大規模な再建と選択的集団のニューロンを分類するために形態学的指標に基づいて独立、不偏クラスタリング

Neuroscience

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Summary

このプロトコルは、選択的ニューロン集団の大規模な再構成を説明し、蛍光マーカーを発現する修正された狂犬病ウイルス、および独立した、公平なクラスタとラベルされた次の逆行性感染症は、それが明確なニューロンのサブクラス間の形態学的評価指標の包括的な特性評価を可能に分析します。

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Bragg, E. M., Briggs, F. Large-scale Reconstructions and Independent, Unbiased Clustering Based on Morphological Metrics to Classify Neurons in Selective Populations. J. Vis. Exp. (120), e55133, doi:10.3791/55133 (2017).

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Abstract

このプロトコルは、独立した公正なクラスタリングの使用と組み合わせニューロンの大規模な再構成を概説し、選択的ニューロン集団の間で観察された形態学的特徴の総合的な調査を作成するために分析します。これらの技術の組み合わせは、神経解剖学的データの収集と分析のための新規なアプローチを構成しています。一緒に、これらの技術は、大規模を可能にし、したがって、より包括的、選択的ニューロン集団のサンプリングと集団内の形態学的にユニークなニューロンのクラスを記述するための公平な定量的な方法を確立します。

プロトコルは、選択的ニューロンを標識するための修正された狂犬病ウイルスの使用を概説します。 G-削除された狂犬病ウイルスは、目的の標的脳構造に定位注射後の逆行性トレーサーのように機能し、神経細胞におけるEGFPの送達および発現のための車両として機能します。ニューロンの数が多いと、これを使用して感染しています技術および個々のニューロンの「ゴルジ様」完全な塗りつぶしを生産、彼らの樹状突起全体にGFPを発現します。したがって、ウイルス媒介逆行性トレーシング法は、完全な細胞内の塗りつぶしを生成することによって、従来の染料ベースの逆行トレース技術に改良を加えます。

研究下の脳領域の全領域に及ぶ個々のウェルに単離されたニューロンは、ニューロンの代表的なサンプルを得るために、再構成のために選択されます。プロトコルは、細胞体を再構築し、複数の組織切片にまたがるラベルされたニューロンの樹状突起樹枝状のパターンを完了するための手順の概要を説明します。脳構造内の各ニューロンの位置を含む形態学的データは、さらなる分析のために抽出されます。標準のプログラミング機能は、独立したクラスター分析し、形態学的指標に基づいて、クラスタの評価を行うために利用されました。クラスタ分析perfoのこれらの分析の有用性、統計的評価を確認するにはマカクザルの視床(TRN)の視床網様核に再構成された160のニューロンに行われたrmed。元のクラスター分析とここで行われる統計的評価の両方がTRNニューロンは3亜集団、ユニークな形態学的特性を持つそれぞれに分離されていることを示しています。

Introduction

神経解剖学は、神経科学1の基盤の一つであり、「connectomics」の最近の関心は、ニューロン集団および特定のニューロン2との間の接続の形態的多様性を理解するための熱意をリニューアルしました。標識するための方法および復元ニューロンが大きく、遺伝的およびウイルス媒介回路トレースを含む最近の技術革新と改善しているニューロン集団5のより包括的な形態学的調査を可能にする、3、4近づきます。個々のニューロンを標識の改善に加えて、定量的なデータ分析技術はまた、それは形態学的データ5、6に基づいて個別の亜集団にニューロンの独立した公正な分類を可能に浮上しています。これらの公平の技術は、よりtraditiona時に改善されています一世紀以上にわたって分野における標準をされているリットル定性的な分類方法。本研究の目的は、アウトラインステップバイステップすることで、選択的な集団内のニューロンのウイルス媒介標識の組み合わせは、これらのニューロンの包括的なサンプル、および定量的なデータ分析の大規模な再構成が持つ独立したクラスタリングに基づきます統計的評価。これらの方法を組み合わせることにより、我々は包括的サンプリングと選択的ニューロン集団内の形態学的にユニークな神経細胞の種類の公平な分類を容易にするために、神経解剖学データの収集と分析に向けた新たなアプローチを概説します。

これらの方法の一例として、我々はマカクザルの視床網様核(TRN)の単一のセクタ内のニューロンの大集団の我々の分析について説明します。これらのデータは、以前の研究7からのものです。選択的背Lateraのに突出したTRNニューロンを標識するための方法EGFP 4、8コードする改変狂犬病ウイルスの外科的注入を使用して視床(dLGN)のリットルの膝状核が概説されている( 具体的な材料/設備 、行2 の表を参照てください)。この修正された狂犬病ウイルスは、ウイルスのトランスシナプスの動きを排除する必須のコートタンパク質をコードする遺伝子を欠いています。ウイルスが注射部位での軸索終末に入ると、それは、感染したニューロン5、9、10の完全な樹状樹枝状全体でEGFPの発現を駆動する重要な利点を持つ伝統的な逆行性トレーサーのような役割を果たします。従って、このG欠失狂犬病ウイルスは、選択的に注入し、逆行性輸送、次のいずれかのニューロン集団に感染し、標識するために使用することができます。

特定のニューロン集団の総合的な分析を行うために、それからサンプリングすることが重要です集団内のニューロンの広い分布。ウイルス媒介性標識技術は、完全な細胞内に生成するので、「ゴルジ様」は、ウイルス注射部位における軸索を有する多くのニューロンの充填は、脳構造の完全な範囲内でのニューロンの非常に大きなサンプルを再構成することが可能です。修正された狂犬病ウイルスが感染したニューロンの多数の標識に非常に効果的であるため、また、動物あたりのニューロンの数百を再構成することが可能です。 dLGN投射TRNニューロンの総合的なサンプルを生成するために、TRN 11の視覚的なセクター全体で160ニューロンをサンプリングするための手順が概説されています。顕微鏡、カメラ、および再構成ソフトウェアを含むニューロンの再構成システムを使用して個々のニューロンを再構成する過程を説明します。また(TRN内この場合)脳構造内の個々のニューロンの位置を決定し、ウイルス注入SITを検証する方法が記載さ体積輪郭再構成を使用して(dLGN内でこの場合)構造内の電子の量と場所。形態学的データをエクスポートして、独立したクラスタが各ニューロンのために測定された形態学的評価指標に基づいて分析を実行する手順の概要は次のとおりです。クラスタリング手法には限界がありますし、利用可能な異なるクラスタリングアルゴリズムの様々なもあります。したがって、これらのオプションは、より一般的に使用されるアルゴリズムのいくつかの利点が記載されています。クラスター分析は、クラスタの一意の統計的な検証を提供していません。そのため、追加の手順が最適なクラスタリングだけでなく、クラスタ内および全体の形態学的データ間の関係を確認するために概説されています。そのTRNニューロンを確認するために、TRNデータセットのクラスタを評価するための統計的方法が記載されている10の独立した形態学的指標に基づいて、3つのユニークなクラスタにグループ化されています。

このように、選択的に標識するための手順を概説することにより、、再構築、および特定のニューロン集団から形態学的データを分析し、我々は集団内のニューロン間の形態学的差異を定量化するための方法が記載されています。マカクザルのTRNの視覚的なセクタ内の異なるニューロンタイプの前の調査結果は、別の統計的評価法で確認されています。一緒に、我々は、これらの技術は神経解剖学的データセットに広く適用することと脳を介してニューロン集団の多様性の定量的な分類を確立するのに役立ちます願っています。

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Protocol

注:この研究で調べた組織を別の研究5の一部のように調製しました。したがって、動物の使用を含む実験方法の全ては、ブリッグスの実験方法の節に詳細に記載されています (2016年)。前の研究の一環として行われ、動物に関わるすべての手順は、施設内動物管理使用委員会によって承認されました。 2 - dLGNへのウイルスの注入および脳組織の組織学的処理のための手順は、セクション1で簡単に説明されています。

1.定位注射

  1. 無菌技術を用いて、無菌環境内のすべての外科的処置を実行します。オートクレーブ内のすべての金属手術器具、ガーゼやドレープ材料を蒸気滅菌します。化学滅菌( 例えば 、酸化エチレン)を使用した蒸気によって損傷する可能性のあるすべての材料を滅菌します。
  2. 動物 - とpに応じて麻酔を誘導し、維持rotocol固有の要件。
    1. サルにおけるウイルス注射のために、ケタミン(10mg / kgの)で麻酔を誘導し、イソフルランとの完全な外科的麻酔下で動物を維持- CO 2の有効期限が切れ監視(1〜3%が酸素で吸入)、EKG、呼吸数、および温度が継続的かつ定期的にチェックしますジョートーンのための適切な麻酔深度を確保します。
  3. ヘッド位置を安定させるために、関心の注入構造体( 例えば dLGN)を検索するための定位座標の使用を可能にするために、定位フレームに動物を置きます。視覚的な応答を測定する場合は、場所の目は(そうでなければ、生理食塩水点眼剤、瞳孔拡張が望まれる場合には1%アトロピン点眼剤)が低下した後、両眼のコンタクトレンズは、乾燥を防ぐために。視覚的な応答を測定されていない場合、目に眼軟膏を配置します。
  4. 正中頭皮切開を行い、皮膚や筋肉を撤回。
  5. 1 hemisphへの関心の構造(dLGN)のための定位座標によれば、ERE、小開頭術を行います。
  6. 徐々に脳内に開頭を介して記録電極( 例えば 、タングステンまたは白金/イリジウム電極を( 特定の材料/機器の表 、行3を参照)を手動で配置されているマイクロマニピュレーターにクランプ)を下げます。所望であれば、低インピーダンス(<1MΩ)とわずかに厚い(〜250μmの直径)の電極は、硬膜を貫通するために利用することができます。
  7. 皮質表面および視覚的応答が測定された時点でのマニピュレータの位置を記録します。視覚応答が聞こえる、光に時間ロックされたニューロンの応答は、検眼鏡や小さなLED /懐中電灯で目に光りました。
  8. 視覚応答の開始、中間、終了時にマニピュレータの位置に注目し、これらの値から、皮質表面の位置を減算することによりdLGNの位置および厚さを決定します。 dLGN内の各設計注射部位のための深さを記録します。
    注:同様の。手順解像度は、適切な感覚刺激を使用して、非視覚的な構造を配置するために使用することができます。さらに、結合された記録/噴射システムはまた、小さな脳構造を標的化するために使用することができます。
  9. 最適噴射位置が記載されていたら、浅に最も深い注射部位と進むから始まる、各注入のための適切な深さに記録電極を削除し、同じ定位位置にインジェクションピペット(ガラスピペットまたは注射器)を配置し、下電極の位置を変更する前に注入した後、少なくとも1分間待っています。 50ミクロン〜の外径を有するガラスピペットは、シリンジのヒント(〜直径200μm)に比べてウイルスの逆流を減少させることができます。
  10. (複数にわたる修正された狂犬病ウイルスの3 - ; - (注射手順については、製造元の説明書を参照してください5μL1)噴射システムを、少量を注入、picospritzer、またはシリンジポンプ( 具体的な材料/ Equipmenのトン、4行目の表を参照)を使用して10)の深さをターゲット構造(dLGN)内〜100 NL /分の速度で。注:個別の噴射貫通部は、より大きな標的構造( 例えば、サルdLGN)で作製することができます。ターゲット構造のサイズに応じて、総注入量を調整します。
  11. インジェクションピペットを後退させる前に、少なくとも5分を一時停止します。注入用ピペットが除去されると、その後、一緒に戻って、筋肉と皮膚を縫合、(、所定の位置に接着剤の骨片を骨ワックスまたはゲルフォームを適用)保護材との開頭術を埋めます。
  12. 手術前の最後に鎮痛薬( 例えば 、ケトプロフェン)および抗生物質を投与し、動物が歩行可能になるまで継続的に動物を監視します。
  13. 少なくとも3日間と手術後10日まで、縫合糸は、清潔で乾燥し、無傷であり、動物が痛みや不快感の兆候を示していないことを確認するために毎日動物を監視します。必要に応じて、毎日の鎮痛剤と抗生物質を管理します。動物は完全に手術から回復した後、手術後の動物の社会住宅を開始します。
  14. </ OL>

    2.組織の収穫、セクショニングと染色

    1. 14日、ウイルスの逆行性輸送のために、その後、0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水、4%パラホルムアルデヒド、10%スクロースと、その後4%パラホルムアルデヒドで経動物を安楽死溶液( 例えば Euthasol)の過剰投与により動物を安楽死させると灌流- 7を許可します。
    2. 2日- 1のために0.1 Mリン酸バッファーをして冷蔵庫で4%パラホルムアルデヒドで30%スクロース-脳(齧歯類モデルにおける類似のステップのための12を参照)、20内の場所を削除してください。
    3. 脳は、容器の底に沈んでいるときは、それを削除し、逆行性標識されたニューロン( 例えば視覚皮質)と注入ターゲット構造( 例えば dLGN)で脳の領域を含むブロックに組織を切断します。非注射半球からの組織の同じブロックをカット - これらは、制御部として機能します。最良の結果を得るために、immediatel組織学的手順を開始たての切片組織上のy。
    4. 凍結ミクロトームを使用して、セクションごと50μmの厚さで冠状断面組織( 特定の材料/機器の表 、行5を参照してください)。
    5. 皮質層および皮質下構造13を可視化する-チトクロームオキシダーゼ活性のためのすべてのセクションを染色(8 特定材料/設備 、行5 の表を参照てください)。注:セクションは、チトクロームオキシダーゼ染色以下の最終すすぎで冷蔵庫で一晩保存することができます。
    6. GFPに対する一次抗体を用いてすべてのセクションにラベルを付ける(1:1,000希釈、〜12時間インキュベーション; 特定の材料/機器の表を参照して 、行9)プライマリホストに一致する二次抗体とビオチン5でタグ付けされた(1:500希釈、2から4時間のインキュベーション; 特定の材料/機器の表 、行10)を参照してください。二次抗体に一晩セクションをインキュベートすることをお勧めします。
    7. アビジン/ビオチン複合体とラベルのセクションでは、その後、永久的にすべての標識ニューロン5を染色するDABおよび過酸化物と反応します。
    8. 下塗りスライドガラス上にセクションをマウントし、一晩乾燥してみましょう。
    9. アルコールやキシレンのシリーズを使用して、脱脂のセクションでは、その後、スリップ14をカバーリンス。

    3.神経再建

    注:元の実験のためのすべての再構成は、顕微鏡で構成されたニューロンの再構成システムを使用して行われたが、接続されたカメラ(13行、 特定の材料/機器の表を参照)、および再構築ソフトウェアを(14行、 特定の材料/機器の表を参照てください)パッケージには、( - 12 具体的な材料/機器 、行11 の表を参照てください)。ソフトウェアアシスト神経再建は、神経突起のコンピュータベースの図面を重ね組織スライドの可視化を可能にします。重要なことは、ソフトウェアは、形態学的reconstrucをデジタル化位置特異的形態学的情報の抽出を可能にする3次元でるデータ。関連データ抽出プログラムは、( 特定の材料/機器 、行12 の表を参照)、各保存された復興から形態学的データの豊富なセットの抽出を可能にします。

    1. 顕微鏡のスライドホルダーにスライドを配置し、低倍率の対物レンズ( 例えば 2倍または10倍)を用いて目的の単一のセクションに焦点を当てます。カメラ画像が適切にカメラのシャッターを配置することによって、ソフトウェアのビューに表示されていることを確認します。
    2. 明確できるだけ樹状樹枝状のできるだけ多くを再構築するように合理的に隔離されている関心の脳構造( 例えば TRN)内のラベルされたニューロンを選択してください。細胞体が完全に各セル本体の最大範囲をキャプチャし、正確にその面積や真円度を推定するために、単一のセクション内であれば、優先的にニューロンを選択します。セルBを識別するために、10X顕微鏡対物レンズを使用ホームセクションでODY。
    3. よく染色された、よく分離されたニューロンが識別されると、「新規セクション」ボタンをクリックして課長に細胞体を含む「ホーム」セクションを追加します。含めるセクションの番号を入力します( - を開始するために3つのセクション2をお勧めします)。プロンプトが表示されたら、50μmの切片厚を割り当てる(ステップ2.3を参照)。
    4. 細胞体を含む家庭のセクションに関連する脳構造の輪郭をトレースします。輪郭追跡のための2X目的/倍率を使用してください。
      1. まず、上部のツールバーのドロップダウンメニューから「輪郭」を選択し、ドロップダウンメニュー( 例えば 「LGN」または「TRN」)からの輪郭の種類を選択します。
      2. ドローツールとしてマウスを使用して、輪郭に沿ってポイントをクリックすることで、必要に応じて、ターゲット構造( 例えば TRN)だけでなく、隣接する構造体の輪郭をトレースします。
      3. マウスを右クリックして、このオプションを選択して「閉じる輪郭」を選択メニューからトレースされた各輪郭を完了し、同封します。
    5. 右側のツールバー上に所望のマーカー記号をクリックし、その場所にマーカーを配置することが復興に目的の場所をクリックすることで、ターゲット構造の中心にマーカーを配置。すべての再建における標的構造の中心をマークするためのマーカーの同じタイプを使用してください。
    6. 60X対物/倍率 - 輪郭が完了したら、40を使用して細胞体の輪郭をトレースします。これを行うには、まず上部のツールバーのドロップダウンメニューから「ニューロン」を選択し、この場合、「セルボディ」で、トレースするニューロン構造を選択します。次に3.4のように細胞体をトレースします。
    7. 3.5に記載されている手順に従って、細胞体の中心に異なるスタイルのマーカーを配置します。
    8. 細胞体から始まるすべての樹状突起をトレースします。
      1. まず、ドロップダウンメニューから「デンドライト」を選択します。その後、細胞BODで始まる各樹状突起をトレースyおよびドローツールとしてマウスを使用。正確にデンドライトの角度と方向を捕捉するために、トレース全体にZ深度を調整してください。
      2. マウスを右クリックし、ドロップダウンメニューから「分岐ノード」または「Trifurcatingノード」を選択することにより、樹状突起に沿って各分岐点にノードを配置します。 60X客観的/すべての樹状突起の再構成のための倍率 - 40を使用してください。
      3. 各デンドライトの終わりには、マウスを右クリックし、ドロップダウンメニューから「終了」を選択します。
    9. 隣接するセクションに続行し、顕微鏡画像内の適切なZ深度で焦点にこれらをもたらす可能性がある樹状終末を識別します。このような顕微鏡画像内の血管または容易に認識デンドライトパターンやバンドルなどの近くの主要なランドマークが含まれます。
      1. (最大のランドマークの可視化を可能に倍率を選択)顕微鏡で20Xや10Xの倍率を削減し、取りますデジタルカメラを使用した顕微鏡画像の画像( 例えば 、携帯電話、タブレット)コンピュータ画面に手持ち。
    10. スライド上の隣接するセクションに移動し、新しいセクションでdLGNとTRNの境界を使用して、以前にトレースされた部分の輪郭をラインアップ。
    11. (輪郭および主要なランドマークに基づいて)細胞体の一般的な領域に視野を返し、バック最大10倍を持って来る - 20X。
    12. 新しいセクションにおける樹状突起の始まりと語尾を整列させるのを助けるために、以前にトレースされたセクションからのデンドライト語尾の写真を使用してください。
      1. トレースを回転させると再構成を選択するには、矢印ツールを使用し、樹状突起を配置することを移動するには、右クリックし、ドロップダウンメニューから「移動」を選択します。
      2. あるいは、初めに樹状語尾に一致するように「一致」ツールを使用します。上部のツールバーからマッチツールを選択し、プロンプトが表示されたら、終了をクリックしてください復興と画像の対応継続点インチ3以上の語尾について、この手順を繰り返します。
    13. 前節からのトレースが新しいセクションの樹状突起と整列されると、対応する新しいセクションが現在のセクションをクリックして課長に選択されていることを確認。 3.3で説明したように、または、それに応じて家庭セクションにそれぞれの新しいセクション相対のz深さと位置を調整し、50ミリメートル(ステップ2.3参照)に各セクションの厚さを設定し、セクションマネージャーに新しいセクションを追加します。
    14. 40に倍率を増加 - 60X、その後のようなマウスを使用してデンドライトをトレースし、再建からの樹状突起の端にマウスを右クリックし、ドロップダウンメニューから「エンディングに追加」を選択することで、樹状突起継続をトレースツールを描きます。継続は新しいセクションであるかどうかを指定するには、プロンプトに従います。
    15. の両側に(少なくとも3隣接するセクションを介して1を樹状突起に従ってください3.15 - 手順3.8以下のホーム項)。少なくとも3総セクションは、ニューロンまたは樹状突起は、もはや続くか見つけることができるようになるまでトレースされるまで、復興に追加します。必要であれば、上記の手順を実行し、隣接するセクションの輪郭をトレースします。

    4.独立したクラスタリング

    注:独立したクラスタは、他の可視化と、重要なのは、形態的多様性の定量的評価を提供することは困難かもしれない大、多次元データセットの公平な分析を可能に分析します。マトリックスベースのプログラミングプラットフォームは、多次元データセットの分析に非常に有用であり、高度なデータ操作および統計分析を可能にします。ステップ4に記載されている機能- 6は、 特定の材料/機器の表に記載されているプログラミングプラットフォーム、行15で定義されています。

    1. 内線を使用して、各個々の神経細胞の復興から形態学的データを抽出しますニューロン再構成システムに関連付けられているractionプログラム(行11、 具体的な材料/機器の表を参照てください- 12)。
      1. 輪郭情報、マーカ情報、細胞体と樹状樹枝状などの形態学的データ:まず、を含む、各再建のための所望の形態学的データを選択します。
      2. 上部のツールバーの[編集]ドロップダウンメニューから、「すべてのオブジェクトを選択」を選択します。その後、上部のツールバーに分析ドロップダウンメニューから「分岐構造解析」を選択し、各タブをクリックし、各タブで目的の分析オプションを選択します。
      3. 分析ウィンドウで「OK」ボタンをクリックすることで、すべての所望のデータを抽出し、出力ウィンドウを右クリックして、スプレッドシート形式で保存し、「Excelへのエクスポート」を選択します。
    2. マスタースプレッドシートをコンパイルします( 具体的な材料/機器の表 、行16を参照)、各形態学的変数/私れますTRICは、ニューロンごとに単一の数値の観測で表されます。このマスタースプレッドシートでは、各ニューロンのための行識別子を記録しておきます。
    3. クラスター分析に含まれるすべての変数( 例えば 、形態学的指標は)互いに独立していることを確認します。例えば、ノードの数は、樹状または軸索樹枝状に支店の数と相関します。したがって、この2つの変数のうちの1つのみが、クラスタ分析に含まれるべきです。
    4. 、各測定値はすべての変数の観測が含まれていることを確認し、各ニューロン(測定)、すなわち 、各形態素メトリック(変数)に対応するデータ点(観測)を持っている必要があります。特定の変数の観測値(例えば、軸索の長さ)は、ニューロンのサブセットに対して不足している場合、この変数(軸索の長さ)は、クラスター分析に含めることができません。
    5. 各行はニューロンとEACを表す、単一の行列にマスタースプレッドシート上のデータを整理します時間列には、各形態素メトリック( 図1)の数値データが含まれています。例えば、100ニューロンを含むデータセットは、100×5(行ごとの列)の行列によって表現される5つの独立変数の観測値があります。マトリックス内に各ニューロンのための任意の識別情報を含める必要はありません - 行インデックスは、各ニューロンの一意の識別子として機能します。また、マトリックス内にギャップまたは「NaNの「Sがあってはなりません。単一の変数として行列を保存します( 例:データ= [100×5行列]; 補足コードは、サンプルコードのファイルを参照してください)。
    6. nは変数の数によって定義されるn次元空間内の個々のニューロンを表す点の間の距離を計算するためのアルゴリズムを選択します。 「PDIST '関数は、間ニューロンの距離を計算する際の柔軟性を可能にします。デフォルトの距離の計算はユークリッド距離であり、神経morphologicaの同様の分析のために以前に使用されていますリットルデータ5、6。
    7. 間、ニューロン」PDIST '関数の出力を距離に、クラスターを形成するために'結合」関数を使用します。ここでも、複数のクラスタリング・オプションが利用可能です。ウォード法と重心距離が形態学的データセット5、6の分析でも同様の結果が得られています。
    8. 必要であれば、「PDIST」と「連携」機能に代わるクラスタリング手法として「関数kmeans」関数を使用します。 「関数kmeansは 'との間のニューロンの距離を計算し、次にクラスタを割り当てるには重心距離に乗ユークリッド距離を採用しています。
    9. 階層的クラスタツリーを可視化するために、「連携」操作の出力に「樹状図」関数を使用します。この関数は、30の測定値に可視化を制限するデフォルト設定がありますが、測定値の数を指定することで上書きすることができます(<em>の例えばニューロン)が表示されます。樹状図は、x軸上での行インデックスによって識別されたニューロンの各々のためのy軸上の結合距離を示します。
      注:「リンケージ」と「樹状図」の出力は、クラスターの最適数を定義しません。 「関数kmeans 'の出力は、クラスタに測定値を割り当てるんが、これらのクラスターが最適であるかどうかをテストするものではありません。別個の統計的比較と最適なクラスタリングの検証(以下を参照)を行うことができます。

    クラスタリングの5.検証

    注:上記のように、クラスタ分析そのものが直接クラスタ樹形図に示されているクラスタがユニークで、サンプルの代表的なものであるかどうかの統計的評価を提供していません。樹状図からクラスタを検証するための方法は、しかし、これらは、最適なクラスタリングの統計的な検証を提供しない、15を提案されています。 multiがあります。最適なクラスタ化を検証するためのPLE方法。

    1. 方法1:評価クラスタリング:
      1. このような「関数kmeans 'または'結合」としてクラスタを計算するために使用される方法を指定する「evalclusters」機能を使用してください。ガウス混合モデル出力も評価することができます(以下のステップ5.2を参照してください。 補足コードは、サンプルコードのファイルを参照してください)。
      2. オプションの数から評価基準を指定します( たとえば、 'CalinskiHarabasz' -基準オプションについては、[ヘルプ]メニューを参照して、「evalclusters」を検索)。
      3. ([1:6] 例えば、1、2、3、4、5、または6クラスタが最適であるかどうかをテストするために)試験に最適なクラスタ番号の範囲を指定します。
        注:「evalclusters 'の出力は、指定されたクラスタリングアルゴリズムおよび基準を与えられたクラスターの最適数です。
    2. 方法2:ガウス混合モデルクラスタリング:
      注:ガウス混合モデルクラスタリングALGORithms(遺伝子組換え微生物は)自分自身の平均と共分散とそれぞれ、各変数の観測が各推定クラスタを定義するガウス分布の混合物から来ることを想定しています。 GMMは、その後、特定のクラスタ16に属する確率を示す、各測定に事後確率を割り当てるためにEMアルゴリズムを使用しています。
      1. データにおいて観察クラスタの推定数を入力することにより、「fitgmdist」機能を使用してGMMを実装します。また、クラスタ数の先験的割り当てを避けるために、ここで説明する手順を使用して、異なる最適なクラスタ番号、一連の主成分分析(PCA)を使用します( 補足コードは、サンプルコードのファイルを参照してください)。
      2. 元のデータ行列に「PCA」機能を使用して、出力として主成分得点を保存します。
      3. ループ1から始まると推定される最適なクラスタの一部の数を通過するには、目を使います主成分スコア上のE 'fitgmdist」機能と推定される最適なクラスタ数ごとのGMMを生成します。
      4. 負の対数尤度、赤池の情報量基準、およびベイズ情報量規準を調べることによって、各GMMを評価します。最低基準にGMMが最適です。
      5. 所望の場合、クラスタの数が(各クラスタの手段は、各GMMの「ミュー」出力に格納されている)が最適である場合、各クラスタの平均値が有意に異なるかどうかをテストします。

    クラスタ化されたデータの6.統計解析

    1. クラスターの最適数は、階層的クラスタリングを用いて測定し、評価されると、クラスタに元のデータ、別々のニューロンに戻り、形態学的指標はユニークなクラスにニューロンのクラスタリングに寄与するかを決定します。
    2. ニューロンは、クラスタの割り当てに応じてグループ化されているように、元の形態学的メトリックデータをソートします。 、(すべてのニューロンのためまたはクラスターに分けニューロンのための)ニューロン全体の形態学的データ間の関係を調べ、線形回帰を実行するには、形態学的メトリック観測の2位と3ウェイの比較にフィットします。これらのフィットは、「フィット」機能を使用して推定し、フィット出力の良さは、回帰フィットのためにR 2およびp値が含まれている「fitlm」機能を使用して評価することができます。
    3. 各クラスタ内のニューロン間の統計的関係を調べるために、クラスタの数に応じて、ノンパラメトリック二サンプル(ウィルコクソン順位和検定)、または複数のサンプルの比較試験(ANOVA)を使用します。重要なことは、複数のサンプルANOVAをの使用は、p値は多重比較のために補正されることが保証されます。

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Representative Results

我々は、選択的な集団内のニューロンの大規模な再構成がdLGN 5に変更狂犬病ウイルスの注射後可能であることが以前に示されています。最近では、同じ組織はTRNの視覚的なセクターで160ニューロンを再構築するために利用された(ブラッグ 、レビューで; 図2A-B)上記の詳細な方法論的手順以下。 TRNの研究において、TRNニューロンの3つの固有のクラスタは、独立10形態学的指標のクラスタ分析に基づいて同定した:細胞体領域、細胞体の真円度、TRN内TRN、背腹位置の中心に内外の相対位置、樹状突起の数、ノードへの平均樹状距離、 第3の平均長および高次樹状突起、1次樹状突起の平均角度、総樹状樹枝状の平均位相角、およびへの角度偏差タル樹状樹枝状分岐。 TRNのニューロンは、等価的に、これらの3つのクラスター( 図2C)に分散させました。 3つのクラスター内のニューロン全体のすべての10の形態学的評価指標の個別の統計的な比較は、元のクラスタ分析に含ま形態学的評価指標のすべてが、2つのためのクラスタ間で統計的に有意な差が得られました。このように、クラスター分析( 図2C)とクラスタ間の形態学的評価指標の個別の統計的比較から生成された階層ツリー樹形図に基づいて、TRNのニューロンは、3つのユニークなグループに分類されます。

本研究では、具体的に別々にクラスター分析を用いて決定クラスタを評価するための統計的手法を適用したかったです。先行研究からのTRNデータセットが観察された3つのクラスタが最適であったかどうかを決定するために評価しました。独立した追加のクラスタは、すなわちPCAとGMM CLUSを分析します結は、従来のクラスタリング方法( 図1)を確認するために行きました。 3つの重要な成果は、個別に先立ってクラスター分析を確認します。元のクラスタ分析方法は、クラスタを生成するために、「結合」機能を指定する「evalclusters」機能を使用して評価した場合、まず、クラスタの最適数は、階層ツリーの系統樹( 図2C)に基づいて、元の結論と一致する、3でした。第二に、PCAは、形態学的指標の寄与に基づいて、ニューロンをグループ化する別の手段として、160 TRNニューロン10の形態学的指標の元のデータマトリックスで行いました。三つの遺伝子組換え微生物は、TRNニューロンは1、2、または3つのユニークなクラスターに分類したと仮定すると、生成されました。負の対数尤度(NLL)と赤池の情報量基準(AIC)は、最低が得られ、そのため最も有益な、価値観やGMMはTRN形態学的データを記述するために3つのクラスタを使用した場合、両方の値が最適であった(FigurE 3)。第三に、GMMベースのクラスタリングは、別途「evalclusters」機能を使用して評価し、最適なクラスタ数は、神経細胞全体の形態学的評価指標の統計的な比較は3つのクラスタ、PCAとGMM-に分け、階層ツリー樹形図のしたがって3.観測しましたクラスタリング、および各クラスタリング手法(リンケージとGMM)の独立した評価は、すべてのは、TRNのニューロンが最適に利用10形態学的指標に基づいて、3つのクラスタに分割されるのと同じ結果が得られました。

図1
図1: データフォーマット。 (データマトリックス内のヘッダーを含まない)クラスター分析に含める独立変数の総数に対応するニューロンおよびm = 5列の数に対応するn個の行を持つデータ例行列。


2:160 TRNニューロンの独立したクラスタリング。シトクロムオキシダーゼ活性について染色A.左、1動物のdLGNを通じて単一の冠状断面の写真は、dLGN層を視覚化し、GFPに対してウイルス注射を可視化します。矢印は、高密度の逆行性標識されたTRNニューロンの領域を示しています。セクションの向きは以下の背腹/内側-外側(DV / ML)コンパスとスケールバーを次の中のすべてのパネルの500ミクロンを表します。第二に、左から、輪郭は、ウイルス注射(黒輪郭)を含むすべてのセクションのためにdLGN(赤)とTRN(栗色)の概要を説明します。黄色の星は、注射部位の中心を示しています。 Aのように、方向及びスケールバー。のような輪郭と注射部位、方向及びスケールバーの左、3-Dレンダリングからサード。再構築されたの場所の右、地図 TRNニューロンは、クラスタの割り当て(C)単一の集約TRN輪郭内(マルーン)に応じて色分けされました。 Aのように、方向及びスケールバー。 B。左、TRN内でのそれらの内側 - 外側位置に応じて冷却するために暖かい色の5復元されたTRNのニューロンとTRN(黒)とdLGN(グレー)の集合体の輪郭。オリエンテーションAでのDV / MLのコンパスによると、スケールバーは500μmで表します。右、カラーマッチングのスケールバーと同じ5 TRNニューロンの写真は100μmで表します。 C。 10の独立した形態学的指標に基づいて、160復元されたTRNニューロン間の結合距離を示すクラスター分析以下の階層ツリー樹形図。 3つのクラスタには、青、緑、赤で示されています。この図のすべての部分は、ブラッグに含まれる数値と適合されます (審査中)。痩せ細った ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
図3: クラスタ評価。二つの異なる基準値のプロット、負の対数尤度(赤NLL)と赤池の情報量基準1、2、または3つのクラスタを想定した3遺伝子組換え微生物から生成された(AIC、青)。 3つのクラスタを持つ遺伝子組換え微生物は、最低基準値を提供します。

補足コードファイル:Matlabの互換言語で書かれたコード例、PCAとGMMのアプローチを使用して、クラスタの評価に続いて、例えばデータ行列にクラスター分析を実行します。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

神経解剖学の研究では、神経科学とconnectomicsと構造と機能の関係の最近の関心の柱が選択的ニューロン集団の詳細な形態学的特徴付けのために熱意を更新したままです。伝統的に、神経解剖学の研究では、専門家のneuroanatomistsによって定義されたニューロンの形態学的に異なるクラスにニューロンの定性的な分類に依存してきました。ニューロンを再構築し、形態学的データを抽出するための技術の進歩により、公平な方法で、形態学的に異なる神経細胞のクラスを分類するために、より洗練され、定量的なデータ分析方法を利用することが可能になりました。本研究では、ステップバイステップの方法は、1のために概説されている)を選択的にウイルス媒介逆行性標識法を用いて、個々のニューロンの数百を標識します。 2)個々のニューロンの体系的に再構成する何百もの内のニューロンの総合的なので、代表的なサンプルを形成します選択人口; 3)独立したクラスタリングは、形態学的評価指標に基づいて選択的集団内のニューロンの最適なクラスタを決定するために統計的評価と分析します。これらの解析方法は、TRNニューロンの既存のデータセットに異なるクラスタリング手法を適用することによって確認され、我々は、TRNニューロンが最適3形態学的に異なる亜集団にクラスタ化された3つの独立した評価方法に基づいて実証します。

本研究で概説プロトコルの主な利点は、その柔軟性です。 G-削除された狂犬病ウイルスは、標的構造への注入、次の逆行性標識されたニューロンの数百にEGFPの発現を駆動するのに有効でした。同じ狂犬病ウイルス株はマカクザル5、9、(改正でハッセ&ブリッグス、)フェレット、およびげっ歯類7を含む複数種でも同様に効果的です"> 8があるため、修正された狂犬病ウイルスを選択的に標的構造への注射後の神経細胞のいずれかの人口の完全な樹枝状樹枝状のパターンを標識するために利用することができる。DAB /過酸化反応を行ったGFPに対する抗体染色は、これが永久的染色の原因となるためお勧めしますニューロンを標識し、(より長い露光で蛍光標識を漂白)蛍光顕微鏡の助けを借りずに、顕微鏡下で可視化される組織切片を可能にする。しかしながら、他の染色法が利用可能である、および/または所望であれば、蛍光を直接可視化することができる。測定の利点生の蛍光は、異なる蛍光分子の発現を駆動する別のウイルスがニューロンが複数のターゲットの脳構造に突出するかどうかを決定するために、例えば、組み合わせることができることである。さらに、上記の手順は、(例えば、軸索および樹状突起のために)利用可能なすべての形態学的データに適用することができますますます強固なモルフォを有効にしますニューロンの論理的な分類。狂犬病ウイルスの少量も、樹状突起に加えて、軸索の再構成のために有利である可能性がまばら逆行性標識を生成するために注入することができることに留意することも重要です。

本研究で概説分析方法のさらなる利点は、複数の異なるクラスタ化手法を利用して比較することができることです。クラスタ分析の各ステップにおいて、異なるオプションがクラスターを生成する間、ニューロンパラメータ空間における距離だけでなく、異なるアルゴリズムを計算するために利用可能です。さらに、複数の評価方法が利用可能です。代表的な結果のセクションで概説したように、後者は、最適なクラスタリングを確認する手段として特に有用です。フィールドが前方に移動すると、間違いなく、クラスタを生成するための、最適なクラスタリングを評価するための追加のアルゴリズムが利用できるようになります。一緒に、これらの分析方法はインプロしていきます神経解剖学の分野で定量的アプローチをVEのと調査結果の頑健性を高めます。

個々のラベルされたニューロンの理由により、ハンド再構成は、時間がかかり、訓練と経験を必要とし、まだ幾分主観的である神経細胞の再構成の自動化への関心の高まりがあります。コンピュータベースの自動ニューロンの再構成が依然として誤りがちであるため、電子顕微鏡ベースの神経解剖学的データがまだ人々 (実施例17を参照)によって分析します。しかし、自動化された神経細胞の再構成が近い将来に利用できるようになる可能性が高いです。自動化された神経再建は、このようにクラスタリング分析およびフィールドが技術的に前進し続けてここで説明する評価方法はさらに重要になるであろう、データ解析の端にさらに多くの精査が必要になります。

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Disclosures

著者らは、開示することは何もありません。

Acknowledgments

我々は、博士に感謝したいと思います。エド・キャロウェイとマーティUsrey私たちは神経細胞再構成のヘルプのための先行研究とリビーFairlessとShiyuan劉の一部として調製された組織を使用することを可能にするため。ホワイトホール財団:この作品は、NIH(EY018683 NEI)によって賄われていました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SADΔG-EGFP E.M. Callaway Laboratory, Salk Institute Prepared by Dr. F. Osakada. G-deleted rabies virus available through the Salk Institute Viral Core
Recording electrode: platinum/iridium or tungsten FHC UEPSGGSE1N2M Visit website (www.fh-co.com) for alternative order specifications
Nanoject II Drummod Scientific 3-000-204, 110V Alternatives: picospritzer, Hamilton syringe
Freezing microtome Thermo Scientific
DAB Sigma Aldrich D5905-50TAB 3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride, tablet, 10 mg substrate per tablet. Caution: carcinogen - must be bleached before discarding
Cytochrome C Sigma Aldrich C2037-100MG
Catalase Sigma-Aldich C9322-5G
Rabbit anti-GFP Life Technologies/Thermo Fisher #A-11122  Primary antibody
Biotinylated goat anti-rabbit Vector Laboratories #BA-1000 Secondary antibody
Neurolucida System  MicroBrightField Software for neuron tracing and analysis. http://www.mbfbioscience.com/neurolucida
Neurolucida Explorer MicroBrightField Data export software
Microfire Camera  Optronics 2-Megapixel true color microscope camera. http://www.simicroscopes.com/pdfs/microfire.pdf
Nikon E800 Microscope Nikon Instruments Inc. Biological research microscope. http://www.microscopyu.com/museum/eclipseE800.html
Matlab The MathWorks Inc.  Matrix-based computational mathematics software. http://www.mathworks.com
Microsoft Office Excel Microsoft Spreadsheet program

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cajal, S. R. y Histologie du systeme nerveaux de l'homme et des vertebres. Maloine. (1911).
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