Форсколин-индуцированной Отек в кишечном органоидов:
1Foundation Hubrecht Organoid Technology, 2Department of Pediatric Pulmonology, Regenerative Medicine Centre Utrecht, Wilhelmina Children's Hospital, University Medical Centre Utrecht, 3Department of Stem Cells and Cancer, Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, 4Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, University Medical Centre Utrecht

Published 2/11/2017
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Boj, S. F., Vonk, A. M., Statia, M., Su, J., Dekkers, J. F., Vries, R. R., et al. Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients. J. Vis. Exp. (120), e55159, doi:10.3791/55159 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

CF обусловлена мутацией в муковисцидоз трансмембранного регулятора проводимости (CFTR) гена , который кодирует эпителиальный канал анион. CF затрагивает около 85 000 человек во всем мире 1. Более 2000 CFTR мутации были идентифицированы ( www.genet.sickkids.on.ca ). Это разнообразие частично объясняет широкий спектр наблюдаемых болезненных фенотипов ( www.CFTR2.org ) 2, 3. Шесть классов CFTR мутаций определяются на основе их влияния на экспрессию CFTR белка и функции: (I) не синтеза, (II) нарушение оборота, (III) литниковой дефектный канал, (IV) изменен проводимости, (V) пониженные уровни нормально функционирование CFTR, и (VI) нарушение клеточной устойчивости поверхности 4. Хотя общие мутации CFTR хорошо изучены, функция CFTR и связь с клиническим статусом остаются poorlу понимается на уровне индивидуума, особенно для большой группы редких "бесхозных" мутаций ( www.CFTR2.org ) 1, 3.

В последнее время препараты были разработаны, которые нацелены на белок CFTR в мутации конкретной моды. Два класса CFTR белка таргетирования препаратов в настоящее время используется в клинической практике и имеют различные способы действия. Потенциаторы, такие как VX-770, повышения открытой вероятность апикально локализованной мутантного CFTR и действовать непосредственно после их добавления к клеткам 5. Корректоры, такие как VX-809, восстановить торговлю эндоплазматического ретикулума локализованы неправильно свернутых CFTR и требуют предварительной инкубации с клетками до воздействия наблюдаются 6. CFTR , потенцирующее, VX-770, было зарегистрировано для субъектов с мутацией G551D 7, 8, а также для восьми другихCFTR стробирования мутации, в том числе S1251N 9; вместе, эти мутации переносятся на 5% всех субъектов МВ. Другие клинические испытания показали , что VX-770, в сочетании с корректором VX-809, имеет ограниченную еще значительное влияние на функцию легких и вызывает снижение темпов обострений у субъектов , гомозиготных по мутации F508del переносимой 45-50% пациентов , 10, 11.

Обычные клинические испытания по выявлению субъектов с наркотиками реагировать в течение оставшихся 50% пациентов с МВ являются дорогостоящими и отнимает много времени и не представляется возможным для людей с крайне редкими CFTR генотипов. Роман, экономически эффективные, персонифицированные методы имеют решающее значение, чтобы соответствовать все большее число CFTR модуляторов для лиц, осуществляющих любые виды мутации CFTR. До сих пор суд включение групп пациентов, несущих специфические мутации CFTR не руководствовался исследований с использованием мутантного гена CFTR трансфекции в часeterologous клеточные системы, за которыми следуют электрофизиологических исследований в Ussing камеры 5, 6, 12. Из - за отсутствия адекватных моделей CF животных, исследования эффективности лекарственного средства в воздушно-жидкостным интерфейсными-дифференцированный бронхиальных эпителиальных клеток , полученных из CF легких эксплантов материалов были использованы для разработки лекарственных средств 13, 14, 15. Тем не менее, ограниченная доступность легких тканей эксплантов и инвазивных процедур для получения бронхиальных клеток от субъектов без терминальной стадии болезни затрудняют анализ менее часто встречающихся мутаций CFTR и предотвратить испытывать снадобья в персонализированным способом. Чтобы преодолеть эти ограничения, «легкий доступ» тканей, таких как колоректальный органоидов, назальных клеток в дыхательных путях и клетки дыхательных путей, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, которые в настоящее время изучаются для персонализированного медикаментозного лечения.

16, 17. Для толстой кишки человека / прямой кишки, условия культивирования, определенные вовлекают факторы роста (эпителиального фактора роста (ЭФР), гастрин, Wnt-3A, R-spondin 3 (Rspo3), и Noggin) в сочетании с малыми молекулами (никотинамид, A83-01, и SB202190) в матрице базальной мембраны. В этих условиях, одиночные стволовые клетки или фрагменты тканей небольшие вырастают из в закрытые, кистозный, 3D структуры, образованные высоко-поляризованного эпителия с базальной стороне, ориентированной в направлении наружу. Все типы клеток, как правило, появляются в их нормальных соотношениях и положениях. Органоидами может быть расширен в течение длительного периода времени путем еженедельного механического разрушения и повторного покрытия. Они генетически и фенотипически стабильны и могут быть сохранены, что позволяет долгосрочное расширение и био-банкинг 17. Они поддаютсявсе стандартные клеточные биологические / генетические манипуляции и аналитические методы , разработанные для клеточных линий 2D 18.

Недавно мы показали , что функция CFTR , можно легко измерить в колоректальных органоидам в форсколин-индуцированной набухание (ФИС) анализа 19, 20. При воздействии форсколина (FSK) или, в качестве альтернативы, холерного токсина, органоиды быстро увеличить их циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) уровней, что в свою очередь приводит к открытию канала CFTR 19. Органоидам от здоровых людей, или из субъектов с CFTR мутаций , ассоциированных с остаточной функцией, будет впоследствии набухают в результате ионного и водного транспорта к Органоид просветом, эквивалент в пробирке секреторной диареи. Реакция ФИС колоректального органоидам было показано ранее, является полностью CFTR-зависимой, как указано органоидам, полученных из CFTR-нулевые лицами Анаходим путем использования специфических фармакологических ингибиторов CFTR 19. Большие наборы данных по конкретным темам может быть получена в течение нескольких недель после взятия биопсии.

Для анализа ФИС подробно описаны здесь, органоиды культивируют из ректальных биопсий , которые могут быть получены в любом возрасте , и лишь с ограниченным дискомфорта 21. Органоидами пассируют еженедельно механическим разрушением в отдельных склепах, которые легко Reseal и образуют новые органоиды. Для проведения анализа ФиС, ~ 30-80 из этих маленьких разрушенными органоидам высевают в каждую лунку 96-луночного планшета 19. В день анализа, органоидов окрашивают кальцеин зеленый флуоресцентный клеток проницаемой для красителя, который он удерживается в живых клетках, облегчая живых изображений. Затем Fsk, что повышает внутриклеточный цАМФ и тем самым активирует CFTR, добавляется для того, чтобы стимулировать Органоид отек. Потенциаторы которые действуют на апикальной CFTR одновременно добавляют WIth в форсколин, в то время как корректоры, восстанавливающих оборотом CFTR добавляют 24 ч перед добавлением FSK. Органоид набухание количественно с помощью анализа изображения в автоматическом режиме, который вычисляет относительное увеличение общей площади всех флуоресцентных объектов для каждой временной точки при форсколина дополнение.

3D Органоид набухание обеспечивает преимущества и недостатки по сравнению с существующими электрофизиологических CFTR считываниями в 2D-клетках, культивируемых в дыхательных путях Ussing камер. Основным преимуществом является то, пропускная способность набухать анализа. Клетки культивировали и анализировали с использованием одного типа культуральной среды, и опытный специалист может культура до 25 Органоид образцов на еженедельной основе в то время как количественной оценки приблизительно 1200 точек данных в неделю в течение 12 образцов пациентов. Мы условно ввести одну экспериментальную условие по дублированию или трехкратных измерений на пластину и повторить подобные измерения в трех независимых точках времени инкубации. В общей сложности около 300-500 летИнгл Органоид структуры затем измеряются в экспериментальных условиях, что приводит к очень точные измерения функции CFTR с ограниченной технической изменчивости. Такая точность позволяет четко определить различия в остаточной функции и реакции на CFTR модуляторов и позволяет легко подобрать генетические фоновые эффекты между пациентами , несущих идентичные мутации CFTR 19, 22, 23, 24, 25. Качество данных можно легко оценить с микроскопом изображений. В то время как ФИС полностью CFTR-зависимой, это является косвенным мера результата для функции CFTR, ее считыванием, вызванным взаимодействием транспорта ионов к транспортировке жидкости. Это контрастирует с прямых измерений функции CFTR в Ussing камерах, измеряющих трансэпителиальная ионных токов 26. Ussing камеры позволяют выберите стимуляцию апикальной или базолатеральной Compartments (которых Органоид анализ не позволяет); по permeabilizing базолатеральной мембраны, секреция анион верхушечный CFTR-зависимые могут быть выборочно измерены 27.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все эксперименты с использованием человеческих тканей, описанных здесь было одобрено этическим комитетом в университетском медицинском центре Утрехта (UMCU; TcBio # 14-008). Информированное согласие на сбор тканей, производства, хранения и использования органоидами была получена от пациентов в Вильгельмины детской больницы (WKZ) -UMCU.

Оборудование потребляемый инструменты
ламинаре 15 и 50 мл конические пробирки Цейсс LSM 800 - Zen 2 (синий издание) программное обеспечение для измерения изображений
CO 2 инкубатор микроцентрифуге трубки Программа Microsoft Excel
Клеточные культуры микроскоп (свет / оптический микроскоп) 0,22 мкм фильтры
центрифуга серологические пипетки
прокатка шейкер советы Микропипетки фильтр
4 ° C комнате или 4 ° C холодильник для инкубатора криопробирок
CoolCell Cell Замораживание контейнера
Серологическое дозаторов
Micropippette (1000, 200 и 20 мкл)
Viaflo Повторите пипетка
(Живая клетка) конфокальный микроскоп
компьютер
резервуар жидкого азота
Многоканальный (200 мкл)

1. Подготовка Реагенты для культуры

  1. Базальной среды Приготовление
    Примечание: базальную среду (БМ) относится к Расширенный Дульбекко в модификации Дульбекко с питательной смесью Ham F-12 (Ad-DF), дополненной 4- (2-hydroxyethil) -1piperazineethanesulfonic кислоты (HEPES), глутамин и пенициллин / стрептомицин (Pen / Strep).
    1. В средней бутылке 500 мл Ad-DF, добавляют 5 мл 200 мМ глутамина, 5 мл 1 М HEPES, и 5 мл пен / стреп растворов (10000 Ед / мл, 10000 мкг / мл).
    2. Магазин БМ в холодильнике при 4 ° С в течение не менее 4 недель.
  2. Wnt-3A-кондиционированная среда Приготовление
    Примечание: Wnt-3A-кондиционированной среды производится в доме USINг клеточной линии L-Wnt-3A в соответствии с инструкциями изготовителя.
    1. Для уборки Wnt-3A-кондиционированной среды, собирают среду, подверженную клетки в течение одной недели и вращать его вниз в течение 5 мин при 450 мкг для удаления плавающих клеток.
    2. Фильтр Wnt-3A-кондиционированной среды через фильтр 0,22 мкм и разделить его на порции по 40 мл в 50 мл конические пробирки. Хранить их при температуре 4 ° С в течение по крайней мере 4-х месяцев без потери активности.
    3. Тест на активность Wnt-3A-кондиционированной среды в анализе TOP / ФОП с использованием эмбриональной почки человека (HEK) -293 клеток , трансфицированных Топ- и ФОП-люциферазы и TK- рениллы и измерили с рениллы -luciferase набора для анализа в соответствии с инструкции изготовителя.
      Примечание: TOP-люциферазы репортер, который содержит плазмиду дикого типа TCF связывающие регионы. Если Wnt-3A-кондиционированная среда активна, каноническое сигнализации Wnt активируется. Бета-катенин транслоцируется в ядро ​​ассоциировать остроумиеч TCF / LEF транскрипционные факторы, и активирует транскрипцию люциферазы, вызывая увеличение относительной активности люциферазы при добавлении субстрата. ФОП-люциферазы используют в качестве отрицательного контроля, так как ТСФ области связывания выше по потоку от гена люциферазы мутируют.
  3. Colon Средний Приготовление
    Примечание: Подготовка и разбавить все факторы роста и реагентов в соответствии с рекомендациями производителей. Использование малых размеров аликвоты во избежание циклов замораживания-оттаивания. Функциональные факторы роста имеют важное значение для результатов.
    1. Подготовка среды толстой кишки (СМ), дополнив BM с 1x B27, 1,25 мМ N-ацетилцистеин, 50 нг / мл hEGF, 5 нМ гастрина, 10 мМ никотинамида, 300 нг / мл hRspo3, 100 нг / мл hNoggin, 500 мкМ A83-01 , 10 мкМ SB202190, и 100 мкг / мл антимикробного для первичных клеток.
    2. Разделите КМ на аликвоты и заморозить их при температуре -20 ° С в течение до 4-х месяцев. Оттепель аликвот подготовить полный толстой кишкисреда (ТСМ) путем добавления 50% Wnt-3A-conditoned среды в СМ. Магазин ТСМ до 7 дней при 4 ° С без потери активности.
    3. Для создания Органоид культуры из ректальных биопсий, дополняют ТСМ с 50 мкг / мл ванкомицина, 50 мкг / мл гентамицина и 10 мкМ Rho-ассоциированный белок серин / ингибитор киназы суперспирализованный формирования треонин (RhoKi). Используйте эту среднюю, называемую изоляции среды (IM), только в течение первых двух-трех дней в культуре.
  4. ЭДТА Массоподготовка раствор
    1. Готовят 0,5 М этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), рН 8, в сверхчистой H 2 O, стерилизованный с фильтром с размером пор 0,22 мкм.
  5. Манипуляция базальной мембраны Matrix
    1. Подготовьте матрицу базальной мембраны (BMM) в соответствии с рекомендациями производителя.
    2. Оттепель ВММ ночь на льду.
    3. При переводе СМЛ из бутылки в 15 мл коническую пробирку, использование5 мл пипетку, в 15 мл коническую трубку предварительно охлажденный при -20 ° С.
    4. После размораживания хранить СМЛ в холодильнике при 4 ° С и инкубировать на льду в течение по крайней мере, 30-60 мин перед использованием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения наилучших результатов, СМЛ должен быть холодным и должным образом перемешаны перед вложением крипты или органоиды.

2. Создание Colon органоидами из биопсию CF пациента

Примечание: После сбора ткани, важно , чтобы поддерживать образец на льду в физиологическом растворе, Дульбекко забуференный фосфатом физиологический раствор без Са 2+ и Mg 2+ (DPBS), или БМ. Быстрая обработка биопсий рекомендуется, но она доказала свою возможность установить Органоид культур из биопсий, хранящихся на льду в течение до 7 дней.

  1. Пусть биопсий оседать на дне конической трубки 15 мл и удалить супернатант.
  2. Добавьте 10 мл ДЗФР к биопсий и пипетку вверх и вниз 10-20 раз с помощью 10 мл пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: пипетка должна быть предварительно увлажненный с БМ перед отбором биопсии.
  3. Пусть биопсий оседают на дне и удалить супернатант.
  4. Повторите шаги 2.2 и 2.3 4-5 раз, пока супернатант не станет прозрачным.
  5. Добавляют 10 мл ППД и 200 мкл ЭДТА (0,5 М) в биоптатах и ​​поместите трубку на качающейся платформе трубки в течение 60-120 мин при температуре 4 ° С.
    Примечание: Время инкубации может отличаться в зависимости от пациента. Если крипты освобождаются, DPBS становится мутным. ЭДТА инкубирование может быть завершена, когда крипты можно наблюдать под микроскопом.
  6. Разрешить склепы осесть. Удалите супернатант.
  7. Возьмите 2 мл BM и добавить его в новый 15 мл коническую трубку. Взболтать эту новую трубу вручную таким образом, чтобы внутренняя покрыта БМ.
  8. С помощью пипетки предварительно смачивать BM, добавляют 2 мл ДЗФР в пробирку, содержащую биопсию и пипетку вверх и вниз 10-20 раз.
  9. Дайте биопсий отстояться и передать DPBS с крипт к новомупробирку, содержащую 2 мл БМ, который был подготовлен в шаге 2.7.
  10. Повторите шаги 2.8 и 2.9 пока больше крипты не будут освобождены.
  11. Спин крипты вниз при 130 мкг в течение 5 мин при 8 ° C.
  12. В то же время, передача IM к шкафу безопасности при комнатной температуре (RT).
  13. Удалите супернатант и добавляют 10 мл БМ в склеп окатышей и повторите шаг 2.11.
  14. Ресуспендируют осадок в 1 мл БМ. Возьмите 5-10 мкл и подсчитать количество крипт на глаз под микроскопом.
  15. Спин крипты вниз при 130 мкг в течение 5 мин при 8 ° C.
  16. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 55% ВММ (v ВММ к об IM).
    ПРИМЕЧАНИЕ: крипты ресуспендируют в соответствующем объеме 55% СМЛ на 1 склепе на мкл. Если не хватает крипты, минимальный объем СМЛ составляет 40 мкл.
  17. Для затравки, пипеткой 35 мкл на лунку (в 24-луночный планшет). Разделить 35 мкл BMM в 3-5 капель по отдельности для того, чтобы улучшить диффузию GROWTH факторов в СМЛ. Не создавать пузыри.
  18. Поместите и оставьте тарелку вверх дном в термостате при температуре 37 ° С в течение по меньшей мере 20 мин для БММ затвердеть.
  19. Добавить 500 мкл на лунку IM и держать его в термостате при температуре 37 ° С и 5% CO 2.
  20. Обновление среды каждые 2-3 дня. Удалите старую среду пипеткой вне с P1000 пипетки, оставляя нетронутыми ВММ капли. Осторожно добавьте FCM пипеткой его в сторону колодца, а не непосредственно на СМЛ капель.
    Примечание: Если никакие крипты не выпускаются в протоколе изоляции, центрифугировать супернатант, Вымойте гранул 2-3 раза с БМ, и ресуспендируют его в СМЛ. Возьмите остатки ткани и разрезать его на маленькие кусочки с бритвой. Собирают их в коническую пробирку на 15 мл, центрифуга их, и ресуспендируют их в том же BMM. Если какие-либо эпителиальные стволовые клетки присутствуют, то они будут также генерировать органоиды.

3. Пассирование толстой кишки органоидами для обслуживания, замораживания, так и дляskolin-индуцированной Отек Анализ (ФИС)

Примечание: Каждый Органоид культура имеет свое собственное время удвоения. Как правило, колоректальный CF органоиды может быть расширен 1: 3-1: 5 раз через каждые 7-10 дней. Это хороший знак, если наблюдаются многообещающий структуры. Колоректальный CF органоиды являются менее кистозным (рис 2А - 2С) , чем колоректального нормальных органоидов (рис 2D). Для создания и поддержания, органоиды культивировали в 24-луночных планшетах; для замораживания, в 6-луночные планшеты; и для анализа ФиС, в 96-луночных паштетов.

  1. Пассажи органоидами
    1. Хранить СМЛ на льду в течение по крайней мере, 30-60 мин перед использованием.
    2. Храните ТСМ при комнатной температуре в течение по крайней мере 1 часа перед его использованием.
    3. Добавьте один 15 мл коническую трубку с именем образца и другую пробирку как «промывали».
    4. Тщательно аспирата среду из лунок с использованием P1000 пипетки, не нарушая СМЛ капли.
    5. Добавьте 1 мл BM 1 а и бвверх по рубить ВММ капли с помощью пипетки P1000. Перенести этот 1 мл в 15 мл коническую трубку с названием образца.
    6. Промыть скважину с еще 1 мл БМ и передать его в ту же 15 мл трубки.
    7. Повторите шаги 3.1.5 и 3.1.6 с более 5 скважин (до 6 лунки 24-луночного планшета будут смыты в одном 15 мл коническую трубку).
    8. Заполните трубку до 12 мл с БМ. Пипетка вверх и вниз с использованием предварительно смачивают 5 мл пипетку.
    9. Спин при 85 мкг в течение 5 мин при 8 ° С.
    10. Удалите супернатант и добавьте 1 мл BM к осадку. С тем же самым кончиком пипетки P1000, подними наконечник P10 без фильтра, и пипеткой вверх и вниз 20 раз. Откажитесь как P1000 и P10 советы.
    11. Добавляют 4 мл БМ с 5 мл пипетки и держать трубку наклоненной приблизительно 70 ° от вертикали в одну сторону. Предварительное смачивание новый наконечник P1000 и перемешать энергично 2-3 раза с P1000 (объем 1 мл).
    12. Сосчитайте до 10, оставаясь при этом в наклонном положении, осторожно соберите верхний слой WIth с P1000 пипетки и передачи 4 х 1 мл в пробирку как «промывали».
    13. Обратите внимание на органоиды оседания на дно в наклонном трубки; бесперебойных органоиды и большие куски будут опускаться на дно. Центрифугируйте 15 мл "промывали" трубку в течение 5 мин при 85 мкг до 8 ° C.
    14. Жидкость над осадком сливают и добавляют необходимое количество средних и BMM к Органоид осадку до конечной концентрации 55% BMM. Смешайте с помощью пипетки вверх и вниз , не создавая пузырьков (рис 3B).
      Примечание: Хорошая плотность достигается путем высева 25-30 органоиды в 10 мкл BMM.
    15. Выполните шаги 2.17-2.19.
  2. Пассирование для Замораживание
    1. Хранить БМ во льду в течение по крайней мере, 30-60 мин перед использованием. Хранить ТСМ при комнатной температуре в течение по крайней мере 1 часа перед использованием.
    2. Подготовьте ТСМ, дополненную RhoKi (этап 1.3.3).
    3. Возьмите трипсина из холодильника и оставить его при комнатной температуре в течение по крайней мере за 30 минут до использования.
    4. Выполните шаги 3.1.5-3.1.10.
    5. Удалить столько супернатант, насколько это возможно, добавить 4 мл трипсина и вортексе в течение 30 сек.
    6. Поместите трубку в ванну с теплой водой при температуре 37 ° С в течение 1 мин и вортексе в течение 30 сек.
    7. Проверьте раствор в трубке. Если неповрежденные органоиды все еще видны под микроскопом, повторите шаг 3.2.7.
    8. Когда органоиды разрушены, добавляют 8 мл БМ для нейтрализации трипсина и пипетку 10 раз.
    9. Спин в течение 3 мин при 450 х г при 8 ° С.
    10. Жидкость над осадком сливают и добавляют необходимое количество средних и BMM к органелл, чтобы достичь 55% -ного раствора BMM. Смешайте с помощью пипетки вверх и вниз, не создавая пузырьков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для замораживания, органоиды должны быть посеяны в соотношении 1: 1 после трипсином.
    11. Семенной 250 мкл в одну лунку подогретого 6-луночного планшета для культуры ткани, производя крошечные, разделенных капель ~ 10 мкл. Поместите планшет вверх дном в термостате при температуре 37 ° С и оставляютБММ затвердеть в течение 20-30 мин.
    12. Добавить 2,5 мл свежей ТСМ + RhoKi в каждом 6-луночный планшет хорошо и передавать пластины в инкубатор (рис 3C).
  3. Пассирование органоидами для анализа ФИС
    Примечание: В зависимости от количества и размера органелл, между 4 и 6 лунки 24-луночного планшета достаточно для высева 27 лунки 96-луночного планшета.
    1. Процесс органоидов, как описано на этапах 3.1-3.1.13.
    2. Ресуспендируют осадок в 120 мкл 50% СМЛ.
    3. Проверьте количество органелл (30-50) в 3 мкл ВММ капли под микроскопом.
    4. Тарелка органоидов использованием одной капли 3 мкл, размещенных в середине каждой лунки паштет 96-луночного.
    5. Поместите пластину в 37 ° C инкубаторе в течение 15 мин для БММ затвердеть; дальнейшие шаги описаны в шаге 6.1.1.

4. Замораживание Colon CF органоидами

Примечание: ОрганOIDs готовы быть заморожены до 1-2 дней после того, как трипсином и культивированием, так что органоиды все еще будет небольшой, что увеличивает эффективность выживания после размораживания.

  1. Добавляют 1 мл БМ и разбить ВММ капли с помощью пипетки P1000. Переложить в 15 мл коническую трубку.
  2. Промыть скважину с еще 1 мл БМ и передачи в той же 15 мл трубки.
  3. Повторите шаги 4.1 и 4.2 со всеми скважинами.
    Примечание: Для того, чтобы избежать избытка ВММ, 3 лунки 6-луночного планшета объединяют в одном 15 мл пробирку.
  4. Заполните 15 мл пробирку, содержащую органоиды 12 мл холодного БМ и пипетку вверх и вниз с 5 мл пипетки. Оставьте пробирку на льду в течение 5 мин.
  5. Спин в течение 3 мин при 450 х г и 8 ° C и удалить супернатант.
  6. Растворить осадок из органоидов переохлажденный среды и пипетку вверх и вниз, чтобы правильно ресуспендирования органоиды.
    Примечание: 500 мкл среды замораживания используют для каждых 100 мкл СМЛ.
  7. С помощью 5 мл пипетку, перенесите 0,5 млорганоиды ресуспендировали в среде замораживания в стерильную криогенных флаконах.
  8. Передача флаконах в контейнер ячейки морозильной камеры и положить его при -80 ° С.
  9. Через 24 часа, передавать чаш для хранения в жидком азоте.

5. Создание культур из замороженных органоидами

Примечание: Оттепель СМЛ на льду и держать его на льду. Пусть БМ достигают RT и утеплить 10 мл аликвоты до 37 ° С перед тем как приступить к процедуре размораживания одного криопробирку.

  1. Оттепель флакон быстро при перемешивании в C водяной бане при 37 ° до тех пор, пока еще немного замороженного материала.
  2. Передача талой органоиды в коническую пробирку 15 мл с помощью пипетки P1000.
  3. Сразу же после того, как, добавляют 1 мл теплой капли БМ за каплей при встряхивании в нижней части трубки. После того, как 1 мл среды добавляют, тщательно перемешать пипетированием вверх и вниз несколько раз, чтобы разбавить морозильную среду.
  4. Медленно (по капле) добавляют 9 мл теплого BM к конической Конта трубкиоцен- ками органоидов. Инверсия несколько раз.
  5. Спин суспензии клеток в течение 3 мин при 85 мкг и 8 ° C.
  6. Удалите супернатант осторожно, не нарушая гранул. Ресуспендируют Органоид в 90 мкл ТСМ, дополненной RhoKi (этап 1.3.3). Затем добавьте 110 мкл СМЛ.
  7. Добавьте 35 мкл в каждую лунку предварительно нагретый 24-луночного планшета, делая крошечные, отделенные капли.
  8. Перенести пластину на 37 ° C инкубаторе, в результате чего пластины вверх дном в течение 20-30 мин.
  9. Добавьте 500 мкл ТСМ с RhoKi в каждую лунку и передавать пластину обратно в инкубатор (рис 4A - 4C).
  10. После того, как органоиды восстановились должным образом из оттаивании, разбавленные более СМЛ, так что каждый 10 мкл СМЛ содержит 25-30 органоиды. Эта процедура может быть сделано через 2-3 дня после разморозки (рисунок 4D - 4G) и обеспечивает надлежащее рост Органоид.

6. форсколин-индуцированной Отек Какговорят (ФИС)

Примечание: FSK титрование позволяет для измерения остаточной функции CFTR. Для CFTR модуляции, органоиды подвержены данной корректора (например, VX-809) и / или потенцирующее (например, VX-770), в зависимости от генотипа. Как правило, VX-809 добавляется 18-24 ч перед измерением, в то время как VX-770 и Fsk добавляют непосредственно перед началом измерений. Имейте в виду, что некоторые модуляторы (корректоры / потенциаторы) может связываться с пластиковой поверхностью планшета для анализа.

  1. Покрытие для анализа
    Примечание: VX-809 запасы аликвоты при 20 мМ и хранят при -80 ° С. При оттаивании, оставьте при комнатной температуре и защищенном от света месте.
    1. Процесс органоидов, как описано в разделе 3.3.
    2. Если тестирование VX-809 корректора, подготовить кривую доза-ответ в трех повторах со следующими концентрациями: 0,0003, 0,003, 0,03, 0,3, 3,0 и 30 мкм. Подготовьте разведений в ТСМ.
    3. К 96-луночного планшета, добавляют либо 100 мкм; Л ТСМ с соответствующими VX-809 концентрации или 100 мкл ТСМ только и инкубировать пластину.
  2. Измерение Пробирной
    Примечание: VX-770 запасы аликвоты при 20 мМ, в то время как ЧМн в 10 мМ; и хранили при -80 ° С. При оттаивании, оставить при комнатной температуре и защищать от света.
    1. Возьмите флакон кальцеина и ДМСО и оставляют при комнатной температуре в течение 15 мин.
    2. Добавить 5,1 мкл ДМСО во флакон, где кальцеин поставляется в виде порошка, если не открывать крышку. В противном случае, используйте уже ресуспендировали кальцеина флакон, содержащий 2,5 мкл кальцеина.
    3. Добавить 2,5 мкл кальцеина до 580 мкл БМ в 1,5 мл трубки и пометьте его.
    4. Добавьте 10 мкл этого раствора красителя (БМ + кальцеиновой) в каждую лунку с помощью повтора пипетку.
    5. Ресуспендируют один раз с многоканальным, чтобы гарантировать, что краситель смешан хорошо.
    6. Инкубируйте планшет в инкубаторе C 37 ° С в течение 30 мин.
    7. Во время кальцеиновой инкубации начать подготовку FSKи решения VX-770, если это необходимо.
    8. При использовании потенцирующее VX-770, подготовить кривую доза-ответ в трех экземплярах со следующими концентрациями: 0,0003, 0,003, 0,03, 0,3, 3,0 и 30 мкМ. В случае титрования FSK, концентрации являются: 0, 0,008, 0,02, 0,05, 0,12, 0,32, 0,8, 2,0 и 5,0 мкМ. Подготовить разведений в БМ.
      Примечание: Для FSK, VX-770, или любой другой препарат добавлен на второй день, Разведения должны быть приготовлены на 2х конечной концентрации, так как 100 мкл FSK / титрование раствора наркотиков будет добавлено в каждую лунку, которые уже содержат по 100 мкл ТСМ.
    9. Передача FSK и VX-770 растворов, P200 пипетку, а также советы для микроскопа комнате.
    10. Для визуализации анализа ФИС, использовать живой визуализации клеток конфокальной микроскопии , оснащенный автоматизированной стадии, нагретую камеру и CO 2 потока.
      Примечание: Следующие шаги относятся к конкретному микроскопе. Различные расстановок должны применяться к другим микроскопов следующие производителяинструкции.
    11. Поместите 96-луночный планшет в держателе.
    12. Введите конфокальной настройки для работы с изображениями.
      1. Предустановленные инструмент живого изображения до 37 ° С и 5% CO 2 , и пусть камера предварительно инкубировать в течение как минимум 30 минут до измерения.
      2. Используйте опцию "Смарт настройки", чтобы выбрать трек Alexa Fluor-488.
      3. Установите 5X объектив и область сканирования до 0.6X, чтобы уменьшить масштаб и захватить всю скважину.
      4. Адаптировать мощности лазера и чувствительность детектора, чтобы включить оптимальное обнаружение кальцеиновыми-зеленого меченых органелл над фоном. Обскура может быть увеличена до 130 мкм и усреднение изображения может быть установлен на уровне 2.
      5. Установите битовую глубину в 8 и размер кадра 512 х 512.
      6. Используйте параметр временных рядов, чтобы установить измерение времени, частоты и интервалы.
        Примечание: Рекомендуется для регулярных измерений: 1 час 10 мин Интервал: циклов = 7 (цикл 1 Т = 0). Для измерений, незначительный отек органиnoids могут быть отображены до 3 часов.
      7. Используйте опцию плитки, чтобы вручную определить отдельные позиции так.
    13. Добавьте 100 мкл FSK и / или VX-770 решений в соответствующие лунки, следуя той же порядка, что и измерения. Начните добавлять решения в первой вошедшие в образ хорошо и по-прежнему с порядком формирования изображения.
    14. Начните измерение.
    15. После того, как эксперимент закончен, сохраните файл.
  3. Анализ данных ФИС пробирной
    1. Создание "Органоид анализ" макрос для анализа данных анализа ФИС с помощью инструмента анализа в качестве программного обеспечения для анализа изображений, который распознает все структуры вошедшие в образ через трек Alexa-488 и заполняет выявленные структуры для расчета увеличение общей Органоид площади за разные моменты времени.
    2. Откройте файл данных с полученных изображений в программе анализа изображения.
    3. Выберите макрос для Органоид анализа.
    4. <li> Установите порог, чтобы сбалансировать соотношение сигнал-шум в одной скважине в момент времени 1 и убедитесь, что все Органоид структуры признаются и заполнены.
      1. Проверьте в 4-6 лунок, чтобы увидеть, если все структуры также признаются в момент времени 7. Слегка изменить порог, чтобы гарантировать, что фоновые сигналы в момент времени 7 не признаются в качестве структур (конкретный порог может несколько меняться между экспериментами).
    5. Установить критерии минимального размера площади признанных объектов до 1000 мкм 2.
    6. Нажмите кнопку "анализ", чтобы начать. Анализ занимает примерно 3 мин, в зависимости от используемого программного обеспечения.
    7. Когда программное обеспечение будет завершена, перейдите в раздел "создать таблицу" и выберите следующие данные: а цифры (таблица должна увеличиваться в таком порядке), моменты времени, а общая площадь на лунку.
    8. Сохранить файл как .xlm экспортировать в программу электронных таблиц.
    9. В этой программе вычислить относительное увеличение площади на достл путем установки зоны временной точке 1 на 100%. Вычислить площадь под кривой (AUC) от временных точек 1-7 в состоянии; нижний предел области (Y-значение) устанавливается на уровне 100%. FSK или наркотиков титрование (X-ось) нанесены на график ППК (Y-ось).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

На фиг.1А показана репрезентативная свежий изоляцию крипт встроено в СМЛ. Крипт взяты из колоректального биопсии CF субъекта. Обычно Органоид генерируется из каждого склепа (рис 1А - С). Из - за дисфункции CFTR, наиболее толстой кишки CF органоидам не кистозный, а скорее являются компактными и с выступами и buddings (фиг.2А - 2В). Тем не менее, некоторые CF Органоид культур, особенно с высокой остаточной функции, имеют несколько органоиды с кистозной формой (рис 2С), как Органоид культур дикого типа (рис 2D).

Перед тем как пассирования органоиды для расширения культуры или посевом анализа на ФиС, важно , что органоиды имеют большой размер с несколькими buddings, как показано на фигуре 3А. Если органоиды маленькие и без пumerous buddings при обработке для пересева, то Органоид культура отрицательно сказывается. В зависимости от качества и активности основных факторов роста , таких как EGF, Wnt-3A и Rspo3, органоидов достичь желаемого размера от 7 до 12 дней (рис 3 , а ). После механического разрушения, то buddings разрушены и использованы для создания новых органоиды в следующем отрывке (рис 3B). При обработке органоиды для замораживания, важно , чтобы они обрабатывали трипсином малого размера, как показано на фиг.3С. После того, как трипсином, органоидов высевают на 1 или 2 дня для того, чтобы позволить им оправиться от стресса манипуляции. Этот шаг, вместе с небольшим размером органелл, обеспечивает восстановление клеток на 98% после разморозки (фиг.4А).

Когда органоиды размораживают, важно, чтобы иметь их в высокой плотности, таким образом, как правило, они оттаивают вмалый объем (Figure4A). После одного или двух дней в культуре, и после наблюдения , что органоиды увеличивают размер (сравните рис 4A с фиг.4В - 4C), органоидов разводили в соотношении 20-30 органоидами на 10 мкл СМЛ, обеспечивая правильную плотность перерасти в больший размер. Если органоиды слишком разбавлены, они могут замедлить рост и даже может дифференцировать и умереть. Если органоиды слишком тесно, нехватка места или дефицит факторов роста также замедляет рост органоидов и уменьшает количество buddings.

Обшивку органоидам из жизнеспособных культур с ограниченным клеточных остатков должно приводить к условиям , в которых> 95% органоидам набухают при FSK стимуляции, при условии , что достаточный функция CFTR присутствует (рис 5А - 5В). Органоидами набухают в genotype- и лекарственно-зависимым образом, как ииллюстрируется представительными изображениями органелл с двумя F508del аллели (рис 5А) и органоиды соединения-гетерозиготных для F508del и S1251N (рис 5б) мутации CFTR стробирования , связанный с некоторой остаточной функции.

Для количественной оценки отечность, общая площадь поверхности кальцеин-зеленый выбираются для каждой временной точки и выражали в процентах от T = 0 (за 100%; 6А). Обломки и малые, ненабухающей структуры, как правило, ниже 5% от общей площади поверхности. Относительное увеличение площади выражается в 10 - минутного интервала времени, и ППК (произвольные единицы измерения) генерируются для каждого состояния (Т = 0 до 60 мин, базового порогового значения , установленного на 100%; Рисунок 6B). Мы нашли АУК, чтобы быть самым надежным, так как она включает в себя некоторые вариации в инициации набухания, а также криволинейной отношения за пределами 30-40 мин FSK на уровне функций высокой CFTR.

рисунок 6в). Органоиды, связанные с CFTR остаточной функции может доходить до 4500 единиц ППК через 60 мин 5 мкМ FSK стимуляции в отсутствие CFTR модуляторов (200-220% площади поверхности условий предварительно FSK). Органоид опухоль достигает потолка при ~ 4500 АУК единиц, предположительно из-за физических ограничений на Органоид структур, влияние лимитирующей базолатеральной транспорта ионов, а также создание и ион- жидкости транспортной гомеостаза под "растянутых" условиях. Fsk можно титровать для дальнейшего расширения динамического диапазона анализа на этих высоких уровнях остаточной функции CFTR, чтобы лучше количественно оценить остаточную функцию или высоко эффективной обработки соединением (например, как указано в более высокой активности VX770 на опухание S1251N органоидам при стимуляции более низкими концентрациями FSK; Рисунок 6D).

Рисунок 1
Рисунок 1: Создание CF колоректального органоидами из биопсий. (A) Типичные изображения изолированного материала из ректальной биопсии после встраиваются в СМЛ на день изоляции (прохода 0, 0 -й день). Расширение указанной крипте показан на нижней правой панели. (Б) То же крипты последовало после того, как 7 дней в культуре (пассаж 0, 7 -й день). Расширение же крипты, представленной в панели А показан. (С) представитель изображение того же Органоид культуры через 11 дней после того, как раскалывается (проход 1, день 11). Масштабные полоски = 100 мкм.
159fig1large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2: Типичные изображения CF колоректального органоидов , полученных от пациентов с различными CFTR мутаций. Типичные изображения CF колоректального органоидами от субъектов с F508del / F508del (A), F508del / R117H-7T (B), и F508del / S1251N (C) мутаций. (D) представитель образ колоректального Органоид культуры от дикого типа CFTR субъекта. Масштабные полоски = 100 мкм. Эти изображения были получены без каких-либо стимуляции FSK. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

5159 / 55159fig3.jpg "/>
Рисунок 3: Обработка органоиды толстого кишечника CF для технического обслуживания и анализа или для замораживания. (A) Характерные образы CF толстой кишки Органоид культуры готово к обработке либо для пересева (B) или замораживания (C). (B) После того, как их механического разрушения, образуются маленькие кусочки, которые будут генерировать новые органоиды в следующем отрывке. (C) После того, как трипсином, очень маленькие, круглые органоиды образуются, способствуя их жизнеспособности в процессе замораживания. Масштабные полоски = 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4: Создание CF колоректального Органоид культуры из замороженных органоидов. (<сильный> A - C) Характерные образы CF колоректального Органоид культуры размороженные на день 0 (A). Изображения из той же скважине были взяты один (В) и два (C) дней после. (D - G) Типичные изображения на стадии разбавления , описанной в разделе 5.9. После того , как органоиды восстановились правильно с оттаиванием (3 -й день после оттаивания), они разбавляют таким образом они имеют пространство для роста (D). Изображения из той же скважины были взяты шесть (Е), десять (F), и пятнадцать (C) дней после оттаивания. Масштабные полоски = 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5: форсколин-индуцированной набухание CFорганоиды. и Б) Типичные изображения F508del / F508del (А) или F508del / S1251N (В) колоректальных органоидам до или после 60 мин стимуляции с FSK (5 мкм) в отсутствие или в присутствии VX-770 (3 мкм]) или VX-770 в комбинации с VX-809 (3 мкм). Масштабные полоски = 200 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6
Рисунок 6: Количественная форсколин-индуцированное набухание. (A) Типичные изображения Органоид выбора области путем анализа образа программного обеспечения из F508del / S1251N органоиды до (0 мин) и через 60 мин стимуляции с FSK (5 мкМ) и VX770 (3 мкМ). Масштабные полоски = 200 мкм. (B) Representative изображения относительного увеличения площадей F508del / F508del или F508del / S1251N органоидам в течение 60 мин FSK (5 мкм), стимуляция в отсутствие или в присутствии VX770 (3 мкм) и / или VX809 (3 мкм). (С) Площадь под кривой измерений условий , указанных в (В) (Т = 60 мин, эпидемический порог = 100%). (D) площадь под кривой измерений F508del / F508del или F508del / S1251N органоидов при различных концентрациях FSK. Данные представляют собой средние значения ± стандартное отклонение от отдельных представительных экспериментов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы предоставляем полный протокол для поколения, расширения, замораживания и оттаивания колоректального органоидов человека. В то время как мы установившиеся культуры Органоид людских некоторое время назад 17, это иногда оказалось трудно установить технологию в других лабораториях без практического обучения. Мы ожидаем, что эти протоколы будут заменить такую ​​подготовку.

Wnt-3A-кондиционированной среды является одним из наиболее важных реагентов для того, чтобы добиться успеха в установлении и поддержании долгосрочных Органоид культуры. Действительно, Органоид культуры могли бы "аварии" при воздействии на Wnt-3A-conditoned среде с низкой активностью. Поскольку Wnt-3A-кондиционированной среды производится в доме, есть несколько аспектов, которые должны быть приняты во внимание при создании активной среды. Активный Wnt-3A может быть получен только в среде с высоким качеством эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), который обеспечивает соответствующие сигналы для роста L клеток и стабилизации гидрофобныймолекулы Wnt-3A. Когда активность Wnt-3A низкий (т.е. низкий TOP / отношения ФОП, смотри ниже), то, как правило , ФПС , что является причиной проблемы.

Коммерческий рекомбинантный Wnt работает плохо, поэтому мы не рекомендуем использовать его в качестве положительного контроля для анализа репортер TOP / ФОП Wnt. Соотношение между TOP / рениллы и ФОП / рениллы является показателем Wnt активности кондиционированной среды, так что хорошая партия Wnt-3A-кондиционированной среды дает отношение T / E ФОП выше, чем 25, по сравнению со значением T / E FOP из отрицательный контроль: среда не подвергается воздействию Wnt-3A-продуцирующие клетки. Рекомбинантный Noggin и R-spondin можно заменить Noggin и R-spondin кондиционером среды 28, 29.

Текущий протокол также описывает функциональное тестирование для CFTR-анализа ФИС. Недавно мы показали взаимосвязь между CFTR генотипом и ФИС и как это отражает опубликованную CFTR genotyре-фенотип , полученные из клинических реестров (www.CFTR2.org) 25. С помощью этого анализа, были идентифицированы два человека с чрезвычайно редкими CFTR мутаций , чьи органоиды поддавались ivacaftor (VX-770) 25. Последующее назначение этого препарата привело к четкой клинической реакции, выделяя значение анализа ФИС, чтобы соответствовать определенные лекарственные препараты, с пациентами с редкими мутациями в отсутствие данных клинических испытаний. Существенный для количественного определения ФИС являются оптимальные условия для роста и анализа, указанные только ограниченное фракции ненабухающей органоидам (как правило, ниже 5%). Высокие уровни мусора приводят к недооценке набухания, а большая доля нежизнеспособных, ненабухающей структур распознаются с помощью программного обеспечения для анализа изображений.

Корреляция между ФИС пробирке ответов в и ранее установленных CFTR-зависимой биомаркеров (концентрации хлорида пота и INTESTИнал измерения тока) на персонализированный уровне были легко доказуемо в наших предыдущих исследованиях 19, 25. Это поддержали идею о том, что остаточные измерения с использованием функции ФИС по предметам с МВ могут дополнять существующие подходы в качестве диагностического или прогностического маркера в персонифицированной форме. Пропускная способность анализа ФИС по сравнению с другими биомаркеров функции CFTR, например, измерения концентрации хлоридов пота в естественных условиях и кишечника измерения тока в естественных условиях бывших ректальных биопсий, позволяет лучше контролировать технической изменчивости. Она также обеспечивает полностью CFTR-зависимое считывание и большой динамический диапазон, используя титрование FSK, которые точно типы остаточной функции CFTR.

Тем не менее, анализ ФИС отражает лишь воздействие индивидуального генотипа на изменчивость эффективности лекарственного средства, в то время как модуляция болезни CF влияет больше, чем только CFTR функции. Для друг ответ, анализ отражает потенциального тканевого ответа. Хотя очень точные измерения в CFTR, изменение человеческой фармакокинетики не включены, в отличие от других в естественных условиях 7, 8 или прямых ех естественных условиях измерений CFTR 32. Как уже говорилось ранее, не являющиеся модификаторы CF (как генетические и экологические), также влияющие на фенотип, в результате чего разрыв между наблюдениями в пробирке или CFTR биомаркеров и клинический фенотип 2. Кроме того, идентификация потенциальных чувствительных мутаций с использованием клеточных линий 33 связан с меньшим воздействием на пациентов , которым необходимо получить ректальной биопсии для установления органоидов.

Несколько CFTR таргетирования препараты находятся в стадии разработки 1. Предполагается, что клинические испытания не позволит правильно прогнозировать клиническую эффективность бAsed на одном только CFTR мутационного статуса. Поскольку анализ ФИС измеряет функцию CFTR и реакции лекарственного средства функционально, оно может стать методом выбора, чтобы определить, какой препарат лучше всего работает для какого пациента. Анализ ФИС может быть также полезным для идентификации групп пациентов, подлежащих включению в регистрационных испытаний и разработки новых форм лекарственных средств. Стимуляция колоректального органоидами с плазмой до и во время лечения может также помочь количественно оценить функциональные количества циркулирующих CFTR модуляторов в крови, потенциально способствуя персонализированный дозирование и выбор доз лекарственных средств в клинических испытаниях 30, 31. И, наконец, ФИС может быть полезным для лучшего базового понимания функции CFTR и его взаимодействия с другими -SO далеко в значительной степени unknown- генетических модификаторов его функции.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана программой HIT-CF голландского CF фонда (NCFS), ZonMw (40-00812-98-14103), Вильгельмины Детский фонд научно-исследовательского госпиталя и CZ и Zilverenkruis / Achmea. Мы хотели бы поблагодарить С. Heida-Мишель, М. Geerdink, К. де Винтер-де Гроот и Г. Berkers (кафедра детской пульмонологии, Вильгельмины детской больницы, UMC Utrecht), и RHJ Хоувен (отдел детской гастроэнтерологии, Вильгельмине Детская больница, УМС Утрехт) для приближения к пациентам и получать биопсию для генерации CF Биобанка.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Advanced Dulbecco’s Modified Eagles Medium with Nutrient Mixture F-12 Hams (Ad-DF) 500 ml  Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen #12634 stored at 4 °C
GlutaMax Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen #35050 stored at 4 °C
Hepes Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen # 15630-056 stored at 4 °C
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen #15140-122 stored at -20 °C
96 well culture plate Cellstar #655180
24 well culture plate Cellstar #662160
6 well culture plate Cellstar #657160
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (-) CaCl2 (-) MgCl2) (DPBS) Life Technologies: Gibco #14190-094 stored at 4 °C
Dulbecco’s Modified Eagles Medium  (DMEM) 500 ml  Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen #31966-021 For Wnt-3A Conditioned Medium Production. Stored at 4 °C
Fetal Bovine Serum (FBS) Bovogen #SFBS LOT#11113 For Wnt-3A Conditioned Medium Production. Stored at -20 °C
L Wnt3A cell line ATCC #CRL-2647 For Wnt-3A Conditioend Medium Production.
TOP/FOP plasmids Millipore  #17-285 For measuring Wnt activity
pTK-Renilla Promega  #E2241 For measuring Wnt activity
HEK-293 ATCC #CRL-1573 For measuring Wnt activity
Dual-Luciferase Reporter Assay System Promega  #E1910 For measuring Wnt activity
Zeocin  Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen #R250-01 For Wnt-3A Cell line selection
B27 supplement  Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen #17504-044 stored at -20 °C
N-Acetylcysteine Sigma Aldrich #A9165-5G stored at -20 °C
Nicotinamide Sigma Aldrich #N0636 stored at -20 °C
Human Epithelial Growth Factor (hEGF) PrepoTech #AF-100-15 stored at -20 °C
Gastrin Sigma Aldrich #G9145 stored at -20 °C
TGFb type I Receptor inhibitor (A83-01)  Tocris #2939 stored at -20 °C
Y-27632 dihydrochloride (RhoKi) Selleckchem #S1049 stored at -20 °C
p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) Sigma Aldrich #S7067 stored at -20 °C
Primocin InvivoGen #ant-pm-1 stored at -20 °C
Human Noggin (hNoggin) PrepoTech #120-10C stored at -20 °C
Human R-spondin 3 (hRspo-3) R&D Systems #3500-RS/CF stored at -20 °C
Vancomycin Sigma Aldrich #861987- 250mg stored at -20 °C
Gentamycin Life Technologies: Gibco #15710-049 stored at -20 °C
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich #431788 Stored at 4 °C
Matrigel Corning #354230 stored at -80 °C
TryplE Express  Life Technologies: Gibco #12605-010 for trypsinizing organoids for freezing
Recovery Cell Culture Freezing Medium Life Technologies: Gibco #12648010 for freezing
Calcein Life Technologies: Gibco #C3100MP stored at -20 °C
Forskolin R&D Systems #1099-50 mg stored at -80 °C
Lumacaftor (VX-809) Selleckchem #s1565 stored at -80 °C
Ivacaftor (VX-770) Selleckchem #s1144 stored at -80 °C
Name of Reagents/Material Solvent Stock Concentration Final Concentration
GlutaMax 200 mM 2 mM
Hepes 1 M 10 mM
Penicillin/Streptomycin 10K U/ml 10K µg/ml 100 U/ml 100 µg/ml
Zeocin  100 mg/ml  125 µg/ml
B27 supplement  100x 1x
N-Acetylcysteine MiliQ H2O 500 mM
Nicotinamide DPBS 1 M 10 mM
Human Epithelial Growth Factor (hEGF) DPBS 0.1% BSA 0.5 mg/ml 50 ng/ml
Gastrin DPBS 100 µM 10 nM
TGFb type I Receptor inhibitor (A83-01)  DMSO 5 mM 500 nM
Y-27632 dihydrochloride (RhoKi) DMSO 10 mM 10 µM
p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) DMSO 30 mM 10 µM
Primocin 50 mg/ml  100 µg/ml
Human Noggin (hNoggin) DPBS 0.1%BSA 100 µg/ml 100 ng/ml
Human R-spondin 3 (hRspo-3) varies per lot 300 ng/ml
Vancomycin 10 mg/ml 50 µg/ml
Gentamycin 10 mg/ml 50 µg/ml
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) MiliQ H2O 0.5 M 2 mM
Calcein DMSO 10 µg/ml 3.3 ng/ml
Forskolin DMSO 10 mM variable
Lumacaftor (VX-809) DMSO 20 mM variable
Ivacaftor (VX-770) DMSO 20 mM variable

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. De Boeck, K., Amaral, M. D. Progress in therapies for cystic fibrosis. Lancet Respir Med. 4, (8), 662-674 (2016).
  2. Cutting, G. R. Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application. Nature Rev Genet. 16, (1), 45-56 (2015).
  3. Sosnay, P. R., Siklosi, K. R., et al. Defining the disease liability of variants in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene. Nature Genet. 45, (10), 1160-1167 (2013).
  4. Zielenski, J. Genotype and phenotype in cystic fibrosis. Respiration. 67, (2), 117-133 (2000).
  5. Van Goor, F., Hadida, S., et al. Rescue of CF airway epithelial cell function in vitro by a CFTR potentiator, VX-770. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 106, (44), 18825-18830 (2009).
  6. Van Goor, F., Hadida, S., et al. Correction of the F508del-CFTR protein processing defect in vitro by the investigational drug VX-809. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 108, (46), 18843-18848 (2011).
  7. Accurso, F. J., Rowe, S. M., et al. Effect of VX-770 in persons with cystic fibrosis and the G551D-CFTR mutation. N Engl J Med. 363, (21), 1991-2003 (2010).
  8. Ramsey, B. W., Davies, J., et al. A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation. N Engl J Med. 365, (18), 1663-1672 (2011).
  9. De Boeck, K., Munck, A., et al. Efficacy and safety of ivacaftor in patients with cystic fibrosis and a non-G551D gating mutation. J Cyst Fibros. 13, (6), 674-680 (2014).
  10. Boyle, M. P., Bell, S. C., et al. A CFTR corrector (lumacaftor) and a CFTR potentiator (ivacaftor) for treatment of patients with cystic fibrosis who have a phe508del CFTR mutation: a phase 2 randomised controlled trial. Lancet Respir Med. 2, (7), 527-538 (2014).
  11. Wainwright, C. E., Elborn, J. S., et al. Lumacaftor-Ivacaftor in Patients with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del CFTR. N Engl J Med. 373, (3), 220-231 (2015).
  12. Van Goor, F., Yu, H., Burton, B., Hoffman, B. J. Effect of ivacaftor on CFTR forms with missense mutations associated with defects in protein processing or function. J Cyst Fibros. 13, (1), 29-36 (2014).
  13. Neuberger, T., Burton, B., Clark, H., Van Goor, F. Use of primary cultures of human bronchial epithelial cells isolated from cystic fibrosis patients for the pre-clinical testing of CFTR modulators. Methods Mol Biol. 741, 39-54 (2011).
  14. Randell, S. H., Fulcher, M. L., O'Neal, W., Olsen, J. C. Primary epithelial cell models for cystic fibrosis research. Methods Mol Biol. 742, 285-310 (2011).
  15. Karp, P. H., Moninger, T. O., et al. An in vitro model of differentiated human airway epithelia. Methods for establishing primary cultures. Methods Mol Biol. 188, 115-137 (2002).
  16. Sato, T., Vries, R. G., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, (7244), 262-265 (2009).
  17. Sato, T., Stange, D. E., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, (5), 1762-1772 (2011).
  18. Clevers, H. Modeling development and disease with Organoids. Cell. 165, (7), 1586-1597 (2016).
  19. Dekkers, J. F., Wiegerinck, C. L., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Med. 19, (7), 939-945 (2013).
  20. Dekkers, J. F., van der Ent, C. K., Beekman, J. M. Novel opportunities for CFTR-targeting drug development using organoids. Rare Diseases. 1, (1), e27112 (2014).
  21. Servidoni, M. F., Sousa, M., et al. Rectal forceps biopsy procedure in cystic fibrosis: technical aspects and patients perspective for clinical trials feasibility. BMC gastroenterology. 13, 91 (2013).
  22. Ommen, D. D. Z. -V., Vijftigschild, L. A. W., et al. Limited premature termination codon suppression by read-through agents in cystic fibrosis intestinal organoids. J Cyst Fibros. 15, (2), 158-162 (2016).
  23. Dekkers, J. F., Gogorza Gondra, R. A., et al. Optimal correction of distinct CFTR folding mutants in rectal cystic fibrosis organoids. Eur Respir J. (2016).
  24. Dekkers, J. F., Van Mourik, P., et al. Potentiator synergy in rectal organoids carrying S1251N, G551D, or F508del CFTR mutations. J Cyst Fibros. (2016).
  25. Dekkers, J. F., Berkers, G., et al. Characterizing responses to CFTR-modulating drugs using rectal organoids derived from subjects with cystic fibrosis. Sci Transl Med. 8, (344), 344ra84 (2016).
  26. Li, H., Sheppard, D. N., Hug, M. J. Transepithelial electrical measurements with the Ussing chamber. J Cyst Fibros. 3, 123-126 (2004).
  27. Sheppard, D. N., Carson, M. R., Ostedgaard, L. S., Denning, G. M., Welsh, M. J. Expression of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in a model epithelium. Am J Physiol. 266, (4 Pt 1), L405-L413 (1994).
  28. Farin, H. F., van Es, J. H., Clevers, H. Redundant sources of Wnt regulate intestinal stem cells and promote formation of Paneth cells. Gastroenterology. 143, (6), 1518-1529 (2012).
  29. Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11, (2), 347-358 (2016).
  30. Vijftigschild, L. A. W., Berkers, G., et al. β2-adrenergic receptor agonists activate CFTR in organoids and subjects with cystic fibrosis. Eur Respir J. 48, (3), 768-779 (2016).
  31. Dekkers, R., et al. A bioassay using intestinal organoids to measure CFTR in human plasma. J Cyst Fibros. 14, (2), 178-181 (2015).
  32. Graeber, S. Y., et al. Intestinal Current Measurements Detect Activation of Mutant CFTR in Patients with Cystic Fibrosis with the G551D Mutation Treated with Ivacaftor. Am J Respir Crit Care Med. 192, (10), 1252-1255 (2015).
  33. Van Goor, F., et al. Ivacaftor potentiation of multiple CFTR channels with gating mutations. Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the Eur Cyst Fibrosis. 11, (3), 237-245 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats