Quantificazione dei batteri istidina chinasi autophosphorylation usando un test nitrocellulosa Binding

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Fischer, J., Johnson, R. A., Boon, E. Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay. J. Vis. Exp. (119), e55129, doi:10.3791/55129 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

risposta adattativa è cruciale per la sopravvivenza dei batteri. Al fine di rilevare e rispondere a cambiamenti ambientali, batteri usano un sistema stimolo-risposta nota come segnalazione bicomponente. 1,2 In un tipico sistema a due componenti, la chinasi istidina rileva uno stimolo affine, autophosphorylates suo residuo istidina conservati, poi trasferisce fosfato ad un residuo aspartato conservati nel dominio ricevente di una proteina regolatore di risposta. 3 Questo evento attiva un cambiamento nell'attività del regolatore di risposta, che stimola un effetto valle. 4,5 Così, i batteri sono in grado di rilevare e adattarsi ai cambiamenti nell'ambiente locale. Alcuni sistemi di segnalazione a due componenti si discostano da questo archetipo. In alcuni casi, il dominio sensoriale della chinasi istidina è una proteina stand-alone, che rileva direttamente l'input sensoriale e modifica attività chinasica attraverso una interazione proteina-proteina. 6-8 Tuttavia, il fondoprocesso amental e il ruolo globale del sistema rimane lo stesso. segnalazione bicomponente è un sistema stimolo-risposta onnipresente che è essenziale per la sopravvivenza dei batteri, e chinasi istidina giocano un ruolo critico nella trasduzione del segnale. 9

Nonostante l'importanza di istidina chinasi alla biologia batterica, rimangono poco caratterizzato. Ciò è dovuto alla instabilità intrinseca di phosphohistidine, e la mancanza di un metodo pratico per misurare autofosforilazione. Phosphohistidine è più labile di Fosfoserina, phosphothreonine, e fosfotirosina. 10 Così, le tecniche che vengono comunemente utilizzati per analizzare chinasi Ser / Thr / Tyr non sono applicabili per chinasi istidina. 11 saggi in vitro per lo studio chinasi istidina sono stati in gran parte limitato a SDS-PAGE autoradiografia. 12,13 In questo metodo, [γ- 32 P] -ATP viene incubata con chinasi, e la fosforilazione della chinasi viene analizzato dal polgel yacrylamide elettroforesi (PAGE) seguita da autoradiografia del gel. Questo metodo può essere usato per monitorare autofosforilazione chinasi, nonché phosphotransfer dalla chinasi ad un regolatore di risposta. Tuttavia, questo metodo ha notevoli carenze. test basato sulla pagina sono bassa produttività e che richiede tempo. Tali limitazioni non sono favorevoli a caratterizzare una proteina e accertare i parametri cinetici. Un metodo alternativo per lo studio chinasi istidina che è stato pubblicato di recente utilizza anticorpi per rilevare phosphohistidine autofosforilazione. 14 Mentre questo metodo ha il vantaggio di distinguere tra 1-phosphohistidine e 3-phosphohistidine, a seconda della strumentazione utilizzata per il rilevamento, questo metodo non può offrire una vasta gamma dinamica o limite superiore alta di rilevamento. Pertanto, vi è la necessità per un saggio rapido, meno faticoso e più sensibile che può essere usato per studiare queste proteine ​​importanti.

Qui, descriviamo e demonstrate un saggio di legame nitrocellulosa accuratamente sviluppato che può essere utilizzato per quantificare autofosforilazione di purificati chinasi istidina batteriche in vitro. Questo saggio è un throughput più elevato e meno tempo rispetto test basato sulla pagina. Il metodo utilizza anche la radiazione Cherenkov per phosphohistidine quantificazione, che offre un elevato limite superiore di rilevazione e una vasta gamma dinamica. Il saggio può essere utilizzato per determinare i parametri cinetici per chinasi istidina.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Attenzione: Questo protocollo richiede una formazione adeguata per l'uso e la manipolazione di materiali radioattivi. Si prega di utilizzare il dispositivo di protezione individuale richiesto durante l'esecuzione di questo test, tra cui schermatura contro le radiazioni beta. I rifiuti radioattivi deve essere maneggiato con cura, come i grandi volumi di rifiuti sono generati durante la fase di lavaggio dell'esperimento. Assicurarsi che la rifiuti sono stoccati in un contenitore in posizione verticale, come un grande secchio o una bottiglia che non sarà facilmente rovesciato o fuoriuscita. Una volta che l'esperimento è concluso, trasferire accuratamente tutti i rifiuti liquidi ad segnato in modo appropriato contenitori per rifiuti radioattivi. Manipolare tutti i materiali con cura, e mantenere un contatore Geiger vicino per monitorare l'area di lavoro per la contaminazione.

NOTA: Questo protocollo è una versione rivista di un saggio riportato in precedenza dal nostro gruppo. 15 stabilità Phosphohistidine in H 3 PO 4 dovrebbe essere testato per qualsiasi istidina chinasi non caratterizzato prima di utilizzare questo metodo. Il phosphohistidine sttest di abilità è stato descritto in precedenza. 15 Un controllo negativo che non contiene chinasi deve essere incluso. Ciò è necessario per sottrarre il segnale di fondo da ogni campione e assicurarsi che [γ- 32 P] -ATP è sufficientemente lavato dalla membrana.

1. Preparazione dei reagenti e materiali

  1. Purificare chinasi istidina dalla coltura batterica prima di utilizzare questo test.
    1. Purificare una chinasi istidina (gene ID 1.189.383) da Vibrio parahaemolyticus (EB101, ATCC 17802) per lo sviluppo di questo test. Clonare il chinasi in vettore di espressione pET-23aHis-TEV con NdeI e siti di restrizione XhoI, ed effettuare mutagenesi sito-diretta per produrre il mutante costruire Vp1876 D499A.
    2. Trasformare il plasmide in E. coli BL21 (DE3) pLysS, e far crescere le cellule in mezzi TB a 37 ° C. culture integrare con ampicillina (100 mg / ml) e cloramfenicolo (34 mg / ml), e crescere con l'agitazione(250 rpm) ad una OD 600 di 0,6.
    3. Indurre l'espressione della proteina con IPTG ad una concentrazione finale di 25 micron, e far crescere le culture per una notte a 16 ° C. Celle di raccolta per centrifugazione (5000 x g), Lyse per sonicazione, e centrifugare per rimuovere i detriti cellulari (18.000 xg).
    4. Purificare la chinasi His-tag utilizzando Ni-NTA agarosio. Confermare la purezza mediante SDS-PAGE. Ottimizzare la purificazione per ogni proteina, e confermare la purezza prima di utilizzare questo test.
  2. Preparare la mm H 3 PO 4 soluzione di lavaggio 25. Per 1 L di acqua deionizzata distillata, aggiungere H 3 PO 4 ad una concentrazione finale di 25 mM. Il pH di tale soluzione è circa 2,0. Posizionare 25 mM H 3 PO 4 su ghiaccio.
  3. Preparare una soluzione 13x magazzino di 325 mm H 3 PO 4, da utilizzare per estinguere reazione chinasi. Il pH di tale soluzione è circa 1,5. Mettere 325 mm H 3 PO 4 sul ghiaccio.
    NOTA: H 3 PO 4
  4. Preparare una soluzione tampone di reazione 4x madre contenente 160 mM Tris-HCl pH 8.0, 600 mm KCl, 16 mM MgCl 2, e il 40% di glicerolo.
  5. Quantificare istidina chinasi concentrazione di proteine con metodi stabiliti di concentrazione (Bradford, UV-Vis, etc.). 16,17 Preparare una soluzione istidina chinasi con una concentrazione che è 4 volte la concentrazione finale desiderata. Per ottenere adeguato segnale, la concentrazione proteica finale nella reazione dovrebbe essere idealmente almeno 5 micron.
  6. Preparare una radiomarcato 4x [γ- 32 P] -ATP soluzione con la concentrazione 4x adeguata di ATP senza etichetta e l'etichetta: il rapporto senza etichetta per l'esperimento.
    NOTA: La quantità di [γ- 32 P] -ATP che dovrebbe essere incluso in questo mix dipende da quanto [^7; - 32 P] -ATP in ultima analisi, essere individuato per ogni reazione. Abbiamo ottenuto segnale adeguata, con concentrazioni finali comprese tra 0,1-5 uCi per reazione. È importante che l'etichetta: senza etichetta rapporto ATP essere mantenuta costante per tutte le reazioni in un dato esperimento. diluizioni seriali devono essere effettuate quando più concentrazioni di ATP sono desiderati, in quanto questo e mantenere il etichettato: senza etichetta costante il rapporto ATP in tutte le concentrazioni. Le concentrazioni di ATP finali in genere varia da 10 micron a almeno 1 mm, e ogni concentrazione devono essere analizzati in triplice copia per ottenere dati cinetici affidabili.
  7. 96- apparato ben Dot Blot
    1. Tagliare un pezzo x 12 cm 8 cm di membrana di nitrocellulosa (dimensione dei pori 0,2 micron).
    2. Posizione nitrocellulosa in un apparato dot blot, assicurando che la membrana si adatta in modo tale che l'apparecchio è sigillato, e tutti i pozzetti sono completamente coperta dalla membrana. Se montato correttamente, non ci dovrebbero essere perdite d'aria quando il vuoto è applied.
    3. Per raccogliere filtrato, collegare l'apparecchio a un pallone braccio laterale secondario. Dal stelo della valvola, collegare il tubo adeguata in modo tale che il dispositivo può essere utilizzato comodamente senza ribaltare il matraccio secondario.
    4. Collegare il pallone braccio laterale secondario per fonte di aspirazione / vuoto.
    5. Prova che l'apparecchio è completamente sigillato applicando vuoto per l'apparato. Se l'apparato viene montato correttamente, una forte depressione sarà presente in tutti i pozzetti. Tutti i collegamenti dei tubi possono essere avvolti in Parafilm o Saran Wrap per garantire una perfetta tenuta.
    6. Facoltativamente, per testare il vuoto, pipetta 100 microlitri di tampone di reazione in un pozzetto. Il vuoto dovrebbe essere abbastanza forte per disegnare tutto il liquido attraverso il pozzo e sulla membrana.
    7. Spegnere il vuoto fino a quando tutti i campioni sono pronti per essere individuati sulla membrana.

2. Reazione Iniziazione e Tempra

  1. Miscelazione dei componenti di reazione
    1. Prima di initizione, preparare tutti i quattro componenti della reazione come soluzioni madre 4x: tampone di reazione (vedere paragrafo 1.4), istidina chinasi (1.5), [γ- 32 P] -ATP (1.6), e DDH 2 O.
    2. Miscelare uguali volumi di tampone di reazione, istidina chinasi, e DDH 2 O. Lasciare questi componenti di reazione equilibrare a temperatura ambiente per un breve periodo (10 min).
      NOTA: Il volume finale di reazione dipende dal fatto che l'esperimento è dipendente dal tempo, l'enzima-dipendente, o substrato-dipendente. reazioni dipendenti dal tempo devono essere più grandi, come più aliquote sono prese dalla stessa reazione e raffreddati al punto di tempo desiderato. Il volume di reazione dipenderà dal numero di punti di tempo desiderati. Il test è ottimizzato per ciascuna macchia sulla membrana di nitrocellulosa per contenere 30 microlitri della reazione. Così, se 10 punti di tempo sono desiderati, il volume di reazione deve essere di almeno 300 ml (un volume superiore come 330 microlitri sarebbe preferibile nel caso di eventuali errori di pipettamento).Enzima e gli esperimenti substrato-dipendente richiedono volumi di reazione più piccoli. Il volume di reazione per questi esperimenti può essere piccolo come 30 microlitri, in quanto questo è il volume finale che sarà depositata su membrana di nitrocellulosa.
    3. Per iniziare la reazione, aggiungere un volume della soluzione [γ- 32 P] -ATP alla reazione e mescolare pipettando su e giù. Traccia tempo di reazione trascorso con un timer e lasciare che la reazione di procedere per il tempo desiderato.
    4. Per spegnere la reazione, aggiungere 1/13 del volume di reazione totale di ghiacciata 325 mM H 3 PO 4 alla reazione e mescolare pipettando su e giù. In alternativa, aggiungere una aliquota della reazione a 325 mM H 3 PO 4.
      NOTA: La concentrazione finale di H 3 PO 4 dovrebbe essere di 25 mM per placare sufficientemente la reazione. Ad esempio, aggiungere 2,5 microlitri 325 mm H 3 PO 4 a 30 microlitri di reazione, oppure aggiungere 30 microlitri di reazione a 2,5 microlitri 325 mm H 3 PO <sub> 4. Il pH finale della reazione è di circa 4,0. Questa concentrazione di H 3 PO 4 è stato testato e confermato per placare la reazione della chinasi in questo buffer senza degradare phosphohistidine.
      1. Ad esempio, mescolare 7,5 microlitri di buffer 4x reazione, 7,5 microlitri 4x istidina chinasi, e 7,5 ml DDH 2 O. Iniziato reazione con 7,5 ml [γ- 32 P] -ATP. Placare la reazione con 2,5 microlitri 325 mm H 3 PO 4.
    5. Porre immediatamente reazioni bonificati sul ghiaccio fino a quando tutte le reazioni sono stati terminati.
      NOTA: Per massimizzare l'efficienza, si consiglia di avviare una reazione ogni 15 o 20 s fino a tutte le reazioni sono iniziati, e una volta che il tempo di reazione desiderata è passato, placare una reazione ogni 15 o 20 s fino a quando tutti sono state spente. Per coloro che utilizzano il test per la prima volta, un intervallo più lungo può essere più gestibile.

3. Spotting oReazioni f bonificati di nitrocellulosa

  1. Inizia vuoto su 96 pozzetti apparato macchia dot
    1. Mettere l'apparato preassemblato 96 pozzetti macchia punto (sezione 1.7) in un contenitore secondario. Questo contenitore deve essere abbastanza grande per l'apparato di essere facilmente smontabile, come l'apparato e la membrana sarà radioattivi dopo l'uso.
    2. Applicare il vuoto all'apparato 96 pozzetti macchia punti.
    3. Una volta che l'apparato è sotto vuoto, pipettare attentamente la reazione bonificato direttamente sulla membrana di nitrocellulosa in ciascun pozzetto. Ripetere fino a quando tutte le reazioni sono caricati sulla membrana. Poiché la capacità di legame di nitrocellulosa (75 - 110 mg / cm 2) è maggiore della quantità di istidina chinasi che è individuato, si può presumere che quasi tutti chinasi si lega alla membrana quando caricato correttamente.
      NOTA: A seconda dello strumento utilizzato, bisogna fare attenzione a non forare la nitrocellulosa. Si osservi che tutti la reazione ha preso contatto con the nitrocellulosa. È facile per alcuni o tutti la reazione al bastone alle pareti del pozzo, e non raggiungono la nitrocellulosa.
    4. Lavare i pozzetti con 100 ml di ghiacciata 25 mm H 3 PO 4. Ciò consentirà qualsiasi volume di reazione che può essere stato intrappolato nel pozzo per raggiungere la membrana, garantendo carico completo di tutte le reazioni. Consentire l'intero volume di fluire attraverso la membrana.
  2. lo smontaggio e trasferimento Apparato membrana di nitrocellulosa
    1. Disassemblare con cura l'apparato prima di spegnere il vuoto. Occorre considerare che sia l'apparato e la membrana di nitrocellulosa sono radioattivi in ​​questo momento. Non rimuovere i componenti dell'apparato dal contenitore secondario in questo momento.
    2. Con pinze, trasferire accuratamente la membrana di nitrocellulosa dall'apparato ad un contenitore di 200 ml circa 25 mM ghiacciato H 3 PO 4. Mettere un coperchio su questo contenitore, come il lavaggio sarà radioactive. In questo momento, il vuoto può essere spento.

4. nitrocellulosa Processing

  1. nitrocellulosa lavaggio
    1. Posizionare il contenitore con la membrana lavaggio su un bilanciere. Lasciare la membrana al rock delicatamente per 20 min.
    2. Dopo 20 min, con attenzione decantare la soluzione di lavaggio utilizzato in un grande secchio da utilizzare per lo stoccaggio temporaneo dei rifiuti. Aggiungere 200 ml di ghiacciata 25 mm H 3 PO 4 alla membrana e ripetere.
      NOTA: Almeno sono necessari per rimuovere lo sfondo [γ- 32 P] segnale -ATP dalla membrana tre 20 min lavaggi. Dopo il terzo lavaggio, testare la soluzione di lavaggio utilizzato per la radiazione con un contatore Geiger. Continuare lavare la membrana come descritto sopra finché nessun segnale è presente nella soluzione di lavaggio.
  2. nitrocellulosa essiccazione
    1. Dopo la membrana è sufficientemente lavato, consentire la membrana all'aria brevemente secca. Questo richiede in genere 5 minuti o meno.

5. L'esposizione a bagagli Phosphor schermo

Nota: Questa sezione è facoltativa. Esponendo la membrana ad uno schermo al fosforo è vantaggiosa in quanto consente la visualizzazione dell'intensità della chinasi radiomarcato in ogni punto sulla membrana. L'intensità relativa di questi punti è direttamente proporzionale alla quantità di fosforilata istidina chinasi in ogni punto. L'intensità può essere quantificata con un software di elaborazione delle immagini, e questi risultati può essere paragonato a quelli generati dalla sezione 7. Inoltre, questo passaggio consente un controllo di qualità. Anomalie visto in questa scansione potrebbero spiegare i risultati irregolari ottenuti dal conteggio a scintillazione.

  1. Preparazione schermo al fosforo
    1. Prima di esporre la membrana allo schermo di fosfori stoccaggio, esporre lo schermo al fosforo per luce bianca per almeno 5 minuti. Questo assicura che qualsiasi immagine residua che può essere tenuto dallo schermo viene cancellata.
    2. Assicurarsi che lo schermo sia pulitoed asciutto. Se necessario, pulire delicatamente lo schermo con una soluzione di pulizia schermo al fosforo approvato dal produttore di schermi, e asciugare.
  2. preparazione membrana di nitrocellulosa
    1. spostare con attenzione la membrana di nitrocellulosa secca in un involucro di plastica sottile per evitare che l'umidità residua da danneggiare lo schermo al fosforo. Assicurarsi che non vi siano grinze o bolle.
  3. L'esposizione a schermo al fosforo
    1. Posizionare la membrana di nitrocellulosa avvolto nella schermata di cassette di archiviazione al fosforo, posizionare lo schermo a faccia in giù sulla membrana, e chiudere la cassetta. Non aprire la cassetta o spostare la membrana fino a quando è il momento di eseguire la scansione del schermo al fosforo, come lo spostamento della membrana durante l'esposizione causerà una doppia immagine o macchiata da catturare.
    2. Esporre per almeno 4 ore, o fino a quando il produttore schermo al fosforo suggerisce.
    3. Dopo esposizione è stata completata, la scansione dello schermo fosforo e catturare l'immagine con uno scanner fosforo.

6. Preparazione nitrocellulosa a membrana per il conteggio a scintillazione

  1. Ponceau S colorazione e decolorazione
    1. Brevemente immergere la membrana di nitrocellulosa in soluzione colorante Ponceau S (0,1% Ponceau S (w / v) in 5% di acido acetico) per 1 - 2 min. Bagnare tutta la membrana con la macchia prima decolorazione.
    2. Decantare eccesso Ponceau S dalla membrana.
    3. Sciacquare la membrana con DDH 2 O fino a quando solo le macchie dalla chinasi istidina sono macchiati. Si noti che questa procedura funziona solo se tutti i punti contengono quantità rilevabili di proteine.
      NOTA: Questo passaggio è necessario confermare che la chinasi è legato alla nitrocellulosa, e che la proteina caricamento è ancora in tutti i punti. Consente inoltre chinasi maculato di essere facilmente tagliato fuori dalla membrana.
  2. Taglio macchie
    1. Utilizzando le forbici, tagliare ogni punto sulla membrana di nitrocellulosa. Non è necessario tagliare perfettamente along il bordo della macchia macchiato; se la membrana viene lavata sufficientemente, fondo dovuto al variare dimensioni delle macchie ritagliate sarà trascurabile. E 'importante solo per tagliare il posto intero per ogni reazione.
    2. Utilizzando pinze, trasferire accuratamente ogni punto in fiale di scintillazione. No scintillazione cocktail è necessario in quanto il 32 P è facilmente rilevabile dalla radiazione Cherenkov.
      NOTA: In alternativa, il punto può essere tagliato utilizzando una sonda di carotaggio affilato. Rimuovere ogni punto dalla nitrocellulosa con la sonda di carotaggio, e spingerla in una fiala di scintillazione con uno spillo. Con questo metodo, la membrana non deve essere toccato, riducendo ulteriormente l'esposizione alle radiazioni.
  3. Determinazione CPM / pmol di [γ- 32 P] -ATP soluzione
    1. Spot diverse diluizioni di [γ- 32 P] -ATP soluzione (paragrafo 1.5) sul 1 cm x 1 cm quadrati di nitrocellulosa. asciugare all'aria brevemente.
    2. Utilizzando pinze, trasferire accuratamente ogni quadrato in scintillazionefiale. No scintillazione cocktail è necessario. Questi campioni saranno utilizzati per generare una curva standard per determinare il CPM / pmol della soluzione ATP.

7. il conteggio a scintillazione

  1. Caricare tutti fiale di scintillazione in cassette contatore a scintillazione. Inserire le cassette in contatore a scintillazione.
  2. Eseguire programma di conteggio a scintillazione per misurare CPM per ogni flacone. Questi dati, insieme con il CPM / pmol della miscela ATP radiomarcato (dal punto 6.3), possono essere utilizzati per calcolare la quantità di fosforilata istidina chinasi presente in ogni punto, e quindi la velocità di autofosforilazione. 18,19

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Un insieme di dati rappresentativi è stato generato con un'immagine catturata con un imager fosforo (Figura 1), Ponceau S macchia della membrana di nitrocellulosa (Figura 2), e dati di conteggio a scintillazione (Figura 3). La figura 3A mostra le costanti cinetiche degli enzimi in una trama Lineweaver-Burk. Questi risultati sono stati ottenuti utilizzando una chinasi istidina purificata dalla specie gram-negativi Vibrio parahaemolyticus (gene ID 1.189.383). Il protocollo utilizzato per purificare questa chinasi è descritto nella sezione 1.1. La concentrazione finale chinasi nella reazione era 7,5 mM. Le concentrazioni finali ATP variava da 0 micron a 1,28 mm. La soluzione [γ- 32 P] -ATP era 171,97 CPM / pmol ATP. Questi dati possono essere generati in un solo giorno utilizzando la procedura che abbiamo descritto.

/55129/55129fig1.jpg "/>
Figura 1: Ponceau S colora su membrana di nitrocellulosa. Ponceau macchia mostra la chinasi legata alla membrana di nitrocellulosa. La membrana è stato avvistato con reazioni contenenti varie concentrazioni di ATP, ma la concentrazione chinasi costante. Non proteina viene rilevato nei punti di controllo no-chinasi (4 ° e 8 ° fila). soluzione colorante Ponceau S era composta da 0,1% Ponceau S (w / v) in acido acetico al 5%. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: risultati fluorography. L'immagine digitalizzata di uno schermo al fosforo che erano stati esposti ad una membrana di nitrocellulosa. La membrana è stato avvistato con reazioni contenenti conconcentrazione chinasi costante, e varie concentrazioni di ATP. Ogni concentrazione è stato analizzato in triplicato. A ciascuna concentrazione, un controllo senza chinasi era inclusa (4 ° e 8 ° fila) per dimostrare che radiomarcato ATP viene completamente rimosso dalla membrana durante la fase di lavaggio. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: dati di conteggio in scintillazione. A) diagramma doppio reciproco della autophosphorylation di istidina chinasi. La curva substrato-dipendenza è stata generata dal conteggio a scintillazione. Formazione Phosphohistidine è stato calcolato utilizzando la pendenza della figura 3B (CPM / pmol ATP), che è stato anche generato con scspettrometria intillation. B) Curva standard del CPM / pmol di ATP. La pendenza è utilizzato per calcolare la quantità di phosphohistidine (pmol) presente in ciascun campione. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Il saggio di legame nitrocellulosa che abbiamo descritto ha molti vantaggi rispetto ai metodi utilizzati in precedenza per caratterizzare chinasi istidina. Rispetto ai tradizionali SDS / PAGE autoradiografia-based, il nostro metodo è maggiore produttività e meno tempo. La membrana di nitrocellulosa è facile da gestire rispetto gel SDS, e non deve essere fissato. Ponceau macchiare la nitrocellulosa consente per le macchie di proteine ​​per essere visualizzati. Questo fornisce un modo semplice per tagliare ogni spot per il conteggio di scintillazione, e determinare che la proteina di carico è coerente in tutti i punti. Conteggio a scintillazione di ogni spot fornisce risultati accurati che possono essere facilmente convertiti in velocità di reazione utilizzando la pendenza della curva standard mostrato nella Figura 3B.

Sebbene esponendo la membrana di nitrocellulosa a uno schermo fosfori aggiunge tempo alla durata totale dell'esperimento, questa fase permette di comprendere il successo della blotting. Qualsiasidiscrepanze che si notano nei dati di conteggio a scintillazione possono potenzialmente essere spiegati con l'immagine di fosforo complementare. Se, per esempio, la membrana non era sufficientemente lavato, l'immagine fosforo rivelarle. Fluorography della membrana è consigliato a tutti coloro che hanno intenzione di usare questo test, i risultati di questo passo può essere un utile elemento di informazione supplementare.

Un altro vantaggio significativo di questo test è la capacità di generare dati di conteggio di scintillazione. Taglio ogni singolo spot per il conteggio di scintillazione è preferibile utilizzare dei software di elaborazione dell'immagine per quantificare intensità della banda, come tipicamente fatto per test basato sulla pagina. Il limite superiore e la gamma dinamica per la rilevazione sono di gran lunga più alto con il conteggio a scintillazione. Generazione di una curva standard per determinare l'ATP CPM / pmol lo rendono facile da calcolare il tasso di autofosforilazione dai dati grezzi. Utilizzando questo metodo, siamo in grado di rilevare con precisionepicomoli di prodotti fosforilata.

Nonostante i numerosi vantaggi di utilizzare il nostro metodo, non è priva di limiti. Il nostro metodo non distingue tra 1-phosphohistidine e 3-phosphohistidine. Sebbene anticorpi phosphohistidine possono essere utilizzate per distinguere tra questi prodotti fosforilati, il nostro metodo ha ancora il vantaggio di utilizzare radiazioni Cherenkov per quantificare la fosforilazione. radiazione Cherenkov offre un'ampia gamma dinamica e limite superiore alta di rilevazione. A seconda del metodo di rilevazione, utilizzando anticorpi per quantificare formazione phosphohistidine possono soffrire di un limite superiore minore e gamma dinamica. Il nostro metodo è limitata ad essere utilizzato con proteine purificate, e non può essere utilizzato per rilevare chinasi fosforilate in vivo. Il nostro metodo richiede substrato radioattivo, che potrebbe scoraggiare i laboratori che non sono attrezzati per la radioattività. In definitiva, questo metodo è particolarmente adatta per i laboratori che già attrezzate per gestirela radioattività, e sono interessati ad un rendimento più elevato e richiede meno tempo alternativa alle tecniche di uso frequente SDS-PAGE per studiare chinasi istidina. Coloro che stanno studiando chinasi Ser / Thr / Tyr può anche trovare questo metodo per essere utile, nonostante la relativa abbondanza di metodi alternativi per lo studio queste proteine.

Caratterizzazione delle chinasi istidina è stata a lungo inafferrabile nonostante i progressi nei metodi per quantificare altri tipi di chinasi. Con questo test, possiamo cominciare a caratterizzare queste proteine ​​ancora poco conosciute biologicamente rilevanti. Questo avanzamento nella metodologia per quantificare l'istidina chinasi autophosphorylation in ultima analisi, migliorare la nostra comprensione di due componenti di segnalazione nei batteri. Questa analisi sarà uno strumento prezioso come abbiamo esplorare l'effetto di stimoli affini e le interazioni proteina-proteina sulle attività chinasi istidina in diverse vie di segnalazione a due componenti.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dal Dipartimento della Pubblica Istruzione attraverso l'assistenza Laurea in Aree di programma di fabbisogno nazionale (P200A100044).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphoric acid VWR AAAA18067-AP For quenching reactions and washing nitrocellulose
Tris base RPI T60040-5000.0 Tris-HCl pH 8.0, for kinase reaction buffer
Potassium chloride RPI P41000-2500.0 For kinase reaction buffer
Magnesium chloride RPI M24000-500.0 For kinase reaction buffer
Glycerol RPI G22020-4000.0 For kinase reaction buffer
5'-ATP Promega E6011 Kinase substrate
[γ-32P]-5'-ATP Perkin Elmer NEG002Z250UC  6,000 Ci/mmol
96-well dot blot apparatus Bio-rad 1706545 For spotting reactions
Nitrocellulose Whatman 32-10401396-PK For spotting reactions
Ponceau S Sigma aldrich P3504-50G For staining nitrocellulose

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stock, A. M., Robinson, V. L., Goudreau, P. N. Two-component signal transduction. Annu. Rev. Biochem. 69, 183-215 (2000).
  2. Jung, K., Fried, L., Behr, S., Heermann, R. Histidine kinases and response regulators in networks. Curr. Opin. Microbiol. 15, (2), 118-124 (2012).
  3. Parkinson, J. S., Kofoid, E. C. Communication modules in bacterial signaling proteins. Annu. Rev. Genet. 26, 71-112 (1992).
  4. Laub, M. T., Biondi, E. G., Skerker, J. M. Phosphotransfer profiling: systematic mapping of two-component signal transduction pathways and phosphorelays. Methods Enzymol. 423, 531-548 (2007).
  5. Ronson, C. W., Nixon, B. T., Ausubel, F. M. Conserved domains in bacterial regulatory proteins that respond to environmental stimuli. Cell. 49, (5), 579-581 (1987).
  6. Szurmant, H., Bu, L., Brooks, C. L., Hoch, J. A. An essential sensor histidine kinase controlled by transmembrane helix interactions with its auxiliary proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, (15), 5891-5896 (2008).
  7. Price, M. S., Chao, L. Y., Marletta, M. A. Shewanella oneidensis MR-1 H-NOX regulation of a histidine kinase by nitric oxide. Biochemistry. 46, (48), 13677-13683 (2007).
  8. Zhulin, I. B. The superfamily of chemotaxis transducers: from physiology to genomics and back. Adv. Microb. Physiol. 45, 157-198 (2001).
  9. Robinson, V. L., Buckler, D. R., Stock, A. M. A tale of two components: a novel kinase and a regulatory switch. Nature Struct. Biol. 7, (8), 626-633 (2000).
  10. Attwood, P. V., Piggott, M. J., Zu, X. L., Besant, P. G. Focus on phosphohistidine. Amino acids. 32, (1), 145-156 (2007).
  11. Kee, J. -M., Muir, T. W. Chasing phosphohistidine, an elusive sibling in the phosphoamino acid family. ACS Chem. Biol. 7, (1), 44-51 (2012).
  12. Tawa, P., Stewart, R. C. Kinetics of CheA Autophosphorylation and Dephosphorylation Reactions. Biochemistry. 33, (25), 7917-7924 (1994).
  13. Marina, A., Mott, C., Auyzenberg, A., Hendrickson, W. A., Waldburger, C. D. Structural and mutational analysis of the PhoQ histidine kinase catalytic domain. Insight into the reaction mechanism. J. Biol. Chem. 276, (44), 41182-41190 (2001).
  14. Fuhs, S. R., et al. Monoclonal 1- and 3-Phosphohistidine Antibodies: New Tools to Study Histidine Phosphorylation. Cell. 162, (1), 198-210 (2015).
  15. Ueno, T. B., Johnson, R. A., Boon, E. M. Optimized assay for the quantification of histidine kinase autophosphorylation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 465, (3), 331-337 (2015).
  16. Bradford, M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 7, (72), 248-254 (1976).
  17. Stoscheck, C. M. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).
  18. Funt, B. L., Hetherington, A. Scintillation counting of beta activity on filter paper. Science. 131, (3413), 1608-1609 (1960).
  19. Bem, E. M., Bem, H., Reimchüssel, W. Determination of phosphorus-32 and calcium-45 in biological samples by Čerenkov and liquid scintillation counting. Int. J. Appl. Radiat. Isot. 31, (6), 371-374 (1980).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics