mikropinzette, ist das untere Ende der Bandage gezogen zuerst und dann die Oberseite der Bandage über der Maus auf den Bauch gewickelt.

In völliger Fehlanpassungs Modelle sind Vollhauttransplantaten in der Regel 8 bis 12 Tagen abgelehnt. In kleineren Fehlanpassungsmodelle sind Abstoßungsreaktionen langsamer, variabel, und die Hauttransplantation Erscheinungsbild wird durch weniger deutliche Veränderungen wie Schrumpfung oder den Verlust von Haaren (2) gekennzeichnet. Akute Abstoßungsreaktion Gattungenlly beginnt mit Schwellung und Rötung des Transplantats. Diese Ereignisse werden gefolgt von Graft Austrocknungs, Schrumpfung und Krustenbildung (2B und C). Je nach dem Grad der Nichtübereinstimmung und dem MHC Immunsuppression Protokoll, Ablehnung kann durch eine subakute Prozess, gekennzeichnet durch subtile Veränderungen wie Haarausfall, Pigmentierung, Papillarlinien und Graft Volumen auftreten. In diesen Fällen erscheint ein abgelehnter Transplantat glänzend, weiß und unbehaart, mit unebenen Kanten (2F) 14.

Unter Verwendung dieses Modells von Hauttransplantation untersuchten wir einen neuartigen Ansatz Targeting T-Zell - Stoffwechsel 15 Transplantatabstoßung zu verhindern. Es ist bekannt , dass metabolische Signalwege eine entscheidende Rolle bei diktierte die Ergebnisse der T-Zell - Reaktionen 16 spielen. Naiver T-Zellen beruhen auf der mitochondrialen oxidativen Phosphorylierung die notwendige Energie für die grundlegende Immunüberwachung zu erzeugen. Aber,bei Aktivierung, Effektor - T - Zellen umprogrammieren metabolisch zu aerobe Glykolyse und zeigen eine erhöhte Glutamin Stoffwechsel 16,17. Mit Balb / c als Spender und C57BL / 6 als Empfänger beobachteten wir, dass die Hemmung der Glykolyse und oxidative Phosphorylierung (2DG + Metformin) oder Glutamin Stoffwechsel allein (DON) Hauttransplantation Überleben verlängert, aber die Blockierung der drei Wege führten gleichzeitig in deutlich erhöhter Transplantat Überlebenszeit (Figur 3C). Außerdem war triple metabolische Therapie wirksamer als herkömmliche Cyclosporin oder Rapamycin (3A und B). Ständige Annahme wurde nicht erreicht, und weitere Strategien, einschließlich der Depletion-Therapie, Kostimulation Blockade oder neuere metabolischen Therapien fördern kann eine bessere Induktion von Transplantationstoleranz. Allerdings stellte die Studie zwei neue Erkenntnisse: die Verwendung von nicht-spezifischen Inhibitoren selektive Immunzellen mit einer erhöhten metabolischen Anforderungen an Ziel sowie die Anforderung t o blockieren die drei Stoffwechselwege gleichzeitig robuster Immunsuppression bei Transplantatabstoßung zu erhalten.

Calcineurin Inhibitoren und mammalian target of rapamycin (mTOR) Inhibitoren darstellen meisten herkömmlichen immunsuppressiven Therapie in der klinischen Transplantation verwendet. Median Transplantat-Überlebensraten von Balb / c zu C57BL / 6 Hauttransplantaten behandelt mit Cyclosporin und Rapamycin waren 17 und 16 Tagen auf. Im Vergleich dazu behandelten Empfänger mit metabolischen Inhibitoren, die T-Zell-Glykolyse, mitochondriale oxidative Phosphorylierung und Glutamin Stoffwechsel Überleben hatte verlängert hemmen: die mediane Überleben des Transplantats war 29 Tage. Darüber hinaus zeigte die Histologie von Hauttransplantaten aus der metabolischen Therapiegruppe mehr intaktem Gewebe Ausrichtung und weniger lymphatischer Entzündungsinfiltrat (Abbildung 4).

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Abbildung 1: Bedecken des Transplantats mit dem Verband. (A) Hauttransplantat auf der rechten Kofferraum platziert. (B) Bandage hergestellt mit einem gefalteten Gaze und zwei Kunststoffstreifen Bandagen. (C) Empfängermaus auf die Gaze gelegt. (DF) Bandage um die Maus gewickelt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: Skin Graft Aussehen während der akuten und chronischen Abstoßung. (A) Balb / c zu C57BL / 6 (vollständige Mismatch) Vollhauttransplantation ohne Nachweis einer Ablehnung (Tag 8). (B) Balb / c zu C57BL / 6 Vollhauttransplantation mit 50% der Transplantatabstoßung (Tag 13). (C) Balb / c zu C57BL / 6 Vollhauttransplantation mit kompletten Transplantatabstoßung (Tag 18). (D) syngenen Vollhauttransplantation (Tag 8). (E) syngenen Vollhauttransplantation (Tag 30). (F) C57BL / 10 bis C57BL / 6 (minor Mismatch) Vollhauttransplantation mit chronischer Transplantatabstoßung (Tag 100). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3: Balb / c zu C57BL / 6 Skin Graft Überleben. (A) Die Behandlung mit Cyclosporin (25 mg / kg QD). (B) Die Behandlung mit Rapamycin (3 mg / kg QD). (C) Behandlung mit metabolischen Inhibitoren, 2-Deoxy-D-Glukose (2DG) 500mg / kg QD, Metformin 150 mg / kg QD und 6-Diazo-5-oxo-L-norleucin (DON) 1,6 mg / kg QOD. Alle Behandlungen wurden ab dem Tag der Transplantation bis Abstoßung verabreicht. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4: Hämatoxylin und Eosin - Färbung (rechts, X100, links, X200) von Hauttransplantaten mit Metabolic Therapie bei postoperativen Tag 7. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Seit seiner Einführung durch Medawar, zuerst in Studien am Menschen und dann bei Kaninchen und Mäusen hat Hauttransplantation ein unschätzbares Modell für die Untersuchung von allogenen Immunantworten 6,7 gewesen. In diesem Manuskript präsentieren wir ein Modell von großen, nicht-gefäß, Vollhauttransplantation die oberen und unteren Rückenhaut verwendet wird. Verschiedene alternative Methoden, einschließlich der Schwanzhaut oder Ohrhaut der Maus als Transplantatgewebe Quelle, wurde berichtet , 8,9 bis heute. Diese Modelle präsentieren den deutlichen Vorteil, technische Einfachheit und ermöglichen High-Volume-Durchsatz. Der relative Mangel an epidermalen Langerhans - Zellen und dermale dendritische Zellen in Schwanzhauttransplantate, führt jedoch zu einer verzögerten Abstoßung sowie erleichtert Transplantat Akzeptanz durch den Wirt, insbesondere in kleineren MHC Mismatch Modelle 10,11. Daher wird die gesamte Dicke Stamm Hauttransplantation ein robusteres Modell und besser geeignet zu studieren T-Zell-Medien betrachtetted akuten Abstoßung 12.

Darüber hinaus beschäftigt unser Modell einfache Techniken und nicht erweiterte mikrochirurgisch Fähigkeiten erfordern. Die Betriebszeit ist kurz (~ 10 min pro Maus vom Beginn der Anästhesie bis zum Abschluss des Verfahrens) und die postoperative Morbidität und Mortalität vernachlässigbar ist. Das gesamte operative Sterblichkeit (Tod innerhalb von 24 Stunden nach der Operation plus Tod vor der Entfernung des Verbands) wurde berichtet , 3,8% 13 sein. Die meisten der Komplikationen entstehen aus der Narkose Überdosierung oder übermäßig restriktiven Bandagen, die leicht durch eine enge Überwachung der Atemfunktion während der unmittelbaren postoperativen Phase und durch rasche Entfernung des Verbands in den frühesten Anzeichen von Atemnot 6,17 verhindert werden kann.

Der kritischste Faktor in dem Prozess der Verpflanzung ist die Revaskularisierung des Transplantats Gewebe durch das Einwachsen von Wirtsgefäße auf das Pfropf - 6. Die geerntete Haut erforderns eine sorgfältige Vorbereitung und die Präparation des panniculus carnosus ist ein kritischer Schritt. Wir bevorzugen die panniculus carnosus unter einem Mikroskop zu entfernen. Es wird empfohlen, die Dissektion von einem der Ränder zu beginnen und langsam voran durch den Muskel Schub- und es von der Haut mit der Klinge eines gekrümmten tenotomy abgewinkelt leicht trennen. Die Seite des Transplantats Bett sollte von Gelenken und der Wirbelsäule weit sein. Vor dem Erstellen von Einschnitten in die Empfängermaus, sollte die Schulter und Hüfte bewegt werden, um die Haut Falten sichtbar zu machen, die das Niveau der Gelenke abgrenzen helfen. Wenn der Empfänger der Haut zu entfernen, ist es wichtig, die Blutgefäße zu beschädigen, die dem panniculus carnosus oberflächlich laufen. Wenn die Blutung auftritt, gelten lokale Kompression und entfernen Blut und Blutgerinnsel, die mit Verpflanzung stören können. Schließlich sollte der Verband nicht Atembeschwerden, dass ein Kompromiss Erholung führen, obwohl es ausreichend constrictive sein muss Verschiebung des Transplantats und Auto-mu zu verhinderntilation während des Prozesses der Revaskularisierung. Kunststoff-Streifen Band-Aids sind haftend und stark genug für diesen Zweck. Wir kombinieren zwei Bandagen vollständig mit der Maus Taille wickeln und die Platzierung einer gefalteten Gaze zwischen dem Verband und dem Transplantat (Abbildung 1) zu ermöglichen. Die Bandage wird durch Aufschneiden der Bauchseite davon entfernt, und der Rest wird von dem Tier entfernt wird, um das Transplantat nicht zu stören beim Versuch, den Verband von Hand zu entfernen.

Zusammengefasst ist Vollhauttransplantation ein gut etabliertes Modell mit reichlich Referenzen in der Literatur. Das Verfahren ist einfach durchzuführen, ist die Betriebszeit kurz und die postoperativen Komplikationen sind begrenzt. Die kritischen Schritte beziehen sich auf sorgfältige Spenderhaut Ernte und die korrekte Platzierung des Empfängers Verband. Zukünftige Studien mit Biomaterialien, die Angiogenese und die Reparatur von Gewebe fördern kann weiterhin die Erfolgsrate des Verfahrens zu verbessern.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von NIH Zuschusses R01AI077610 finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Straight micro forceps Sigma F4017
Curved micro forceps Aesculap BD333R
Curved Stevens tenotomy scissors Aesculap BC905R
Mayo dissecting scissors Sigma S3146
Micro needle holder Aesculap BM563R
Sterile gauze Covidien 441218
6-0 Nylon suture MWI 31849
Plastic Strips Band-Aid Johnson & Johnson Obtained from pharmacy
10 cm Petri dish Fisherbrand FB0875712
PBS Quality Biological 119069131
Buprenorphine DEA Number required; Obtained from hospital pharmacy
Enrofloxacin Bayer Health Care 186599

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References

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