الكمي للبكتيريا الحامض الأميني كيناز Autophosphorylation باستخدام الفحص النيتروسليلوز التجليد

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Fischer, J., Johnson, R. A., Boon, E. Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay. J. Vis. Exp. (119), e55129, doi:10.3791/55129 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

استجابة تكيفية حاسمة لبقاء البكتيريا. من أجل كشف والاستجابة للتغيرات البيئية والبكتيريا استخدام نظام الحوافز والاستجابة المعروفة باسم إشارات مكون اثنين. 1،2 في نظام ثنائي مكون نموذجي، كيناز الحامض الاميني يكشف حافز وما شابه ذلك، autophosphorylates بقايا لها الحامض الاميني الحفظ، ثم ينقل الفوسفات إلى بقايا اسبارتاتي الحفظ على نطاق الاستقبال من البروتين استجابة منظم. 3 هذا الحدث يؤدي إلى تغيير في نشاط منظم استجابة، مما يحفز تأثير المصب. 4،5 وهكذا، البكتيريا قادرة على الإحساس والتكيف مع التغيرات في البيئة المحلية. بعض أنظمة إنذار مكون اثنين تحيد عن هذا النموذج الأصلي. في بعض الحالات، المجال الحسي للكيناز الحامض الاميني هو بروتين قائمة بذاتها، الذي يكتشف مباشرة المدخلات الحسية ويعدل النشاط كيناز من خلال تفاعل البروتين البروتين. 6-8 ومع ذلك، فإن صندوقعملية amental ودورها الشامل للنظام لا يزال هو نفسه. إشارات ثنائي مكون هو نظام الحوافز والاستجابة في كل مكان التي لا غنى عنها لبقاء البكتيريا، وتحركات الحامض الاميني تلعب دورا حاسما في تنبيغ الإشارة. 9

وعلى الرغم من أهمية تحركات الحامض الاميني لعلم الأحياء البكتيرية، إلا أنها تظل سيئة تتسم. ويرجع ذلك إلى عدم الاستقرار المتأصل في phosphohistidine، وعدم وجود طريقة عملية لقياس autophosphorylation هذا. Phosphohistidine أكثر عطوب من phosphoserine، phosphothreonine، وphosphotyrosine. 10 وهكذا، والتقنيات التي تستخدم عادة لتحليل تحركات سر / منتدى المجالس الرومانسية / صور غير قابلة للتطبيق لتحركات الحامض الاميني. وقد اقتصرت عموما 11 في فحوصات المختبر لدراسة تحركات الحامض الاميني لتصوير الإشعاع الذاتي SDS-PAGE. 12،13 في هذه الطريقة، يتم تحضين [γ- 32 ف] -ATP مع كيناز، ويتم تحليل الفسفرة من كيناز من قبل بولهلام yacrylamide الكهربائي (PAGE) تليها تصوير الإشعاع الذاتي من هلام. ويمكن استخدام هذا الأسلوب لمراقبة autophosphorylation كيناز، وكذلك phosphotransfer من كيناز إلى منظم استجابة. ومع ذلك، فإن هذا الأسلوب له عيوب ملحوظة. فحوصات على أساس PAGE منخفضة الإنتاجية وتستغرق وقتا طويلا. وهذه القيود لا تساعد على تحديد خصائص البروتين والتأكد من المعلمات الحركية. طريقة بديلة لدراسة تحركات الحامض الاميني الذي نشر مؤخرا يستخدم الأجسام المضادة phosphohistidine للكشف عن autophosphorylation. 14 في حين أن هذا الأسلوب له ميزة التمييز بين 1-phosphohistidine و 3 phosphohistidine، اعتمادا على الأجهزة المستخدمة للكشف، وهذه الطريقة قد لا توفر مجموعة ديناميكية كبيرة أو الحد الأعلى عال من الكشف. وبالتالي، هناك حاجة لفحص أسرع وأقل مشقة، وأكثر حساسية والتي يمكن استخدامها لدراسة هذه البروتينات الهامة.

هنا، نحن تصف ودemonstrate فحص النيتروسليلوز وضعت بعناية ملزم التي يمكن استخدامها لتحديد autophosphorylation من النقاء تحركات الحامض الاميني البكتيرية في المختبر. هذا الاختبار هو أعلى إنتاجية وأقل استهلاكا للوقت من المقايسات القائم على الصفحة. كما يستخدم طريقة إشعاع شيرينكوف لتقدير phosphohistidine، الذي يوفر الحد الأعلى عال من الكشف ومجموعة ديناميكية كبيرة. الفحص يمكن استخدامها لتحديد معالم الحركية للتحركات الحامض الاميني.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تحذير: هذا البروتوكول يتطلب التدريب المناسب في استخدام وتداول المواد المشعة. الرجاء استخدام معدات الوقاية الشخصية اللازمة عند إجراء هذا الفحص، بما في ذلك الحماية من الإشعاع بيتا. يجب التعامل مع النفايات المشعة بعناية، كما يتم إنشاء كميات كبيرة من النفايات خلال مرحلة الغسل من التجربة. ضمان أن يتم تخزين النفايات في حاوية تستقيم مثل دلو كبير أو زجاجة أنه لن يتم طرقت بسهولة أكثر أو المسكوب. بمجرد أن تنتهي التجربة، ونقل بعناية جميع النفايات السائلة إلى وضع علامة على النحو المناسب حاويات النفايات المشعة. التعامل مع جميع المواد مع الرعاية، والحفاظ على عداد جيجر في مكان قريب لمراقبة مساحة العمل للتلوث.

ملاحظة: هذا البروتوكول هو نسخة منقحة من فحص ذكرت سابقا من مجموعتنا. وينبغي اختبار 15 Phosphohistidine الاستقرار في H 3 PO 4 لأي كيناز الحامض الاميني uncharacterized قبل استخدام هذا الأسلوب. وphosphohistidine الواحدوقد وصفت اختبار قدرة سابقا. يجب تضمين 15 عنصر تحكم السلبية التي لا تحتوي على كيناز. وهذا أمر ضروري من أجل طرح إشارة الخلفية من كل عينة، والتأكد من أن [γ- 32 ف] -ATP يتم غسلها بما فيه الكفاية من الغشاء.

1. إعداد الكواشف والمواد

  1. تنقية تحركات الحامض الاميني من ثقافة البكتيرية قبل استخدام هذا الاختبار.
    1. تنقية كيناز الحامض الاميني (ID الجينات 1189383) من الضمة نظيرة الحالة للدم (EB101، آي تي سي سي 17802) لتطوير هذا الاختبار. استنساخ كيناز في التعبير ناقلات الحيوانات الأليفة 23aHis-TEV باستخدام NdeI وتقييد مواقع XhoI، وتنفيذ الطفرات موقع الموجه لانتاج متحولة بناء Vp1876 D499A.
    2. تحويل البلازميد إلى كولاي BL21 (DE3) pLysS، وتنمو الخلايا في وسائل الإعلام السل عند 37 درجة مئوية. الثقافات الملحق مع الأمبيسلين (100 ميكروغرام / مل) والكلورامفينيكول (34 ميكروغرام / مل)، وتنمو مع الإثارة(250 دورة في الدقيقة) إلى OD 600 من 0.6.
    3. حمل تعبير البروتين مع IPTG إلى تركيز النهائي من 25 ميكرومتر، وتنمو الثقافات بين عشية وضحاها في 16 درجة مئوية. حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي (5000 x ج)، ليز صوتنة، وأجهزة الطرد المركزي لإزالة الحطام الخلوي (18000 x ج).
    4. تنقية كيناز صاحب الكلمات الدلالية باستخدام ني NTA الاغاروز. تأكيد نقاء بواسطة SDS-PAGE. تحسين تنقية لكل من البروتين، وتأكيد نقاء قبل استخدام هذا الاختبار.
  2. إعداد ملي H 3 PO 4 حل 25 غسل. ل1 لتر من الماء منزوع الأيونات المقطر، إضافة H 3 PO 4 إلى تركيز النهائي من 25 مم. الرقم الهيدروجيني لهذا الحل هو ما يقرب من 2.0. وضع 25 مم H 3 PO 4 على الجليد.
  3. يعد حل 13x الأسهم من 325 ملي H 3 PO لاستخدامها في إخماد رد فعل كيناز. الرقم الهيدروجيني لهذا الحل هو ما يقرب من 1.5. وضع 325 مم H 3 PO 4 على الجليد.
    ملاحظة: H 3 PO 4
  4. إعداد محلول المخزون الاحتياطي رد فعل 4x والتي تحتوي على 160 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك 8.0 درجة الحموضة، و 600 ملي بوكل، 16 ملي MgCl و 40٪ الجلسرين.
  5. قياس الحامض الاميني تركيز كيناز بالطرق البروتين أنشئت تركيز (برادفورد، الأشعة فوق البنفسجية فيس، وما إلى ذلك). 16،17 إعداد محلول الحامض الاميني كيناز مع التركيز الذي هو 4 أضعاف تركيز النهائي المطلوب. للحصول على إشارة كافية، وتركيز البروتين النهائي في رد الفعل يجب أن يكون مثاليا لا يقل عن 5 ميكرومتر.
  6. إعداد رديولبلد 4x و[γ- 32 ف] -ATP حل مع تركيز 4X المناسب للاعبي التنس المحترفين الخالي من الملصقات والمسمى: نسبة غير المسماة للتجربة.
    ملاحظة: مقدار [γ- 32 ف] -ATP التي ينبغي إدراجها في هذا المزيج تعتمد على كم [^في نهاية المطاف أن رصدت 32 ف] -ATP لكل رد فعل - (7)؛. لقد حصلنا على إشارة كافية مع تركيزات النهائي تتراوح بين 0،1-5 μCi في رد الفعل. من المهم أن المسمى: أن تظل تحمل اسما نسبة ATP المستمر لجميع ردود الفعل في تجربة معينة. وينبغي بذل التخفيفات المسلسل عندما يتم المطلوب تركيزات ATP متعددة، حيث الاحتفاظ جيدا المسمى: تحمل اسما نسبة ATP ثابت في جميع التركيزات. تركيزات ATP النهائية عادة ما تتراوح من 10 ميكرومتر إلى 1 مم على الأقل، ويجب أن يعاير كل التركيز في ثلاث نسخ للحصول على بيانات الحركية يمكن الاعتماد عليها.
  7. 96- جهاز لطخة دوت جيدا
    1. قطع 8 سم × 12 سم قطعة من غشاء النيتروسليلوز (حجم 0.2 ميكرون المسام).
    2. النيتروسليلوز موقف في جهاز نقطة وصمة عار، وضمان أن الغشاء يناسب هذا أن جهاز مختومة، وجميع الآبار مغطاة بالكامل من قبل الغشاء. إذا تجميعها بشكل صحيح، ينبغي أن يكون هناك أي تسرب الهواء عند الفراغ هو تطبيق ورقةالعبوات الناسفة.
    3. لجمع الرشاحة، قم بتوصيل الجهاز إلى قارورة الجانب الذراع الثانوية. من جذع صمام، قم بتوصيل أنابيب كافية بحيث الجهاز يمكن استخدامها بشكل مريح دون ترجيح القارورة الثانوية.
    4. ربط الثانوية قارورة الجانب الذراع إلى مصدر الشافطة / فراغ.
    5. اختبار هذا الجهاز وختم تماما من خلال تطبيق فراغ إلى الجهاز. إذا تم تجميعها الجهاز بشكل صحيح، سوف فراغ قوي يكون حاضرا في كل من الآبار. كافة الاتصالات الأنابيب يمكن أن تكون ملفوفة في بارافيلم أو ساران التفاف لضمان ختم مشددة.
    6. اختياريا، لاختبار الفراغ، الماصة 100 ميكرولتر من رد فعل العازلة في بئر واحدة. يجب أن يكون فراغ قوي بما يكفي لرسم كل السائل من خلال جيدا وعلى الغشاء.
    7. إيقاف فراغ حتى جميع العينات جاهزة للرصدت على الغشاء.

2. رد الفعل بدء وتسقيه

  1. خلط المكونات رد فعل
    1. قبل initiأوجه، وإعداد جميع مكونات رد فعل أربعة كحلول الأسهم 4X: رد فعل العازلة (انظر القسم 1.4)، الحامض الاميني كيناز (1.5)، [γ- 32 ف] -ATP (1.6)، وده 2 O.
    2. خلط كميات متساوية من العازلة رد فعل، كيناز الحامض الاميني، وده 2 O. السماح هذه المكونات رد فعل للتوازن في درجة حرارة الغرفة لفترة قصيرة (10 دقيقة).
      ملاحظة: إن حجم رد الفعل النهائي يعتمد على ما إذا كانت التجربة، التي تعتمد على الإنزيم، أو التي تعتمد على الركيزة التي تعتمد على وقتا طويلا. يجب أن تكون ردود الفعل تعتمد على الوقت أكبر، كما يتم أخذ قسامات متعددة من نفس رد الفعل وتطفأ عند نقطة زمنية محددة. وسوف تعتمد على حجم رد الفعل على عدد من النقاط الوقت المطلوب. هو الأمثل لفحص لكل بقعة على غشاء النيتروسليلوز لاحتواء 30 ميكرولتر من رد الفعل. وبالتالي، إذا المطلوب 10 نقاط الوقت، يجب أن يكون حجم رد الفعل لا يقل عن 300 ميكرولتر (حجم أكبر مثل 330 ميكرولتر من شأنه أن يكون أفضل في حال وجود أي أخطاء pipetting ل).انزيم والتجارب التي تعتمد على ركيزة تتطلب كميات رد فعل أصغر. حجم رد الفعل لهذه التجارب يمكن أن تكون صغيرة مثل 30 ميكرولتر، وهذا هو الحجم النهائي الذي سيتم رصدت على غشاء النيتروسليلوز.
    3. لبدء التفاعل، إضافة إلى حجم واحد من حل [γ- 32 ف] -ATP للتفاعل ومزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا. تتبع انقضى وقت رد الفعل مع جهاز توقيت والسماح للرد فعل على المضي قدما لمدة الوقت المطلوب.
    4. لإرواء رد الفعل، إضافة 1/13 من حجم رد الفعل الكلي للالمثلج 325 مم H 3 PO 4 إلى التفاعل ومزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا. بدلا من ذلك، إضافة قسامة من رد الفعل إلى 325 مم H 3 PO 4.
      ملاحظة: تركيز النهائي من H 3 PO 4 يجب أن تكون 25 مم لإرواء بما فيه الكفاية رد الفعل. على سبيل المثال، إضافة 2.5 ميكرولتر 325 مم H 3 PO 4-30 رد فعل ميكرولتر، أو إضافة 30 ميكرولتر رد فعل على 2.5 ميكرولتر 325 مم H 3 PO <فرعية> 4. درجة الحموضة النهائية للتفاعل ما يقرب من 4.0. وقد تم اختبار هذا تركيز H 3 PO وأكد لإرواء رد الفعل كيناز في هذا المخزن المؤقت دون المهينة phosphohistidine.
      1. على سبيل المثال، مزيج 7.5 ميكرولتر 4X عازلة رد فعل، 7.5 ميكرولتر 4X الحامض الاميني كيناز، و 7.5 ميكرولتر ده 2 O. الشروع في رد فعل مع 7.5 ميكرولتر [γ- 32 ف] -ATP. إخماد رد فعل مع 2.5 ميكرولتر 325 مم H 3 PO 4.
    5. المكان على الفور ردود فعل تطفئ على الجليد حتى يتم إنهاء كافة ردود الفعل.
      ملاحظة: لتحقيق أقصى قدر من الكفاءة، فإنه من المستحسن لبدء رد فعل واحد وبدأ كل 15 أو 20 ثانية حتى كل ردود الفعل، ومرة ​​واحدة مرت وقت رد الفعل المطلوب، إخماد رد فعل واحد كل 15 أو 20 ثانية حتى يتم تطفئ جميع. بالنسبة لأولئك الذين يستخدمون فحص للمرة الأولى، قد يكون فاصل زمني أطول أكثر سهولة.

3. الإكتشاف سردود الفعل و مروي على النيتروسليلوز

  1. بدء فراغ على 96 ابار جهاز صمة عار نقطة
    1. وضع 96 بئرا جهاز صمة عار نقطة تجميعها مسبقا (القسم 1.7) في وعاء الثانوية. وينبغي أن تكون هذه الحاوية كبيرة بما يكفي لجهاز لتفكيكها بسهولة في، وجهاز والغشاء سيكون الإشعاعي بعد الاستعمال.
    2. تطبيق فراغ إلى الجهاز وصمة عار نقطة 96-جيدا.
    3. مرة واحدة الجهاز هو تحت فراغ، الماصة بعناية رد الفعل مروي مباشرة على غشاء النيتروسليلوز في كل بئر. كرر حتى يتم تحميل جميع ردود الفعل على الغشاء. منذ القدرة ملزم من النيتروسليلوز (75-110 ميكروغرام / سم 2) أكبر من كمية كيناز الحامض الاميني التي رصدت، فإنه يمكن الافتراض أن ما يقرب من جميع كيناز بربط غشاء عند تحميلها بشكل صحيح.
      ملاحظة: اعتمادا على جهاز يستخدم، يجب الحرص على عدم ثقب النيتروسليلوز. نلاحظ أن كل من رد فعل قد اجرى اتصالا مع الالبريد النيتروسليلوز. فمن السهل لبعض أو كل من رد الفعل على التمسك جدران البئر، وليس الوصول إلى النيتروسليلوز.
    4. غسل الآبار مع 100 ميكرولتر من الجليد الباردة 25 مم H 3 PO 4. وهذا سوف يسمح أي حجم رد الفعل الذي قد حوصر في البئر للوصول إلى الغشاء، وضمان تحميل الكامل لجميع ردود الفعل. تسمح وحدة التخزين بالكامل بالتدفق عبر الغشاء.
  2. التفكيك أجهزة والنيتروسليلوز نقل الغشاء
    1. تفكيك بعناية الجهاز قبل اغلاق قبالة الفراغ. أخذ العلم بأن كلا من أجهزة وغشاء النيتروسليلوز المشعة في هذا الوقت. لا تقم بإزالة أي مكون من مكونات الجهاز من الحاوية الثانوية في هذا الوقت.
    2. بالملقط، ونقل بعناية غشاء النيتروسليلوز من الجهاز إلى وعاء يحتوي على ما يقرب من 200 مل 25 ملي الجليد الباردة H 3 PO 4. وضع غطاء على هذه الحاويات، وغسل ستكون راضيoactive. في هذا الوقت، يمكن أن تغلق الفراغ خارج.

4. معالجة النيتروسليلوز

  1. غسل النيتروسليلوز
    1. وضع الحاوية مع غشاء الغسيل على الكرسي الهزاز. السماح للغشاء لموسيقى الروك بلطف لمدة 20 دقيقة.
    2. بعد 20 دقيقة، صب بعناية محلول الغسيل المستخدمة في دلو كبير لاستخدامها لتخزين النفايات المؤقت. إضافة 200 مل من الجليد الباردة 25 مم H 3 PO 4 إلى الغشاء، وتكرار.
      ملاحظة: على الأقل ضرورية لإزالة الخلفية [γ- 32 ف] إشارة -ATP من الغشاء ثلاثة 20 يغسل دقيقة. بعد غسل الثالث، اختبار محلول الغسيل المستخدمة للإشعاع مع عداد جيجر. تواصل غسل غشاء على النحو المبين أعلاه حتى لا إشارة موجودة في محلول الغسيل.
  2. تجفيف النيتروسليلوز
    1. بعد أن يتم غسل غشاء بما فيه الكفاية، والسماح للغشاء للهواء الجاف لفترة وجيزة. هذا عادة ما يستغرق 5 دقائق أو أقل.

5. التعرض للشاشة تخزين الفوسفور

ملاحظة: هذا القسم هو اختياري. فضح الغشاء إلى شاشة الفوسفور هو مفيد لأنه يسمح لتصور من شدة كيناز رديولبلد في كل بقعة على الغشاء. كثافة النسبية لهذه البقع يتناسب طرديا مع كمية من الحامض الاميني كيناز فسفرته في كل بقعة. يمكن قياس كثافة مع برامج معالجة الصور، ويمكن مقارنة هذه النتائج لتلك التي تم إنشاؤها من قسم 7. وعلاوة على ذلك، هذه الخطوة تتيح لمراقبة الجودة. تشوهات ينظر في هذا المسح قد يفسر النتائج غير النظامية التي تم الحصول عليها من التلألؤ العد.

  1. إعداد شاشة الفوسفور
    1. قبل تعريض الغشاء إلى شاشة الفوسفور التخزين، وتعريض شاشة الفوسفور إلى الضوء الأبيض لمدة 5 دقائق على الأقل. هذا يضمن أن أي صورة المتبقية التي قد تعقد من قبل على الشاشة تم محوها.
    2. تأكد من أن الشاشة نظيفةوجافة. إذا لزم الأمر، وتنظيف بلطف الشاشة مع محلول تنظيف الشاشة الفوسفور معتمدة من قبل المصنع الشاشة، ومسح جاف.
  2. إعداد غشاء النيتروسليلوز
    1. بعناية التفاف غشاء النيتروسليلوز الجافة في غلاف بلاستيكي رقيق لمنع الرطوبة المتبقية من إتلاف الشاشة الفوسفور. تأكد من عدم وجود التجاعيد أو الفقاعات.
  3. التعرض للشاشة الفوسفور
    1. وضع غشاء النيتروسليلوز ملفوفة في تخزين الفوسفور شاشة كاسيت، وضع الشاشة وجها لأسفل على الغشاء، وإغلاق الكاسيت. لا تفتح كاسيت أو نقل غشاء حتى حان الوقت لمسح الشاشة الفوسفور، كما غشاء التحول خلال التعرض سوف يتسبب في صورة مزدوجة أو لطخت ليتم القبض.
    2. فضح لمدة 4 ساعة على الأقل، أو ما دامت تشير الشركة المصنعة شاشة الفوسفور.
    3. بمجرد الانتهاء من التعرض، ومسح الشاشة الفوسفور والتقاط صورة مع ماسح ضوئي الفوسفور.

6. إعداد النيتروسليلوز غشاء لالتلألؤ العد

  1. الشقائقية S تلطيخ وdestaining
    1. لفترة وجيزة تزج غشاء النيتروسليلوز في الشقائقية S حل تلطيخ (0.1٪ الشقائقية S (ث / ت) في 5٪ من حمض الخل) 1 - 2 دقيقة. الرطب الغشاء كامل مع وصمة عار قبل destaining.
    2. صب الزائد الشقائقية S من الغشاء.
    3. شطف الغشاء مع ده 2 O حتى ملطخة فقط بقع من كيناز الحامض الاميني. لاحظ أن هذا الإجراء لن تنجح إلا إذا تحتوي على جميع البقع كميات ملحوظة من البروتين.
      ملاحظة: هذه الخطوة غير ضرورية للتأكد من أن كيناز لا بد أن النيتروسليلوز، وأن تحميل البروتين، بل هو في جميع المناطق. كما يسمح للكيناز رصدت أن تقطع بسهولة من الغشاء.
  2. الاستغناء عن البقع
    1. باستخدام مقص، وقطع كل بقعة على غشاء النيتروسليلوز. وليس من الضروري أن يقطع تماما ألونز حافة بقعة الملون. إذا تم غسلها الغشاء بما فيه الكفاية، والخلفية نظرا لاختلاف حجم قطع البقع ستكون ضئيلة. من المهم فقط لقطع بقعة كامل لكل رد فعل.
    2. باستخدام ملقط، ونقل بعناية كل بقعة في قوارير التلألؤ. لا كوكتيل التلألؤ ضروري لأن 32 P غير قابلة للكشف بسهولة عن طريق إشعاع شيرينكوف.
      ملاحظة: بدلا من ذلك، بقعة يمكن أن يكون قطع باستخدام حفار الفلين شحذ. إزالة كل بقعة من النيتروسليلوز مع حفار الفلين، ودفعها إلى قارورة التلألؤ مع دبوس. مع هذا الأسلوب، لا يحتاج أن يكون لمست، مما يقلل التعرض للإشعاع الغشاء.
  3. تحديد الاجتماع التحضيري للمؤتمر / بمول من [γ- 32 ف] -ATP الحل
    1. بقعة عدة التخفيفات من [γ- 32 ف] -ATP حل (القسم 1.5) على 1 سم × 1 سم ساحات النيتروسليلوز. لفترة وجيزة الهواء الجاف.
    2. باستخدام ملقط، ونقل بعناية كل مربع في التلألؤقارورة. لا كوكتيل التلألؤ ضروري. وسوف تستخدم هذه العينات لتوليد منحنى القياسية لتحديد الاجتماع التحضيري للمؤتمر / بمول من الحل اعبي التنس المحترفين.

7. التلألؤ العد

  1. تحميل كل قارورة التلألؤ إلى أشرطة التلألؤ العداد. أشرطة الحمل في التلألؤ العداد.
  2. تنفيذ برنامج التلألؤ العد لقياس CPM لكل قنينة. هذه البيانات، جنبا إلى جنب مع الاجتماع التحضيري للمؤتمر / بمول من مزيج ATP رديولبلد (من القسم 6.3)، ويمكن أن تستخدم لحساب كمية الحامض الاميني كيناز فسفرته موجودة في كل بقعة، وبالتالي فإن معدل autophosphorylation. 18،19

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم إنشاء مجموعة بيانات تمثيلي يضم الصور الملتقطة مع تصوير الفوسفور (الشكل 1)، الشقائقية S صمة عار للغشاء النيتروسليلوز (الشكل 2)، وبيانات عد التلألؤ (الشكل 3). ويبين الشكل 3A الثوابت الحركية الانزيم في مؤامرة خطيطة لبيرك. تم الحصول على هذه النتائج باستخدام كيناز الحامض الاميني النقاء من الأنواع سلبية الغرام الضمة نظيرة الحالة للدم (ID الجينات 1189383). يتم وصف بروتوكول يستخدم لتنقية هذه كيناز في القسم 1.1. وكان تركيز كيناز النهائي في رد فعل 7.5 ميكرومتر. وتراوحت تركيزات ATP النهائية من 0 ميكرومتر إلى 1.28 ملم. كان [γ- 32 ف] -ATP حل 171.97 الاجتماع التحضيري للمؤتمر / بمول اعبي التنس المحترفين. يمكن أن تكون جميع ولدت هذه البيانات في يوم واحد باستخدام الإجراء التي وصفناها.

/55129/55129fig1.jpg "/>
الشكل 1: الشقائقية S تلطيخ غشاء النيتروسليلوز. الشقائقية وصمة عار تبين كيناز منضمة إلى غشاء النيتروسليلوز. شوهد الغشاء مع ردود الفعل التي تحتوي على تركيزات مختلفة من ATP، ولكن تركيز كيناز المستمر. لم يتم الكشف عن البروتين في البقع التحكم لم كيناز (4 عشر والصف ال 8). تألفت الشقائقية S حل تلطيخ من 0.1٪ الشقائقية S (ث / ت) في حامض الخليك 5٪. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: نتائج تصوير تألقي. الصورة الممسوحة ضوئيا من شاشة الفوسفور التي كانت قد تعرضت لغشاء النيتروسليلوز. شوهد الغشاء مع ردود الفعل التي تحتوي على يخدعتركيز كيناز STANT، وتركيزات مختلفة من ATP. وكان يعاير كل التركيز في ثلاث نسخ. في كل التركيز، وقد اشتمل على التحكم لم كيناز (4 عشر والصف الخامس 8) لإثبات أن رديولبلد ATP يتم إزالتها تماما من الغشاء خلال خطوة الغسيل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3: بيانات العد التلألؤ. أ) مؤامرة مزدوجة متبادلة من autophosphorylation كيناز الحامض الاميني. تم إنشاء منحنى الركيزة الاعتماد من التلألؤ العد. تم احتساب تشكيل Phosphohistidine باستخدام منحدر من الشكل 3B (CPM / بمول ATP)، والتي تم إنشاؤها أيضا مع الشوريالطيف intillation. ب) منحنى قياسي من الاجتماع التحضيري للمؤتمر / بمول للاعبي التنس المحترفين. يتم استخدام منحدر لحساب كمية phosphohistidine (بمول) موجودة في كل عينة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

فحص النيتروسليلوز الملزمة التي وصفناها لديها العديد من المزايا أكثر الأساليب المستخدمة سابقا لوصف تحركات الحامض الاميني. بالمقارنة مع SDS / تصوير الإشعاع الذاتي التقليدي القائم على PAGE، أسلوبنا هو أعلى إنتاجية وأقل استهلاكا للوقت. غشاء النيتروسليلوز هو أسهل للتعامل مع من المواد الهلامية SDS، وليس من الضروري أن تكون ثابتة. الشقائقية تلطيخ النيتروسليلوز يسمح للبقع البروتين يمكن تصور. وهذا يوفر وسيلة سهلة لقطع كل بقعة لحساب التلألؤ، وتقرر أن البروتين التحميل هو ثابت في جميع المواقع. عد التلألؤ من كل بقعة ويقدم نتائج دقيقة التي يمكن تحويلها بسهولة إلى سرعة رد الفعل باستخدام ميل المنحنى القياسي هو مبين في الشكل 3B.

على الرغم من أن يعرض غشاء النيتروسليلوز إلى شاشة تخزين الفوسفور يضيف الوقت لمدة الإجمالية للتجربة، هذه الخطوة توفر نظرة ثاقبة على نجاح النشاف. أيمن المحتمل أن التناقضات التي لاحظت في البيانات التلألؤ العد يتم تفسير الصورة الفوسفور التكميلية. إذا، على سبيل المثال، لم يكن غسلها الغشاء بما فيه الكفاية، فإن الصورة الفوسفور تكشف هذه المعلومات. ينصح تصوير تألقي الغشاء لأي شخص يخطط لاستخدام هذا الاختبار، حيث أن نتائج هذه الخطوة يمكن أن تكون قطعة ثمينة من المعلومات الإضافية.

ميزة هامة أخرى من هذا الاختبار هو القدرة على توليد البيانات من عد التلألؤ. الاستغناء عن كل بقعة الفردية لحساب التلألؤ من الأفضل استخدام صورة برامج معالجة لقياس كثافة الفرقة، ويتم ذلك عادة لفحوصات القائم على الصفحة. الحد الأعلى والنطاق الديناميكي للكشف وأعلى من ذلك بكثير مع التلألؤ العد. توليد منحنى القياسية لتحديد لاعبي التنس المحترفين الاجتماع التحضيري للمؤتمر / بمول تجعل من السهل لحساب معدل autophosphorylation من البيانات الخام. باستخدام هذه الطريقة، ونحن قادرون على كشف بدقةpicomoles من الناتج فسفرته.

وعلى الرغم من العديد من المزايا من استخدام أسلوب لدينا، فإنه لا يخلو من حدودها. لا يميز اسلوبنا بين 1-phosphohistidine و 3 phosphohistidine. على الرغم من أن الأجسام المضادة phosphohistidine يمكن استخدامها للتمييز بين هذه المنتجات فسفرته، أسلوبنا لا تزال لديه ميزة الاستفادة من إشعاع شيرينكوف لتحديد الفسفرة. يوفر إشعاع شيرينكوف مجموعة ديناميكية كبيرة والحد الأعلى عال من الكشف. اعتمادا على طريقة الكشف باستخدام الأجسام المضادة لتحديد تشكيل phosphohistidine قد تعاني من الحد الأعلى أقل والنطاق الديناميكي. يقتصر أسلوبنا أيضا إلى استخدامها مع تنقية البروتينات، والتي لا يمكن استخدامها للكشف عن تحركات فسفرته في الجسم الحي. يتطلب أسلوبنا الركيزة رديولبلد، والتي قد ردع المختبرات التي ليست مجهزة للنشاط الإشعاعي. في نهاية المطاف، وهذا الأسلوب هو في الغالب مناسبة للمختبرات التي تكون مجهزة بالفعل للتعامل معالنشاط الإشعاعي، وترغب في إنتاجية أعلى وأقل استهلاكا للوقت بديل لاستخدامها في كثير من الأحيان تقنيات SDS-PAGE لدراسة تحركات الحامض الاميني. أولئك الذين يدرسون تحركات سر / منتدى المجالس الرومانسية / صور قد تجد أيضا هذه الطريقة لتكون مفيدة، على الرغم من الوفرة النسبية لطرق بديلة لدراسة هذه البروتينات.

وقد تم توصيف تحركات الحامض الاميني طويلا بعيد المنال على الرغم من التقدم في أساليب لقياس أنواع أخرى من تحركات. مع هذا الاختبار، ونحن قد تبدأ في تميز هذه البروتينات بعد مفهومة ذات الصلة من الناحية البيولوجية. هذا التقدم في منهجية لقياس الحامض الاميني كيناز autophosphorylation ستحسن في نهاية المطاف فهمنا ليومين عنصر في اشارة البكتيريا. وهذا الاختبار أن يكون أداة قيمة ونحن نستكشف تأثير المحفزات وما شابه ذلك وتفاعلات البروتين البروتين على النشاط كيناز الحامض الاميني في مختلف مسارات الإشارات اثنين من عناصر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من قبل وزارة التربية والتعليم من خلال المساعدة الدراسات العليا في مجالات البرنامج حاجة وطنية (P200A100044).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphoric acid VWR AAAA18067-AP For quenching reactions and washing nitrocellulose
Tris base RPI T60040-5000.0 Tris-HCl pH 8.0, for kinase reaction buffer
Potassium chloride RPI P41000-2500.0 For kinase reaction buffer
Magnesium chloride RPI M24000-500.0 For kinase reaction buffer
Glycerol RPI G22020-4000.0 For kinase reaction buffer
5'-ATP Promega E6011 Kinase substrate
[γ-32P]-5'-ATP Perkin Elmer NEG002Z250UC  6,000 Ci/mmol
96-well dot blot apparatus Bio-rad 1706545 For spotting reactions
Nitrocellulose Whatman 32-10401396-PK For spotting reactions
Ponceau S Sigma aldrich P3504-50G For staining nitrocellulose

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stock, A. M., Robinson, V. L., Goudreau, P. N. Two-component signal transduction. Annu. Rev. Biochem. 69, 183-215 (2000).
  2. Jung, K., Fried, L., Behr, S., Heermann, R. Histidine kinases and response regulators in networks. Curr. Opin. Microbiol. 15, (2), 118-124 (2012).
  3. Parkinson, J. S., Kofoid, E. C. Communication modules in bacterial signaling proteins. Annu. Rev. Genet. 26, 71-112 (1992).
  4. Laub, M. T., Biondi, E. G., Skerker, J. M. Phosphotransfer profiling: systematic mapping of two-component signal transduction pathways and phosphorelays. Methods Enzymol. 423, 531-548 (2007).
  5. Ronson, C. W., Nixon, B. T., Ausubel, F. M. Conserved domains in bacterial regulatory proteins that respond to environmental stimuli. Cell. 49, (5), 579-581 (1987).
  6. Szurmant, H., Bu, L., Brooks, C. L., Hoch, J. A. An essential sensor histidine kinase controlled by transmembrane helix interactions with its auxiliary proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, (15), 5891-5896 (2008).
  7. Price, M. S., Chao, L. Y., Marletta, M. A. Shewanella oneidensis MR-1 H-NOX regulation of a histidine kinase by nitric oxide. Biochemistry. 46, (48), 13677-13683 (2007).
  8. Zhulin, I. B. The superfamily of chemotaxis transducers: from physiology to genomics and back. Adv. Microb. Physiol. 45, 157-198 (2001).
  9. Robinson, V. L., Buckler, D. R., Stock, A. M. A tale of two components: a novel kinase and a regulatory switch. Nature Struct. Biol. 7, (8), 626-633 (2000).
  10. Attwood, P. V., Piggott, M. J., Zu, X. L., Besant, P. G. Focus on phosphohistidine. Amino acids. 32, (1), 145-156 (2007).
  11. Kee, J. -M., Muir, T. W. Chasing phosphohistidine, an elusive sibling in the phosphoamino acid family. ACS Chem. Biol. 7, (1), 44-51 (2012).
  12. Tawa, P., Stewart, R. C. Kinetics of CheA Autophosphorylation and Dephosphorylation Reactions. Biochemistry. 33, (25), 7917-7924 (1994).
  13. Marina, A., Mott, C., Auyzenberg, A., Hendrickson, W. A., Waldburger, C. D. Structural and mutational analysis of the PhoQ histidine kinase catalytic domain. Insight into the reaction mechanism. J. Biol. Chem. 276, (44), 41182-41190 (2001).
  14. Fuhs, S. R., et al. Monoclonal 1- and 3-Phosphohistidine Antibodies: New Tools to Study Histidine Phosphorylation. Cell. 162, (1), 198-210 (2015).
  15. Ueno, T. B., Johnson, R. A., Boon, E. M. Optimized assay for the quantification of histidine kinase autophosphorylation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 465, (3), 331-337 (2015).
  16. Bradford, M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 7, (72), 248-254 (1976).
  17. Stoscheck, C. M. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).
  18. Funt, B. L., Hetherington, A. Scintillation counting of beta activity on filter paper. Science. 131, (3413), 1608-1609 (1960).
  19. Bem, E. M., Bem, H., Reimchüssel, W. Determination of phosphorus-32 and calcium-45 in biological samples by Čerenkov and liquid scintillation counting. Int. J. Appl. Radiat. Isot. 31, (6), 371-374 (1980).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics