Hurtig Isolering af BMPR-IB + Adipose-afledte stromaceller til brug i en calvariale Defekt Healing Model

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Marshall, C. D., Zielins, E. R., Brett, E. A., Blackshear, C. P., Hu, M. S., Leavitt, T., Barnes, L. A., Lorenz, H. P., Longaker, M. T., Wan, D. C. Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model. J. Vis. Exp. (120), e55120, doi:10.3791/55120 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Større knogledefekter skyldes skade, infektion, eller invasiv cancer have en betydelig indvirkning på en patients helbredelse og livskvalitet. Teknikker eksisterer for at udfylde disse fejl med sund knogle fra andre steder i patientens egen krop, men denne overførsel bærer sin egen sygelighed og risiko for komplikationer 1, 2, 3. Desuden er nogle defekter er så stort eller komplekst at tilstrækkelig donor knogle er ikke tilgængelig til at fylde defekten. Proteseindretninger er en potentiel mulighed til fyldning knogledefekter men disse er forbundet med adskillige ulemper, herunder infektionsrisiko, hardwarefejl, og fremmedlegemereaktion 4.

Af disse årsager er der stor interesse i muligheden for engineering biologiske knoglesubstitutter ved hjælp af en patientens egne celler 5. Adipøst afledte stromaceller (ASC'er)har potentiale til denne anvendelse, fordi de er rigeligt til rådighed i patientens eget fedtvæv og de har vist evnen til at helbrede knogledefekter ved at generere nye knoglevæv 6, 7. ASC'er er en forskelligartet population af celler og flere undersøgelser har vist, at selektion for specifikke celleoverflademarkører kan producere cellepopulationer med forøget osteogen aktivitet 8, 9. Valg ASC'er med den højeste osteogene potentiale vil øge sandsynligheden for, at et stillads podet med disse celler kunne regenerere en stor knogledefekt.

Knoglemorfogenetisk protein (BMP) signalering er kritisk for regulering af knogle differentiering og dannelse 10 og BMP receptor type IB (BMPR-IB) vides at være vigtige for osteogenese i ASC'er 11. For nylig har vi vist, at ekspression af BMPR-IB kan be bruges til at vælge for ASC med forbedret osteogen aktivitet 12. Her demonstrerer vi en protokol til isolering af BMPR-IB-udtrykkende ASC'er fra humant fedt efterfulgt af et assay af deres osteogen aktivitet under anvendelse af en in vivo calvariale defekt model.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: Prøver blev opnået fra patienter, som gav informeret samtykke. Alle protokoller blev gennemgået og godkendt af den relevante Stanford University Institutional Review Board. Mens håndtering humane væv og celler, altid holde sig til biosikkerhedsniveau 2 (BSL2) forholdsregler, som angivet af din institution.

1. Fremstilling af reagenser

  1. Forbered FACS buffer: 10 ml FBS, 5 mL Poloxamer 188 og 5 ml Pen-Strep til 500 ml steril phosphatbufret saltvand (PBS).
  2. Forbered fordøje blanding: Tilføj 0,375 g C. hemolyticum collagenase type II pulver og 5 ml Poloxamer 188 til 500 ml steril 199 / EBSS medium.
  3. Forbered standardmedium: Tilsæt 50 ml FBS og 5 ml Pen-Strep til 500 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium.

2. Høst og Isolering af ASC'er

BEMÆRK: Sørg for, at passende institutionelle godkendelser er på plads for at bruge humane væv og til isolering hUman stamceller. Opnå menneskelige abdominal, flanke, eller låret spæk fra en rask donor undergår elektiv fedtsugning. Hold fedt i en plastik suge dunk.

  1. Tilføj sterilt PBS i en 1: 1-forhold til fedt i den oprindelige plastbeholder. (Hvis der er 500 ml fedt, tilsættes 500 ml PBS). Bland ved forsigtig omrøring i 30 s. Tillad det vandige lag til sedimentere til bunden (figur 1) og derefter aspireres og den vandige fase kasseres med en 10 ml plastik pipette fastgjort til sugning.
  2. Dekanteres fedt til en stor plastikbeholder og tilsæt fordøje blanding i et 1: 1 forhold. Lukke beholderen og rengøre ydersiden med 70% ethanol. Forsegl cap med paraffin film.
  3. Omrør denne beholder i en orbitalryster ved 180 rpm ved 37 ° C i 30 minutter.
  4. Neutralisere fordøjelse ved tilsætning standard medium i en 1: 1-forhold. (Hvis der er 1.000 ml fedtblandingen, tilsæt 1000 ml standard medium).
  5. Fordel blandingen ligeligt i et lige antal 250 mL plast konisk centrifugerør og centrifugeres blandingen ved 300 xg i 20 minutter ved 4 ° C.
  6. Aspirere supernatanten og være omhyggelig med at forlade pellet intakt. Resuspender pellets i 5 ml standard medium for hver konisk rør.
  7. Filtreres suspensionen gennem en 100 micron filter over i en 50 ml konisk centrifugerør. Derefter centrifugeres ved 300 xg i 15 minutter ved 4 ° C.
  8. Aspirere supernatanten og resuspender pelleten i 5 ml stuetemperatur RBC lysebuffer. Lad blandingen sidde i 5 minutter ved stuetemperatur centrifugeres ved 300 xg i 15 minutter ved stuetemperatur (RT).
  9. Aspirere supernatanten og resuspender pelleten i 15 ml standardmedium. Igen filtreres gennem et 100 micron filter i en 50 ml konisk centrifugerør.
  10. I et nyt 50 ml konisk, tilsæt 15 ml polysucrose løsning designet til vægtfylde-baserede separation (se listen over reagenser). Derefter holder røret i en 45 ° vinkel, omhyggeligt pipette cellerne på siden afrøret, så at cellesuspensionen forsigtigt lag oven på polysucrose opløsning (figur 2).
    BEMÆRK: Det er vigtigt at pipettespidser celler på overfladen af ​​opløsningen. Tilsæt ikke polysucrose opløsning til en suspension af celler, da dette vil skabe en irreversibel blanding. Ligeledes ikke opsuges cellerne i midten af ​​polysucrose opløsning.
  11. Centrifuger denne blanding ved 300 xg i 10 minutter ved stuetemperatur. Brug lav acceleration (2 - 3 af 10) og indstille bremsefunktion af centrifugen til nul for dette skridt.
    BEMÆRK: Tre lag vil være synlig: klar på bunden, overskyet i midten, og laks-farvet på toppen. Det midterste lag indeholder cellerne af interesse.
  12. Ved hjælp af en 10 ml pipette forsigtigt fjerne det midterste lag og overførsel til en ny 50 ml konisk rør.
    BEMÆRK: Det er bedre helt at overføre midterlaget og i processen tage nogle af de øverste og nederste lag end at efterlade nogle af mellemlaget.
  13. <li> Tæl celler ved hjælp af et hæmocytometer og bestemme samlede levende celle nummer.
    BEMÆRK: Vi bruger typisk trypanblåt tilsat til celleblandingen til en slutkoncentration på 0,8% for at hjælpe med at tælle celler. Levedygtige levende celler vil ikke tage op det blå farvestof og vises hvid.

3. FACS Sortering for BMPR-IB Positive celler og Udarbejdelse af Cell-holdige Stilladser

  1. Centrifuger cellesuspensionen ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Resuspender cellerne i FACS-buffer i en koncentration på 1 million celler pr 100 pi (baseret på celletælling udført i trin 2.13).
  2. Overfør mindst 10 millioner celler til en plastik centrifugerør mærket "BMPR-IB." Særskilt, overføre en million celler i 100 pi FACS buffer til et separat plast centrifuge rør mærket "Ufarvet." Tilsæt 1 ml FACS-buffer til "Ufarvet" rør. Hold den resterende del af cellerne i FACS-buffer på is, mens FACS sortering del af experprøv dig frem sker. Mærk disse celler "Ukategoriseret". Brug disse som kontroller senere i eksperimentet.
  3. Tilsæt en passende mængde af et fluorescerende anti-humant BMPR-IB antistof til "BMPR-IB" rør ifølge producentens anvisninger. Pipetteres blandingen op og ned forsigtigt for at fordele antistoffet.
    BEMÆRK: Vi bruger en human BMPR-IB / ALK-6 APC-konjugeret antistof ved en 1:10 fortynding (se listen over reagenser for detaljer). antistoffer fra forskellige producenter, vil dog have forskellige anbefalede koncentrationer.
  4. Dæk isspanden på en måde, der holder ud lys. Tillad celle / antistof-blandingen til at sidde i 30 min (eller i henhold til instruktionerne af antistoffet producenten).
    BEMÆRK: Hvis anti-BMPR-IB antistof kommer som et primært ukonjugeret antistof, som kræver et sekundært antistof, udføre en separat farvning trin på is med det sekundære antistof i henhold til producentens anvisninger.
  5. Centrifuger begge rør på300 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Aspirere supernatanten, og pas på ikke at aspirere pillen. Resuspender de pelleterede celler i 1 ml FACS buffer. Igen centrifugeres rørene ved 300 xg i 5 min. aspirere omhyggeligt supernatanten og resuspender cellerne i FACS-buffer til en koncentration på 1 million celler pr 1 ml.
  6. Filtrer "BMPR-IB," "Ufarvet," og "Ukategoriseret" celler gennem 40 micron celle sier til nye mærkede glas FACS rør. Skyl filtrene med 500 uL FACS buffer for at sikre, at cellerne ikke bliver efterladt i filteret. Tilføj også 2 ml standard medium til to separate plastik centrifugerør mærket "BMPR-IB-positive" og "BMPR-IB-negativ." Brug disse to at indsamle de sorterede celler i FACS-maskine.
  7. På FACS maskine, bruge ufarvede celler til at definere en negativ gate for den fluorescerende markør.
  8. Anvendelse af en 100 um dyse, sortere BMPR-IB positive og negative celler i de respektive rør conTaining standard medium. Holde disse rør kølet ved 4 ° C under sortering hvis FACS maskine har denne evne.
    BEMÆRK: Der henvises til JOVE artiklen 13 af Sharon et al. for en fremragende protokol for FACS sortering.
  9. Anvendelse af et hæmocytometer, tælle cellerne i hvert rør. Centrifugeres "BMPR-IB-positiv", "BMPR-IB-negativ," og "Ukategoriseret" rør ved 300 xg i 5 min ved 4 ° C og aspireres supernatanten, og pas på ikke at forstyrre cellepelleten. Derefter resuspenderes cellerne i standard medium til en koncentration på 1 million celler pr 250 pi.
  10. Opnå forskårne 4 mm PLGA (poly [mælke-co-glycolsyre]) skeletter overtrukket med hydroxyapatit. Placer hver stillads i en brønd i en plade med 24 brønde. Omfatte hver stillads med 50 pi cellesuspension fra en af de tre grupper (dvs, 200.000 celler.): Usorteret, BMPR-IB-positive, og BMPR-IB-negative (figur 3).
    BEMÆRK: Venligsthenvises til JOVE artiklen 14 af Lo et al. for detaljer om konstruktionen af ​​PLGA stilladser.
  11. Delvist fylde de omkringliggende tomme brønde med standardmedium (for at forhindre udtørring af skeletterne), Dæk pladen med låg, og inkuber i en cellekultur inkubator ved 37 ° C i 30 minutter.

4. Oprettelse af calvariale Mangler og anvendelse af ACS-holdige Scaffold

BEMÆRK: Sørg for, at passende institutionelle godkendelser er på plads til oprettelse af calvariale defekter i levende mus. Denne protokol er blevet godkendt af Stanford University Institutional Animal Care og brug Udvalg.

  1. Bedøver en CD-1 nøgne mus under anvendelse af enten inhaleret isofluran gas eller en injiceret langtidsvirkende anæstetikum cocktail.
    1. For at bruge gas alene, placere musen i en anæstesi kammer og starte tilførslen af ​​ilt til 2 - 3 l / min med en koncentration på 2% af isofluran. Når musen er fUlly bevidstløs, placere den tilbøjelige på et varmt vand recirkulerende tæppe med en absorberende pude og placere sin snude ind i en anæstesi næse kegle med den samme koncentration af ilt og isofluran. overvåge forsigtigt respirationsfrekvens og justere koncentrationen af ​​isofluran efter behov.
    2. At bruge en injiceret langtidsvirkende anæstetikum cocktail, bedøver musen i en anæstesi kammer som beskrevet ovenfor og derefter injicere bedøvelsesmiddel cocktail. Fjern musen fra anæstesi kammer og observere dens adfærd.
      BEMÆRK: Musen kan kortvarigt komme ud anæstesi men inden for flere minutter bør igen fuldt bedøvet under påvirkning af det injicerede bedøvelsesmiddel. Overfør musen til et varmt vand recirkulerende tæppe dækket med en absorberende pude.
      BEMÆRK: et bedøvelsesmiddel cocktail, anbefaler vi en blanding indeholdende ketamin 10 mg / ml og xylazin 1 mg / ml i normalt saltvand, leveret intraperitonealt. Standarddosis af denne blanding er300 pi i en 30 g mus, hvilket svarer til ketamin 100 mg / kg og xylazin 10 mg / kg. Se afsnittet Diskussion for flere detaljer om injicerbar bedøvelsesmiddel.
    3. Brug en tå knivspids manøvre for at bestemme dybden af ​​bedøvelse. Et tilstrækkeligt bedøvet mus vil ikke trække sin pote, når det er let klemt af kirurgen.
    4. Påfør øjensalve til at forhindre udtørring af hornhinden.
    5. Administrere 1 mg / kg buprenorphin SR subkutant.
      BEMÆRK: At give analgesi før operationen resulterer i overlegen smertelindring.
    6. Under hele proceduren, overvåger respirationsfrekvens på musen.
      BEMÆRK: En mus korrekt bedøvet under isofluran bør have en respirationsfrekvens på 50 - 100 vejrtrækninger / min. En øget respirationsfrekvens indikerer, at anæstesi er for lys, mens en nedsat respirationsfrekvens kan indikere, at anæstesi er for dybt.
  2. Prep huden på den dorsale aspekt af kraniet med povidon-IODIne opløsning efterfulgt af 70% ethanol tre gange. Drapere med sterile afdækningsstykker, der forlader det kirurgiske sted blotlagt.
    BEMÆRK: Brug sterile kirurgiske handsker og vedligeholde steril teknik under proceduren. Kun røre sterile overflader og objekter, såsom den sterile afdækning og autoklaverede instrumenter. Har en assistent justere belysning, åbne suturer pakker mv
  3. Ved hjælp af en 15-bladet skalpel en sagittal midtlinjeincision der strækker sig over størstedelen af ​​den dorsale kraniet. Med fint fortandede pincet, trække huden på højre side af snittet for at eksponere den højre parietal knogle.
  4. Ved hjælp af en boremaskine med en autoklaveret 4 mm diamant-belagt trepan bore en defekt gennem parietal knogle. Forlæng ikke defekt forbi knoglen ind i dura mater lag. (Figur 4)
  5. Placer et stillads i defekten, og derefter lukke huden snit med rindende nylon sutur.
  6. Overvåg musen og give standard postoperativ pleje enccording til institutionelle retningslinier.
    1. Hold musen på et rent stykke køkkenrulle i et rent bur, mens den kommer sig. Den ene halvdel af buret skal placeres over et varmt vand recirkulerende tæppe og musen skal i første omgang placeres i denne halvdel.
    2. Lad ikke en mus uden opsyn, indtil det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til ambulate. Du må ikke returnere en mus, der har gennemgået kirurgi til et bur med andre mus, indtil den er fuldt tilbagebetalt.
  7. Gentag ovenstående trin med en ny mus for hvert stillads, der skal testes. Sterilisere kirurgiske instrumenter i mellem operationer under anvendelse af en varm perle sterilisator eller en anden egnet metode.
  8. Kort efter proceduren, og derefter på 2, 4, 6, og 8 uger, skal du bruge mikro CT-scanning til at analysere hastigheden af ​​calvariale defekt lukning.
    BEMÆRK: Se artiklen af Levi et al. 6 for en beskrivelse af mikro CT-scanning af calvariale defekter.
  9. Når eksperimentet er komplete, aflive musene ved at placere dem i en ren eutanasi kammer og startede en strøm af carbondioxidgas ind i kammeret ved en hastighed på 2 l / min. Efter respirations er ophørt fuldstændigt (efter ca. 10 min) udføre cervikal dislokation at bekræfte dødshjælp.
  10. Eventuelt efter eksperimentet er færdig, brug sektionering og histologisk farvning for at vurdere knogledannelse i defekten.
    BEMÆRK: Se artiklen af McArdle et al. 12 for nærmere oplysninger om forberedelse knogle prøver til histologi. For en gennemgang af histologiske og farvningsteknikker, se en histologisk håndbog såsom Manual of Surgical Pathology 15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Micro CT scanning udført på operationsdagen vil tydeligt vise kraniet defekt. På dette tidspunkt vil der ikke være indvækst i 4 mm defekt. Efterfølgende scanninger opnås over tid for at kvantificere størrelsen af ​​defekten over tid sammenlignet med basislinjen. Defekter podet med BMPR-IB + -celler skal demonstrere hurtigere lukning af defekten i forhold til BMPR-Ib- og Usorterede celler (figur 5). Desuden kan den del af kraniet indeholder defekten afkalkes og bearbejdet for histologi under anvendelse af standardmetoder 12. Snit farvet med Movat s pentachrome plet vil afsløre større knogleregenerering i defekten behandlet med BMPR-IB-celler sammenlignet med de andre cellepopulationer (figur 6).

figur 1
Figur 1: Lipoaspirate efter PBS vask. strong> En beholder af lipoaspirate efter PBS tilsættes, og blandingen får lov til at bundfælde. Det øverste vævslag er fedtvæv, der er vært ASC'er, mens bundlaget er det vandige lag, hovedsageligt bestående af saltvand og blod. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: Placering af cellesuspensionen på Polysucrose Solution. (a) Cellesuspensionen skal pipetteres meget forsigtigt på siden af røret, som gør det til lag oven på polysucrose opløsning. (b) Dette er den korrekte udseende af en cellesuspension lag oven på før centrifugering polysucrose."> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3: Podning af celler på den Scaffold. (a) På den sterile overflade af én brønd i en 24-brønds celledyrkningsplade, indlæse en tør stillads med cirka 50 pi cellesuspension. (b) Der inkuberes stilladset i en cellekultur inkubator i 30 minutter for at tillade celleadhæsion. Bemærk: I figuren er 10 cm plade, der anvendes til demonstration. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4: Oprettelse af calvariale Defekt. Den calvariale defekt (pile) er synlig iåben hudincision. Bemærk de intakte duremæssige blodkar (pilespidser), hvilket indikerer, at boringen ikke har tilsidesat dura. Scale bar, 5 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5: Healing af Kritiske størrelse calvariale defekter med forskellige ASC subpopulationer. (A) Tre-dimensionelle mikro- CT rekonstruktioner blev udført for calvariale defekter repareres med usorterede, BMPR-IB (+), eller BMPR-IB (-) ASC'er. (B) Kvantificering af healing på 8 uge, viste signifikant større knogle regeneration med BMPR-IB (+) ASC (92%) sammenlignet med usorteret og BMPR-IB (-) ASC (58% og 46% henholdsvis ** p < 0,01). Væsentlige forskelle i helbredelse blev også set ved 2 viEKS (** p <0,01), 4 uger (*** p <0,001), og 6 uger (*** p <0,001). Micro-CT, mikro-computertomografi. Genoptrykt med tilladelse fra McArdle et al. 12. Fejl- søjler repræsenterer standardafvigelse. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6
Figur 6: Histologisk Farvning af Bone regenerere. (A) Movat s pentachrome farvning af knogle regenerere i defekter repareres med usorteret, BMPR-IB (+), eller BMPR-IB (-) ASC på 5X forstørrelse ved hjælp lysfeltmikroskopi. Bemærk mere robust knogledannelse i BMPR-IB (+) sammenlignet med BMPR-IB (-) gruppe. Den stiplede linie repræsenterer udstrækningen af ​​det defekte område. Området inden for det sorte rektangel vises på højere magnification anvendelse af (B) 10X og (C) 40X lysfeltmikroskopi af defekte område. Genoptrykt med tilladelse fra McArdle et al. 12. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritiske trin i protokollen

Under høsten af ​​ASC'er, det afgørende skridt er tilstrækkelig fordøjelse af fedt med collagenase. Utilstrækkelig fordøjelse vil resultere i et lavt udbytte af ASC'er. Under FACS sortering af BMPR-IB + -celler, er det vigtigt nøje at definere gate for positivitet. Definition porte for løst kan resultere i sorterede befolkningsgrupper, der ikke er rene. Under oprettelsen af ​​calvariale defekt, er det kritisk at bore defekten gennem knoglen af ​​kraniet, men at ikke rykke ind i dura mater. Dette vil forårsage kraftig blødning og eksponering af hjernen, som vil nødvendiggøre aflivning af dyret.

Ændringer og fejlfinding

Vedrørende anæstesi for calvariale defekt kirurgi, vores laboratorium foretrækker at anvende inhalerede isofluran, men en anden mulighed er at intraperitonealt injicere en blanding indeholdende en endelig koncentration af ketamin 10 mg / ml og xylazin 1 mg / ml i normal salinje. Standarddosis af denne blanding er 300 pi for en 30 g mus. Dette tilvejebringer omkring 30 min på pålidelige anæstesi, der ikke kræver musen til at være i den isofluran næsekonus under kirurgi. En ulempe ved anvendelse af injiceret bedøvelsesmiddel er, at det ikke er muligt at nedsætte dosis efter injektionen er givet. I modsætning hertil kan indåndes isofluran let titreres op eller ned i realtid.

Når der tilføjes cellesuspension til stilladset, kan forskerne finde, at det væskevolumen er for lille og vil delvis fordampe i 30 min inkubation. Fordampning kan forårsage celledød, hvilket er en særlig skadelig confounder i knogleheling eksperimenter. For at bekæmpe dette, indlæse stillads inde i en brønd i en plade med 24 brønde. Fyld straks omkringliggende brønde med almindelig medium. Dette vil skabe en befugtet mikromiljø, som hjælper med at holde den belastede stillads tørrer ud.

Histologisk farvning af knogle er prædicated om korrekt og grundig afkalkning af hovedskallen før indlejring og sektionering. Det accepteres, at kranier af forskellig aldre kræver forskellige varigheder af afkalkning, traditionelt gjort i en EDTA-opløsning

Begrænsninger af teknikken

Denne protokol udnytter en 4 mm calvariale defekt for at vurdere evnen af ​​en population af celler, der kan forbedre lukning af defekten. Denne model kan ikke simulere healing der forekommer i et mere komplekst miljø, såsom en lang knogle fraktur eller en tumor resektion. Af denne grund skal muligvis bruges til at forstå bidrag ASC'er til knogleheling i disse indstillinger alternative dyremodeller.

Betydningen af ​​Teknik med Respekt for eksisterende / Alternative Metoder

Brug af flowcytometri at isolere specifikke ASC populationer er en lovende teknik til forøgelse heling og regenerering i forbindelse med multiple væv og ijury modeller, såsom angiogenese, adipogenese og osteogenese. Anvendeligheden af ​​pro-osteogene celler er undersøgt i denne undersøgelse, der viser en dybtgående virkning med celler positivt selekterede for BMPR-IB i healing en calvariale defekt.

Kendte protokoller til isolering af ASC involverer dyrkning af cellerne i adskillige dage på cellekulturplader 16. Dog kan celler opleve betydelig fænotypisk afdrift, mens i kultur. Derfor bruger vi en ASC isolation protokol, der tillader hurtig isolering af disse celler, efterfulgt af yderligere subpopulation oprensning under anvendelse af FACS. Hele proceduren udføres på mindre end en dag, hvilket minimerer effekterne af celleoverflademarkør eller fænotypisk afdrift.

Fremtidige Programmer og vejvisning

Vi har vist, at ASC'er stærkt udtrykkende BMPR-IB demonstrerer en større evne til at forbedre regenerativ knogledefekt heling sammenlignet med andre ASC'er. De mekanismer, ligger til grunding dette fænomen er ikke kendt. For eksempel er det ikke klart, om selve cellerne direkte differentierer til knogledannende celler, eller om de producerer faktorer der tilskynder andre celler til at gøre det. Fremtidige undersøgelser skal udføres for at besvare disse spørgsmål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 micron cell strainer Falcon 352360
15 blade scalpel Miltex 4-515
24 well plate Corning 3524
40 micron cell strainer Falcon 352340
50 mL conical centrifuge tubes Falcon 352098
6-0 Ethilon nylon suture, 18", P-3 needle,  Ethicon 1698G
Anti-BMPR-IB primary antibody R&D systems FAB5051A
BioGel PI surgical gloves Mölnlycke Health Care ALA42675Z
Buprenorphine SR ZooPharm
Castro-Viejo needle driver Fine Science Tools 12565-14
CD1 nude mouse Charles River 086
Collagenase Type II powder Gibco 17101-015
DMEM medium Gibco 10564-011
Drill: Circular knife 4.0 mm Xemax Surgical CK40
Drill: Z500 Brushless Micromotor NSK NSKZ500
FBS Gicbo 10437-077
Fisherbrand Absorbent Underpads, 20" x 24" Fisher Scientific 14-206-62
Fisherbrand Sterile cotton gauze pad, 4" x 4" Fisher Scientific 22-415-469
Heating pad Kent Scientific DCT-20
Hyclone 199/EBSS medium GE  Life Sciences SH30253.01
Isothesia isoflurane Henry Schein  050033
Micro Forceps with teeth Roboz RS-5150
Micro Forceps with teeth Roboz RS-5150
Paraffin film (Parafilm) Bemis PM996
PBS Gibco 10010-023
Pen-Strep Gibco 15140-122
PLGA scaffolds Proprietary Formulation
Poloxamer 188, 10% Sigma P5556-100ML
Polylined Sterile Field, 18" x 24" Busse Hospital Disposables 696 Cut a rectangular hole of the appropriate size
Polysucrose Solution: Histopaque 1119 Sigma 11191
Povidone Iodine Prep Solution Medline MDS093944H
Puralube petrolatum ophthalmic ointment, 1/8 oz. tube Dechra Veterinary Products
RBC lysis buffer Sigma 11814389001
Webcol alcohol prep swabs Covidien 6818

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Silber, J. S., et al. Donor site morbidity after anterior iliac crest bone harvest for single-level anterior cervical discectomy and fusion. Spine (Phila Pa 1976). 28, (2), 134-139 (2003).
  2. Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Tsiridis, E. Bone substitutes: an update. Injury. 36, S20-S27 (2005).
  3. Laurencin, C., Khan, Y., El-Amin, S. F. Bone graft substitutes. Expert Rev Med Devices. 3, (1), 49-57 (2006).
  4. Walmsley, G. G., et al. Nanotechnology in bone tissue engineering. Nanomedicine. 11, (5), 1253-1263 (2015).
  5. Chapekar, M. S. Tissue engineering: challenges and opportunities. J Biomed Mater Res. 53, (6), 617-620 (2000).
  6. Levi, B., et al. Human adipose derived stromal cells heal critical size mouse calvarial defects. PLoS One. 5, (6), e11177 (2010).
  7. Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Circ Res. 100, (9), 1249-1260 (2007).
  8. Levi, B., et al. CD105 protein depletion enhances human adipose-derived stromal cell osteogenesis through reduction of transforming growth factor beta1 (TGF-beta1) signaling. J Biol Chem. 286, (45), 39497-39509 (2011).
  9. Chung, M. T., et al. CD90 (Thy-1)-positive selection enhances osteogenic capacity of human adipose-derived stromal cells. Tissue Eng Part A. 19, (7-8), 989-997 (2013).
  10. Wozney, J. M., et al. Novel regulators of bone formation: molecular clones and activities. Science. 242, (4885), 1528-1534 (1988).
  11. Wan, D. C., et al. Osteogenic differentiation of mouse adipose-derived adult stromal cells requires retinoic acid and bone morphogenetic protein receptor type IB signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, (33), 12335-12340 (2006).
  12. McArdle, A., et al. Positive selection for bone morphogenetic protein receptor type-IB promotes differentiation and specification of human adipose-derived stromal cells toward an osteogenic lineage. Tissue Eng Part A. 20, (21-22), 3031-3040 (2014).
  13. Sharon, Y., Alon, L., Glanz, S., Servais, C., Erez, N. Isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J Vis Exp. (71), e4425 (2013).
  14. Lo, D. D., et al. Repair of a critical-sized calvarial defect model using adipose-derived stromal cells harvested from lipoaspirate. J Vis Exp. (68), (2012).
  15. Lester, S. C. Manual of surgical pathology. Saunders/Elsevier. (2010).
  16. Bunnell, B. A., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation. Methods. 45, (2), 115-120 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics