Um mouse modelo de fadiga induzida por irradiação periférica

Cancer Research

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Summary

Nós descrevemos um método que utiliza a irradiação periférica direcionada para induzir comportamento à fadiga, como em ratos. A dose de irradiação não letal selecionado leva a uma redução de uma semana em atividade de execução roda voluntária.

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Wolff, B. S., Renner, M. A., Springer, D. A., Saligan, L. N. A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation. J. Vis. Exp. (121), e55145, doi:10.3791/55145 (2017).

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Abstract

A fadiga relacionada ao câncer (CRF) é uma condição angustiante e caro que muitas vezes afeta os pacientes que receberam tratamentos de câncer, incluindo a terapia de radiação. Aqui nós descrevemos um método que utiliza a irradiação periférica direcionada para induzir comportamento à fadiga, como em ratos. Com proteção adequada, a irradiação tem como alvo a região abdominal inferior / pélvica do rato, poupando o cérebro, em um esforço para modelar o tratamento de radiação recebida pelos indivíduos com câncer pélvico. Nós entregamos uma dose de irradiação que é suficiente para induzir comportamento à fadiga, como em ratos, medido pela atividade de execução roda voluntária (VWRA), sem causar morbidade óbvio. Desde roda de corrida é um comportamento normal, voluntária em ratos, a sua utilização deve ter pouco efeito de confusão em outros testes comportamentais ou medidas biológicas. Por isso, roda de corrida pode ser usado como uma medida do resultado viável na compreensão dos correlatos comportamentais e biológicos de fadiga. CRF é uma condição complexa com co frequentemorbidades, e provavelmente tem causas relacionadas tanto ao câncer e seus vários tratamentos. Os métodos descritos neste documento são úteis para investigar mudanças induzidas pela radiação que contribuem para o desenvolvimento de CRF e, mais genericamente, para explorar as redes biológicas que podem explicar o desenvolvimento e persistência de um comportamento perifericamente-acionada, mas centralmente dirigido como fadiga .

Introduction

A fadiga relacionada ao câncer (CRF) é uma condição angustiante e caro que muitas vezes afeta os pacientes que receberam tratamentos de câncer 1. A fadiga é proporcional à actividade nem recente nem aliviada pelo repouso, e que está associada com uma grande variedade de distúrbios relacionados com o humor, a motivação, a atenção, a cognição e 2. As causas biológicas de CRF são desconhecidas, embora tenha sido demonstrado em muitos casos que se correlacionam com níveis de inflamação e citocinas, também, em alguns casos com níveis de hemoglobina e a função de vários sistemas hormonais (ver Saligan et al. 3 para uma revisão de biológico estudos de CRF).

estudos controlados utilizando modelos animais são necessários para entender o comportamento e biologia associada com esta condição complexa. Enquanto 4 ou 5 relacionadas com quimioterapia relacionado com o tumor, 6 gorduraIgue foi estudada em modelos de roedores, a etiologia de CRF pode ser específica do tratamento. Para investigar CRF relacionado com a terapia de radiação, o nosso grupo desenvolveu recentemente um modelo do rato da fadiga induzida por irradiação 7. Em contraste com modelos de CRF existentes que envolvem o cérebro ou irradiação total do corpo 8, 9, este modelo explora como uma mudança no comportamento centralmente-driven, como fadiga, pode ser desencadeada por um procedimento de irradiação perifericamente-alvo.

O procedimento aqui descrito é concebido para modelar a terapia de radiação administrada a doentes com cancro pélvica, usando protecção de chumbo para atingir a parte inferior região abdominal / pélvica com irradiação. No entanto, pela modificação da protecção de chumbo ou a sua colocação em relação aos animais experimentais, este procedimento pode ser adaptado para modelar a irradiação de outras partes do corpo. Voluntária atividade de execução roda (VWRA) é usado para medir a fadiga behavio-likeR; porque é um comportamento voluntário e normal 10, deve permitir o uso concomitante de outros testes comportamentais e biológicos. Nós descobrimos que a irradiação periférica é suficiente para reduzir VWRA em ratos sem causar morbidade ostensiva 7. Experiências futuras com este modelo pode ajudar a revelar os efeitos de irradiação periférica sobre a sinalização imune biológica e outros, bem como as alterações a jusante no sistema nervoso central que podem produzir défices associadas com o CRF.

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Protocol

Declaração de Ética: Este estudo foi aprovado pelo National Institutes of Health (NIH) Animal Care e do Comitê Use. Todos os investigadores que participam no manejo dos animais e medição dos resultados do estudo foram devidamente treinados pelo Gabinete NIH da Animal Care e Use e do National Heart, Lung, and Blood Institute Murino fenotipagem Core. Todos os aspectos de testes em animais, habitação e condições ambientais utilizados neste estudo estavam em conformidade com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório 11.

1. Habitação e animais experimentais

NOTA: Casa do sexo masculino camundongos C57BL / 6 (cerca de cinco semanas de idade no momento da chegada) individualmente ao longo da experiência e fornecer acesso ad libitum a comida e água. Todas as gaiolas são mantidos em um ciclo claro-escuro 12:12 h com a fase de luz a partir das 06:00 e fase escura às 6 da tarde.

  1. Identificar os ratos e atribuí-los a ventilar norma individualgaiolas d mouse. Permitir que 24 horas após o procedimento de identificação para a recuperação.
    NOTA: tatuagem da cauda é recomendada como um meio de identificação para eliminar a possibilidade de que uma marca auricular pode ser pego em uma roda de corrida. Tatuar uma série na cauda de cada ratinho, com o número na cauda correspondente ao número escrito na gaiola do rato.
  2. Permitir que a aclimatar os ratos às suas gaiolas durante pelo menos mais três dias, tratamento de cada rato suavemente durante um período de três minutos por dia.

2. roda Running Aclimatação e Linha de Base

  1. Introduzir os ratos para gaiolas VWRA individuais, cada um equipado com uma roda de corrida conectado a um contador eletrônico para a gravação contínua.
    NOTA: Todos os contadores de rodas conectar a um computador através de uma única interface USB (veja Lista de Materiais). O software calcula o número de rotações das rodas, a distância percorrida e velocidade média em cada intervalo de tempo designado do duratio total especificadon. Uma vez que a gravação é interrompida, os dados são salvos automaticamente tanto como texto e, como planilhas.
  2. Iniciar a gravação de VWRA através da interface do software de computador. Definir intervalos de gravação a uma hora e a duração de pelo menos cinco dias. Continuar a gravar VWRA durante pelo menos cinco dias.
    NOTA: No final da etapa 2.2, todos os ratos devem atingir uma quantidade relativamente consistente de atividade diária roda de corrida. Se não, então identificar e excluir os valores atípicos.
  3. Pare VWRA gravação através da interface do software, e retornar os ratos às suas gaiolas convencionais descritos no passo 1.1 (gaiolas sem correr rodas).
  4. Randomize ratos em qualquer controle sham-irradiado ou grupos irradiados.

3. irradiação

Nota: Execute as seguintes etapas para todos os ratos de ambos os grupos, uma vez por dia durante três dias sequenciais. Tratar os ratos na mesma ordem em cada dia.

  1. Anestesiar cada rato por injeção intraperitoneal deuma mistura de cetamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) mistura.
  2. Confirmar anestesia com uma pitada dedo do pé e usar pomada sobre os olhos para evitar a secura e sob anestesia.
  3. Transferir o mouse anestesiados em um dispositivo de protecção de chumbo. Organizar o mouse na blindagem para que apenas a região abdominal inferior / pélvica é exposto.
    NOTA: A blindagem é composto por duas caixas de chumbo "," com um estreito espaço aberto entre em que permite a exposição às radiações de uma pequena região, alvo do rato (ver Figura 1).
  4. Use fita adesiva médica para fixar a base da cauda do rato em posição dentro da blindagem.
    NOTA: Passo 3.4 é opcional, mas isso pode ajudar a garantir que a posição do mouse não muda durante o passo seguinte.
  5. Transportar o dispositivo de blindagem para o irradiador, garantir que a posição de animais dentro da blindagem é mantida.
  6. Se o mouse está no grupo de irradiação, entregar 800 cGy em um dostaxa e de cerca de 110 cGy / min. Se o mouse está no grupo controle de irradiação simulada, deixe o mouse na irradiador inactivo durante o tempo equivalente.
    NOTA: As configurações irradiadores Optimal dependerá do dispositivo em particular. A taxa de dose de 110 cGy / min entregues a partir de uma fonte de Césio 137 é a taxa de dose central do irradiador usado aqui. O tempo de exposição foi ajustado para atingir a dose total desejada de 800 cGy.
  7. Remover o mouse do irradiador e blindagem, e, em seguida, devolvê-lo ao seu original gaiola, padrão mencionado na etapa 1.1.
  8. monitorar continuamente o rato até que ele recuperou a consciência suficiente para manter decúbito esternal.

4. Medição Fadiga induzida por radiação

  1. No dia após a conclusão de três dias sucessivos de irradiação, transferir os ratos às suas gaiolas individuais VWRA descritos no passo 2.1.
  2. VWRA ficha, tal como descrito na etapa 2.2, excepto aqui definindo a gravaçãoduração a mais de 15 dias. No final dos 15 dias, parar manualmente VWRA gravação através do interface de software.
    NOTA: Os dados de cada período de gravação são salvos automaticamente como planilhas, cada um dos quais inclui as rotação, distância e medições de velocidade para todos os animais (colunas) e em todos os intervalos (linhas) durante toda a duração da gravação. No final da experiência, existem duas folhas de cálculo gerados pelo programa de gravação: uma para o VWRA pré-irradiação, e uma para o VWRA pós-irradiação.

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Representative Results

Três lotes de ratos foram realizadas por meio do protocolo descrito acima. Houve um total de 16 sham e 20 irradiadas (2400 cGy, 3 x 800 / dia cGy) ratinhos. Depois de três dias consecutivos de irradiação, o grupo irradiado apresentaram redução significativamente VWRA comparação com sham (medidas repetidas mistos ANOVA: efeito principal do tratamento de irradiação, F 1,13 = 19,233, p <0,001). O efeito foi significativo para os primeiros sete dias após a irradiação (principais efeitos simples, p <0,05, com correcção de Bonferroni), com a menor distância média VWRA ocorrendo no terceiro dia após a radiação (Figura 2A). Nos dias 25 e 26, não existem dados foram recolhidos devido a outros testes de comportamento.

A Figura 2B mostra a distribuição da mudança na VWRA de antes e depois da irradiação. Enquanto a maioria dos ratos testados apresentaram sintomas de fadiga-like (a i reduçãoN actividade roda Running), houve um pequeno número de ratos que apresentaram pouca alteração ou mesmo um aumento da VWRA (Figura 2B, trama inferior). Devido a essa variabilidade, experimentos com amostras pequenas podem não captar o comportamento de fadiga-like.

figura 1
Figura 1: Chumbo Aparelho Blindagem. A blindagem, que foi desenvolvido in-house, é reunido em duas caixas idênticas. Os ratos são colocados apenas com a sua região pélvica expostos no espaço entre as caixas de chumbo. (A) Uma fotografia da blindagem no seu recipiente. As caixas de chumbo são cercados por espuma de poliestireno para mantê-los na posição, que é cercado por o recipiente de diâmetro plexiglass 10,5 polegadas que foi projetado para o irradiador. (B) Esquema da protecção de chumbo. A protecção de chumbo é composto por blocos de espessura de 1 polegada de ar chumbovariou como duas caixas. Cada caixa é composta por quatro peças: as partes superior e inferior são de 4,25 "x 3" x 1 ", enquanto que as peças laterais são ~ 0,5" x 3 "x 1". Quando montada, as dimensões exteriores de cada caixa são 4,25 "x 3" x 3 ", e há uma uma" lacuna entre eles. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: Diariamente Voluntário Distance Running Wheel. (A) A distância média total de correr por ratos por dia (n = 16 controle, 20 irradiados). Os ratos foram irradiados nos dias 14, 15 e 16. Nos dias 25 e 26, não existem dados foram recolhidos devido a outros testes de comportamento. As barras de erro mostram o erro padrão da média. * P <0,05. (B) Os histogramas da alteração na VWRA, definida aqui como a média da relação Três dias imediatamente antes da irradiação (dias 11 - 13) menos a média das três dias imediatamente após a irradiação (dias 17 - 19). Os números positivos indicam uma redução na VWRA. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Nós descrevemos um protocolo usando irradiação periférica direcionada para induzir uma redução de VWRA em camundongos sem confundir morbidade ou mortalidade. Importante, um dispositivo de blindagem simples permite a irradiação neste protocolo para alvejar uma região desejada de forma consistente, imitando os tratamentos de radiação recebidas por pacientes com câncer pélvico. Em contraste com modelos de CRF existentes que envolvem o cérebro ou irradiação total do corpo 8, 9, este modelo explora como um procedimento de irradiação perifericamente-alvo pode afetar o comportamento da fadiga central-driven. Em nossos resultados representativos, mostramos que a irradiação periférica entregues desta forma é suficiente para produzir comportamento de fadiga-like com uma recuperação completa cerca de uma semana depois.

Como medida de fadiga, VWRA permite uma avaliação simples e objetiva de distância e velocidade durante 24 horas por dia, o que requer um tempo mínimo de treinamento e experiência. É fazeres exigem ratos habitacionais em gaiolas individuais, tornando o espaço instalação de um possível fator limitante. Enquanto habitação individual podem afetar o comportamento do rato, possivelmente levando à ansiedade 12 ou hiperatividade 13, há evidências de que roda de corrida pode reduzir esses efeitos negativos 14. Comportamento roda de funcionamento, também tem sido demonstrado que possuem uma menor variabilidade intra-ratinho e uma maior reprodutibilidade do que as outras avaliações da actividade física 15. No entanto, é possível que o cansaço físico pode ser capturado de forma mais seletiva em outros do que a atividade voluntária maneiras, desde que a atividade voluntária pode depender de motivação ou outros do que a fadiga física estritamente 16 fatores. Outras experiências seriam necessárias para fazer tal determinação.

No entanto, há vários pontos no âmbito do protocolo que são críticos para o sucesso. É importante que os ratinhos são permitidos tempo para recuperamr no momento da chegada de uma nova instalação, e que o tratamento ser realizado durante este período, conforme mencionado. Estes procedimentos reduzir o stress e ansiedade, que pode afetar a atividade voluntária 17. A manutenção de anestesia completa durante o processo de irradiação também é crítico, não só porque sendo constrangida dentro de espaços fechados (a protecção de chumbo) pode ser um estressor significativa para os animais 18, mas também para evitar a exposição desnecessária de outros órgãos / tecidos à irradiação. Por conseguinte, é importante assegurar que a dose do anestésico é adequada para a idade e estirpe de ratinhos antes de iniciar a porção de irradiação deste protocolo. Além disso, a aclimatação de ratos para as rodas de correr para um mínimo de cinco dias é essencial para obter um comportamento estável antes da irradiação e adequados para a análise de dados.

Para solucionar números VWRA incomuns, as gaiolas VWRA devem ser monitorizados regularmente para possíveis problemas. para example, se materiais de cama tornam-se amontoados em ou diretamente abaixo da roda, ou se as rodas de corrida não são suficientemente limpo, isto pode adicionar resistência ao giro da roda e reduzir medições do nível de atividade. Além disso, já que a maioria roda de corrida ocorre durante as horas escuras 7, VWRA podem ser sensíveis às flutuações do ciclo de luz, e os cuidados devem ser tomados para manter os ciclos de luz regular e ininterrupta.

Este protocolo pode acomodar a utilização de diferentes níveis de irradiação. Por exemplo, descrevemos três dias da administração de 800 cGy neste protocolo, mas temos visto níveis ligeiramente mais baixos de fadiga usando três dias de 600 cGy dosagem 7. Os efeitos de uma dose de irradiação em particular irá depender da estirpe de ratinhos 19, a taxa de dosagem do irradiador 20, o fraccionamento ao longo de vários dias 21, e provável que o tamanho da região de exposed debaixo da blindagem. Doses únicas de 1000 cGy de irradiação de todo o corpo têm sido usados em ratinhos C57 / BL6, sem aumento da mortalidade 22, mas devem ser tomadas precauções para assegurar que as doses elevadas de radiação não produzem quaisquer sinais de morbidade.

Além de dosagem de radiação, vários outros passos podem ser modificados para atender a experiência na mão. Ao modificar a protecção de chumbo ou a colocação do animal no interior da blindagem, estes métodos pode ser adaptado para segmentar outras regiões do corpo com irradiação. No entanto, as alterações no dispositivo de blindagem deverá ser validado com dosimetria para assegurar que a irradiação não penetra na zona protegida. Este protocolo pode também ser adaptado para incorporar uma ampla variedade de medidas comportamentais, como actividade de corrida voluntária não impediria experiências comportamentais que são mais fisicamente e mentalmente exigente. Por exemplo, CRF muitas vezes ocorre juntamente com déficits cognitivos 3; futuroexperiências poderiam explorar o papel que a terapia de radiação pode desempenhar nesta associação. A presença de actividade de execução da roda deve ser tomada em consideração ao realizar os testes comportamentais suplementares, como VWRA pode afectar a fisiologia e comportamento em muitos aspectos 16.

Com doses de irradiação de 800 cGy ou menos, os ratos não deve precisar de cuidados especiais após a recuperação da anestesia. No entanto, o procedimento de irradiação e fadiga resultante pode potencialmente interagir com outras intervenções, tais como testes de comportamento adicionais ou tratamentos farmacêuticos. Os animais devem ser cuidadosamente monitorizados nos dias imediatamente após a irradiação, sempre que alterar ou adicionar a este procedimento descrito. Diferentes linhagens de camundongos também podem mostrar sensibilidade diferente à irradiação 19, por isso recomenda-se precaução quando se utiliza diferentes de C57BL / 6 cepas.

Embora esta técnica é concebido para representar radiação em-fadiga produzida, é apenas um componente do complexo conceito de CRF. CRF é uma condição que provavelmente tem várias causas e ocorre em pacientes que têm câncer e muitas vezes recebem vários tratamentos. Uma compreensão do CRF pode, portanto, requerem conjuntos de experiências com ratos portadores de tumor e com outros tratamentos, tais como quimioterapia ou terapia hormonal. Incorporando essas variáveis ​​em testes biológicos e comportamentais permitirá aos pesquisadores identificar suas contribuições a esta condição complexa. O modelo de rato descrito aqui pode ajudar a compreender o papel específico de radiação na CRF e desenvolver potenciais terapias.

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Disclosures

Esta pesquisa foi apoiada pela Divisão de Investigação Intramural, Instituto Nacional de Pesquisa em Enfermagem, National Institutes of Health.

Acknowledgments

Os autores gostariam de agradecer Michele Allen do National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) para generosamente compartilhando sua experiência em métodos fenotípicos murino e por sua assistência técnica em curso, bem como para Timothy Hunt, da NHLBI por nos ajudar a desenvolver o dispositivo de blindagem. Este estudo é apoiado pela Divisão de Investigação Intramural do Instituto Nacional de Pesquisa em Enfermagem do NIH, e parte do julgamento de validação é apoiado por uma bolsa da Fundação Oncology Nursing Society.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6 Mice Charles River Strain code 027 (http://www.criver.com/products-services/basic-research/find-a-model/c57bl-6n-mouse)
Ketamine HCl Putney 100 mg/mL stock solution
Xylazine HCl Lloyd Laboratories 100 mg/mL stock solution
Rodent Tattoo System AIMS ATS-3 http://animalid.com/lab-animal-identification-systems/ats-3-general-rodent-tattoo-system
Lead Shielding Apparatus (custom made) One-inch thick lead shielding arranged as two boxes with a one-inch thick gap between them for targeted irradiation
Plexiglass shielding container (custom made) Plexiglass container filled with styrofoam. Styrofoam cutouts hold the lead shielding in place.
GammaCell 40 Exactor Best Theratronics http://www.theratronics.ca/product_gamma40.html
RAD Disk Ultra Best Theratronics http://www.theratronics.ca/product_rad.html
Mouse Single Activity Wheel Chamber Lafayette Instrument Company #80820 http://www.lafayetteneuroscience.com/product_detail.asp?itemid=980
Activity Wheel Counter for Computer Monitoring Lafayette Instrument Company #86061 http://www.lafayetteneuroscience.com/product_detail.asp?itemid=1052
Modular Cable for Wheel Counters Lafayette Instrument Company #86051-7 http://www.lafayetteneuroscience.com/product_detail.asp?itemid=1046
USB Computer Interface for Activity Wheel Counters Lafayette Instrument Company #86056A http://www.lafayetteneuroscience.com/product_detail.asp?itemid=1047
Activity Wheel Monitor Software Lafayette Instrument Company #86065 http://www.lafayetteneuroscience.com/product_detail.asp?itemid=1053

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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