Kvantificering af Bakteriel Histidin kinase Autophosphorylering Ved hjælp af en Nitrocellulose-bindingsassay

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Fischer, J., Johnson, R. A., Boon, E. Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay. J. Vis. Exp. (119), e55129, doi:10.3791/55129 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Adaptiv reaktion er afgørende for bakteriel overlevelse. For at opdage og reagere på miljømæssige ændringer, bakterier anvender en stimulus-respons system kaldet to-komponent signalering. 1,2 I en typisk to-komponent system, histidin kinase detekterer et sammenhørende stimulus, autophosphorylates dens konserverede histidinrest, derefter overfører phosphat til en konserveret aspartatresten på receiveren domæne af et responsregulatorprotein protein. 3 Denne begivenhed udløser en ændring i aktiviteten af responsregulatorprotein, som stimulerer en nedstrøms retning. 4,5 Således bakterier er i stand til at sanse og tilpasse sig ændringer i det lokale miljø. Nogle to-komponent signalsystemer afvige fra dette arketype. I nogle tilfælde, den sensoriske domæne af histidin-kinase er en stand-alone-protein, der direkte registrerer sanseindtryk og modificerer kinaseaktivitet gennem en protein-protein-interaktion. 6 - 8 Men fondenamental proces og overordnede rolle systemet forbliver den samme. To-komponent signalering er en allestedsnærværende stimulus-respons, der er afgørende for bakteriel overlevelse og histidin kinaser spiller en kritisk rolle i transduktionen af ​​signalet. 9

Trods betydningen af ​​histidin kinaser til bakteriel biologi, de forbliver dårligt karakteriseret. Dette skyldes den iboende ustabilitet af phosphohistidin, og manglen på en praktisk fremgangsmåde til måling autophosphorylering. Phosphohistidin er mere labilt end phosphoserin, phosphothreonin og phosphotyrosin. 10 Således teknikker, der almindeligvis anvendes til at analysere Ser / Thr / Tyr kinaser er ikke gældende for histidin kinaser. 11 In vitro assays til at studere histidin kinaser er stort set begrænset til SDS-PAGE autoradiografi. 12,13 I denne fremgangsmåde [γ- 32P] -ATP inkuberes med kinase, og phosphorylering af kinasen analyseres ved polyacrylamide gelelektroforese (PAGE) efterfulgt af autoradiografi af gelen. Denne metode kan anvendes til at overvåge kinase autophosphorylering, samt phosphotransfer fra kinasen til en responsregulatorprotein. Men denne metode har bemærkelsesværdige mangler. PAGE-baserede assays er lille produktion og tidskrævende. Sådanne begrænsninger er ikke befordrende for at karakterisere et protein og fastslå dens kinetiske parametre. En alternativ fremgangsmåde til undersøgelse histidin kinaser, der blev offentliggjort for nylig udnytter phosphohistidin antistoffer til påvisning af autophosphorylering. 14 Selv om denne fremgangsmåde har den fordel, at skelne mellem 1-phosphohistidin og 3-phosphohistidin, afhængigt af den instrumentering, der anvendes til påvisning, kan denne fremgangsmåde ikke tilbyder et stort dynamikområde eller høj øvre detektionsgrænse. Således er der et behov for en hurtigere, mindre arbejdskrævende og mere følsom analyse, der kan bruges til at studere disse vigtige proteiner.

Her beskriver vi og demonstrate en omhyggeligt udviklet nitrocellulose bindingsassay, der kan bruges til at kvantificere autophosphorylering af oprensede bakterielle histidin kinaser in vitro. Denne analyse er højere gennemløb og mindre tidskrævende end PAGE assays. Metoden udnytter også tjerenkovstråling for phosphohistidin kvantificering, som tilbyder en høj øvre detektionsgrænse og et stort dynamisk område. Assayet kan anvendes til at bestemme kinetiske parametre for histidin kinaser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Advarsel: Denne protokol kræver passende uddannelse i anvendelsen og håndteringen af ​​radioaktivt materiale. Brug venligst det nødvendige personlige værnemidler, når du udfører denne analyse, herunder beta-stråling afskærmning. Radioaktivt affald skal håndteres forsigtigt, da store mængder affald genereres under vask fase af forsøget. Sørg for, at affaldet opbevares i opretstående beholder, såsom en stor spand eller flaske, der ikke vil blive let væltes eller spildt. Når eksperimentet er afsluttet, omhyggeligt overføre alle flydende affald på passende markeret radioaktive affaldsbeholdere. Håndter alle materialer med omhu, og holde en geigertæller i nærheden til at overvåge arbejdsområdet for forurening.

BEMÆRK: Denne protokol er en revideret version af en tidligere rapporteret assay fra vores gruppe. 15 phosphohistidin stabilitet i H 3 PO 4 bør testes for enhver karakteriseret histidin kinase, før du bruger denne metode. Den phosphohistidin stevne test er tidligere blevet beskrevet. 15 En negativ kontrol, der ikke indeholder kinase skal medtages. Dette er nødvendigt for at trække baggrundssignalet fra hver prøve, og sikre, at [γ- 32P] -ATP er tilstrækkeligt vasket fra membranen.

1. Fremstilling af reagenser og materialer

  1. Oprense histidin kinaser fra bakteriekultur før anvendelse af dette assay.
    1. Oprens en histidin-kinase (gen ID 1.189.383) fra Vibrio parahaemolyticus (EB101, ATCC 17802) til udvikling af dette assay. Klon kinasen i ekspressionsvektoren pET-23aHis-TEV hjælp Ndel og Xhol-restriktionssteder, og udføre site-directed mutagenese til opnåelse af mutanten konstruere Vp1876 D499A.
    2. Omdan plasmidet i E. coli BL21 (DE3) pLysS, og vokse celler i TB medium ved 37 ° C. Supplement kulturer med ampicillin (100 ug / ml) og chloramphenicol (34 ug / ml), og vokse med omrøring(250 rpm) til en OD 600 på 0,6.
    3. Inducere proteinekspression med IPTG til en slutkoncentration på 25 uM, og vokse kulturer natten over ved 16 ° C. Harvest celler ved centrifugering (5000 x g), lyserer ved sonikering, og centrifuge for at fjerne cellerester (18.000 xg).
    4. Oprens His-mærket kinase under anvendelse af Ni-NTA agarose. Bekræft renhed ved SDS-PAGE. Optimer rensning for hvert protein, og bekræft renhed, før du bruger denne analyse.
  2. Forbered 25 mM H 3 PO 4 vaskeopløsning. Til 1 l destilleret deioniseret vand, tilsæt H 3 PO 4 til en slutkoncentration på 25 mM. PH af denne opløsning er ca. 2,0. Anbringes 25 mM H 3 PO 4 på is.
  3. Der fremstilles en 13x stamopløsning af 325 mM H 3 PO 4, der skal anvendes for at standse kinasereaktion. PH af denne opløsning er ca. 1,5. Placer 325 mM H 3 PO 4 på is.
    BEMÆRK: H 3 PO 4
  4. Forbered en 4x reaktionsbuffer stamopløsning indeholdende 160 mM Tris-HCI pH 8,0, 600 mM KCI, 16 mM MgCl2 og 40% glycerol.
  5. Kvantificer histidin kinase koncentration af etablerede proteinkoncentration metoder (Bradford, UV-Vis, etc.). 16,17 Forbered en histidin kinase løsning med en koncentration, der er 4 gange den ønskede slutkoncentration. At opnå tilstrækkelig signal, bør den endelige proteinkoncentration i reaktionen ideelt set være mindst 5 um.
  6. Forbered en 4x radiomærket [γ- 32P] -ATP opløsning med det passende 4x koncentration af umærket ATP og mærket: umærket forhold til eksperimentet.
    BEMÆRK: Mængden af [γ- 32P] -ATP som bør indgå i denne blanding er afhængig af, hvor meget [^7 - 32 P] -ATP i sidste ende vil blive opdaget for hver reaktion. Vi har opnået tilstrækkelig signal med slutkoncentrationer i området på mellem 0,1 - 5 uCi pr reaktion. Det er vigtigt, at den mærkede: umærket ATP-forhold holdes konstant for alle reaktioner i en given eksperiment. Serielle fortyndinger bør foretages, når flere ATP-koncentrationer ønskes, da det godt holde det mærkede: umærket ATP-forholdet konstant på tværs af alle koncentrationer. Endelige ATP-koncentrationer typisk i området fra 10 pM til mindst 1 mM, og hver koncentration bør analyseret tre gange for at opnå pålidelige kinetiske data.
  7. 96- godt dot blot apparat
    1. Skær en 8 cm x 12 cm stykke nitrocellulosemembran (0,2 um porestørrelse).
    2. Position nitrocellulose i et dot blot apparat, der sikrer, at membranen passer sådan, at apparatet er forseglet, og alle brønde er helt dækket af membranen. Hvis samlet korrekt, bør der ikke være luft lækage, når vakuum er ApplIED.
    3. At indsamle filtrat, tilslutte apparatet til en sekundær side-arm kolbe. Fra ventilstammen, forbinde passende rør, således at apparatet kan være komfortabelt anvendes uden tipning af sekundære kolbe.
    4. Tilslut den sekundære side-arm kolbe til aspirator / vakuum kilde.
    5. Test at apparatet er fuldstændigt forseglet ved påføring af vakuum på apparatet. Hvis apparatet er monteret korrekt, vil en stærk vakuum være til stede i alle brøndene. Alle slangeforbindelser kan pakkes i Parafilm eller Saran wrap at sikre en tæt forsegling.
    6. Eventuelt at teste vakuum, pipette 100 pi reaktionsbuffer i en brønd. Vakuummet bør være stærk nok til at trække al væske gennem brønden og på membranen.
    7. Slå vakuum, indtil alle prøver er klar til at blive opdaget på membranen.

2. Reaktion Indledning og Quenching

  1. Blanding af reaktionskomponenter
    1. Forud for initiation, forberede alle fire reaktionsbestanddele som 4x stamopløsninger: reaktion buffer (se afsnit 1.4), histidin-kinase (1,5), [γ- 32P] -ATP (1,6), og Hedeselskabet 2 O.
    2. Bland lige volumener af reaktionsbuffer, histidin-kinase, og Hedeselskabet 2 O. Lad disse reaktionskomponenter at ækvilibrere ved stuetemperatur i et kort tidsrum (10 min).
      BEMÆRK: Det endelige reaktionsvolumen er afhængig af, om forsøget er tidsafhængig, enzym-afhængig, eller et substrat-afhængig. Tidsafhængige reaktioner skal være større, da flere portioner er taget fra den samme reaktion og standset på det ønskede tidspunkt. Reaktionsvolumenet vil afhænge af antallet af tidspunkter ønskede. Assayet er optimeret til hver plet på nitrocellulosemembranen at indeholde 30 pi af reaktionen. Hvis der således ønskes 10 tidspunkter, skal reaktionsvolumenet være mindst 300 pi (en højere volumen såsom 330 pi ville være at foretrække i tilfælde af eventuelle pipetteringsfejl).Enzym og substrat-afhængige eksperimenter kræver mindre reaktion mængder. Reaktionsvolumenet til disse eksperimenter kan være så lille som 30 pi, da dette er det endelige volumen, der vil blive spottet på nitrocellulosemembranen.
    3. For at initiere reaktionen, tilsættes en mængde på [γ- 32P] -ATP opløsning til reaktionsblandingen og blandes ved pipettering op og ned. Spor forløbet reaktionstid med en timer, og reaktionen forløbe i det ønskede tidsrum.
    4. For at standse reaktionen, tilsæt 1/13 af det samlede reaktionsvolumen iskold 325 mM H 3 PO 4 til reaktionen og blandes ved pipettering op og ned. Alternativt tilsættes en alikvot af reaktionen til 325 mM H 3 PO 4.
      BEMÆRK: Slutkoncentrationen af H 3 PO 4 bør være 25 mM til tilstrækkelig standse reaktionen. For eksempel tilsættes 2,5 uL 325 mM H 3 PO 4 til 30 uL reaktion, eller tilsættes 30 uL reaktion på 2,5 uL 325 mM H 3 PO <sub> 4. Den endelige pH af reaktionen er ca. 4,0. Denne koncentration af H 3 PO 4 er blevet testet og bekræftet at slukke kinasereaktionen i denne buffer uden nedbrydning phosphohistidin.
      1. For eksempel blande 7,5 pi 4x reaktionsbuffer, 7,5 pi 4x histidin-kinase, og 7,5 pi Hedeselskabet 2 O. Start omsætning med 7,5 pi [γ- 32P] -ATP. Stands reaktionen med 2,5 pi 325 mM H 3 PO 4.
    5. Anbring straks quenchede reaktioner på is, indtil alle reaktioner er blevet opsagt.
      BEMÆRK: For at maksimere effektiviteten, er det tilrådeligt at indlede en reaktion hver 15 eller 20 sekunder, indtil alle reaktioner initieres, og når den ønskede reaktionstid er gået, slukke én reaktion hver 15 eller 20 sekunder, indtil alle er standset. For dem, der bruger analysen for første gang, kan et længere interval være mere overskueligt.

3. Spotting of slukket Reaktioner på Nitrocellulose

  1. Start vakuum på 96-brønds dot blot apparat
    1. Anbring den formonterede 96 brønde dot-blot-apparat (afsnit 1.7) i en sekundær beholder. Denne beholder skal være stort nok til, at apparatet let demonteres, da apparatet og membranen vil være radioaktiv efter brug.
    2. Påfør vakuum på 96-brønds dot blot apparat.
    3. Når apparatet er under vakuum, forsigtigt pipetteres den standsede reaktionen direkte på nitrocellulosemembranen i hver brønd. Gentag, indtil alle reaktioner er fyldt på membranen. Da bindingskapacitet nitrocellulose (75 - 110 pg / cm2) er større end mængden af histidin-kinase, der er plettet, kan det antages, at næsten alle kinasen binder til membranen når lagt korrekt.
      BEMÆRK: Afhængigt af det anvendte apparat, skal man passe på ikke at punktere nitrocellulose. Bemærk at alle af reaktionen er kommet i kontakt med the nitrocellulose. Det er let for nogle eller alle af reaktionen til at klæbe til væggene af brønden, og ikke nå nitrocellulose.
    4. Vask brøndene med 100 pi iskold 25 mM H 3 PO 4. Dette vil tillade nogen reaktionsvolumen der kan være blevet fanget i brønden for at nå membranen, hvilket sikrer fuldstændig fyldning af alle reaktioner. Tillad hele mængden til at strømme gennem membranen.
  2. Apparatur afmontering og nitrocellulosemembran overførsel
    1. Demontere omhyggeligt apparatet før lukke for vakuum. Vær opmærksom på at både apparatet og nitrocellulosemembranen er radioaktive på dette tidspunkt. Fjern ikke apparater komponenter fra den sekundære beholder på dette tidspunkt.
    2. Med en pincet, omhyggeligt overføre nitrocellulosemembranen fra apparatet til en beholder med ca. 200 ml 25 mM iskold H 3 PO 4. Placer låg på denne beholder, som vask vil være radioactive. På dette tidspunkt, kan vakuummet afbrydes.

4. Nitrocellulose Processing

  1. nitrocellulose vask
    1. Placer beholderen med vask membran på en rocker. Lade membranen Vip forsigtigt i 20 min.
    2. Efter 20 min, dekanteres forsigtigt den brugte vaskeopløsning i en stor spand, der skal bruges til midlertidig opbevaring af affald. Tilsæt 200 ml iskold 25 mM H 3 PO 4 til membranen og gentag.
      BEMÆRK: Mindst er nødvendigt at fjerne baggrund [γ- 32P] -ATP signal fra membranen tre 20 minutters vaske. Efter den tredje vask, teste brugt vask løsning til stråling med en geigertæller. Fortsæt vask af membranen som beskrevet ovenfor, indtil intet signal er til stede i vaskeopløsningen.
  2. nitrocellulose tørring
    1. Efter membranen er tilstrækkeligt vasket, lade membranen kortvarigt lufttørre. Det tager typisk 5 minutter eller mindre.

5. Udsættelse for Storage phosphor screen

Bemærk: Dette afsnit er valgfri. Eksponering af membranen til en phosphor screen er fordelagtig i at det giver mulighed for visualisering af intensiteten af ​​radioaktivt mærket kinase i hver plet på membranen. Den relative intensitet af disse pletter er direkte proportional med mængden af ​​phosphoryleret histidin-kinase i hver plet. Intensiteten kan kvantificeres med billedbehandling software, og disse resultater kan sammenlignes med dem, der genereres fra afsnit 7. Desuden dette trin giver mulighed for kvalitetskontrol. Abnormiteter ses i denne scanning kan forklare uregelmæssige resultater opnået fra scintillationstælling.

  1. forberedelse phosphor screen
    1. Forud for eksponering af membranen til opbevaring phosphor screen, udsætte phosphor screen til hvidt lys i mindst 5 min. Dette sikrer, at enhver resterende billede, der kan holdes ved skærmen er slettet.
    2. Sørg for, at skærmen er renog tørre. Hvis det er nødvendigt, forsigtigt rengøre skærmen med en phosphor screen rengøring løsning godkendt af producenten skærmen, og tør.
  2. forberedelse nitrocellulosemembran
    1. wrap forsigtigt tør nitrocellulosemembran i en tynd plastfolie for at forhindre resterende fugt i at beskadige phosphor screen. Sørg for, at der ikke er nogen rynker eller bobler.
  3. Udsættelse for phosphor screen
    1. Placer indpakket nitrocellulosemembranen i opbevaring phosphor screen kassette, skal du placere skærmen med forsiden nedad på membranen, og luk kassetten. Åbn ikke kassetten eller flytte membranen, indtil det er tid til at scanne phosphor screen, som membran gearskift under eksponering vil medføre en dobbelt eller udtværet billede, der skal indfanges.
    2. Eksponere i mindst 4 timer, eller så længe phosphor screen fabrikanten antyder.
    3. Når eksponeringen er fuldført, scanne phosphor screen og tage billedet med en fosfor-scanner.

6. Forberedelse nitrocellulosemembran for scintillationstælling

  1. Ponceau S farvning og affarvning
    1. Kort fortalt fordybe nitrocellulosemembranen i Ponceau S farveopløsning (0,1% Ponceau S (vægt / volumen) i 5% eddikesyre) til 1 - 2 min. Væde hele membran med før affarvning pletten.
    2. Dekanteres overskydende Ponceau S fra membranen.
    3. Skyl membranen med Hedeselskabet 2 O indtil kun de pletter fra histidin-kinase er plettet. Bemærk, at denne procedure kun vil fungere, hvis alle pletter indeholder påviselige mængder af protein.
      BEMÆRK: Dette trin er nødvendigt for at bekræfte, at kinasen er bundet til nitrocellulose og at protein loading er endda hele alle pletter. Det giver også den plettede kinase til let at blive skåret ud fra membranen.
  2. Udskæring spots
    1. Med saks, skåret ud hver plet på nitrocellulosemembranen. Det er ikke nødvendigt at skære perfekt along kanten af ​​det farvede stedet; hvis membranen blev vasket tilstrækkeligt, vil baggrunden på grund af varierende størrelse skåret ud pletter være ubetydelig. Det er kun vigtigt at skære hele sted for hver reaktion.
    2. Ved hjælp af pincet, omhyggeligt overføre hver plet i scintillationsglas. Nr scintillationscocktail er nødvendigt, da 32 P er let påviselige ved tjerenkovstråling.
      BEMÆRK: Alternativt kan spot skæres ud ved anvendelse af en skærpet propbor. Fjern hver plet fra nitrocellulose med propbor, og skub den ind et scintillationshætteglas med en nål. Med denne metode fremgår membranen ikke at blive rørt, yderligere minimering stråling.
  3. Bestemmelse CPM / pmol [γ- 32P] -ATP opløsning
    1. Spot flere fortyndinger af [γ- 32P] -ATP løsning (afsnit 1.5) på 1 cm x 1 cm kvadrater af nitrocellulose. Kortvarigt lufttørre.
    2. Ved hjælp af pincet, omhyggeligt overføre hver firkant i scintillationhætteglas. Nr scintillationscocktail er nødvendig. Disse prøver vil blive anvendt til at generere en standardkurve for at bestemme CPM / pmol ATP opløsning.

7. scintillationstælling

  1. Indlæse alle scintillationshætteglas i scintillationstæller kassetter. Load kassetter i scintillationstæller.
  2. Udfør scintillationstælling program til måling af CPM for hvert hætteglas. Disse data, sammen med CPM / pmol af radioaktivt mærkede ATP mix (fra afsnit 6.3), kan bruges til at beregne mængden af ​​phosphoryleret histidin kinase til stede i hver plet, og dermed hastigheden af ​​autophosphorylering. 18,19

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En repræsentativ datasæt blev genereret med et billede optaget med en phosphorimager (figur 1), Ponceau S plet af nitrocellulosemembranen (figur 2), og scintillationstælling data (figur 3). Figur 3A viser enzymkinetiske konstanter i en Lineweaver-Burk plot. Disse resultater blev opnået under anvendelse af en oprenset histidin-kinase fra den gram-negative arter Vibrio parahaemolyticus (gen ID 1.189.383). Den anvendte protokol til oprensning af denne kinase er beskrevet i afsnit 1.1. Den endelige kinase i reaktionen var 7,5 uM. De endelige ATP-koncentrationer varierede fra 0 pM til 1,28 mM. Den [γ- 32P] -ATP løsning var 171,97 CPM / pmol ATP. Disse data kan alle genereres på en enkelt dag ved anvendelse af fremgangsmåden, vi har beskrevet.

/55129/55129fig1.jpg "/>
Figur 1: Ponceau S-farvning af en nitrocellulosemembran. Ponceau plet viser kinase bundet til nitrocellulosemembranen. Membranen blev spottet med reaktioner indeholdende forskellige koncentrationer af ATP, men konstant kinase koncentration. Ingen protein er påvist i de no-kinase kontrol pletter (4. og 8. række). Ponceau S farvningsopløsning var sammensat af 0,1% Ponceau S (vægt / volumen) i 5% eddikesyre. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: fluorografi resultater. Scannet billede af en phosphor-skærm, der havde været udsat for en nitrocellulosemembran. Membranen blev spottet med reaktioner indeholdende constant kinase koncentration, og forskellige koncentrationer af ATP. Hver koncentration blev analyseret tre gange. Ved hver koncentration blev et nej kinase kontrol inkluderet (4. og 8. række) for at vise, at radioaktivt mærket ATP er helt fjernet fra membranen under vask trin. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3: scintillationstælling data. A) Dobbelt-gensidige plot af autophosphorylering af histidin kinase. Substratet-afhængighed kurve blev genereret fra scintillationstælling. Phosphohistidin-dannelse blev beregnet ved anvendelse af hældningen af figur 3B (CPM / pmol ATP), som også er blevet til med scintillation spektrometri. B) Standard kurve af CPM / pmol ATP. Hældningen bruges til at beregne mængden af ​​phosphohistidin (pmol) til stede i hver prøve. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nitrocellulosen bindingsassay vi har beskrevet har mange fordele i forhold til tidligere anvendte fremgangsmåder til at karakterisere histidin kinaser. I forhold til traditionelle SDS / SIDE-baserede autoradiografi, vores metode er højere gennemløb og mindre tidskrævende. Nitrocellulosemembranen er lettere at håndtere end SDS-geler, og behøver ikke at være fast. Ponceau farvning nitrocellulosen muliggør proteinpletterne, der skal visualiseres. Dette giver en nem måde at skære hver plet for scintillationstælling, og bestemme, at protein belastning er konsistent på tværs af alle pletter. Scintillationstælling af hver plet giver nøjagtige resultater, der let kan omdannes til reaktionshastighed under anvendelse hældningen af standardkurven vist i figur 3B.

Selvom udsætte nitrocellulosemembranen til et lager phosphor screen tilføjer tid til den samlede varighed af forsøget, dette trin giver indblik i succes blotting. Enhverafvigelser, der er bemærket i scintillationstælling data kan potentielt forklares ved den supplerende phosphor billedet. Hvis for eksempel membranen blev ikke tilstrækkeligt vasket, vil fosfor billedet afsløre disse oplysninger. Fluorografi af membranen anbefales til alle, der planlægger at bruge denne analyse, da resultaterne fra dette trin kan være en værdifuld supplerende oplysninger.

En anden væsentlig fordel ved dette assay er evnen til at generere data fra scintillationstælling. Udskæring hver enkelt spot for scintillationstælling er foretrukket at anvende af billedbehandling software at kvantificere båndintensitet, som sker typisk for side-baserede assays. Den øvre grænse og dynamikområde til detektion er langt højere med scintillationstælling. Generering af en standardkurve for at bestemme CPM / pmol ATP gør det let at beregne hastigheden af ​​autophosphorylering fra de rå data. Under anvendelse af denne metode, er vi i stand til præcist at detekterepicomol phosphoryleret produkt.

På trods af de mange fordele ved at bruge vores fremgangsmåde er det ikke uden begrænsninger. Vores metode skelner ikke mellem 1-phosphohistidin og 3-phosphohistidin. Selvom phosphohistidin antistoffer kan anvendes til at skelne mellem disse phosphorylerede produkter, vores metode har stadig den fordel at udnytte tjerenkovstråling at kvantificere phosphorylering. Tjerenkovstråling giver et stort dynamikområde og høj øvre detektionsgrænse. Afhængigt af metoden til påvisning, ved hjælp af antistoffer til at kvantificere phosphohistidin dannelse kan lide af mindre øvre grænse og dynamisk område. Vores metode er også begrænset til at blive anvendt med oprensede proteiner, og kan ikke anvendes til at detektere phosphorylerede kinaser in vivo. Vores metode kræver radioaktivt mærket substrat, hvilket kan afskrække laboratorier, som ikke er udrustet til radioaktivitet. I sidste ende er denne metode mest egnet til laboratorier, der allerede udstyret til at håndtereradioaktivitet, og er interesseret i et højere gennemløb og mindre tidskrævende alternativ til ofte anvendte SDS-PAGE teknikker til at studere histidin kinaser. De, der studerer Ser / Thr / Tyr kinaser kan også finde denne metode til at være nyttig, på trods af den relative forekomst af alternative metoder til at studere disse proteiner.

Karakterisering af histidin kinaser har længe været undvigende trods af fremskridt i metoder til at kvantificere andre former for kinaser. Med dette assay, kan vi begynde at karakterisere disse biologisk relevante endnu dårligt forståede proteiner. Denne avancement i metode til at kvantificere histidin kinase autophosphorylering i sidste ende vil forbedre vores forståelse af to-komponent signalering i bakterier. Denne analyse vil være et værdifuldt redskab, som vi undersøge effekten af ​​beslægtede stimuli og protein-protein interaktioner på histidin-aktivitet i forskellige to-komponent signalveje.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af Institut for Uddannelse gennem Graduate bistand på områder af National Need program (P200A100044).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphoric acid VWR AAAA18067-AP For quenching reactions and washing nitrocellulose
Tris base RPI T60040-5000.0 Tris-HCl pH 8.0, for kinase reaction buffer
Potassium chloride RPI P41000-2500.0 For kinase reaction buffer
Magnesium chloride RPI M24000-500.0 For kinase reaction buffer
Glycerol RPI G22020-4000.0 For kinase reaction buffer
5'-ATP Promega E6011 Kinase substrate
[γ-32P]-5'-ATP Perkin Elmer NEG002Z250UC  6,000 Ci/mmol
96-well dot blot apparatus Bio-rad 1706545 For spotting reactions
Nitrocellulose Whatman 32-10401396-PK For spotting reactions
Ponceau S Sigma aldrich P3504-50G For staining nitrocellulose

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stock, A. M., Robinson, V. L., Goudreau, P. N. Two-component signal transduction. Annu. Rev. Biochem. 69, 183-215 (2000).
  2. Jung, K., Fried, L., Behr, S., Heermann, R. Histidine kinases and response regulators in networks. Curr. Opin. Microbiol. 15, (2), 118-124 (2012).
  3. Parkinson, J. S., Kofoid, E. C. Communication modules in bacterial signaling proteins. Annu. Rev. Genet. 26, 71-112 (1992).
  4. Laub, M. T., Biondi, E. G., Skerker, J. M. Phosphotransfer profiling: systematic mapping of two-component signal transduction pathways and phosphorelays. Methods Enzymol. 423, 531-548 (2007).
  5. Ronson, C. W., Nixon, B. T., Ausubel, F. M. Conserved domains in bacterial regulatory proteins that respond to environmental stimuli. Cell. 49, (5), 579-581 (1987).
  6. Szurmant, H., Bu, L., Brooks, C. L., Hoch, J. A. An essential sensor histidine kinase controlled by transmembrane helix interactions with its auxiliary proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, (15), 5891-5896 (2008).
  7. Price, M. S., Chao, L. Y., Marletta, M. A. Shewanella oneidensis MR-1 H-NOX regulation of a histidine kinase by nitric oxide. Biochemistry. 46, (48), 13677-13683 (2007).
  8. Zhulin, I. B. The superfamily of chemotaxis transducers: from physiology to genomics and back. Adv. Microb. Physiol. 45, 157-198 (2001).
  9. Robinson, V. L., Buckler, D. R., Stock, A. M. A tale of two components: a novel kinase and a regulatory switch. Nature Struct. Biol. 7, (8), 626-633 (2000).
  10. Attwood, P. V., Piggott, M. J., Zu, X. L., Besant, P. G. Focus on phosphohistidine. Amino acids. 32, (1), 145-156 (2007).
  11. Kee, J. -M., Muir, T. W. Chasing phosphohistidine, an elusive sibling in the phosphoamino acid family. ACS Chem. Biol. 7, (1), 44-51 (2012).
  12. Tawa, P., Stewart, R. C. Kinetics of CheA Autophosphorylation and Dephosphorylation Reactions. Biochemistry. 33, (25), 7917-7924 (1994).
  13. Marina, A., Mott, C., Auyzenberg, A., Hendrickson, W. A., Waldburger, C. D. Structural and mutational analysis of the PhoQ histidine kinase catalytic domain. Insight into the reaction mechanism. J. Biol. Chem. 276, (44), 41182-41190 (2001).
  14. Fuhs, S. R., et al. Monoclonal 1- and 3-Phosphohistidine Antibodies: New Tools to Study Histidine Phosphorylation. Cell. 162, (1), 198-210 (2015).
  15. Ueno, T. B., Johnson, R. A., Boon, E. M. Optimized assay for the quantification of histidine kinase autophosphorylation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 465, (3), 331-337 (2015).
  16. Bradford, M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 7, (72), 248-254 (1976).
  17. Stoscheck, C. M. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).
  18. Funt, B. L., Hetherington, A. Scintillation counting of beta activity on filter paper. Science. 131, (3413), 1608-1609 (1960).
  19. Bem, E. M., Bem, H., Reimchüssel, W. Determination of phosphorus-32 and calcium-45 in biological samples by Čerenkov and liquid scintillation counting. Int. J. Appl. Radiat. Isot. 31, (6), 371-374 (1980).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics