bir nitroselüloz Bağlama Deneyi kullanılarak bakteriyel Histidin Kinaz otofosforilasyon miktarının belirlenmesi

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Fischer, J., Johnson, R. A., Boon, E. Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay. J. Vis. Exp. (119), e55129, doi:10.3791/55129 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Adaptif cevap bakteriyel yaşam için çok önemlidir. algılamak ve çevresel değişimlere cevap verebilmek amacıyla, bakteri iki bileşenli sinyalizasyon olarak bilinen bir uyarıcı-tepki sistemi kullanın. Tipik, iki bileşenli bir sistem olarak 1,2, histidin kinaz, ortak kökenli bir uyarıcı tespit onun korunmuş histidin kalıntısı autophosphorylates, o zaman bir yanıt düzenleyici protein, alıcı alan bir korunmuş aspartat artığına fosfat aktarır. 3. Bu olay, bir alt etki uyarır yanıt düzenleyici, aktivitesinde bir değişiklik başlatır. 4,5 Böylece bakteriler duyu ve yerel ortamda değişikliklere uyum edebiliyoruz. Bazı iki bileşenli sinyalizasyon sistemlerin bu arketip sapma. Bazı durumlarda, histidin kinaz duyusal etki doğrudan duyu girişi algılar ve bir protein-protein etkileşimi yoluyla kinaz aktivitesi değiştiren bir tek başına proteinidir. 6 - Ancak 8, fonamental proses ve sistem bütün olarak rolü aynı kalır. İki bileşenli sinyal, bakterinin yaşamda kalması için gerekli olan bir yerde teşvik yanıt sistemi, ve histidin kinazlar sinyal transdüksiyonunda önemli bir rol oynar. 9

Bakteriyel biyoloji histidin kinazlar önemine rağmen, iyi tanımlanmamış kalır. Bu phosphohistidine tabiatında bulunan kararsızlık ve otofosforilasyonunu ölçmek için pratik bir yöntem olmaması kaynaklanmaktadır. Phosphohistidine fosfoserin, fosfotreonin ve fosfotirosin daha hassastır. 10 Böylece, sık Ser / Thr / Tyr kinazlar analiz etmek için kullanılan teknikler histidin kinazlar için geçerli değildir. Histidin kinazlar çalışma 11, in vitro deneyler, büyük ölçüde, SDS-PAGE otoradyografiye sınırlıdır. Bu yöntemde 12,13 [γ- 32P] -ATP kinaz ile kuluçkaya yatırılır, ve kinaz fosforilasyon pol ile analiz ediliryacrylamide jel elektroforezi (PAGE) jelin otoradyografisi eklenmiştir. Bu yöntem, bir yanıt regülatörüne kinaz kinaz otofosforilasyon, hem de phosphotransfer izlemek için de kullanılabilir. Bununla birlikte, bu yöntem, önemli eksiklikleri vardır. PAGE bazlı deneyler, düşük verimlilik ve zaman alıcıdır. Bu tür sınırlamalar bir proteini karakterize ve kinetik parametrelerin ascertaining için elverişli değildir. en son yayınlanan histidin kinazlar çalışmak için alternatif bir yöntem, oto-fosforilasyonunu tespit etmek için phosphohistidine antikorları kullanır. Bu yöntem 1-phosphohistidine ve 3-phosphohistidine arasında ayrım avantajı taşımasının yanısıra, 14 tespiti için kullanılan aletlere bağlı olarak, bu yöntem, bir geniş dinamik aralık veya algılama için yüksek bir üst sınır sağlayamayabilir. Bu nedenle, bu önemli proteinlerin incelemek için kullanılabilir, daha hızlı, daha az zahmetli ve daha hassas analiz için bir ihtiyaç vardır.

Burada, tarif ve din vitro olarak saf halde bir bakteri histidin kinazlar otofosforilasyonu ölçmek için kullanılabilecek bir dikkatle geliştirilmiş nitroselüloz bağlanma tahlili göstermenin. Bu deney, daha yüksek verim ve sayfa tabanlı deneylerde daha az zaman alıcıdır. Yöntem ayrıca algılama ve geniş bir dinamik aralıkta yüksek bir üst sınırı sunan phosphohistidine ölçümü için Cherenkov radyasyon kullanır. Deney histidin kinazlar için kinetik parametreleri belirlemek için kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dikkat: Bu protokol radyoaktif maddelerin uygun kullanımı konusunda eğitim ve kullanım gerektirir. Beta radyasyon koruma da dahil olmak üzere, bu testte yaparken gerekli kişisel koruyucu donanımları kullanın. Atıkların büyük miktarlarda deney yıkama aşamasında üretilen olarak radyoaktif atıklar, dikkatle ele alınması gerekir. Atık böyle kolayca devrilebilecek veya dökülen olmayacak büyük bir kova ya da şişe gibi dik kapta saklanır emin olun. Deney tamamlandığında, dikkatlice sıvı atık uygun radyoaktif atık konteynerleri işaretli transfer. dikkatle tüm malzeme Kulp ve kirlenme çalışma alanını izlemek için yakınlardaki bir Geiger sayacı tutun.

NOT: Bu protokol bizim gruptan önceden bildirilen tahlil gözden geçirilmiş bir versiyonu. H 3 PO 4 15 Phosphohistidine stabilitesi, bu yöntemi kullanarak önce bir uncharacterized histidin kinaz için test edilmelidir. phosphohistidine styetenek test daha önce tarif edilmiştir. Kinaz içermeyen 15 bir negatif kontrol dahil edilmelidir. Bu, her bir numuneden arka plan sinyalini çıkarmak ve [γ- 32P] -ATP yeterli zardan yıkanır sağlamak için gereklidir.

Reaktifler ve Materyallerinin Hazırlanması 1.

  1. bakteri kültürü önceden bu testte kullanmadan histidin kinazları arındırın.
    1. Bu denemenin gelişimi için Vibrio parahaemolyticus (EB101, ATCC 17802), bir histidin kinaz (gen İD 1.189.383) saflaştınlır. Ndel ve XhoI kısıtlama bölgeleri kullanılarak ifade vektörü pET-23aHis-TEV içine kinaz klon ve mutant Vp1876 D499A oluşturmak vermek üzere bölgeye yönelik mutagenez yerine.
    2. E. coli BL21 (DE3) 'e pLysS içine plazmid dönüşümü ve 37 ° C'de TBC medya hücreleri büyür. ampisilin (100 ug / ml) ve kloramfenikol ile Ek kültürleri (34 ug / mL), ve ajitasyon ile büyümeyeOD, 0.6 ila 600 (250 rpm).
    3. 25 uM'lik nihai bir konsantrasyona kadar IPTG ile protein sentezlenmesinin neden olması ve 16 ° C'de gece boyunca kültür büyür. santrifüj (5000 xg), sonikasyon ile lyse ve santrifüj ile Hasat hücreleri hücresel enkaz (18,000 xg) kaldırın.
    4. Ni-NTA agaroz kullanılarak His etiketli kinazın saflaştırılır. SDS-PAGE ile saflık teyit edin. Her bir protein için arıtma optimize etmek ve bu testte kullanmadan önce saflık teyit etmektedir.
  2. 25 mM H 3 PO 4 yıkama çözeltisi hazırlayın. Damıtılmış iyonu giderilmiş su, 1 L için, 25 mM nihai konsantrasyona kadar H3 PO 4 ekleyin. Bu çözeltinin pH değeri yaklaşık 2.0 kadardır. Buz üzerinde 25 mM H 3 PO 4 yerleştirin.
  3. 325 mM ila 3 saat arasında bir 13x stok çözeltisi PO 4, Hazırlama kinaz reaksiyonu söndürmek için kullanılır. Bu çözeltinin pH değeri, yaklaşık 1.5. Buz üzerinde 325 mM H 3 PO 4 yerleştirin.
    NOT: H 3 PO 4
  4. 4x 160 mM Tris-HCI, pH 8.0, 600 mM KCI, 16 mM MgCI2 ihtiva eden reaksiyon tamponu stok solüsyonu ve% 40 gliserol hazırlayın.
  5. Kurulan protein konsantrasyonu yöntemleri (Bradford, UV-Vis, vs.) histidin kinaz konsantrasyonunu ölçmek. 16,17 4 kez arzu edilen nihai konsantrasyonu olan bir konsantrasyonuna sahip bir histidin kinaz çözelti hazırlayın. Yeterli bir sinyal elde edilmesi için, reaksiyon, nihai protein konsantrasyonu ideal olarak en az 5 uM olmalıdır.
  6. 4x radyo etiket hazırlayın etiketsiz ATP uygun 4x konsantrasyonu ve etiketli ile ATP çözeltisi [32 P γ-]: deney için etiketsiz oranı.
    NOT: Bu karışıma dahil edilmelidir [γ- 32P] -ATP miktarı ^ [ne kadar bağlıdır7, - 32P] -ATP sonunda, her reaksiyon için tespit edilir. Reaksiyon başına 5 uCI - Biz 0.1 arasında değişen nihai konsantrasyonlarda yeterli sinyali almış. etiketlenmemiş ATP oranı, belirli bir deneyde, tüm reaksiyonlar için sabit tutulması: etiketli önemlidir. Tüm konsantrasyonlar arasında etiketlenmemiş ATP oranı sabiti: birden fazla ATP konsantrasyonlarının arzu edildiğinde, bu şekilde etiketlenmiş tutmak gibi seri seyreltileri, yapılmalıdır. Nihai ATP konsantrasyonu tipik olarak 10 uM, en az 1 mm arasında değişir ve her konsantrasyon güvenilir kinetik veriler elde etmek için üç kopya halinde test edilmelidir.
  7. 96- de nokta lekesi aparatı
    1. Nitroselüloz zar (0.2 um gözenek boyutu) 8 cm x 12 cm parça kesin.
    2. Membran cihazı kapatılır ve tüm çukurlar tamamen zar ile kaplıdır şekilde oturduğundan emin olacak şekilde bir nokta lekesi cihazında Pozisyon nitroselüloz. doğru monte Eğer vakum İçi olduğunda, hava kaçağı olmamalıdıried.
    3. Filtrat toplamak için, ikinci bir yan kol şişeye tertibatı bağlanır. supap sapı itibaren, cihaz rahatça ikincil şişeyi devrilme olmadan kullanılabilir şekilde yeterli boru bağlayın.
    4. aspiratör / vakum kaynağına bağlı yan kol şişesi bağlayın.
    5. Cihaz tamamen alete vakum uygulanarak sızdırmaz olduğunu test edin. Cihaz doğru monte edilirse, güçlü bir vakum kuyu tüm mevcut olacaktır. Tüm boru bağlantıları Parafilm sarılmış olabilir ya da sıkı bir mühür sağlamak için sarın Saran.
    6. İsteğe bağlı olarak, iyi birine reaksiyon tamponu vakum, pipet 100 uL test etmek. Vakum kuyunun içinden ve membran üzerine tüm sıvı çizmek için yeterince güçlü olmalıdır.
    7. tüm numuneler zar üzerinde lekeli olabilir hazır olana kadar vakum kapatın.

2. Reaksiyon Başlatma ve Quenching

  1. Reaksiyon bileşenlerinin karıştırılması
    1. Önceki başlatılışının içinreaksiyon tamponu -ATP (1.6) [32 P γ-], histidin kinaz (1.5), (bölüm 1.4) ve GKD 2 O.: tirme, 4x stok solüsyonları olarak dört reaksiyon bileşenleri hazırlamak
    2. Reaksiyon tamponu, histidin kinaz eşit hacimlerde karıştırın ve GKD 2 O, bu reaksiyon bileşenleri kısa bir süre (10 dakika) oda sıcaklığında dengelenmeye bırakın.
      NOT: Nihai reaksiyon hacmi Deney zamana bağlı olarak, enzim-bağlı ya da alt-tabaka bağımlı olmasına bağlıdır. Birden alikotları istenen bir zaman noktasında, aynı reaksiyon alınır ve söndürüldü gibi zamana bağlı tepkimeler, büyük olmalıdır. Reaksiyon hacmi, istenen zaman noktalarının sayısına bağlıdır. Deney reaksiyon 30 uL içeren nitroselüloz zar üzerine her nokta için optimize edilmiştir. 10 zaman noktalarında arzu edilir böylece, eğer, reaksiyon, hacim, en azından 300 uL olmalıdır (daha yüksek bir ses seviyesi gibi 330 uL bir pipetleme hata durumunda tercih edilebilir).Enzim ve substrat bağımlı deneyler daha küçük reaksiyon hacimleri gerektirir. Bu nitroselüloz zar üzerinde benekli nihai hacim olarak, bu deneyler için reaksiyon hacmi 30 uL kadar küçük olabilir.
    3. Reaksiyonun başlatılması için, reaksiyona [32P γ-] -ATP çözeltisinin bir hacim kazandırmak ve aşağı yukarı pipetleme karıştırılır. Bir zamanlayıcı ile geçen reaksiyon zamanı takip ve reaksiyon istenilen zaman için devam etmesine izin.
    4. Reaksiyonu söndürmek reaksiyona buzla soğutulmuş 325 mm ila 3 saat toplam reaksiyon hacmi PO 4 1/13 ilave yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın. Seçenek olarak ise, 325 mm ila 3 saat reaksiyona PO 4 bir kısım ilave edin.
      Not: 3 konumundaki H atomu PO 4 nihai konsantrasyonu yeterli reaksiyonun sönmesi için 25 mm olmalıdır. Örneğin, 30 uL reaksiyonuna 2.5 uL 325 mM H 3 PO 4 ekleyebilir veya <30 uL reaksiyon 2.5 mL 325 mM H 3 PO ekleyinsub> 4. Reaksiyonun son pH yaklaşık 4.0'dır. H 3 PO 4 Bu konsantrasyon olarak test edilmiş ve phosphohistidine düşürmeden bu tamponda kinaz reaksiyonu söndürmek için doğrulanmıştır.
      1. Örneğin, 7.5 uL [γ- 32P] -ATP ile reaksiyon başlatılır 7.5 uL 4x reaksiyon tamponu, 7.5 ul 4x histidin kinaz ve 7.5 uL GKD 2 O karıştırın. 2.5 uL 325 mM H 3 PO 4 ile reaksiyonu söndürmek.
    5. Tüm reaksiyonlar sona kadar hemen buz üzerine söndürüldü reaksiyonlann.
      Not: verimliliğini en üst düzeye çıkarmak için, bütün reaksiyonlar kadar her 15 ya da 20 başlatılan bir reaksiyonun başlatılması için tavsiye edilir, ve arzu edilen reaksiyon süresi geçtikten sonra, tüm söndürüldü kadar, bir reaksiyonda her 15 ya da 20 söndürme. ilk defa deney kullanılarak olanlar için, daha uzun bir aralık daha yönetilebilir olabilir.

3. Spotting oNitroselüloz f söndürdüler reaksiyonlar

  1. 96-iyi nokta leke cihazı üzerinde vakum başlat
    1. ikincil kap içine önceden monte 96-iyi nokta leke aparatı (bölüm 1.7) yerleştirin. Cihaz ve membran kullanımdan sonra radyoaktif gibi tertibat kolayca demonte edilmesi için bu kapsayıcı kadar büyük olmalıdır.
    2. 96 gözlü nokta lekesi aparatına bir vakum uygulanır.
    3. Cihaz vakum altına alındıktan sonra, dikkatli bir şekilde her bir nitroselüloz zar üzerine doğrudan söndürülmüş reaksiyon pipetleyin. Tüm reaksiyonlar membran üzerine yüklenir kadar tekrarlayın. Nitroselüloz bağlama kapasitesi bu yana (75-110 ug / cm2), daha doğru bir şekilde yüklendiğinde Neredeyse bütün kinaz membrana bağlanan kabul edilebilir fark edilir histidin kinaz miktarından daha büyüktür.
      NOT: Kullanılan aparat bağlı olarak, bakım nitroselüloz delinme dikkat edilmelidir. reaksiyonun tüm th ile temas yapmış olduğu gözlemleyine nitroselüloz. Bazı veya reaksiyon tüm kuyunun duvarları sopa ve nitroselüloz ulaşamaz için kolay olduğunu.
    4. Buz soğukluğunda 25 mM H3 PO 4 100 uL ile kuyu yıkayın. Bu, tüm reaksiyonların tam yükleme sağlanması, membran ulaşmak için kuyuda sıkışmış olabilecek herhangi bir reaksiyon hacmi sağlayacaktır. tüm hacim zarından akmasına izin verin.
  2. Aparat sökme ve nitroselüloz membran transferi
    1. Dikkatle vakum kapatmadan önce cihazı sökmeye. Cihaz ve nitroselüloz membran hem şu anda radyoaktif olduğunu hatırlatırız. Şu anda ikincil kaptan herhangi aparat bileşenlerini çıkarmayın.
    2. Forseps ile dikkatli bir şekilde, yaklaşık 200 ml 25 mM buz soğukluğunda H 3 PO 4 bir kaba aygıtından nitroselüloz membran aktarın. Yıkama radi olacak gibi, bu kabın üzerine bir kapak yerleştirinoactive. Şu anda, vakum kapatmak olabilir.

4. Selülozik İşleme

  1. Selülozik yıkama
    1. bir rocker yıkama membran ile kap yerleştirin. membran hafifçe 20 dakika rock izin verin.
    2. 20 dakika sonra, dikkatli bir büyük kovaya kullanılan yıkama solüsyonu geçici atık depolama için kullanılacak süzün. Membran ve tekrar buz gibi soğuk 25 mM H3 PO 4 200 mL ekleyin.
      Not: En az üç adet 20 dakika yıkama arka membrandan ATP sinyali [32P γ-] kaldırmak için gereklidir. Üçüncü yıkamadan sonra, bir Geiger sayacı ile radyasyon için kullanılan yıkama solüsyonu test edin. sinyal yıkama çözeltisi içinde mevcut olmayana kadar yukarıda tarif edildiği gibi bir zan yıkamaya devam edin.
  2. Selülozik kurutma
    1. Membran yeterli yıkandıktan sonra, kısa bir süre için hava ile kurumaya membran sağlar. Bu genellikle 5 dakika veya daha az sürer.

Depolama Fosfor Ekran 5. Pozlama

Not: Bu bölüm isteğe bağlıdır. bir fosfor ekranına membran maruz zarında her bir noktada radyo-etiketli kinazın yoğunluğunun görünüm için izin vermesidir faydalıdır. Bu noktalar nispi yoğunluk her nokta fosforile histidin kinaz miktarı ile doğru orantılıdır. Ayrıca bölüm 7. oluşturulan olanlara yoğunluk görüntü işleme yazılımı ile ölçülebilir ve bu sonuçlar mukayese edilebilir, bu adım kalite kontrolü sağlar. Bu taramada görülen anormallikler sintilasyon sayımı elde edilen düzensiz sonuçları açıklayabilir.

  1. Fosfor ekran hazırlığı
    1. Depolama fosfor ekrana zarı maruz önce en az 5 dakika boyunca beyaz ışığa fosfor ekrana maruz bırakmaktadır. Bu ekran ile tutulabilir herhangi bir kalıntı görüntü silinir sağlar.
    2. ekran temiz olduğundan emin olunve kuru. Gerekirse, yavaşça ekran üreticisi tarafından onaylanmış bir fosfor ekran temizleme solüsyonu ile ekranı temizlemek ve kurulayın.
  2. Nitroselüloz zar preparasyonu
    1. Dikkatle fosfor ekrana zarar vermesini kalan nemi önlemek için ince bir plastik wrap kuru nitroselüloz membran sarın. kırışıklık veya kabarcıklar hiç bulunmadığından emin olun.
  3. fosfor ekrana Pozlama
    1. Depolama fosfor ekran kaseti sarılmış nitroselüloz membran yerleştirin zar üzerine ekran yüzü aşağı yerleştirin ve kaseti kapatın. kaseti açmak veya pozlama sırasında membran kaydırma çift veya kirli görüntü yakalanır neden olacak gibi, fosfor ekran tarama zamanı gelinceye kadar membran hareket ettirmeyin.
    2. sürece fosfor ekran üreticisi anlaşılacağı gibi en az 4 saat süreyle Açığa veya.
    3. Pozlama tamamlandığında, fosfor ekran tarama ve fosfor tarayıcı ile görüntü yakalamak.

Sintilasyon sayımı için nitroselüloz zar hazırlama 6.

  1. Ponceau S boyanması ve destaining
    1. Kısaca Ponceau S boyama çözeltisi içinde nitroselüloz membran daldırın (% 0.1 Ponceau S (a / h)% 5 asetik asit) 1 - 2 dk. destaining önce leke ile tüm membran ıslatın.
    2. zardan aşırı Ponceau S ile yapılır.
    3. Histidin kinaz sadece lekeler lekeli kadar GKD 2 O ile membran durulayın. tüm noktalar protein saptanabilir miktarda içeriyorsa, bu prosedür sadece çalışacağını unutmayın.
      Not: Bu adım kinaz nitroselüloz bağlı olduğunu doğrulamak için gerekli olduğunu ve protein yükleme hatta tüm noktalar genelinde olduğu. Aynı zamanda benekli kinaz kolayca membran kesip sağlar.
  2. noktalar kesmek
    1. makas kullanarak, nitroselüloz membran üzerinde her noktayı kesip. Alon mükemmel kesmek için gerekli değildirg lekeli nokta kenar; zar yeterince yıkandı eğer nedeniyle kesilmiş noktalar değişen boyutuna arka plan önemsiz olacaktır. Her reaksiyon için tüm nokta kesip önemlidir.
    2. forseps kullanarak, dikkatli bir sintilasyon şişeleri içine her noktayı aktarmak. 32P Cherenkov radyasyon ile kolayca tespit edilmektedir Resim sintilasyon kokteyli gereklidir.
      NOT: Alternatif olarak, nokta sivriltilmiş bir mantar delici kullanılarak kesilebilir. mantar delici ile nitroselüloz her nokta çıkarın ve bir iğne ile bir parıldama şişenin içine doğru itin. Bu yöntem ile, doku ayrıca radyasyona maruz minimize dokunulmasından gerekmez.
  3. [Γ- 32P] -ATP çözeltisi belirlenmesi CPM / pmol
    1. Spot birkaç dilüsyonları 1 cm nitroselüloz x 1 cm kareler üzerine ATP çözeltisi (bölüm 1.5) [32 P γ-]. Kısaca hava kuru.
    2. forseps kullanarak, dikkatli bir sintilasyon içine her kareyi transferiŞişeler. Resim sintilasyon kokteyli gereklidir. Bu örnekler, ATP çözeltisi CPM / pmol belirlemek için bir standart eğri oluşturmak için kullanılır.

7. Sintilasyon Sayım

  1. ışıldama sayacı kasetlerine içine tüm sintilasyon şişeleri yükleyin. sintilasyon sayacı yükleyin kasetleri.
  2. Her flakon için CPM ölçmek için sintilasyon sayma programı çalıştırmak. Bu veriler, (bölüm 6.3) radyo-etiketlenmiş ATP karışımı CPM / pmol ile birlikte, her bir noktada, bu fosforile histidin kinaz miktarı ve otofosforilasyon böylece oranını hesaplamak için kullanılabilir. 18,19

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Temsili bir veri kümesi, fosforlu bir görüntü cihazı (Şekil 1), nitroselüloz zarın, Ponceau S boyama (Şekil 2) ve sintilasyon sayımı verileri (Şekil 3) ile çekilen bir resmi içeren oluşturulmuş oldu. Şekil 3A, bir Lineweaver-Burk grafiğine enzim kinetik sabitleri gösterir. Bu sonuçlar, gram-negatif Vibrio parahaemolyticus (gen İD 1.189.383) elde edilen bir saflaştırılmış histidin kinaz kullanılarak elde edildi. Bu kinaz saflaştırmak için kullanılan protokol, Bölüm 1.1'de tarif edilmektedir. reaksiyondaki nihai kinaz konsantrasyonu 7.5 uM idi. Nihai ATP konsantrasyonu 0 uM arasında 1.28 mm arasında değişiyordu. [Γ- 32P] -ATP çözeltisi 171,97 CPM / pmol ATP oldu. Bu veriler, her önce tanımladığımız prosedür kullanılarak, bir günde oluşturulabilir.

/55129/55129fig1.jpg "/>
Şekil 1: bir nitroselüloz zarın Ponceau S boyama. Nitroselüloz zara birleşmiş olarak kinazın gösteren Ponceau lekesi. Membran ATP çeşitli konsantrasyonlarda, ama sürekli kinaz konsantrasyonu içeren reaksiyonlar fark edildi. Resim proteinin hiç kinaz kontrol noktaları (4 ve 8. satır) 'de tespit edilir. Ponceau S boyama çözeltisi,% 0.1 Ponceau S olan (a / h),% 5 asetik asit. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2: Fluorografi sonuçlanır. Bir nitroselüloz membrana maruz kalan bir fosfor ekran Taranan görüntüsü. Membran con içeren reaksiyonlar ile tespit edildistant kinaz konsantrasyonu ve ATP'nin çeşitli konsantrasyonları. Her bir konsantrasyon üç kez analiz edilmiştir. Her bir konsantrasyonda, hiç bir kinaz kontrolü (4 ve 8. satır) radyo-etiketlenmiş ATP tam yıkama aşaması esnasında zardan çıkarılır göstermek için dahil edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3: sintilasyon sayımı verileri. Histidin kinaz otofosforilasyon A) Çift karşılıklı arsa. Alt tabaka bağımlılık eğrisi sintilasyon sayımı elde edilmiştir. Phosphohistidine oluşumu, sc oluşturulacak, Şekil 3B (CPM / pmol ATP) eğimini kullanılarak hesaplandıintillation spektrometrisi. B) ATP CPM / pmol Standart eğri. eğimi, her numunede mevcut olan phosphohistidine (pmol) miktarını hesaplamak için kullanılır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

daha önce tanımladığımız nitroselüloz bağlanma tahlili histidin kinazlar karakterize etmek için daha önce kullanılan yöntemlere göre birçok avantajı vardır. Geleneksel SDS / PAGE tabanlı otoradyografi ile karşılaştırıldığında, bizim yöntemi daha yüksek verim ve daha az zaman alıcıdır. Nitroselüloz zar SDS jelleri daha daha kolaydır ve sabit olması gerekmez. protein spotları görüntülenmiştir için nitroselüloz boyama Ponceau sağlar. Bu sintilasyon sayımı için her nokta kesip, ve protein yükleme tüm noktalar tutarlı olup olmadığını belirlemek için kolay bir yol sağlar. Her bir nokta sintilasyon sayımı kolayca Şekil 3B'de gösterilen standart eğrinin eğimi kullanılarak reaksiyon hızı dönüştürülebilir doğru sonuçlar sağlar.

Bir depolama fosfor ekrana nitroselüloz membran maruz deney toplam süresi için zaman ekler rağmen, bu adımı blotting başarısı hakkında fikir veriyor. herhangisintilasyon sayımı verilerinde fark edilir farklılıklar potansiyel tamamlayıcı fosfor görüntü ile açıklanabilir. Örneğin, zar yeterince yıkandı değil, eğer, fosfor görüntü bu bilgiyi ortaya çıkacaktır. Membranın Fluorografi Bu aşamada elde edilen sonuçlar, tamamlayıcı bilgi değerli bir parçası olabilir, bu tahlil kullanımı yapacak birisi için tavsiye edilir.

Bu testin bir başka önemli avantajı, sintilasyon sayımı ile ilgili verileri üretme yeteneğidir. sintilasyon sayımı için her nokta kesmek genellikle SAYFA tabanlı deneyleri için yapıldığı gibi, bant yoğunluğunu ölçmek için görüntü işleme yazılımı kullanmak için tercih edilir. Üst sınır ve tespiti için dinamik aralığı sintilasyon sayımı ile çok daha yüksektir. bir standart eğri oluşturuluyor CPM / pmol ATP kolay ham verilerden otofosforilasyon oranını hesaplamak için yapmak belirlemek için. Bu yöntemi kullanarak, doğru olarak tespit etmek mümkündürFosforile edilmiş ürünün pikomol.

Bizim yöntemi kullanarak birçok avantajlarına rağmen, kendi sınırlamaları olmadan değildir. Bizim yöntemi 1-phosphohistidine ve 3-phosphohistidine arasında ayırım yapmaz. phosphohistidine antikorların, bu fosforile edilmiş ürünler arasında ayırt etmek için kullanılabilir, ancak eden yöntem yine fosforilasyonunu ölçmek için Cherenkov radyasyonu kullanan bir avantajı vardır. Cherenkov radyasyon geniş dinamik aralık ve algılama için yüksek üst sınır sağlar. algılama yöntemine bağlı olarak, daha düşük bir üst sınır ve dinamik aralık muzdarip olabilir phosphohistidine oluşumunu ölçmek için antikorlar kullanılarak. Önerilen yöntem, aynı zamanda, saflaştırılmış proteinler ile kullanılan ile sınırlıdır, ve in vivo olarak fosforile kinazlar tespit etmek için kullanılamaz. Bizim yöntemi radyoaktivite için donanımlı değil laboratuarları caydırmak olabilir radyoaktif işaretli substrat gerektirir. Sonuçta, bu yöntem zaten işlemek için donatılmıştır laboratuarlar için çoğunlukla uygundurRadyoaktivite ve daha yüksek bir verim ile ilgilenen ve daha az zaman alternatif tüketen sık histidin kinazlar incelemek için SDS-PAGE teknikleri kullanılan. Ser / Thr / Tyr kinazlar eğitim görenler de bu proteinleri eğitim için alternatif yöntemlerin göreceli bolluk rağmen, bu yöntem yararlı bulabilirsiniz.

yöntemlerinde gelişmeler kinazların diğer tip ölçmek için rağmen histidin kinazlar karakterizasyonu uzun zor olmuştur. bu testte, bu biyolojik olarak uygun ancak tam olarak anlaşılamamıştır proteinleri karakterize başlayabilir. sonuçta iki bileşenli bakterilerde sinyal anlayışımızı artıracak histidin kinaz otofosforilasyonunu miktarının için metodoloji Bu gelişme. Bu deney, çeşitli iki-bileşenli sinyal güzergahlannda histidin kinaz aktivitesi üzerindeki aynı kökenli uyaranlara ve protein-protein etkileşimlerinin etkilerini araştırmak olarak değerli bir araç olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgements

Bu çalışma, Ulusal İhtiyaç programı (P200A100044) Alanlarında Lisansüstü Yardımlaşma aracılığıyla Milli Eğitim Bakanlığı tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphoric acid VWR AAAA18067-AP For quenching reactions and washing nitrocellulose
Tris base RPI T60040-5000.0 Tris-HCl pH 8.0, for kinase reaction buffer
Potassium chloride RPI P41000-2500.0 For kinase reaction buffer
Magnesium chloride RPI M24000-500.0 For kinase reaction buffer
Glycerol RPI G22020-4000.0 For kinase reaction buffer
5'-ATP Promega E6011 Kinase substrate
[γ-32P]-5'-ATP Perkin Elmer NEG002Z250UC  6,000 Ci/mmol
96-well dot blot apparatus Bio-rad 1706545 For spotting reactions
Nitrocellulose Whatman 32-10401396-PK For spotting reactions
Ponceau S Sigma aldrich P3504-50G For staining nitrocellulose

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stock, A. M., Robinson, V. L., Goudreau, P. N. Two-component signal transduction. Annu. Rev. Biochem. 69, 183-215 (2000).
  2. Jung, K., Fried, L., Behr, S., Heermann, R. Histidine kinases and response regulators in networks. Curr. Opin. Microbiol. 15, (2), 118-124 (2012).
  3. Parkinson, J. S., Kofoid, E. C. Communication modules in bacterial signaling proteins. Annu. Rev. Genet. 26, 71-112 (1992).
  4. Laub, M. T., Biondi, E. G., Skerker, J. M. Phosphotransfer profiling: systematic mapping of two-component signal transduction pathways and phosphorelays. Methods Enzymol. 423, 531-548 (2007).
  5. Ronson, C. W., Nixon, B. T., Ausubel, F. M. Conserved domains in bacterial regulatory proteins that respond to environmental stimuli. Cell. 49, (5), 579-581 (1987).
  6. Szurmant, H., Bu, L., Brooks, C. L., Hoch, J. A. An essential sensor histidine kinase controlled by transmembrane helix interactions with its auxiliary proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, (15), 5891-5896 (2008).
  7. Price, M. S., Chao, L. Y., Marletta, M. A. Shewanella oneidensis MR-1 H-NOX regulation of a histidine kinase by nitric oxide. Biochemistry. 46, (48), 13677-13683 (2007).
  8. Zhulin, I. B. The superfamily of chemotaxis transducers: from physiology to genomics and back. Adv. Microb. Physiol. 45, 157-198 (2001).
  9. Robinson, V. L., Buckler, D. R., Stock, A. M. A tale of two components: a novel kinase and a regulatory switch. Nature Struct. Biol. 7, (8), 626-633 (2000).
  10. Attwood, P. V., Piggott, M. J., Zu, X. L., Besant, P. G. Focus on phosphohistidine. Amino acids. 32, (1), 145-156 (2007).
  11. Kee, J. -M., Muir, T. W. Chasing phosphohistidine, an elusive sibling in the phosphoamino acid family. ACS Chem. Biol. 7, (1), 44-51 (2012).
  12. Tawa, P., Stewart, R. C. Kinetics of CheA Autophosphorylation and Dephosphorylation Reactions. Biochemistry. 33, (25), 7917-7924 (1994).
  13. Marina, A., Mott, C., Auyzenberg, A., Hendrickson, W. A., Waldburger, C. D. Structural and mutational analysis of the PhoQ histidine kinase catalytic domain. Insight into the reaction mechanism. J. Biol. Chem. 276, (44), 41182-41190 (2001).
  14. Fuhs, S. R., et al. Monoclonal 1- and 3-Phosphohistidine Antibodies: New Tools to Study Histidine Phosphorylation. Cell. 162, (1), 198-210 (2015).
  15. Ueno, T. B., Johnson, R. A., Boon, E. M. Optimized assay for the quantification of histidine kinase autophosphorylation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 465, (3), 331-337 (2015).
  16. Bradford, M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 7, (72), 248-254 (1976).
  17. Stoscheck, C. M. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).
  18. Funt, B. L., Hetherington, A. Scintillation counting of beta activity on filter paper. Science. 131, (3413), 1608-1609 (1960).
  19. Bem, E. M., Bem, H., Reimchüssel, W. Determination of phosphorus-32 and calcium-45 in biological samples by Čerenkov and liquid scintillation counting. Int. J. Appl. Radiat. Isot. 31, (6), 371-374 (1980).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics