BMPR-IB +의 신속한 격리 두개골 결함 치유 모델에서 사용을위한 기질 세포를 지방이는 유래

Developmental Biology

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Marshall, C. D., Zielins, E. R., Brett, E. A., Blackshear, C. P., Hu, M. S., Leavitt, T., Barnes, L. A., Lorenz, H. P., Longaker, M. T., Wan, D. C. Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model. J. Vis. Exp. (120), e55120, doi:10.3791/55120 (2017).

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Abstract

Introduction

손상, 감염 또는 경부암 인한 주요 골 결손 환자의 회복 및 삶의 질에 큰 영향을 미친다. 다른 기술은 환자의 몸으로부터 뼈 건강 이러한 결함을 채우기 위해 존재하지만,이 이동은 자체 이환율과 합병증 1, 2, 3의 위험도를 전달한다. 또한, 일부 결함이 충분한 기증자 뼈 결함을 채우기 위해 사용할 수없는 너무 크거나 복잡하다. 보철 장치는 뼈 결함을 작성을위한 잠재적 인 옵션이 있지만 이러한 감염 위험, 하드웨어 오류 및 이물 반응 (4) 등 여러 가지 단점과 연결되어 있습니다.

이 때문에, 환자 자신의 세포를 이용한 생물학적 5 골 대체재 공학 가능성에 관심이있다. 지방 유래 기질 세포 (의 ASC)이들은 환자 자신의 지방 조직에서 풍부하게 가능하고 새로운 뼈 조직 (6, 7)를 생성하여 뼈의 결함을 치유 할 수있는 능력을 입증하기 때문에이 애플리케이션에 대한 가능성을 갖는다. 세포의 ASC는 여러 다양한 연구 집단은 특정 세포 표면 마커에 대한 선택하는 향상된 골 형성 활성 (8, 9)와 세포 집단을 생산할 수 있음을 보여 주었다이다. 가장 조골 전위의 ASC를 선택하면 이들 세포 시드 발판 큰 골 결손을 재생할 수있는 가능성을 증가시킬 것이다.

뼈 형태 형성 단백질 (BMP) 시그널링은 골 형성 분화의 ASC (10)(11)에서 골 형성에 중요한 것으로 알려진 BMP 수용체 타입 IB (BMPR-IB)를 조절하는 매우 중요하다. 최근에, 우리는 수 b BMPR-IB의 표현을 보여 주었다전자는 강화 된 골 형성 활동 (12)의 ASC를 위해 선택하는 데 사용됩니다. 여기에서 우리는 생체 내 두개골 결손 모델을 사용하여 골 형성 활동의 분석 뒤에 인간 지방에서의 ASC를 BMPR이-IB가 발현의 분리를위한 프로토콜을 보여줍니다.

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Protocol

참고 : 샘플 동의를 주었다 환자를 얻었다. 모든 프로토콜을 검토하고 적절한 스탠포드 대학의 임상 시험 심사위원회의 승인을했다. 인간의 조직과 세포를 처리하는 동안, 항상 당신의 기관에 의해 지정된, 바이오 안전성 레벨 2 (BSL2)주의 사항을 준수합니다.

시약 1. 준비

  1. FACS 버퍼를 준비 : 10 ML의 FBS, 188 5 ㎖ 폴록 사머 500 mL의 멸균 인산 완충 생리 식염수 5 mL의 펜 연쇄상 구균 (PBS)를 추가합니다.
  2. 혼합물을 소화 준비 : 0.375 g C.의 hemolyticum의 콜라게나 제 II 형 분말과 5 ㎖ 폴록 사머 멸균 199 / EBSS 매체 (188) 500 mL를 넣고.
  3. 표준 매체를 준비 : 50 ML의 FBS 500 mL를 둘 베코의 변형 이글 중간에 5 mL의 펜 연쇄상 구균을 추가합니다.

2. 수확과의 ASC의 분리

참고 : 적절한 기관 승인이 인체 조직을 사용하는 및 분리 시간 동안 제자리에 있는지 확인잃어버린 줄기 세포. 인간의 복부를 확보 측면에, 또는 선택 과목 지방 흡입 수술을받은 건강한 기증자로부터 피하 지방을 허벅지. 플라스틱 흡입 용기에 지방을 유지합니다.

  1. 원래 플라스틱 용기에 지방에 : 1 비율로 1 멸균 PBS를 추가합니다. (500 ㎖ 지방이 존재하는 경우, 500 ㎖의 PBS를 추가). 30 초 동안 부드러운 교반 혼합. 수층 흡인에 부착 된 10 mL의 플라스틱 피펫 수층을 하부 (도 1), 그리고, 흡에 정착 폐기 할 수있다.
  2. 대형 플라스틱 용기에 지방을 가만히 따르다하고 1 혼합물을 소화 추가 : 1의 비율. 용기를 닫고 70 % 에탄올로 외부를 청소합니다. 파라핀 필름으로 뚜껑을 밀봉.
  3. 30 분 동안 37 ℃에서 180 rpm에서 오비탈 진탕 컨테이너 선동.
  4. : 1 비율로 1 표준 매체를 추가하여 소화를 중화. (1,000 mL의 지방 혼합물이있는 경우, 1,000 mL로에게 표준 매체를 추가).
  5. 동일하게 (25)의 짝수로 액을 분배0 mL의 플라스틱 원뿔 원심 분리기 튜브와 원심 분리기 4 ℃에서 20 분 동안 300 XG에 혼합물
  6. 뜨는을 대기음 그대로 펠렛을 떠날주의하십시오. 각 원뿔 튜브 5 mL의 표준 매체를 Resuspend 펠릿.
  7. 한 50ml의 원추형 원심 분리 튜브에 100 미크론 필터를 통해 현탁액을 필터. 그런 다음, 4 ℃에서 15 분 동안 300 XG에 원심 분리기.
  8. 상등액을 흡인하고 5 ㎖ 실온 RBC 용해 버퍼에 펠렛을 재현 탁. 혼합물을 실온에서 15 분 (RT) 300 XG에서 원심 분리하여 실온에서 5 분 동안 방치시키고.
  9. 뜨는을 대기음 15 mL의 표준 매체에 펠렛을 재현 탁. 다시 한 50㎖ 원추형 원심 분리 튜브에 100 미크론 필터를 통해 필터링.
  10. 새로운 50 ML 원뿔에서, 밀도 기반의 분리 (시약의 목록 참조)을 위해 설계된 15 ML의 polysucrose 솔루션을 추가 할 수 있습니다. 다음에, 45 ° 각도로 튜브를 들고 신중 측에 세포를 피펫튜브 polysucrose 솔루션의 상단에있는 세포 현탁액은 부드럽게 층 (그림 2) 그래서.
    주 : 용액의 표면에 피펫 세포에 중요하다. 이 돌이킬 수없는 혼합물을 생성하므로 세포의 현탁액에 polysucrose 솔루션을 추가하지 마십시오. 마찬가지로, polysucrose 솔루션의 중심에 세포를 피펫하지 않습니다.
  11. 실온에서 10 분 동안 300 XG에이 혼합물을 원심 분리기. 낮은 가속 사용 (2 - 10 명 중 3)이 단계 0으로 원심 분리기의 브레이크 기능을 설정합니다.
    참고 : 중간에 흐림, 바닥에 분명, 연어 색의 상단에 : 세 가지 레이어가 표시됩니다. 중간 계층은 관심의 세포가 포함되어 있습니다.
  12. 10 mL를 피펫을 사용하여 조심스럽게 중간 층을 제거하고 새로운 50 ML 원뿔 튜브에 전송할 수 있습니다.
    주 :이 완전히 중간층의 일부를 남긴다보다 상부 및 하부 층의 일부를 가지고 중간층 전송 과정에서하는 것이 좋다.
  13. <리> 혈구를 사용하여 세포를 세어 총 생균 수를 결정합니다.
    참고 : 일반적으로 사용 트리 판 블루 세포 계산을 지원하기 위해 0.8 %의 최종 농도로 세포 혼합액에 첨가 하였다. 유력한 살아있는 세포는 파란색 염료를 차지하지 않습니다과 흰색이 나타납니다.

BMPR-IB 양성 세포와 세포 함유 비계의 준비를 위해 정렬 3. FACS

  1. 4 ℃에서 5 분 동안 300 XG에 세포 현탁액을 원심 분리기. (2.13 단계에서 수행 된 세포 수에 기초하여) 100 μL 당 백만 세포의 농도로 FACS 완충액에 세포를 재현 탁.
  2. 라벨 플라스틱 원심 관에 적어도 1 천만 셀로 이동 "BMPR-IB." 별도로 표시된 별도의 플라스틱 원심 분리기 튜브에 100 μL FACS 버퍼에 백만 세포를 전송 "흠." 은 "흠"튜브에 1 mL의 FACS 버퍼를 추가합니다. FACS는 EXPER 부분을 정렬하는 동안 얼음에서 FACS 완충액 세포의 나머지 유지iment가 수행되고있다. 이 세포 레이블 "정렬되지 않은합니다." 컨트롤 나중에 실험에서 이러한를 사용합니다.
  3. 제조업체의 지시에 따라 "BMPR-IB '관 형광 항 인간 BMPR-IB 항체의 적절한 양을 추가한다. 항체를 배포 부드럽게 상하 혼합물을 피펫.
    참고 : 우리는 1:10 희석에 인간 BMPR-IB / ALK-6 APC - 복합 항체를 사용합니다 (자세한 내용은 시약의 목록 참조). 그러나, 다른 제조업체의 항체는 다른 권장 농도를해야합니다.
  4. 빛을 유지하는 방법으로 얼음 양동이를 커버. 셀 / 항체 혼합물을 30 분 (또는 항체를 제조사의 지시에 따라) 동안 앉아 할 수있다.
    주 : 안티 BMPR-IB 항체는 이차 항체를 필요로하는 차 접합 항체 오면, 제조업체의 지시에 따라 이차 항체와 얼음의 별도의 염색 공정을 수행한다.
  5. 양쪽 튜브를 원심 분리기4 ℃에서 5 분 동안 300 XG. 펠렛을 대기음하지 않도록주의, 뜨는을 대기음. 1 ㎖의 FACS 완충액으로 펠렛 세포를 재현 탁. 또 다시 5 분 동안 300 XG에서 튜브를 원심 분리. 조심스럽게 상층 액을 흡인 및 1 mL의 1 백만 세포의 농도로 FACS 완충액에 세포를 재현 탁.
  6. 새로운 레이블이 유리 FACS 튜브로 40 마이크론 셀 스트레이너를 통해 "BMPR-IB", "흠"및 "정렬되지 않은"세포를 필터링합니다. 세포가 필터에 남아되지 않도록 500 μL FACS 버퍼와 필터를 씻어. 또한 "BMPR-IB 양성"을 표시 두 개의 플라스틱 원심 분리기 튜브에 2 mL의 표준 매체를 추가 "BMPR-IB 음성." FACS 기계에 정렬 된 세포를 수집하기 위해이 두 가지를 사용합니다.
  7. FACS 기계에서 형광 마커 음의 게이트를 정의하기 위해 흠없는 세포를 사용합니다.
  8. 100 미크론 노즐 각각 콘 튜브로 정렬 BMPR-IB 양 및 음의 세포를 사용하여표준 매체 이닝. FACS 기계가이 능력이있는 경우 정렬 동안 4 ° C에서 냉각이 튜브를 유지합니다.
    참고 : 샤론 외 알에 의해 조브 제 13 조를 참조하십시오. FACS 정렬을위한 우수한 프로토콜.
  9. 혈구를 사용하여, 각각의 튜브에 세포를 계산. 4 ° C에서 5 분 동안 300 XG에서 ""BMPR-IB 양성 "BMPR-IB 음성"및 "정렬되지 않은"튜브를 원심 분리기와 세포 펠렛을 방해하지 않도록주의, 뜨는을 대기음. 그 후 250 μL 당 백만 세포의 농도를 표준 배지에서 세포를 재현 탁.
  10. 미리 잘라 4mm PLGA (폴리 [락트산 - 코 - 글리콜 산]) 하이드 록시 아파타이트로 코팅 된 지지체를 얻습니다. 24 웰 플레이트의 우물에 각 발판을 놓습니다. BMPR-IB 양성 정렬되지 않은, 그리고 BMPR-IB 음 (그림 3) : (. 내가합니다 .e, 20 셀) 세 그룹 중 하나에서 세포 현탁액 50 μL 각 발판을 커버.
    참고 : 제발소호 등의 알에 의해 조브 제 14 조를 참조하십시오. PLGA 인공 지지체의 구성에 대한 자세한 내용은.
  11. 부분 (골격의 탈수를 방지하기 위해)의 뚜껑 플레이트를 커버하고, 30 분 동안 37 ℃ 세포 배양 인큐베이터에서 배양한다 표준 배지 주변 빈 웰 채운다.

두개골 결함 및 ACS 함유 비계의 적용 4. 작성

참고 : 적절한 기관 승인이 살아있는 생쥐의 두개골 결함의 생성을 제자리에 있는지 확인합니다. 이 프로토콜은 스탠포드 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

  1. 이소 플루 란 가스 흡입 또는 주입 지속성 칵테일 마취제를 사용하여 CD-한 누드 마우스를 마취.
    1. 단독으로 가스를 사용하기 위해, 마취 실에 마우스를 위치시키고이 산소의 흐름을 시작 - 이소 플루 란 2 % 농도 3 L / 분. 마우스는 f를 일단ully 의식, absorbant 패드 따뜻한 물 순환 담요 위에이 발생하기 쉬운 배치하고 산소와 이소 플루 란의 동일한 농도와 마취 코 콘에 그 주둥이를 놓습니다. 조심스럽게 호흡을 모니터링하고 필요에 따라 이소 플루 란의 농도를 조정합니다.
    2. 전술 한 바와 같이 마취 챔버 내에 마우스를 마취, 주입 된 지속성 마취 칵테일을 사용하고 마취 칵테일 주입. 마취 실에서 마우스를 제거하고 그 행동을 관찰.
      참고 : 마우스가 잠시 마취에서하지만 몇 분 내에 나타날 수있다 다시 완전히 주입 마취의 효과에 따라 마취해야합니다. absorbant 패드로 덮여 따뜻한 물 순환 담요에 마우스를 전송합니다.
      참고 : 마취 칵테일을 위해, 우리는 생리 식염수에 케타민 10 ㎎ / ㎖과 자일 라진 1 ㎎ / ㎖를 포함하는 혼합물, 복강 전달하는 것이 좋습니다. 이 혼합물의 표준 용량은300 μL 100 ㎎ / ㎏과 자일 라진 10 ㎎ / ㎏을 케타민와 동일합니다 30 g을 마우스합니다. 주 사용 마취제에 대한 자세한 내용은 토론 섹션을 참조하십시오.
    3. 마취의 깊이를 결정하기 위해 발가락 핀치 책략을 사용합니다. 이 가볍게 외과 의사에 의해 핀치 때 적절하게 마취 마우스는 발을 철회하지 않습니다.
    4. 각막의 탈수를 방지하기 위해 눈 연고를 적용합니다.
    5. 1 ㎎ / ㎏ 부 프레 노르 핀의 SR 피하을 관리 할 수 ​​있습니다.
      참고 : 우수한 통증 완화의 수술 결과 이전에 진통을 제공.
    6. 전체 절차 동안 마우스의 호흡 속도를 모니터링한다.
      참고 : - / 분 (100) 숨을 제대로 이소 플루 란에서 마취 마우스 (50)의 호흡이 있어야합니다. 증가 된 호흡은 감소 호흡 속도는 마취가 너무 깊은 나타낼 수 있습니다 동안 마취가 너무 빛을 나타냅니다.
  2. 포비돈 - IOD와 두개골의 지느러미 측면의 피부를 준비오프라인 용액을 70 % 에탄올 세번 하였다. 노출 수술 부위를 떠나, 멸균 커튼으로 드레이프.
    주 : 멸균 수술 장갑을 착용하고 절차를 수행하는 동안 무균 기술을 유지한다. 그러한 멸균 드레이프와 멸균 도구로 멸균 표면과 객체를 터치합니다. 보조 조명, 오픈 봉합 패킷 등을 조정 한
  3. 15 블레이드 메스를 사용하여 지느러미 두개골의 대부분에 걸쳐 연장 시상 중간 선 절개를합니다. 미세 톱니 집게를 사용하여 오른쪽 마루 뼈를 노출시키는 절개 오른쪽의 피부를 철회.
  4. 멸균 4mm 다이아몬드 코팅 트레 드릴 비트와 드릴을 이용하여 마루 뼈 통해 결함 드릴. 경막 층에 뼈 과거의 결함을 연장하지 마십시오. (그림 4)
  5. 결함에 발판을 놓은 다음 나일론 봉합사를 실행하는 피부 절개를 닫습니다.
  6. 마우스를 모니터링하고 표준 수술 후 치료 a를 제공제도적 지침에 ccording.
    1. 그것을 복구하는 동안 깨끗한 케이지 내부에 깨끗한 종이 타월에 마우스를 유지합니다. 케이지의 절반은 따뜻한 물 순환 담요 위에 배치되어야하고, 마우스는 처음이 반으로 배치해야합니다.
    2. 이 ambulate하기에 충분한 의식을 회복 할 때까지 마우스 방치하지 마십시오. 완전히 복구 될 때까지 다른 마우스와 케이지에 수술을 시행 한 마우스를 반환하지 않습니다.
  7. 테스트 할 각 지지체의 새로운 마우스로 위의 단계를 반복합니다. 뜨거운 구슬 살균기 또는 다른 적절한 방법을 사용하여 수술 사이에 수술 도구를 소독.
  8. 얼마 후 절차 후 2, 4, 6 및 8 주째에, 두개골 폐쇄 결함 비율을 분석하는 마이크로 CT 스캔을 사용한다.
    참고 : 리바이스 등의 알에 의해 문서를 참조하십시오. 두개골 결함의 마이크로 CT 스캔에 대한 설명 (6).
  9. 경우 실험 공단 인TE 클린 안락사 챔버에 넣어서 2 L / min의 속도로 챔버 내로 탄산 가스의 유동을 시작하여 마우스를 안락사. 호흡이 완전히 (후 약 10 분)을 중단 한 후 안락사를 확인하기 위해 자궁 경부 전위를 수행합니다.
  10. 실험 완료 후 선택적으로, 사용 단면 조직 학적 염색 결함 내 골 형성을 평가.
    참고 : McArdle 등의 알에 의해 문서를 참조하십시오. 뼈를 준비 자세한 내용은 12 조직학에 대한 표본. 조직 학적 및 염색 기술 검토를 들어, 외과 병리학 (15)의 수동으로 조직 학적 설명서를 참조하십시오.

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Representative Results

마이크로 CT 명확하게 두개골 결함을 보여줍니다 수술 당일에 이루어 스캔. 이 때 4mm 결함에 더 증식가 없을 것입니다. 후속 검사는 기준에 비하여 시간 경과에 따른 결함의 크기를 정량화하는 시간에 걸쳐 얻어진다. BMPR-IB-및 정렬되지 않은 세포 (그림 5)과 비교했을 때 BMPR-IB + 세포와 시드 결함은 결함의보다 신속한 폐쇄를 입증해야한다. 또한, 결함을 포함 두개골 부분 탈회 할 수 있고, 표준 방법을 사용하여 12 조직학을 위해 처리된다. Movat의 pentachrome 얼룩 염색 섹션은 다른 세포 집단 (그림 6)과 비교 BMPR-IB 세포로 치료 결함에 큰 골 재생을 공개합니다.

그림 1
그림 1 : PBS 세척 후 리포 애스 퍼 레이트. 강한>는 PBS 후 리포 애스 퍼 레이트의 캐니스터를 첨가하고, 혼합물을 침전시킨다. 바닥층은 수성층 주로 염수 및 혈액 구성되는 반면, 상부 직물 층의 ASC를 호스팅하는 지방 조직이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : Polysucrose 솔루션 상 세포 현탁액의 배치. (a) 세포 현탁액는 polysucrose 용액 위에 층 있도록 튜브의면에 매우 부드럽게 피펫 팅되어야한다. (b)이 원심 분리하기 전에 polysucrose 위에 세포 현탁액 층의 정확한 모습이다.">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 : 발판 위에 세포의 시드. (a) 24 웰 세포 배양 플레이트의 한 웰의 멸균 표면에서 세포 현탁액의 약 50 μL로 건조 지지체로드. (b) 세포의 부착을 허용하기 위해 30 분 동안 세포 배양 인큐베이터에서 인큐베이션 지지체. 주 : 도면에서, 10 cm 플레이트는 시범 목적으로 사용된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4 : 두개골 결함의 생성. 두개골 결손 (화살표)를 내 볼 수 있습니다오픈 피부 절개. 시추가 경질을 위반하지 않았 음을 나타내는 그대로 경막 혈관 (화살촉)를 참고. 스케일 바, 5mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
그림 5 : 다른 ASC의 부분 집단으로 중요한 크기의 두개골 결함의 치유. (-)의 ASC (A) 3 차원 마이크로 CT 재구성은 두개골 결함을 수행 하였다는 정렬되지 않은, BMPR-IB (+) 또는 BMPR-IB와 짝을 다시. (B) 분류되지 않은 및 비교 BMPR-IB (+)의 ASC (92 %)로 유의하게 골 재생을 보여 팔주에서 치유의 정량 BMPR-IB (-)의 ASC (각각 58 %, 46 %, ** p < 0.01). 치료에 유의 한 차이는이 우리에 볼 수 있었다EKS (** p <0.01), 3 주 (*** p <0.001), 6 주 (*** p <0.001). 마이크로 CT 마이크로 컴퓨터 단층. McArdle 등의 허가 재판. 12. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6
그림 6 : 뼈 재생성의 조직 학적 염색.(A)의 Movat pentachrome 염색이 정렬되지 않은, BMPR-IB (+), BMPR-IB 또는 수복 결함 재생성 (-) 명 시야 현미경을 사용하여 5 배 배율에서의 ASC. (-) 그룹 BMPR-IB에 비해 BMPR-IB (+) 그룹의보다 강력한 골 형성을합니다. 점선은 결함 영역의 정도를 나타낸다. 검은 사각형 내의 지역은 높은 magnific에 표시됩니다결함 영역의 ATION 사용하여 (B)와 10 배 (C) 40X 명 시야 현미경. McArdle 등의 허가 재판. 12. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

프로토콜 내에서 중요한 단계

의 ASC의 수확하는 동안, 중요한 단계는 콜라겐과 지방의 적절한 소화합니다. 부적절한 소화의 ASC의 낮은 수율 발생합니다. BMPR-IB + 세포를 FACS 정렬 동안 신중 양성하는 게이트를 정의하는 것이 중요하다. 너무 느슨하게 게이트를 정의하는 것은 순수하지 정렬 인구의 원인이 될 수 있습니다. 두개골 결함의 생성 동안, 두개골의 뼈를 통해 결함을 드릴하지만, 뇌경막에 진출하지 않는 것이 중요합니다. 이 넘치 출혈과 동물의 안락사를 필요로합니다 뇌, 노출의 원인이됩니다.

수정 및 문제 해결

두개골 결함 수술을위한 마취에 관해서는, 우리 연구소는 흡입 된 이소 플루 란을 사용하는 것을 선호하지만, 또 다른 옵션은 복강 일반 사에 최종 케타민 10 ㎎ / ㎖의 농도 및 자일 라진 1 ㎎ / ㎖를 포함하는 혼합물을 주입하는 것입니다선. 이 혼합물의 표준 용량은 30g 마우스 300 μL입니다. 이 수술 중에 이소 플루 란 코 콘에 마우스를 필요로하지 않는 신뢰할 수있는 마취의 약 30 분을 제공합니다. 주입 마취제를 사용하는 단점은 주사를받은 후 용량을 감소시킬 수 없다는 것이다. 반대로, 흡입 이소 플루 란은 쉽게 적정하거나 실시간 다운.

발판에 세포 현탁액을 추가 할 때, 연구자들은 유체 볼륨이 너무 작다는 사실을 알게 될 수 있으며, 부분적으로 배양의 30 분의 증발됩니다. 증발 뼈 치유 실험에 특히 해로운 교란 요인 인 세포 죽음을 일으킬 수 있습니다. 이를 방지하기 위해, 24 웰 플레이트의 잘 내부의 발판을로드합니다. 일반 매체와 바로 주변의 우물을 입력합니다. 이 마르지로드 골격을 유지하는 데 도움이 가습 마이크로 환경을 만들 것입니다.

뼈의 조직 학적 염색 사전입니다이전 포함하고 절편에 두 개관의 정확하고 철저한 탈회에 dicated. 다른 연령대의 두개골이 탈회의 다른 기간을 필요로하는이 전통적으로 EDTA 용액에서 수행, 접수

기술의 한계

이 프로토콜은 결함 폐쇄 향상 세포 집단의 능력을 평가하기 위해 4mm 두개골 결함을 이용한다. 이 모델은 긴 뼈의 골절이나 종양 절제와 같은 더 복잡한 환경에서 발생하는 치유를 시뮬레이션 할 수 있습니다. 이러한 이유로, 다른 동물 모델이 설정 뼈 치유의 ASC의 기여를 이해하기 위해 사용될 필요가있다.

기존 / 대체 방법에 대하여 기술의 중요성

특정 ASC 집단을 분리하기 위해 유세포 분석기를 사용하여 여러 조직의 컨텍스트 및 치유 및 회복을 향상시키기위한 유망한 기술이다이러한 혈관 신생, 지방 조직 및 골 형성 등의 배심원 모델. 프로 골 형성 세포의 유틸리티는 적극적 두개골 결함을 치유에 BMPR-IB를 위해 선택된 셀에 지대한 영향을 보여주는이 연구에서 탐구한다.

ASC의 절연을위한 종래 프로토콜은 세포 배양 플레이트 (16)에 몇 일 동안 배양 한 포함한다. 그러나, 세포 배양 동안 중요한 표현형 드리프트가 발생할 수 있습니다. 이러한 이유로, 우리는 FACS를 이용하여 상기 모집단 정제이어서 이러한 세포의 신속한 분리 허용하는 ASC 분리 프로토콜을 사용한다. 전체 과정은 세포 표면 마커 또는 표현형 드리프트의 영향을 최소화하고보다 하루 이루어진다.

미래 응용 프로그램 및 방향

우리는 매우 BMPR-IB 표현의 ASC 기타의 ASC에 비해 골 재생의 결함 치유를 향상시키기 위해 더 큰 능력을 입증 것으로 나타났다. 메커니즘 underly이 현상을 보내고 것은 알려져 있지 않다. 예를 들어, 자신이 직접 골 형성 세포로의 분화, 또는 그렇게하기 위해 다른 셀을 촉진 인자를 생산하는 세포인지 여부를 명확하지 않다. 앞으로의 연구는이 질문에 대답하기 위해 수행해야합니다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 micron cell strainer Falcon 352360
15 blade scalpel Miltex 4-515
24 well plate Corning 3524
40 micron cell strainer Falcon 352340
50 mL conical centrifuge tubes Falcon 352098
6-0 Ethilon nylon suture, 18", P-3 needle,  Ethicon 1698G
Anti-BMPR-IB primary antibody R&D systems FAB5051A
BioGel PI surgical gloves Mölnlycke Health Care ALA42675Z
Buprenorphine SR ZooPharm
Castro-Viejo needle driver Fine Science Tools 12565-14
CD1 nude mouse Charles River 086
Collagenase Type II powder Gibco 17101-015
DMEM medium Gibco 10564-011
Drill: Circular knife 4.0 mm Xemax Surgical CK40
Drill: Z500 Brushless Micromotor NSK NSKZ500
FBS Gicbo 10437-077
Fisherbrand Absorbent Underpads, 20" x 24" Fisher Scientific 14-206-62
Fisherbrand Sterile cotton gauze pad, 4" x 4" Fisher Scientific 22-415-469
Heating pad Kent Scientific DCT-20
Hyclone 199/EBSS medium GE  Life Sciences SH30253.01
Isothesia isoflurane Henry Schein  050033
Micro Forceps with teeth Roboz RS-5150
Micro Forceps with teeth Roboz RS-5150
Paraffin film (Parafilm) Bemis PM996
PBS Gibco 10010-023
Pen-Strep Gibco 15140-122
PLGA scaffolds Proprietary Formulation
Poloxamer 188, 10% Sigma P5556-100ML
Polylined Sterile Field, 18" x 24" Busse Hospital Disposables 696 Cut a rectangular hole of the appropriate size
Polysucrose Solution: Histopaque 1119 Sigma 11191
Povidone Iodine Prep Solution Medline MDS093944H
Puralube petrolatum ophthalmic ointment, 1/8 oz. tube Dechra Veterinary Products
RBC lysis buffer Sigma 11814389001
Webcol alcohol prep swabs Covidien 6818

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References

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