Un simple de un solo paso para la disección Protocolo Todo el montaje Preparación de adulto

Neuroscience

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Summary

El adulto de Drosophila cerebro es un sistema valioso para el estudio de los circuitos neuronales, las funciones cerebrales superiores, y los trastornos complejos. Un método eficaz para diseccionar el tejido cerebral entera de la cabeza pequeña mosca que facilitará los estudios basados ​​en el cerebro. Aquí se describe un protocolo de disección simple, de un solo paso de cerebros adultos con una morfología bien conservada.

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Tito, A. J., Cheema, S., Jiang, M., Zhang, S. A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains. J. Vis. Exp. (118), e55128, doi:10.3791/55128 (2016).

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Abstract

Existe un interés creciente en el uso de Drosophila para modelar enfermedades degenerativas del cerebro humano, el mapa circuitería neuronal en el cerebro adulto, y el estudio de las bases moleculares y celulares de las funciones cerebrales superiores. Una preparación de todo el montaje de los cerebros de adultos con una morfología bien conservada es fundamental para este tipo de estudios integrales basados ​​en el cerebro, pero puede ser técnicamente difícil y requiere mucho tiempo. Este protocolo describe un enfoque disección de un paso fácil de aprender, de una cabeza de mosca adulta en menos de 10 s, mientras se mantiene el cerebro intacto unido al resto del cuerpo para facilitar las etapas de procesamiento posteriores. El procedimiento ayuda a eliminar la mayor parte de los tejidos del ojo y traqueales normalmente asociadas con el cerebro que puede interferir con la etapa de formación de imágenes más tarde, y también pone menos demanda de la calidad de los fórceps de disección. Además, se describe un método simple que permite flipping conveniente de las muestras de cerebro montados sobre un cubreobjetos, que es importante para obtener imágenes de ambos lados de la blluvias con intensidad de señal similar y la calidad. Como un ejemplo del protocolo, se presenta un análisis de las neuronas dopaminérgicas (DA) en cerebros adultos de WT (1118 w) vuela. La alta eficacia del método de disección hace que sea especialmente útil para los estudios basados en el cerebro adulto a gran escala en Drosophila.

Introduction

El organismo modelo Drosophila, comúnmente conocida como la mosca de la fruta, durante mucho tiempo ha sido valorado por sus herramientas genéticas elegantes, tiempos cortos reproductivos, y muy conservadas vías moleculares y celulares. La mosca de la fruta ha sido empleado con éxito para diseccionar las vías de señalización básicos, los mecanismos de modelado de los organismos multicelulares, así como los mecanismos que subyacen en el desarrollo neuronal, funciones, enfermedades y 1,2. Con los recientes avances en las tecnologías de etiquetado celular y de formación de imágenes, el cerebro mosca de la fruta se ha vuelto especialmente potente en mapeo fino de la circuitería neuronal y en la disección de la base molecular y celular de las funciones cerebrales superiores, como el aprendizaje y la memoria, y el ritmo circadiano 1,3, 4.5.6.7.8.

Una ventaja particular del sistema Drosophila es su tamaño relativamente pequeño, lo que permite todo el montaje preparación y el examen del cerebro usando un compuesto de regular o microscopio confocal. Thicaracterística s permite un análisis detallado anatómicas y funcionales de los circuitos neuronales, o incluso una sola neurona, a nivel celular y subcelular, en el contexto de un tejido de todo el cerebro, lo que proporciona tanto una visión integral del tema estudiado y su geometría exacta dentro del conjunto cerebro. Sin embargo, dado el tamaño miniatura en lugar del cerebro, sino que también presenta un desafío técnico en la disección de una manera eficiente el tejido cerebral intacto fuera de la caja protectora de la cabeza exoesqueleto en una mosca adulta. Varios métodos eficaces y relativamente simples de disección se han descrito en detalle, que por lo general implican cuidado y paso a paso la eliminación de la caja de cabeza y los tejidos asociados incluyendo los ojos, la tráquea, y grasa del cerebro adecuada 9, 10. Estos métodos de disección microquirúrgica menudo imponer exigencias más estrictas sobre la calidad de las pinzas de disección, apoyándose en unas pinzas finas con puntas bien alineados que se pueden dañar fácilmente. Además, como los cerebros disecados son a menudo separated del resto del cuerpo, el cerebro pueden perderse fácilmente durante los subsiguientes procesos de tinción y lavado debido a su pequeño tamaño y su transparencia en el tampón de procesamiento. A continuación, se describe un protocolo de disección de un paso relativamente simple y fácil de aprender, por cerebros adultos que mantienen los cerebros disecados unidos al torso. El proceso de disección a menudo desaparece con facilidad a la mayoría de los tejidos del cerebro asociada tal como el ojo y la tráquea y reduce la demanda de pinza de disección buena calidad.

Además, cuando la formación de imágenes del cerebro bajo el microscopio compuesto fluorescente o un microscopio confocal, el lado del cerebro que está lejos de la fuente de luz fluorescente a menudo produce una señal más débil y menos imágenes nítidas debido a que el espesor del cerebro todo el montaje. Aquí, también se describe un método de montaje simple que permite una fácil mover de un tirón de las muestras de cerebro, lo que permite formación de imágenes conveniente de ambos lados del cerebro con intensi señal similarTy y calidad.

Como una prueba de concepto para la aplicación de este método para estudiar el cerebro adulto, hemos examinado aún más la presencia de las neuronas dopaminérgicas en el cerebro de las moscas w 1118; un genotipo que se utiliza a menudo como la línea parental para la generación de moscas transgénicas y el control de tipo salvaje en muchos estudios de Drosophila.

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Protocol

1. Soluciones utilizadas para el Cerebro La disección y la tinción de inmunofluorescencia

  1. Diseccionar el cerebro adulto mosca artificial en el líquido cefalorraquídeo (ACSF): NaCl 119 mM, 26,2 mM NaHCO3, KCl 2,5 mM, 1 mM NaH 2 PO 4, 1,3 mM de MgCl2 y 10 mM de glucosa. Antes de su uso, el gas de la ACSF con 5% de CO2 / 95% de O2 durante 10 - 15 min y pico con 2,5 mM de CaCl2. Esterilizar la solución LCRa por filtración a través de un filtro de 0,22 micras membrana.
    Nota: tienda LCRa a 4 ° C para evitar la contaminación bacteriana. Fly cerebro también pueden ser diseccionados en una solución tamponada con fosfato salino (PBS), aunque no se han realizado comparaciones detalladas de los efectos de las dos soluciones de disección en la calidad de imagen final de los cerebros disecados.
  2. Usar 4% de paraformaldehído (PFA) preparado en 1x PBS como la solución de fijación, que normalmente se dividió en alícuotas y se almacenó a -20 ° C.
    caution: PFA es tóxico y corrosivo y debe manejarse con cuidado.
  3. Utilice 1x PBS para enjuagar la PFA de los cerebros y después de la última etapa de lavado, durante la tinción de inmunofluorescencia de los cerebros disecados. Preparar el PBS 1x PBS 10x de solución madre (1,37 M NaCl, KCl 27 mM, 100 mM de Na 2 HPO 4, y 18 mM KH 2 PO 4).
  4. Use 0,3% de Tween-20 en PBS 1x (1x PBT) para todas las etapas de lavado posteriores durante la tinción de inmunofluorescencia de los cerebros disecados.

2. La disección microquirúrgica de Jefes de las moscas adultas

Nota: El procedimiento de disección se ilustra en la Figura 1.

  1. Anestesiar las moscas adultas con CO2. Con unas pinzas, recoger una mosca y brevemente desparafinar su cutícula por inmersión en etanol al 70% durante 3 - 5 s. Esto asegura que no hay burbujas se adhieren a la cutícula mosca cuando se sumerge en la solución o LCRa disección 1X PBS.
  2. Debajo demicroscopio de disección con una fuente de luz en un ángulo que no será bloqueada por las manos, establezca la lente del objetivo de alcanzar una visión clara de la marcha (ampliación 1.2X). El uso de fórceps con la mano no dominante para inmovilizar al animal y sumerja la mosca en la solución de disección en frío con su abdomen hacia arriba, como se muestra en la Figura 1A.
  3. Mantener las pinzas en un 160 - 170 ° ángulo con respecto a la placa de disección, mientras se ejerce una pequeña fuerza sobre el abdomen de la mosca (ilustrado como flechas en la Figura 1A). Este paso inmovilizará la marcha y la fuerza para mover la cabeza hacia atrás para el 15 - 25 ° mientras se extiende la trompa hacia arriba. En el proceso, una región suave y translúcido de la cutícula, por debajo de la trompa, debería ser evidente. Aumentar la ampliación y ajustar el plano focal en esta región.
    Nota: No sostenga la pinza con demasiada fuerza, sino que simplemente lo suficientemente firme como para estabilizarla mosca. El exceso de fuerza hará que los órganos dentro de la rotura en la solución.
  4. Utilice la mano dominante para presionar las pinzas de disección de modo que sus puntas están cerrados, lo que generará una fuerza resistente suave en la punta de las pinzas, por lo que el fórceps surgirán abierta cuando se libera la presión de la mano que sujeta. Coloque la pinza perpendicularmente a las pinzas que sostienen la marcha, como se muestra en la Figura 1B.
    1. Pierce las puntas cerradas de los fórceps de disección a través de la región suave y translúcido de la cutícula debajo de la trompa, como se ilustra por la flecha roja en la Figura 1B. Es importante que no penetre el fórceps demasiado profundamente que toque el cerebro. El cerebro adecuada debe ser visible. Mantener un agarre estable de la mosca con la mano no dominante.
  5. Rápidamente, pero de manera constante, suelte las puntas de las pinzas de disección por su propia fuerza y ​​se basan en el impulso de esta versión desgarrar tque exoesqueleto que rodea la cabeza de la mosca. Un cerebro intacto adecuada debe ser visible (el tejido blanco inmediatamente por encima de la punta de la pinza inferior en la figura 1C) Sigue una línea imaginaria para guiar el impulso de las puntas de fórceps liberados (ilustrados como las flechas rojas hacia el exterior que se muestran en la Figura 1C). Esto eliminará suavemente el exoesqueleto y la mayoría del ojo cerebro asociada y la tráquea del cerebro. El momento y la fuerza apropiada aplican para abrir el exoesqueleto será dependiente de la experiencia del investigador.
    Nota: Este es el paso más crítico durante la disección. Es importante que depender de la fuerza natural generado a partir del impulso de las pinzas de apertura para eliminar el exoesqueleto, dejando el cerebro expuesto permanece unido al resto del cuerpo.
  6. Utilice las pinzas en la mano dominante para retirar cuidadosamente los tejidos remanentes de accesorios, tales como la tráquea que aparece como estructuras de fibras blancas remaining unido al cerebro. Tenga cuidado de no tirar o dañar el cerebro adecuado.

3. Inmunofluorescencia La tinción de los cerebros

  1. Fijar las muestras de cerebros disecados con sus torsos asociados en aproximadamente 1 ml de PFA al 4% durante 40 - 60 min.
    Nota: Para éste y los siguientes pasos, mantenga los tubos o placas con las muestras en un nutator para mezclar adecuadamente las muestras en la solución.
  2. Enjuague con 1 ml de PBS 1x pipeteando la solución hacia arriba y abajo 3 veces. Tenga cuidado de no aspirar los cerebros de distancia.
  3. Lavar 5 veces con 1x PBT de 5 min cada uno. Mantener las muestras en el nutator durante la incubación.
  4. Se incuban con anticuerpos primarios a una dilución apropiada de O / N a 4 ° C.
  5. Al día siguiente, eliminar los anticuerpos primarios, y lavar las muestras 5 veces con 1x PBT. Deje las muestras durante 5 - 10 min en la solución 1x PBT entre cada lavado. Mantener las muestras en el nutator durante la incubación.
  6. Incubar la lavamuestras de anticuerpos secundarios apropiados con la dilución y el tiempo de incubación sugerido.
  7. Lavar las muestras seis veces con 1x PBT con una incubación de 10 min entre cada lavado.
    Este paso es crítico para la eliminación de los anticuerpos secundarios unidos de forma no específica de la muestra.
  8. Incubar en una dilución 1: 10000 de 1 mg / ml 4 ', 6'-diamino-2-fenilindol (DAPI) en solución PBT 1x durante 30 min. DAPI es un tinte de ADN que se une a las regiones de AT de ADN y se puede utilizar para revelar la morfología general del cerebro.
  9. Enjuague tres veces con PBS 1x.
  10. Transferir las muestras a un plato de disección, y se separan los cerebros de los órganos en una placa de disección con unas pinzas.
  11. Después de las etapas de tinción y lavado, montar los cerebros en entre dos cubreobjetos y colocar el cubreobjetos en la parte superior de un portaobjetos de montaje. De esta manera, las muestras de cerebro se pueden bascular con facilidad de modo que ambos lados del cerebro se pueden obtener imágenes con una intensidad de señal similar.
  12. Colocar un cubreobjetos de 18 x 18 mm en la parte superior de un portaobjetos de montaje. Ensanchar la abertura de una punta de pipeta con una cuchilla y utilizarla para transferir los cerebros en la solución de PBS 1x en la 18 x 18 mm cubreobjetos.
  13. Coloque los cerebros en el centro del cubreobjetos, eliminar el líquido alrededor de los cerebros con una punta de pipeta fina, y luego añadir otro 20 - 40 l de medio de montaje anti-fade (0,2% (w v) n-propil galato / en 99,5 ACS% de glicerol de grado) en los cerebros.
    Nota: La cantidad de montaje añadido medio depende del número de cerebros examinados.
  14. Suavemente separa los sesos al desplazar el medio de montaje viscoso hacia el exterior. Colocar un segundo 18 x 18 mm cubreobjetos en la parte superior de los cerebros mediante la reducción de la diapositiva primero de un lado hasta que haga contacto conla superficie de la hoja de montaje y, a continuación, reducir poco a poco el otro lado para minimizar el contacto cerebro con burbujas de aire.
    Nota: No hay necesidad de utilizar un espaciador entre los dos cubreobjetos, como el volumen del medio de montaje y el cerebro deben proporcionar un espacio suficiente para separar los dos cubreobjetos.
  15. Deje que los portaobjetos para establecerse. Retire el líquido excesivo que salen de los lados de las tiras con un pañuelo de papel de laboratorio.
  16. Para evitar que los cubreobjetos con los cerebros montados caiga fuera de la diapositiva de montaje durante el transporte, utilizar un pequeño trozo de cinta adhesiva para unir los cubreobjetos al portaobjetos de montaje.
    Nota: Los cerebros montan entre las diapositivas se pueden visualizar inmediatamente o se conservaron a 4 ° C durante un máximo de una semana sin pérdida significativa de la señal fluorescente, sin necesidad de utilizar ningún sellador para sellar las diapositivas. Para la conservación a largo plazo de los cerebros manchadas, el lado de los dos resbalones se puede sellar wITH esmalte de uñas y se almacena en un congelador a -20ºC, aunque cerebros manchados podrían perder sus señales a través del tiempo. Esto no es recomendable.
  • Utilizar un microscopio compuesto fluorescente apropiada o un microscopio confocal para la imagen de los cerebros.
    1. En primer lugar, adquirir la imagen del lado del cerebro más cerca del objetivo, y luego la vuelta con cuidado el cubreobjetos tener las muestras intercaladas en el medio. Este paso facilita la adquisición de la imagen del otro lado de la misma cerebro.
    2. Utilice un microscopio vertical compuesto fluorescente y una lente objetivo 20X en la imagen de conjunto del cerebro (ejemplos en la Figura 2) y un objetivo de 40X a imagen regiones más pequeñas del cerebro, tales como las neuronas DA en la región de clúster Paired anterior medial (PAM) (ejemplos en la Figura 3).
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    Representative Results

    La Figura 1 ilustra los principales procedimientos para la disección cerebro adulto, como se describe anteriormente Las figuras 2 y 3 son imágenes representativas de 3 días de edad WT. (Genotipo: w 1118) mosca adulta cerebros, que fueron costained con un anticuerpo contra tirosina hidroxilasa (TH , coloreado en rojo en la figura 2 y blanco en la figura 3), un marcador comúnmente utilizado para etiquetar las neuronas DA 11, además de que el tinte de ADN DAPI para etiquetar todos los núcleos de las células y un anticuerpo contra la proteína Elav, un marcador para todas las neuronas diferenciadas en la mosca (de color verde), que junto reveló la estructura general del cerebro.

    Para los anticuerpos primarios en las figuras 2 y 3, se utilizó anticuerpo de conejo anti-TH en una dilución 1: y de rata anticuerpo 200 anti-Elav en una dilución 1: 100, WHIch se prepararon de 1x PBT con suero de cabra normal al 5% para bloquear la unión no específica. Para los anticuerpos secundarios, se utilizó Alexa Fluor anticuerpo de cabra anti-rata conjugado 488 y el anticuerpo anti-conejo de cabra conjugado con AlexaFluor596 en una dilución 1: 500 en 1X PBT.

    Para la imagen de los cerebros, se utilizó un microscopio compuesto fluorescente en posición vertical equipado con una función de apótoma para adquirir imágenes Z-pila de rodajas de cerebro que cubren toda la profundidad de la región de interés en el cerebro. Por ejemplo, para obtener una visualización clara de la distribución general de las neuronas DA en todo el cerebro, se utilizó una lente objetivo 20X a separado imagen de los lados anterior y posterior de la misma cerebro (Figura 2). La profundidad de cada lado del cerebro fotografiada que puede cubrir todas las neuronas DA es de aproximadamente 20 a 25 micras en total. Para visualizar y cuantificar de manera fiable las neuronas DA en la región clúster PAM, que tienen tamaños de celdas más pequeñas y más débiles si THgráficas definen (véase más adelante), se utilizó una lente objetivo de 40X. Además, en la función de adquisición de la serie Z desde el software comercial, seleccionamos un espesor de corte de 0,5 a 1 m entre cada rebanada reflejado, lo que garantiza una calidad de imagen óptima en una reconstrucción 3D de la región de clúster PAM (Figura 3c). El espesor de clúster PAM en el cerebro que cubre todas las neuronas DA es cerca de 8 - 10 micras en total. En nuestra experiencia, la función apótoma puede reducir significativamente la señal de ruido en la formación de imágenes con muestras gruesas alta de fondo, como un cerebro completo o la región clúster PAM.

    Las figuras 2A-E muestran la vista anterior de un cerebro, mientras que las figuras 2F-J muestra la vista posterior del mismo cerebro después de voltear los cubreobjetos que sujetan las muestras de cerebro, que muestran un nivel similar de intensidad de la señal entre los dos lados del cerebro para todos los tres canales de imágenes. El neur DAons se agruparon en diferentes grupos siguientes a la designación principios de 11, aunque en este caso usamos el nombre emparejado posterior medial (PPM) para incluir el PPM1, PPM2 y grupos ppm3 en la parte anterior del cerebro, y el nombre emparejado lateral posterior (PPL ) para cubrir los racimos pPL1 y pPL2 desde el lado posterior del cerebro, tal como se representa en las figuras 2E y 2J. Figuras 2E y 2J en demostración blanca vistas anterior y posterior del mismo cerebro en alta magnificación, revelando los diferentes grupos de DA neuronas en ambos lados del cerebro. El blanco líneas discontinuas destacan la racimos Paired lateral anterior (PAL) PAM prominente y en el lado anterior del cerebro (Figura 2E), así como el PPL y los grupos ppm en el lado posterior del cerebro (Figura 2J).

    Las figuras 3A y 3B una re resúmenes de los resultados de la cuantificación de algunos de los grupos de DA en 1118 w moscas. Contamos neuronas DA trozo a trozo y también de 3D reconstruyen las imágenes, lo que debería reducir al mínimo el conteo impreciso. Estimamos que los 3 días de edad w 1118 moscas tienen un promedio de 27 neuronas DA en general en el grupo de PPM por el cerebro, 16 neuronas DA en el cluster PPL por hemisferio, 5 neuronas DA en clúster PAL por hemisferio (Figura 3A), y 97 neuronas DA en cada uno de los grupos de PAM (Figura 3B). la Figura 3C es una reconstrucción 3D representativa de las neuronas DA en los grupos PAL y PAM, proyectadas de rodajas de imágenes de gran aumento que cubren todas las neuronas DA en esta región. Es evidente que en comparación con otros grupos, tales como el PAL, las neuronas DA en el cluster PAM tienen tamaños de celdas relativamente pequeños y las señales de tinción TH más débiles.

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    Figura 1:. Ilustración gráfica del Protocolo de disección para Adultos Drosophila Las moscas del cerebro (A) están colocadas con la parte ventral hacia arriba, y llevan a cabo por el tórax con la mano no dominante. Se aplicó fuerza suavemente (flechas rojas) al fórceps para inducir la inclinación hacia atrás de la cabeza de mosca y ligera extensión hacia el exterior de la trompa, exponiendo la región transparente blanco a continuación. (B) del fórceps de la mano dominante se insertan en la región transparente debajo de la trompa, la creación de una incisión superficial (flecha roja). Tenga en cuenta que el fórceps que utilizamos no tienen extremos de las puntas muy finas. (C) del fórceps pueden a desintegrarse a través de su propia fuerza, como se indica por las flechas rojas. El impulso generado por la apertura de las pinzas elimina los ojos y exoesqueleto, dejando al descubierto un cerebro de Drosophila relativamente limpio. La mayor parte de la tráquea se eliminan en el proceso. ( Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Figura 2
    Figura 2:. DA neuronas Revelado con anti-tirosina hidroxilasa (TH) de anticuerpos en varón adulto de Drosophila B lluvia (Adquirido con un objetivo 20X) Esta cifra incluye imágenes representativas de los cerebros adultos disecados, reconstruido utilizando imágenes apiladas Z-de la región del cerebro de intereses obtenidos con el microscopio de fluorescencia compuesto. (AE) anterior y (FJ) vistas posteriores de la misma cerebro adulto; (A & F) Los núcleos celulares se obtuvieron imágenes mediante tinción con DAPI (blanco) y las neuronas (C & H) wERE marcada por anticuerpos marcadores pan-neuronal anti-Elav (verde); Neuronas (B & G) DA son reveladas por los anticuerpos anti-TH (rojo). (D + i) de superposición de imágenes para DAPI, TH y el tratamiento Elav. (E & J) Vista ampliada de las regiones del cerebro con las neuronas DA se muestran en blanco. Las líneas discontinuas destacan los grupos PAL y PAM en la parte anterior del cerebro y las agrupaciones de PPL y PPM en la parte posterior del cerebro. La barra de escala representa 50 micras de todos los paneles. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    figura 3
    Figura 3. La cuantificación de las neuronas DA en el cerebro de un adulto masculino w 1118 moscas (Adquirido con un objetivo de 40x). (A y B) Cuantificación de DA neurons del día 3 hombres w 1118 moscas, reveladas por tinción con anti-TH. Los datos se representan mediante diagramas de caja de bigotes muestran los valores mínimo y máximo como los valores extremos; así como el primero (Q1), segundo (Q2) y tercero (Q3) cuartiles. El segundo cuartil se representa como el valor medio. (A) PPM {(n = 28) Min: 21, P1: 24, Promedio: 27, P2: 30, Max: 32}, PPL {(n = 26) Min: 10, P1: 12, Promedio: 16, P2: 18, Max: 25}, {y PAL (n = 24), mínima: 2, P1: 4, media: 5, P2: 5, Max: 10} racimos; Clúster (B) PAM {(n = 20) Min: 86, P1: 94, Promedio: 97, P2: 97, Max: 99}. (C) Una imagen de proyección representativo que muestra las neuronas DA en los PAM y PAL grupos de sexo masculino w 1118 moscas a los 3 días. La barra de escala representa 20 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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    Discussion

    Con un creciente interés en el uso de adultos Drosophila cerebro para estudiar enfermedades humanas, los circuitos neuronales del cerebro y las funciones cerebrales superiores, es necesario desarrollar métodos simples y rápidos para obtener cerebros de moscas intactas para análisis de todo el montaje, lo cual es especialmente importante para a gran escalar las pantallas basadas en el cerebro. Nuestro método proporciona una forma sencilla y fácil de aprender enfoque para diseccionar una cabeza de mosca (a menudo en menos de 10 s con experiencia) con morfología bien conservada que se elimina gran parte de los tejidos asociados. Como los cerebros disecados todavía están unidos al resto de los cuerpos de moscas, por lo general se hunden hasta el fondo del tubo de muestra de forma rápida y son fáciles de reconocer y recoger durante las etapas de lavado y de tinción. Esto minimiza significativamente la pérdida de muestra que puede ser un tema importante en el procesamiento de las muestras de cerebro de tamaños diminutos físicas. Este problema puede ser especialmente importante para los estudios a gran escala. El cerebro se puede separar fácilmente del cuerpodespués de la finalización del proceso de tinción, antes de que el montaje.

    Durante la disección, es importante posicionar correctamente la marcha, mantener los ángulos apropiados al retirar el exoesqueleto de la cabeza de la mosca, y suavemente ejercer la fuerza adecuada en la realización de cada paso. Se recomienda que las pinzas se colocan perpendicularmente entre sí con el fin de evitar la decapitación de la mosca (Figura 1B). Como se muestra en las imágenes representativas en la figura 2, los cerebros preparados utilizando este protocolo producen resultados satisfactorios. En este ejemplo, nos centramos en las neuronas DA en el cluster PAM de cerebros adultos. Un cerebro de Drosophila en promedio tiene total de alrededor de 280 neuronas DA por protocerebro, que se distribuyen en grupos distintos en diferentes regiones del cerebro con los patrones distintivos de proyección y de salida funcional 11, 12. Anterior caracterización de las neuronas dopaminérgicas en el cerebro adulto de Drosophila, including vuela modelos de genes de enfermedades humanas como en los mutantes de parkin, se han centrado en gran medida en el PAL, grupos PPL, y PPM que tienen tamaños relativamente grandes de células y expresión prominente de TH, el fabricante estándar que se utiliza para el etiquetado neuronas DA 13-18.

    Sin embargo, la mayoría de las neuronas DA en el cerebro de la mosca se encuentran en los grupos de PAM, con cerca de 100 neuronas DA por racimo. En comparación con las células de otros grupos de DA, las neuronas DA en el cluster PAM normalmente muestran un menor nivel de expresión de la tirosina hidroxilasa y tamaños de celdas más pequeñas. En las muestras preparadas a partir de nuestro protocolo de disección y la tinción, las neuronas DA en el cluster PAM se pueden visualizar claramente y la imagen en alta calidad utilizando un microscopio de fluorescencia compuesto, sin formación de imágenes confocal. Dada su gran número, la cuantificación de las neuronas DA en el cluster PAM de diferentes orígenes genéticos podría producir resultados más fiables y reproducibles. Sugerimos que las neuronas DA en los clus PAMter representan otro sistema útil para el estudio de la biología DA y el modelado de los trastornos relacionados-DA, tales como la enfermedad de Parkinson.

    En nuestra experiencia, la función apótoma del microscopio se utilizó puede reducir significativamente la señal de fondo, sobre todo en el examen de muestras con un espesor considerable, como todo el cerebro de la mosca adulta. Aunque microscopio confocal puede producir imágenes con más detalles, un aumento mayor y de mejor calidad, es a menudo mucho tiempo y es costoso. Esto es especialmente cierto para obtener imágenes de un gran número de muestras gruesas, tales como los cerebros adultos que requieren series de la sección Z-pila para la reconstrucción 3D clara y el análisis de deconvolución. En esta perspectiva, la función apótoma representa una alternativa rápida y rentable para producir imágenes de calidad suficiente (por ejemplo, imágenes en las figuras 2 y 3).

    En estudios del cerebro, es a menudo necesario para celdas de imagen tanto sides de el mismo cerebro. Por ejemplo, las neuronas DA están presentes en grupos de ambos los lados anterior y posterior del cerebro. Sin embargo, debido a su espesor, después de un cerebro se monta sobre el portaobjetos, el lado alejado de la fuente de luz (es decir, el lado orientado hacia la corredera de montaje) por lo general da lugar a las señales más débiles y las imágenes menos claras cuando imágenes utilizando compuesto regular y confocal microscopios. Mediante el montaje de las muestras entre los dos portaobjetos de cubierta, que permite mover de un tirón conveniente de las muestras sobre el portaobjetos montado y la posterior formación de imágenes de ambos lados de la misma cerebro con intensidades de señal similares. Figura 2 es un ejemplo de formación de imágenes neuronas DA de ambos lados de volar cerebros utilizando este método, que mostró la intensidad de señalización relativamente comparables y la calidad de imagen.

    Varios enfoques fáciles de seguir para la disección de las moscas adultas y cerebros han sido muy bien descrito 9, 10. Nuestro enfoque proporciona un método alternativo que pueda pielesTher simplificar los procesos de disección y la tinción de las moscas adultas y cerebros. Con más estudios a gran escala que se llevan a cabo para un mapa de todo el circuito neuronal del cerebro, así como sus componentes moleculares y celulares, es previsible que la disección y la imagen enfoques automatizados pueden ser desarrollados para adultos cerebro de Drosophila para realizar cribados genéticos y de medicamentos de alto rendimiento in vivo en este modelo genética clásica.

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    Acknowledgments

    Reconocemos el Sr. Mehmet Enes, la Sra Kiara Andrade, Sra. Pilar Rodríguez, Chris Kwok, y la Sra Danna Ghafir por su inmenso apoyo al proyecto.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    w*; parkΔ21/TM3, P{GAL4-Kr.C}DC2, P{UAS-GFP.S65T}DC10, Sb1 Bloomington Drosophila Stock Center 51652 Balancer was switched to TM6B
    PBac{WH}parkf01950 Exelixis at Harvard Medical School f01950 Balancer was switched to TM6C
    NaCl Fisher Scientific S640-500
    Sodium Bicarbonate (NaHCO3 Fisher Scientific 02-003-990
    Potassium Chloride (KCl) Fisher Scientific BP366-500
    Sodium phosphate, monobasic monohydrate (NaHCO3) Fisher Scientific 02-004-198
    Magnesium Chloride (MgCl2) Fisher Scientific 02-003-265
    D-Sorbitol Sigma-Aldrich S1876-500G Replaces glucose
    Calcium chloride dihydrate (CaCl2) Sigma-Aldrich C5670-500G
    EMD Millipore Durapore PVDF Membrane Filters: Hydrophilic: 0.22 µm Pore Size Fisher Scientific GVWP14250
    Formalin Solution, 10% (Histological) Fisher Scientific SF98-20
    Potassium Phosphate, Dibasic, Powder, Ultrapure Bioreagent Fisher Scientific 02-003-823
    Tween-20 Fisher Scientific BP337-500
    Excelta Precision Tweezers with Very Fine Points Fisher Scientific 17-456-055 Protocol does not require very fine points. 
    Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody Pel-Freez Biologicals P40101
    Rat-Elav-7E8A10 anti-elav The Developmental Studies Hybridoma Bank Clone 7E8A10
    Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate ThermoFisher Scientific A-21247
    Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate ThermoFisher Scientific A-11037
    DAPI Solution (1 mg/mL) ThermoFisher Scientific 62248
    Propyl gallate powder Sigma-Aldrich P3130-100G
    Glycerol ACS reagent, ≥99.5% Sigma-Aldrich G7893-500ML
    Zeiss Axioimager Z1 Zeiss Quote
    Zeiss Apotome.2 Zeiss Quote
    Zen lite software Quote

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    References

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