生理的酸素条件に曝露されたヒト細胞におけるキャップ結合タンパク質の解析

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Timpano, S., Melanson, G., Evagelou, S. L., Guild, B. D., Specker, E. J., Uniacke, J. Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions. J. Vis. Exp. (118), e55112, doi:10.3791/55112 (2016).

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Abstract

Introduction

翻訳制御は、特に細胞ストレス1の期間中に、遺伝子発現の転写調節にも等しく重要なステップとして浮上しています。翻訳制御の焦点は、タンパク質合成の最初のステップは7-メチルに真核生物の開始因子4E(のeIF4E)の結合を伴う開始の律速段階(メートル7 GTP)のmRNA 2の5 'キャップであります。 eIF4EはeIF4A、RNAヘリカーゼ、およびeIF4Gを、他の翻訳因子と40Sは3リボソームの募集に必要な足場タンパク質を含んでeIF4Fという名前の三量体複合体の一部です。正常な生理的条件下では、mRNAの大半はキャップ依存性機構を介して翻訳されていますが、細胞ストレスの期間の下で人間のmRNAの約10%が1,4- intiationキャップ非依存性翻訳される可能性があり5'UTRを含まれています。キャップ依存性翻訳は、歴史的に同義語となっていますOUのeIF4Fで、しかし、eIF4Fのストレス固有のバリエーションが話題に5-8となっています。

様々な細胞ストレスはのeIF4E活性がラパマイシン複合体1(mTORC1)の哺乳類標的を介して抑制させます。このキナーゼは、その目標の一つ、4E結合タンパク質(4E-BP)の活性の増加をもたらすストレス、下損なわれる。非リン酸化4E-BPはのeIF4EとブロックのeIF4Gは、キャップ依存性翻訳9,10の抑制を引き起こすと相互作用する能力に特異的に結合します。興味深いことに、eIF4E2(または4EHP)という名前のeIF4Eのホモログは、おそらく、それがストレス媒介抑制を回避することができ、4E-BP 11のためのはるかに低い親和性を有します。確かに、最初は原因のeIF4G 12との相互作用の欠如への翻訳のリプレッサーとして特徴づけ、eIF4E2は、低酸素ストレス6,13の間にそれらの3 'UTR中のRNAの低酸素応答エレメントを含むmRNAの何百もの翻訳を開始します。この活性化IeIF4G3、RNA結合タンパク質モチーフ4、および低酸素誘導因子、低酸素eIF4F複合体を構成する(HIF)2α、またはeIF4F H 6,13との相互作用を介して達成秒。通常の条件下ではリプレッサーとして、eIF4E2はGIGYF2とZNF598 14と結合します。これらの複合体は、部分的には、アガロース結合M 7 GTPの親和性樹脂を介して同定されました。この古典的な方法15は、翻訳の分野における標準であり、最高の、最も一般的にプルダウンでキャップ結合複合体を単離するための技術を使用し、in vitroでの結合アッセイ16-19です。キャップ依存性翻訳機構の間に変化する部分6-8,13のように柔軟で適応浮上しているように、この方法は急速にストレス応答に関与する新規キャップ結合タンパク質を同定するための強力なツールです。いくつかの真核生物のモデル系は、このようなストレス応答のためeIF4E2ホモログを使用するように見えるようさらに、eIF4Fの変動は、広い意味を持っている可能性がシロイヌナズナ 20として、S.ポンベ 21は 、Dは 22 ショウジョウバエ 、およびCは 23 エレガンス

証拠は、eIF4Fの変動がストレス条件に厳密に限定されないが、通常の生理24に関与することを示唆しています。 (微小電極を介して測定)(キャピラリー端で)または組織内の組織への酸素供給は、脳25で2から6パーセントから変化し、肺26百分の3から12まで、腸27、4%でで3.5から6パーセント肝臓28、腎臓29内の7から12までパーセント、筋肉30で4%、および骨髄31で6から7パーセント。細胞およびミトコンドリアは、1.3%未満の酸素32を含んでいます 。これらの値は、細胞が日常的に培養される周囲の空気よりも低酸素状態に非常に近いです。これは、どのような以前に低酸素症特異的な細胞過程であると考えられたが、生理的環境の中で関連するかもしれないことを示唆しています。興味深いことに、eIF4FとeIF4F H 「physioxia」24に露出し、いくつかの異なるヒト細胞株におけるmRNAの異なるプールまたはクラスの翻訳開始に関与します。低酸素はまた、適切な胎児の発育33を駆動し、細胞は、一般physioxia 34においてより高い増殖速度、より長い寿命、より少ないDNA損傷の少ない一般的なストレス応答を持っています。したがって、eIF4F Hは、おそらく生理的条件下で、選択遺伝子の発現の重要な要因です。

ここでは、固定された生理的酸素条件や組織の微小環境の可能性が高い、より代表的であるダイナミック変動範囲内の培養細胞へのプロトコルを提供します。この方法の一つの利点は、細胞が低酸素ワークステーション内に溶解されることです。細胞溶解に低酸素細胞培養物からの遷移は、他のプロトコルで実行される頻度は明らかではありません。細胞は、多くの場合、最初の小さな低酸素培養器から除去されること酸素に対する細胞応答が速いようフォア溶解するが、酸素へのこの暴露は35(1または2分)生化学的経路に影響を与える可能性があります。特定のキャップ結合タンパク質が第2の基地との相互作用を必要とするか、またはメートル7 GTPを加水分解することができ、したがって、いくつかのキャップ相互作用は、精製プロセスにおいて見落とされる可能性があります。アガロース結合酵素耐性キャップ類似体には、このプロトコルで置換されていてもよいです。ここに記載の方法によりeIF4F HとeIF4Fの他のバリエーションの活性および組成を探ることは、細胞が生理的条件やストレス応答の際に利用する複雑な遺伝子発現機械に光を当てるます。

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Protocol

細胞培養のための1.準備

  1. ヒト細胞の市販の株式を購入します。
    注:このプロトコルは、HCT116結腸直腸癌および初代ヒト腎近位尿細管上皮細胞(HRPTEC)を利用します。
  2. HCT116の培養のための500ミリリットルの媒体を作る:ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)/ 7.5%ウシ胎児血清(FBS)および1%ペニシリン/ストレプトマイシン(P / S)を補充した高グルコース培地。
  3. HRPTECの培養物を500 mlの培地を加える:5%FBS、1%の上皮細胞成長サプリメント、1%P / Sを補充した上皮細胞培地。
  4. 140mMのNaClを、3のKCl、10mMののNa 2 HPO 4、15mMのKH 2 PO 4:1×リン酸緩衝生理食塩水(PBS)の500ミリリットルを準備します。 pHを7.4に調整し、121℃で40分間オートクレーブで滅菌します。

細胞培養の2開始

  1. 慎重トンを乱すことなく、80〜90%のコンフルエント皿から培地を吸引彼は細胞。
  2. アリコート培養皿あたり1×PBS 3〜5mlの、静かにコーティングするために皿の表面積を各フラスコを揺らして、慎重に1×PBSを吸引します。第1×PBS洗浄のために繰り返します。
  3. 各培養皿に小分けし、0.05%トリプシン - エチレンジアミン四酢酸(EDTA)の3ミリリットルを、穏やかにトリプシンEDTAで均一にコート細胞をに揺すります。 2-3分間37℃でインキュベートします。
  4. 90秒間4000×gで15ミリリットルの遠心分離管と遠心分離機に剥がれた細胞を転送します。
  5. 完全DMEM 1ml中に再懸濁細胞ペレット。
  6. 血球計数器を用いて細胞数を計測します。 100mMの細胞培養皿は、1cm 2あたり約2,500〜5,000細胞の初期播種密度を達成するために必要とされるどのように多くの非発熱性及びポリスチレン計算します。
  7. ステップ30から45分間、37℃の水浴中で1.2または1.3で行われたプレ暖かい完全な細胞培養培地。
  8. 70%エタノールを含む培地ボトル細胞バイアルを除染。この点から前方すべて操作は無菌的に行われるべきです。
  9. ステップ2.6で述べた播種密度内で凍結細胞のボリューム全体を使用するために必要な限り多くの100mmの細胞培養皿にアリコート完全DMEM 6ミリリットル。
  10. 100mm培養皿のそれぞれに、ステップ2.6で算出された細胞懸濁液の量を転送します。均等にプレートの表面上に細胞を分配するために、手動で各プレートを揺らし。
  11. 5%CO 2雰囲気中で37℃のインキュベーター内でシードされた100ミリメートル細胞培養皿を置きます。細胞は、次のステップの前に、少なくとも24時間インキュベートすることを許可します。

3.継代

  1. 細胞集密度の割合(皿の面積をカバー%細胞)を決定するために、顕微鏡下で各細胞培養皿を表示します。インキュベーターとプリ暖かい完全培地および1×PBSに細胞を返します。細胞は、80から100までパーセントのコンフルエントであれば次のステップに進みます。
  2. 慎重に乱すことなく、使用済み培地を吸引各培養皿中の細胞。
  3. アリコート培養皿あたり1×PBS 3〜5mlの、静かにコーティングするために皿の表面積を各フラスコを揺らして、慎重に1×PBSを吸引します。第1×PBS洗浄のために繰り返します。
  4. 各培養皿に小分けし、0.05%トリプシン-EDTAの3ミリリットルを、穏やかにトリプシンEDTAで均一にコート細胞をに揺すります。 2-3分間37℃でインキュベートします。
  5. このインキュベーションの間に、多くの培養皿にアリコート完全培地10mlを1cm 2あたり2,500〜5,000の細胞の細胞密度を得るために必要とされます。
  6. 細胞がプレートから剥離したら、すぐに1×定義されたトリプシンインヒビターの3ミリリットルを追加し、穏やかにトリプシンEDTAの全てが中和されていることを確認するために、1分間の皿を旋回。
  7. 無菌の15mlの遠心管に剥がれた細胞を移し、脇に置きます。残りの細胞を収集し、同じ15ミリリットルの遠心管にそれを転送するために皿にPBS 1×3ミリリットルを追加します。
  8. 150 XGを遠心分離して細胞をペレット化5分間。
  9. 上清を吸引し、完全培地3mlに細胞ペレットを再懸濁します。
  10. 血球計を用いて細胞を計数し、1cm 2あたり2,500〜5,000の細胞の細胞密度を得るために完全培地15 mlを含むの150mm培養皿に播種。各キャップ結合アッセイのための2つの150ミリメートルを使用してください。
    注:液体培地を介して細胞への酸素の拡散は、ボリューム36に依存しています。懸濁液中の接着細胞や細胞を使用するかどうかの実験の間で一貫性のメディアの容量を維持することが推奨されています。メディアが拡散でこれらの変動性を回避するために、(議論で説明したように24時間のワークステーションでインキュベート)予め調節することができます。
  11. 5%CO 2雰囲気中で37℃のインキュベーターで播種し、培養皿を置きます。細胞は、次のステップに進む前に、少なくとも24時間インキュベートすることを許可します。

4. Physioxic露出

  1. 顕微鏡下で細胞を見ます。 BESのためのトンの結果は、細胞が24時間の暴露70〜80%コンフルエント、48時間の暴露50〜60%コンフルエント、および72時間の暴露40〜50%コンフルエントであることを確認してください。
  2. 所望の時間(24、48、または実験に応じて72時間)のための低酸素ワークステーションにセルを配置します。
  3. 適切なphysioxiaにワークステーションを設定します。
    注:たとえば、3%O 2設定は、5%のCO 2および92%N 2を伴うことになります。
    注:ダイナミックレンジ内の酸素変動が機器内に特定のタイムライン、プログラムのスケジュールを超える希望するか、手動で任意の間隔で酸素の設定を調整している場合。
  4. 60%の湿度を設定します。ワークステーションの雰囲気は、それにもかかわらず、非常に乾燥している、とメディアが著しく長い実験(> 48時間)の間に蒸発します。 (メディアは、ワークステーションの雰囲気で平衡化されるように)細胞培養DISのメディアを補充するためにワークステーション内の細胞培養フラスコ内のメディア予約を保ちます彼は。
    注:溶存酸素は大気中の酸素36と均衡するような(例えば、PBSおよびトリプシンEDTAなど)、溶解前に細胞と相互作用する任意のソリューションは、低酸素ワークステーション内で使用する前に24時間事前に調整されなければなりません。
  5. 溶解するまでワークステーション内の細胞を保管してください。

キャップ結合アッセイ5.準備バッファ

  1. 調製1×トリス緩衝食塩水(TBS)。
    1. dH 2 Oの800ミリリットルで、8.76グラムのNaClおよび6.05グラムトリス塩基を溶解します。
    2. 1 M HClを用いて7.4の最終pHに対する解決策をもたらします。
    3. dH 2 Oを使用して、1リットルに最終容量を持参
  2. 非変性溶解バッファーを準備します。キャップ結合アッセイの日を緩衝溶解準備します。空白のアガロースビーズとγアミノフェニルメートル7 GTPアガロースC10-リンクビーズ(7.9および7.13ステップ)を洗浄するために余分な溶解バッファーを作成します。
    1. dH 2 Oの7ミリリットルで、160μlの5 MのNACを追加リットル、160μlの1 Mトリス塩酸pH7.4の、40μlの200mMのNaFを、40μlの1 MのMgCl 2、および40μlの1mMのオルトバナジウム酸ナトリウム。
    2. 7ミリリットル溶液にイゲパールの40μLを加えます。それは非常に粘性があるようイゲパルを取得支援するためにピペットの先端をカットします。
    3. イゲパルの全てが溶解するまで、ピペッティング、またはボルテックスによって7ミリリットルの溶液を混ぜます。
    4. 8ミリリットルの溶液の最終容量を上げ、氷上に保ちます。
  3. 4xのドデシル硫酸ナトリウム(SDS)-PAGEサンプルバッファーを準備します。
    1. ビーカーに、16ミリリットルの1MのTris-HCl pHが6.8、12.64ミリリットルグリセロール、および8ミリリットルジチオスレイトール(DTT)を組み合わせます。
    2. SDSの3.2グラムとブロモフェノールブルーの0.16グラムを追加します。粉末が完全に磁気攪拌棒を混合することにより溶解させます。
    3. -20℃で1.5 mlマイクロチューブに小分けし、店舗。

6.細胞溶解

  1. 非変性溶解緩衝液を準備し、氷の上で目の日を保ちます電子キャップ結合アッセイ。
  2. 前加温1×PBSと30分間37℃の水浴中でトリプシン。
  3. 各キャップ結合アッセイ1.5 mlマイクロ遠心チューブに溶解緩衝液のアリコート980μlを行っています。
  4. 溶解緩衝液980μlに、4-(2-アミノエチル)ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩および100Xプロテアーゼ阻害剤カクテルを10μlの10μLを加えます。氷の上に保管してください。
  5. 低酸素ワークステーション内の廃棄物容器内の各150ミリメートル皿からメディアを破棄します。
  6. 暖かい1×PBS 3-4 mlの細胞を洗浄し、液体のすべてを捨てます。
  7. 各皿に暖かい0.05%トリプシンEDTAの1ミリリットルを加え、2分間、または細胞がもはやプレートに接着されるまで放置します。
  8. ピペットを用いて1.5 mlのマイクロ遠心チューブに1プレートの細胞を移します。必要に応じてセルの各プレートが別々の1.5mL微量遠心管に転送されるように繰り返します。
  9. 90秒tの6000×gで1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブを遠心O細胞をペレット。
  10. ペレットを乱すことなくピペットを用いてトリプシンを吸引します。ペレットを1.5 mlのマイクロ遠心チューブは、90秒間6000×gで再遠心分離、乱された場合。
  11. 優しくちょうどペレット上記チューブに200μlのPBSをピペットで暖かい1×PBSで細胞を洗浄。再び遠心分離し、ペレットを乱されている場合。
  12. ペレットを乱すことなくPBSを吸引します。
  13. 1ミリリットルからピペット500μlを最初に携帯ペレットに溶解緩衝液を調製しました。ピペッティングにより完全にペレットを再懸濁。
  14. 第二の細胞ペレットに再懸濁された細胞を組み合わせて、上下にピペッティングすることにより、第2のペレットを再懸濁。すべてのペレットを合わせ、各サンプルのために再懸濁されるまで、このプロセスを繰り返します。
  15. 1.5ミリリットルマイクロチューブに溶解バッファーの残りの500μlの溶解液を兼ね備えています。
  16. 低酸素ワークステーションからのサンプルを削除します。
    注:溶解緩衝液を添加した後、LL以降の工程は、低酸素ワークステーションを37℃に設定し、次のステップは、冷(4℃または氷上で)実行されるべきであるよう、周囲空気中で実施されます。
  17. 溶解1.5-2時間、4℃でサンプルを回転させることにより、穏やかな攪拌を使用して細胞。
  18. 細胞破片を除去するために、4℃で15分間12,000×gで溶解した細胞を遠心します。
  19. 新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブにライセートを移し、ペレットを捨てます。
  20. 将来のウェスタンブロット分析のための全細胞溶解物の入力制御として使用される上清の一部(5~10%)を予約します。

7.キャップ結合アッセイ

  1. 各サンプルについて、1.5ミリリットルのマイクロチューブを分離するために、ブランクアガロースビーズ制御スラリー50μlのとγアミノフェニルメートル7 GTPアガロースC10-リンクビーズスラリー50μlのを転送します。ビーズスラリーの収集を容易にするために、ピペットの先端を除去するために、はさみを使用してください。
  2. ビーズbをペレットyが30秒間500×gでスラリーを遠心分離します。
  3. 慎重に上清を除去し、TBS500μlのビーズを再懸濁します。
  4. 繰り返しは、7.2と7.3を繰り返します。 30秒間500×gでビーズをペレット化し、上清を除去します。
  5. 空白のアガロースビーズを含む1.5 mlマイクロチューブにステップ6.19からの溶解物を含有する上清を移します。
    注:空白のアガロースビーズは非特異的にビーズと相互作用する溶解物からタンパク質を除去するためのプレクリアステップとして機能します。
  6. 穏やかに攪拌しながら4℃で10分間インキュベートします。
  7. 30秒間500×gで遠心分離することにより、ブランクのアガロースビーズをペレット化。
  8. γアミノフェニルメートル7 GTPアガロースC10-リンクビーズを含む1.5 mlのマイクロチューブにライセートを移します。
  9. 30秒間500×gで遠心分離し、supernaを廃棄することによりビーズをペレット化し、溶解緩衝液500μlでビーズを再懸濁することにより、ブランクアガロースビーズを洗浄タント。 5回の洗浄の合計のために、この4回繰り返します。
  10. 1×SDS-PAGEサンプル緩衝液中でブランクアガロースビーズを再懸濁し、そして95℃で90秒間のビーズを沸騰させます。将来のウェスタンブロット分析のために-20℃で保存は、目的のタンパク質は、ビーズに非特異的に結合するかどうかを観察しました。
  11. キャップ結合タンパク質を捕捉するために4℃で1時間穏やかに攪拌しながらγアミノフェニルメートル7 GTPアガロースC10-リンクビーズと溶解液をインキュベートします。
  12. 30秒間500×gで遠心分離することにより、γアミノフェニルメートル7 GTPアガロースC10-リンクビーズをペレット化。上清を捨てます。
  13. ステップ7.9を繰り返して、γアミノフェニルメートル7 GTPアガロースC10-リンクビーズを洗ってください。
  14. 溶解緩衝液600μlの中でビーズを再懸濁します。
  15. 1mMの最終濃度にGTPを加えます。
  16. 4°Cで1時間穏やかに攪拌しながらγアミノフェニルメートル7 GTPアガロースC10-リンクビーズ+ 1 mMのGTPをインキュベートします。注:このを非特異的( すなわち、非メチル化GTPとの相互作用)は、m 7 GTPと相互作用するタンパク質の関連付けを解除します。
  17. 30秒間500×gで遠心分離することにより、γアミノフェニルメートル7 GTPアガロースC10-リンクビーズをペレット化。
  18. 新しい1.5 mlのマイクロ遠心チューブに上清を移し、4×SDS-PAGE試料緩衝液(50mMのトリス-HCl、100mMのDTT、2%SDS、0.1%ブロモフェノールブルー、10%グリセロール)の200μLを加えます。将来のウェスタンブロット分析37のために-20℃でのGTPコントロールサンプルを保管してください。ステップ7.9を繰り返してビーズを洗浄します。
  19. 1×SDS-PAGE試料緩衝液(50mMのトリス-HCl、100mMのDTT、2%SDS、0.1%ブロモフェノールブルー、10%グリセロール)中でビーズを再懸濁し、90秒間、95℃で沸騰します。将来のウェスタンブロット分析37のために-20℃でメートル7 GTP結合画分を保管してください。

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Representative Results

メートル7 GTPアフィニティーカラムでのeIF4EとeIF4E2の酸素に応答したキャップ結合能の解析

Fのigure 1及び結腸直腸癌において、初代ヒト腎近位尿細管上皮細胞(HRPTEC)(: 図1および2は、2ヒト細胞株中での酸素の変動に応じて二つの主要なキャップ結合タンパク質の典型的なM 7 GTPアフィニティ精製のウエスタンブロットを表します図2のHCT116)。細胞は、液体培地中の溶存酸素は、低酸素ワークステーション内の空気で平衡化したことを確認するために、24時間指示された酸素の可用性に維持されています。 M 7 GTP結合アガロースビーズは、キャップ結合タンパク質を捕捉するために添加される前の入力レーン(IN)は、全細胞溶解物の10%を表します。この入力レーンを富化を測定するための基準として使用されますメートル7 GTPプルダウン中の標的タンパク質の。 GTPレーンは1 mMのGTPで溶出したメートル7 GTPビーズからの溶出液です。このステップは、非メチル化GTPを認識するタンパク質の検出を可能にします。キャップ結合タンパク質のeIF4EとeIF4E2は、具体的にはメートル7 GTPを認識し、それらの同族体(ここでは図示せず)eIF4E3は、非メチル化GTPに結合します。 5 'mRNAキャップ構造(メートル7 GTP)に結合するためのeIF4EとeIF4E2の能力が(全体的に使用可能なプール)入力レーンにおける強度に対するメートル7 GTPの列に相対彼らのバンドの強度を比較することによって測定することができます。

この定量化は、ImageJのような画像分析ソフトウェアで三の生物学的複製のためのタンパク質バンドの画素強度を測定することにより行うことができます。結果は平均±標準誤差濃度ユニット(RDU)の相対的な手段として表現されます。正規化前の生の値実験群および対照両方のサンプルからは、不対両側スチューデントt検定により比較しました。 P <0.05は、統計的に有意とみなしました。この代表的な実験は、2つの細胞株は、それらのeIF4EとeIF4E2使用のための酸素の異なる範囲を有することを示します。 図1は、HRPTECのみのeIF4Eが強くMに結合することを示している7 GTP 8%O 2( 図1A)において、のeIF4EとeIF4E2両方が有意にM 7 GTP 3~5%のO 2( 図1B - C)と関連していること、のみeIF4E2 1%O 2( 図1D)において、M 7 GTPと強く結合します。 図2では、HCT116細胞では、これらのキャップ結合タンパク質の酸素依存用法が異なっている:だけのeIF4Eは、GTP 12%O 2( 図2A)で、両方のキャップ結合タンパク質はメートル7に大きくバインド7メートルに大幅に特異的に結合します百分の五から八O 2の範囲のGTP( 図2B - C)、およびのみeIF4E2は3%O 2( 図2D)におけるM 7 GTPに著しく結合します。 GTPとメートル7 GTPのカラムからの溶出の不在はのeIF4EとeIF4E2をm 7 GTPに固有のものであり、非メチル化GTPを認識しないことを示しています。棒グラフはImageJのを使用して、3つの生物学的複製の定量化を表します。我々の結果は、2つの主要なキャップ結合タンパク質のeIF4EとeIF4E2は、酸素依存的な様式でのmRNA M 7 GTPキャップ構造に結合する能力が異なることを示しています。

これら2つのタンパク質がmRNAのユニークなクラスの翻訳を開始することを、以前の文献に基づいて、キャップ結合活性におけるこのシフトは、酸素利用の変化に適応するために生成された異なるプロテオームにつながる可能性があります。この技術は、5 'mRNAキャップと相互作用する新規な翻訳開始因子を特徴付けるために使用することができます(またはキャップ結合タンパク質との)対象とウエスタンブロット法や、メートル7 GTPの溶出物の質量分析などの幅広いアプローチを通して。

図1
図1: のeIF4EとeIF4E2活動3-5%のO 2 からHRPTECにphysioxia中に重なって います。 GTPビーズヒト腎近位尿細管上皮細胞にM 7を用いて捕捉アッセイは、(HRPTEC)溶解物(A)、8%、(B)5%、(C)3%(D)24時間、1%O 2に曝露しました。 GTP、GTP洗浄がm 7 GTPのための特異性を測定します。メートル7 GTP、GTP洗浄後メートル7 GTPビーズに結合したタンパク質。代表的なウエスタンブロットを示し、少なくとも3つの独立した実験からのデータは、ImageJのにより定量し、相対密度単位(RDとして表しました全細胞溶解物の10%入力(IN)に比べてU)。 * P <0.05(不対両側スチューデントt検定)は、INにキャップ結合画分(メートル7 GTP)でのeIF4EまたはeIF4E2の濃縮を比較し有意な変化と考えられました。データは、3つの独立した実験の平均±標準誤差(SEM)を意味します。この研究は、もともとバイオロジカルケミストリー誌に掲載されました。ティンパーノ、S.とUniacke、生理的酸素下で培養J.ヒトの細胞は、翻訳のための別個のmRNAを募集するために、2つのキャップ結合タンパク質を利用します。 2016; 291(20):10772から82 24。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2. のeIF4EとeIF4E2活動は5月8日からHCT116にphysioxia中に重なって%のO 2。 GTPビーズ(A)12%、(B)8%、(C)5%(D)24時間3%O 2に曝露さHCT116ヒト結腸直腸癌溶解物中のM 7を用いて捕捉アッセイ。 GTP、GTP洗浄がm 7 GTPのための特異性を測定します。メートル7 GTP、GTP洗浄後メートル7 GTPビーズに結合したタンパク質。代表的なウエスタンブロットを示し、少なくとも3つの独立した実験からのデータは、ImageJのにより定量し、全細胞溶解物の10%の入力(IN)に対する濃度単位(RDU)として表しました。 * P <0.05(不対両側スチューデントt検定)は、INにキャップ結合画分(メートル7 GTP)でのeIF4EまたはeIF4E2の濃縮を比較し有意な変化と考えられました。データは、3つの独立した実験の平均±標準誤差(SEM)を意味します。この研究は、もともとバイオロジカルケミストリー誌に掲載されました。 TIMPあの、S.とUniackeは、生理的酸素下で培養J.ヒトの細胞は、翻訳のための別個のmRNAを募集するために、2つのキャップ結合タンパク質を利用します。 2016; 291(20):10772から82 24。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

生理的酸素条件に曝露したヒト細胞中でのキャップ結合タンパク質の分析は、新規な酸素調節翻訳開始因子の同定を可能にすることができます。 mRNA又は他のキャップ結合タンパク質の5 'キャップのためのこれらの因子の親和性がm 7 GTP結合アガロースビーズへの関連の強さを測定することができます。この技術の一つの注意点は、それがタンパク質ポスト溶解のキャップ結合能を測定するが、それは、タンパク質 - タンパク質相互作用、および翻訳後修飾(PTMを)を維持し、非変性条件下で行われることです。いくつかのタンパク質 - タンパク質相互作用は、5 'キャップへのeIF4Eファミリーの結合を媒介します。 4E-BPは結合してのeIF4Gとの相互作用を遮断し、38複雑な開始前43Sの動員を防止することによってのeIF4Eを抑制する。 eIF4E / 4E-BP複合体は、その転写物から任意の開始を阻止する、5 'mRNAキャップに結合したままで、とすることができますM 7 GTPアフィニティーカラムでのeIF4Eの阻害のためのマーカーとして使用することができます。逆に、メートル7 GTP列上のeIF4GとのeIF4Eとの相互作用は、アクティブな翻訳開始のためのマーカーである可能性があります。 PTMは、翻訳開始因子の活性を調節するための別の方法です。例えば、のMnk1によるのeIF4Eのリン酸化は、5 'mRNAキャップ39に対する親和性を増加させることができます。インターフェロン刺激遺伝子15(ISG15)によってコードされるタンパク質の変性剤は、病原体感染40を介してインターフェロン誘導に応答してeIF4E2のキャップ結合活性を上昇させるPTMです。 ISG15遺伝子は、このシステムが低酸素にeIF4E2を調節することができることを示唆し、そのプロモーター中の低酸素応答要素が含まれています。ほとんどのPTMは、生理学的に関連する酸素状態の間、キャップ結合タンパク質の活性を変化させることができる方法については知られています。質量分析に続いて、この技術は、新規な酸素調節および生理学的に関連のPTM目を明らかにする可能性がで翻訳開始因子の活性を媒介します。

M 7 GTPキャップ類似体と捕捉する別の方法は、関連するタンパク質を同定するためにこのようなのeIF4EまたはのeIF4Gのような既知のキャップ結合タンパク質を免疫沈降および質量分析を実行することであろう。この戦略の限界は、キャップ結合タンパク質は、多くの場合、ストレス顆粒41またはキャップ非依存性翻訳1,4における内などの代替の細胞の役割を持っています。したがって、メートル7 GTPキャップ類似体を利用して新たなキャップ結合タンパク質を調査する際、特に、キャップ結合タンパク質を単離するための最良の、最も信頼性の高い方法です。メートル7 GTPキャップアナログの利用制限は、このようなスカベンジャーとして、いくつかのキャップ結合タンパク質はメートル7 GTP mRNAキャップと相互に作用するだけでなく、42を結合するための第二基を必要とするだけでなく、酵素DCPを脱キャップということです。さらに、このようなDCP1 / DCP2複合体として一般的に脱キャップ酵素は、hydrすることができますolyzeメートル7 GTPと効果的に樹脂容量を削減。したがって、いくつかのキャップ結合タンパク質は、この分析において失われることがあります。これらの警告を回避するには、酵素的に耐性のmRNAキャップ類似体を利用することができます。二つの非加水分解性のキャップ類似体、モノヌクレオチドメートル7 GpCH2ppまたはジヌクレオチドメートル7 GpCH2ppAはDCPS、DCP1、およびDCP2 43を捕捉することが示されています。これらのmRNAキャップ類似体は、市販されていないが、化学的に新たに合成されなければなりません。このプロトコルの他の制限は、「ピギーバック」を介してキャップ結合タンパク質と相互作用のみキャップ結合タンパク質またはタンパク質が捕捉されることです。キャップ依存性翻訳開始は、開始の主要な形態であるが、キャップ非依存性のメカニズムは、細胞ストレス1の状態の間に特に普及しています。しかし、この技術および翻訳開始6-8,24の分野での新しいトレンドのコンテキストでそのPA小説ストレス誘発因子の同定キャップ依存性開始においてrticipateは、研究の有望な分野です。

このプロトコルで考慮すべきもう一つの要因は、メディア内の酸素です。液体培地中で細胞を培養した細胞と大気との間のバリアを提供します。液体培地が雰囲気ガス組成36と平衡するために24時間程度かかることが示されています。したがって、細胞は、溶解前に所望の酸素利用可能性に24時間培養されなければならない、または短いインキュベーションが必要な場合、メディアは、プレコンディショニングすることができます。プリコンディショニングは、ガス交換を可能にする無菌培養フラスコ中で、少なくとも24時間、低酸素ワークステーション内のメディアを維持することを含みます。低酸素ワークステーション内の細胞に導入された酸素化ソリューションは、急速にそのようなこのプロトコルで検討されているキャップ依存性翻訳開始のような細胞のシグナル伝達経路を変更することができます。細胞内の酸素感知経路の感度、意志すべてのソリューションへこのようなPBSおよびトリプシンEDTAなどの溶解前に細胞と相互作用はまた、少なくとも24時間、事前に調整されなければなりません。溶解およびポスト溶解洗浄バッファーは、冷たい使用する必要があり、したがって、37℃の低酸素ワークステーションにあらかじめ調整されていません。タンパク質へのいくつかの酸素依存性の変更は、アクティブポスト溶解することができるが、寒さのバッファがアーティファクトにつながる可能性が酵素活性およびタンパク質 - タンパク質またはタンパク質-RNA複合体の「シャッフル」を最小化するために必要とされます。厳密性を高めるために、このプロトコルへの変更は、事前条件の溶解および24時間後の溶解洗浄バッファーになり、その後、使用する前に、ワークステーションの中に氷の上でそれらをインキュベートすることができます。これらのソリューションは、水の蒸発に起因する集中しますので、メディアおよびバッファは、以上の3日間、低酸素ワークステーションに保管すべきではありません。長期的研究(> 3日)のために、播種した細胞の初期量を慎重に考慮しなければなりません。細胞が分裂し、皿の表面積が混雑になるように、そのような媒体の酸性化などの他のストレスがキャップ結合タンパク質の活性に影響を与える可能性があります。実験の最終日に、細胞を80〜90%に密集度を持っている必要があります。

このプロトコル内の4つの重要なステップがあります:溶解、使用する細胞の量、ビーズを洗浄し、非メチル化GTP制御まで、低酸素ワークステーションで細胞を維持します。 1)低酸素で細胞を維持するためのいくつかの方法があります。これらのほとんどは、唯一の細胞培養皿を保持することができる小室を含むが、任意の操作や細胞溶解は、大気中のチャンバの外部で実行する必要があります。そのような低酸素誘導因子として酸素感知機構の構成要素は、1または2分35のところで活性化または不活性化されます。前述のようにそのため、低酸素ワークステーションで細胞を溶解することは、それぞれの酸素利用に関連付けられているキャップ結合タンパク質の活性を確実にするために重要です。 2)細胞数をこのプロトコル(2 150ミリメートルディッシュ)で提案強いメートルに適しているようなのeIF4Eの家族や複雑なeIF4F(eIF4AとのeIF4G)のメンバーとして7 GTP相互作用。より多くの細胞、少なくとも5つの150ミリメートルの料理は、一時的な相互作用でのみeIF4Fを通じてメートル7 GTP mRNAキャップに関連付けることがタンパク質を検出するために要求される可能性があります。 3)細胞溶解物でそれらをインキュベートした後、ビーズを洗浄は、ストリンジェント未満ジェントな方法で行うことができます。ここで紹介するプロトコルは、溶解バッファーは、ビーズを5回洗浄するために使用されている厳格なオプションを提供しています。キャップ結合するタンパク質を弱く相互作用を有するタンパク質は、関心がある場合、人は少ない洗浄を実行し、その代わりに、溶解緩衝液のトリス緩衝生理食塩水を利用することができます。 4)それは、非特異的にビーズと相互作用するタンパク質を除去するための非結合体化アガロースとのプレクリア細胞溶解物、いくつかのキャップ結合タンパク質は、真のmRNAキャップ構造を区別することはできません、メチル化GTP(メートルに重要であるが7 GTP)、および非メチル化GTP。このようなタンパク質の1つは、のeIF4EホモログeIF4E3 44です。 GTPとビーズを溶出することも興味がある可能性があり、非メチル化GTPを、認識する任意のタンパク質を除去します。メートル7 GTPとGTPの両方を認識するタンパク質の生物学的関連性は完全には解明されていません。これは、(保存されたキャップ結合ドメインと善意のキャップ結合タンパク質である)eIF4E3非メチル化GTPからメートル7 GTPを認識行うのeIF4EとeIF4E2タンパク質に対する相対を含むいくつかの出版物によって強調されています。

提示されるこの技術は、質量分析を介して、M 7 GTP溶出液を分析することにより、目的の又は幅広いアプローチとして、M 7 GTPの相互作用を同定するための標的化アプローチとして実行することができます。いくつかの他の技術は、細胞下分画、免疫蛍光、共免疫沈降、Aとキャップ結合活性を分析するためにphysioxic暴露(プロトコル4)に従うことができます目のポリソーム分析。翻訳制御は、転写などの遺伝子発現に等しい貢献者として浮上しています。キャップ結合複合体の活性および組成を調査するためにこの技術を利用すると、キャップ依存性翻訳開始は、低酸素に応答して調節される方法に光を当てるます。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
γ-aminophenyl-m7GTP agarose C10-linked beads Jena Bioscience AC-1555 Agarose-linked m7GTP
100 mm culture dish Corning 877222 10-cm culture dish
150 mm culture dish Thermofisher 130183 15 cm culture dish
AEBSF Hydrochloride ACROS Organics A0356829 AEBSF
Agarose Beads Jena Bioscience  AC-0015 Agarose bead control
Bromophenol Blue Fisher BP112-25 Component of SDS-PAGE loading buffer
1.5 ml Centrifuge Tubes FroggaBio 1210-00S Used to centrifuge small volumes
15 ml Conical Centrifuge Tubes Fisher 1495970C Used in culturing primary cells
Defined trypsin inhibitor Fisher R007100 DTI
Dithiothreitol Fisher BP172-25 DTT
Epithelial cell medium (complete kit) ScienCell 4101 Includes serum and growth factor supplements)
Glycerol Fisher BP229-1 Component of SDS-PAGE loading buffer
100 mM Guanosine 5'-triphosphate, 1 ml Jena Bioscience 272076-0251M GTP
HCT116 colorectal carcinoma ATCC CCL-247 Human cancer cell line
Human renal proximal tubular epithelial cells ATCC PCS-400-010 HRPTEC
Hyclone DMEM/High Glucose GE Life Sciences SH30022.01 Standard media for human cell culture
Hyclone Penicillin-Streptomycin solution GE Life Sciences SV30010 Antibiotic component of DMEM
H35 HypOxystation Hypoxygen N/A Hypoxia workstation
Igepal CA-630 MP Biomedicals 2198596 Detergent component of lysis buffer
Monopotassium phosphate Fisher P288-500 KH2PO4
Potassium chloride Fisher P217-500 KCl
Magnesium chloride Fisher M33-500 MgCl2
Sodium chloride Fisher BP358-10 NaCl
Sodium fluoride Fisher 5299-100 NaF (phosphatase inhibitor component of lysis buffer)
Disodium phosphate Fisher 5369-500 Na2HPO4
Premium Grade Fetal Bovine Serum Seradigm 1500-500 FBS
Protease Inhibitor Cocktail (100x) Cell Signalling 58715 Component of lysis buffer
Sodium Dodecyl Sulfate Fisher BP166-100 SDS
Sodium Orthovanadate Sigma 56508 Na3VO4
Tris Base Fisher BP152-5 Component of buffers
0.05% Trypsin-EDTA (1x) Life Technologies 2500-067 Trypsin used to detach adherent cells

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References

  1. Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6, (4), 318-327 (2005).
  2. Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets. Cell. 136, (4), 731-745 (2009).
  3. Gingras, A. C., Raught, B., Sonenberg, N. eIF4 initiation factors: effectors of mRNA recruitment to ribosomes and regulators of translation. Annu Rev Biochem. 68, 913-963 (1999).
  4. Weingarten-Gabbay, S., et al. Comparative genetics. Systematic discovery of cap-independent translation sequences in human and viral genomes. Science. 351, (6270), (2016).
  5. Andreev, D. E., et al. Oxygen and glucose deprivation induces widespread alterations in mRNA translation within 20 minutes. Genome Biol. 16, 90 (2015).
  6. Ho, J. J., et al. Systemic Reprogramming of Translation Efficiencies on Oxygen Stimulus. Cell Rep. 14, (6), 1293-1300 (2016).
  7. Shatsky, I. N., Dmitriev, S. E., Andreev, D. E., Terenin, I. M. Transcriptome-wide studies uncover the diversity of modes of mRNA recruitment to eukaryotic ribosomes. Crit Rev Biochem Mol Biol. 49, (2), 164-177 (2014).
  8. Ho, J. J., Lee, S. A Cap for Every Occasion: Alternative eIF4F Complexes. Trends Biochem Sci. (2016).
  9. Lin, T. A., et al. PHAS-I as a link between mitogen-activated protein kinase and translation initiation. Science. 266, (5185), 653-656 (1994).
  10. Richter, J. D., Sonenberg, N. Regulation of cap-dependent translation by eIF4E inhibitory proteins. Nature. 433, (7025), 477-480 (2005).
  11. Tee, A. R., Tee, J. A., Blenis, J. Characterizing the interaction of the mammalian eIF4E-related protein 4EHP with 4E-BP1. FEBS Lett. 564, (1-2), 58-62 (2004).
  12. Rom, E., et al. Cloning and characterization of 4EHP, a novel mammalian eIF4E-related cap-binding protein. J Biol Chem. 273, (21), 13104-13109 (1998).
  13. Uniacke, J., et al. An oxygen-regulated switch in the protein synthesis machinery. Nature. 486, (7401), 126-129 (2012).
  14. Morita, M., et al. A novel 4EHP-GIGYF2 translational repressor complex is essential for mammalian development. Mol Cell Biol. 32, (17), 3585-3593 (2012).
  15. Webb, N. R., Chari, R. V., DePillis, G., Kozarich, J. W., Rhoads, R. E. Purification of the messenger RNA cap-binding protein using a new affinity medium. Biochemistry. 23, (2), 177-181 (1984).
  16. Kiriakidou, M., et al. An mRNA m7G cap binding-like motif within human Ago2 represses translation. Cell. 129, (6), 1141-1151 (2007).
  17. Mazza, C., Segref, A., Mattaj, I. W., Cusack, S. Large-scale induced fit recognition of an m(7)GpppG cap analogue by the human nuclear cap-binding complex. EMBO J. 21, (20), 5548-5557 (2002).
  18. Nojima, T., Hirose, T., Kimura, H., Hagiwara, M. The interaction between cap-binding complex and RNA export factor is required for intronless mRNA export. J Biol Chem. 282, (21), 15645-15651 (2007).
  19. Pabis, M., Neufeld, N., Shav-Tal, Y., Neugebauer, K. M. Binding properties and dynamic localization of an alternative isoform of the cap-binding complex subunit CBP20. Nucleus. 1, (5), 412-421 (2010).
  20. Ruud, K. A., Kuhlow, C., Goss, D. J., Browning, K. S. Identification and characterization of a novel cap-binding protein from Arabidopsis thaliana. J Biol Chem. 273, (17), 10325-10330 (1998).
  21. Ptushkina, M., et al. A second eIF4E protein in Schizosaccharomyces pombe has distinct eIF4G-binding properties. Nucleic Acids Res. 29, (22), 4561-4569 (2001).
  22. Cho, P. F., et al. A new paradigm for translational control: inhibition via 5'-3' mRNA tethering by Bicoid and the eIF4E cognate 4EHP. Cell. 121, (3), 411-423 (2005).
  23. Dinkova, T. D., Keiper, B. D., Korneeva, N. L., Aamodt, E. J., Rhoads, R. E. Translation of a small subset of Caenorhabditis elegans mRNAs is dependent on a specific eukaryotic translation initiation factor 4E isoform. Mol Cell Biol. 25, (1), 100-113 (2005).
  24. Timpano, S., Uniacke, J. Human Cells Cultured Under Physiological Oxygen Utilize Two Cap-binding Proteins to Recruit Distinct mRNAs for Translation. J Biol Chem. (2016).
  25. Dings, J., Meixensberger, J., Jager, A., Roosen, K. Clinical experience with 118 brain tissue oxygen partial pressure catheter probes. Neurosurgery. 43, (5), 1082-1095 (1998).
  26. Le, Q. T., et al. An evaluation of tumor oxygenation and gene expression in patients with early stage non-small cell lung cancers. Clin Cancer Res. 12, (5), 1507-1514 (2006).
  27. Muller, M., et al. Effects of desflurane and isoflurane on intestinal tissue oxygen pressure during colorectal surgery. Anaesthesia. 57, (2), 110-115 (2002).
  28. Brooks, A. J., Eastwood, J., Beckingham, I. J., Girling, K. J. Liver tissue partial pressure of oxygen and carbon dioxide during partial hepatectomy. Br J Anaesth. 92, (5), 735-737 (2004).
  29. Muller, M., et al. Renocortical tissue oxygen pressure measurements in patients undergoing living donor kidney transplantation. Anesth Analg. 87, (2), 474-476 (1998).
  30. Richardson, R. S., et al. Human skeletal muscle intracellular oxygenation: the impact of ambient oxygen availability. J Physiol. 571, (Pt 2), 415-424 (2006).
  31. Harrison, J. S., Rameshwar, P., Chang, V., Bandari, P. Oxygen saturation in the bone marrow of healthy volunteers. Blood. 99, (1), 394 (2002).
  32. Gleadle, J., Ratcliffe, P. Hypoxia. John Wiley & Sons, Ltd. Chichester. (2001).
  33. Gluckman, E., et al. Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconi's anemia by means of umbilical-cord blood from an HLA-identical sibling. N Engl J Med. 321, (17), 1174-1178 (1989).
  34. Parrinello, S., et al. Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts. Nat Cell Biol. 5, (8), 741-747 (2003).
  35. Jewell, U. R., et al. Induction of HIF-1alpha in response to hypoxia is instantaneous. FASEB J. 15, (7), 1312-1314 (2001).
  36. Newby, D., Marks, L., Lyall, F. Dissolved oxygen concentration in culture medium: assumptions and pitfalls. Placenta. 26, (4), 353-357 (2005).
  37. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76, (9), 4350-4354 (1979).
  38. Haghighat, A., Mader, S., Pause, A., Sonenberg, N. Repression of cap-dependent translation by 4E-binding protein 1: competition with p220 for binding to eukaryotic initiation factor-4E. EMBO J. 14, (22), 5701-5709 (1995).
  39. Pyronnet, S., et al. Human eukaryotic translation initiation factor 4G (eIF4G) recruits mnk1 to phosphorylate eIF4E. EMBO J. 18, (1), 270-279 (1999).
  40. Okumura, F., Zou, W., Zhang, D. E. ISG15 modification of the eIF4E cognate 4EHP enhances cap structure-binding activity of 4EHP. Genes Dev. 21, (3), 255-260 (2007).
  41. Kedersha, N., et al. Evidence that ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient preinitiation complexes are core constituents of mammalian stress granules. Mol Biol Cell. 13, (1), 195-210 (2002).
  42. Gu, M., et al. Insights into the structure, mechanism, and regulation of scavenger mRNA decapping activity. Mol Cell. 14, (1), 67-80 (2004).
  43. Szczepaniak, S. A., Zuberek, J., Darzynkiewicz, E., Kufel, J., Jemielity, J. Affinity resins containing enzymatically resistant mRNA cap analogs--a new tool for the analysis of cap-binding proteins. RNA. 18, (7), 1421-1432 (2012).
  44. Joshi, B., Cameron, A., Jagus, R. Characterization of mammalian eIF4E-family members. Eur J Biochem. 271, (11), 2189-2203 (2004).

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